EZH 2介导的PP2A失活对HER 2靶向乳腺癌治疗的耐药性

HER 2靶向治疗在HER 2+乳腺癌患者中取得了显著的临床疗效，但由于内在或后天耐药而引起的疾病复发仍然是临床上的一个重大挑战。在这里，我们发现蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基PPP2R2B是抗HER 2反应的关键决定因素。PPP2R2B在相当一部分HER 2+乳腺癌中被下调，这与不良的临床结果和对HER 2靶向治疗的耐药性有关。EZH 2介导的组蛋白修饰PPP2R2B下调，导致PP2A靶点p70S6K和4EBP1的持续磷酸化，导致抗HER 2抑制作用的抗性。临床上可用的EZH 2抑制剂对EZH 2的基因耗竭或抑制作用PPP2R2B表达，消除p70S6K和4EBP 1的残基磷酸化，使HER 2+乳腺癌细胞对抗HER 2的体外和体内处理重新敏感。此外，同样的表观遗传机制也有助于通过克隆选择获得抗性的发展。这些发现证实了EZH 2的依赖性。PPP2R2B抑制作为一种表观遗传控制的抗HER 2抗性，潜在提供了一个机会，以减轻抗HER 2抗药性与EZH 2抑制剂。

HER 2靶向治疗显著改善HER 2+乳腺癌患者的预后。1,2。然而，尽管如此，近一半的此类患者仍因对治疗的内在或后天的抗药性而复发。3,4，证明乳腺癌患者分层的失败谁将受益于HER 2靶向治疗仅仅基于HER 2的状态。尽管为解决这一临床问题做出了巨大努力，但开发具有更多靶向性策略以克服耐药性的临床治疗仍然是一个紧迫的临床问题。缺乏对决定治疗有效结果的分子过程的全面了解，阻碍了合理联合治疗的发展，使其无法克服抗HER 2治疗的耐药性。

HER 2下游PI3K/AKT/mTOR或MAPK通路的异常激活与HER 2靶向治疗的耐药有关。通路中关键成分的调节失调，如PIK3CA突变或丢失PTEN，与抗her 2抗性相关。5,6,7,8,9。此外，许多其他分子的微扰与治疗阻力有关，如p95-her2。10，MUC 411，IGF-1R12，以及c-src13等等，依赖于激活这一途径来发挥抵抗力。然而，抑制PI3K/mTOR通路的mTOR抑制剂everolimus与含trastuzumab的方案相比效果有限，如两期临床试验所示。14,15。MTOR抑制剂作用有限的原因是mTOR对受体酪氨酸激酶(RTKs)和AKT的负反馈作用。16,17,18。AKT抑制剂也观察到了同样的反馈激活。19暗示PI3K或AKT抑制剂也可能无法减轻HER 2靶向治疗的抗药性。因此，虽然激活的PI3K/AKT/mTOR信号参与了抗HER 2的耐药，但要克服这种耐药性，需要更有效的靶向治疗策略。

丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP2A是肿瘤抑制因子家族，在人类癌症中常被灭活。20,21。PP2A负调控肿瘤发生过程中的多种致癌途径，如Myc、Wnt、PI3K/AKT等。22,23,24，并能直接去磷酸化AKT和mTOR，靶点是核糖体蛋白S6激酶β-1(P70S6K)和真核翻译起始因子4e-结合蛋白1(4EBP1)。25,26,27,28,29,30维持PI3K/AKT/mTOR途径磷酸化活性的平衡。因此，PP2A活性与肿瘤中激酶抑制剂(包括mTOR或MEK抑制剂)的敏感性有关，这一点也就不足为奇了。24,31。PP2A家族是一个异三聚体复合体，包含一个支架A亚基、一个催化C亚基和一个由广泛基因编码的调节B亚基。32。脚手架亚基PPP2R1A在某些癌症中经常携带功能缺失突变。31,33，而其他调控性PP2A亚基则被发现带有缺失34或表观遗传抑制24,35。到目前为止，PP2A家族在乳腺癌发生和调节抗HER 2治疗反应中的作用尚未确定。

PPP2R2B下调会导致疾病进展的风险和对抗HER 2治疗的不良反应。

为了研究PP2A在乳腺癌中的作用，我们使用了公共数据库KMPlotter(Http://kmplot.com/analysis/)评价18个已知PP2A亚基的预后价值。36乳癌。7种PP2A亚基的无复发生存分析(RFS)PPP2R2D，PPP2R2B，PPP2R5D，STRN，PPP2R2A，PPP2R5A，和PPP2R1B)，低水平的低表达意味着预后不良(如图所示)。1A及补充资料表1)。其中，少数人曾参与调节其他癌症类型的药物敏感性，包括PPP2R2B, PPP2R2A, PPP2R5A，和PPP2R1A24,31,37.

接下来，我们使用了另一个公共数据库，Gobo(Http://co.bmc.lu.se/gobo/gsa.pl)，探讨上述7个候选PP2A亚基在不同乳腺癌亚型中的预后价值。有趣的是，PPP2R2B被认为是最重要的(P < 0.01) in its association with distant metastasis-free survival (DMFS) in HER2+ breast cancer, but not in basal-like, luminal A, or luminal B breast cancer subtypes (Fig. 1B，c)。除DMF外，PPP2R2B在七个候选国家中，下调监管也与糟糕的RFS(补充图)有关。1A)，以及HER 2+乳腺癌患者的总体生存率(补充图)。1B)。在公共数据库和我们的内部病人标本中，PPP2R2B与正常组织相比，大约50%的HER 2+乳腺癌发生了下调(补充图5)。1C，d)。这些发现表明PPP2R2BHER 2+乳腺癌中有很大一部分发生了下调，这与疾病进展的风险更高有关。

目前，大多数HER 2+乳腺癌患者都采用抗HER 2治疗，而且由于相当一部分接受治疗的患者后来由于治疗耐药性而长期复发，我们试图确定两者之间的关系。PPP2R2B表达和治疗结果。我们分析了16种治疗方案的回顾性队列--天真的原发性HER 2+乳腺癌和7例HER 2+患者的病变，这些患者是在Trastuzumab治疗后复发的远处转移患者。PPP2R2B与原发肿瘤相比，复发转移瘤的表达明显下调(P=0.0035；图1。1D)，表明两者之间存在关联。PPP2R2B下调和trastuzumab抗性。

评估.的价值PPP2R2B在预测HER 2靶向治疗的反应时，我们利用了一组II期临床试验患者的优势，这些患者组包括未转移的HER 2+患者，使用HER 2激酶抑制剂新佐剂雷帕替尼(一种HER 2激酶抑制剂)和化疗(紫杉醇和卡铂)(ClinicalTrials.gov；鉴定：NCT 01309607)。我们发现低水平的肿瘤PPP2R2B与表达较高的肿瘤相比，新辅助治疗两周期后肿瘤的表达明显减少。PPP2R2B(P=0.0080；图1。1E)，支持PPP2R2B下调与抗HER 2治疗后肿瘤反应不良有关。此外，在HER 2+乳腺癌患者的在线数据集中，采用新佐剂trastuzumab方案(trastuzumab+紫杉醇)(GSE 62327)；n=24)386例病理全反应(PCR)的肿瘤均表现出较高的表现。PPP2R2B表达(Z-与有不完全反应(RD)的肿瘤相比，有一半的肿瘤有较低的表达PPP2R2B(无花果)1F)。这一发现还得到了在ROC绘图机上进行的分析的进一步支持。39 (Http://www.rocplot.org/)较低的地方PPP2R2B表达(Z-以−0.5为界)与不完全的病理反应显著相关(n=134；P=0.0159；附图。1E)治疗，并在五年内复发(n=44；P=0.0457；附图。1F)。这些临床数据共同建立了一个强有力的联系PPP2R2BHER 2+乳腺癌的表达及临床意义PPP2R2B测定抗HER 2治疗的敏感性。

PPP2R2B下调与对HER 2靶向治疗的内在抵抗力有关。

上述研究结果表明，PPP2R2B表达可能是HER 2靶向治疗敏感性的分子决定因素；因此，我们试图验证PPP2R2B抗HER 2的治疗反应。PI3K信号通路的改变，包括PIK3CAE 545错义突变PTEN损失，与抗HER 2治疗的抗性有关。5,6,7,8,9。为了确定新的耐药机制和避免上述干扰因素，我们选择了HER 2+乳腺癌细胞株BT 474、SKBR 3和UACC 812，这三种细胞已知都没有这些改变。检查PP2R2B以及PP2A亚基的其他密切成员表明PPP2R2B表达水平在这些细胞系中表现出巨大的差异，在BT 474细胞中最高，而在SKBR 3和UACC 812细胞中表达水平显著降低(如图所示)。2A)。相反，其他检测到的PP2A亚基的表达在这些细胞系之间没有显着性差异。

我们接下来评估了三种HER 2+细胞对抗HER 2药物的反应，包括trastuzumab(又称HER 2靶向抗体，也称为Herceptin)和一种HER 2激酶抑制剂拉帕替尼。结果表明，BT 474的表达水平较高。PPP2R2B，用trastuzumab或lamatinib处理后表现出较强的生长抑制作用(见图)。2B，c)。相反，SKBR 3和UACC 812表达的水平较低PPP2R2B，对这些处理具有较强的抗性(图一)。2B，c)。在细胞模型中的这一观察与假设是一致的PPP2R2B下调与抗HER 2治疗的抵抗相关。

PI3k/AKT/mTOR信号通路与抗HER 2反应有关。5,6,7,8,9，包括AKT、p70S6K和4EBP1在内的该通路的几个关键效应因子是已知的PP2A去磷酸化靶点。25,26,27,28,29,30。虽然trastuzumab或lamatinib有效地阻断了AKT和ERK 1/2在这三种细胞系中的磷酸化(如图所示)。二维空间它们对p70S6K、核糖体蛋白S6(RpS6)和4EBP 1磷酸化的抑制作用仅在敏感的BT 474细胞中明显，而在耐药的SKBR 3和UACC 812细胞中则无明显的抑制作用。二维空间)。这些发现证实了PPP2R2B使用mTOR目标p70S6K和4 EBP，支持以下观点：PPP2R2B下调导致trastuzumab或lamatinib抑制mTOR信号的能力受损，导致抗HER 2治疗无效。相反，在我们的研究中，AKT或MAPK活性似乎与抗HER 2抗性无关。

直接证据PPP2R2B调节mTOR活性及对抗HER 2治疗的反应

的函数直接验证PPP2R2B，我们强迫表达PPP2R2B在SKBR 3细胞中表达低水平的PPP2R2B。异位PPP2R2B促进生长抑制，并使抗HER 2抗性的SKBR 3细胞对雷帕替尼产生抑制作用。3A，b)和trastuzumab(附图)。2A)。Westernblot分析表明，尽管雷帕替尼或trastuzumab对对照SKBR 3细胞mTOR活性(p70S6K，rpS6，4EBP1)有一定的抑制作用，但药物更有效地阻断了SKBR 3细胞中mTOR信号的过度表达。PPP2R2B(无花果)3C和补充图。2B)。标记的PPP2R2B与支架A亚基和催化C亚基共沉淀。三维空间)，表明PPP2R2B-相关PP2A复合物的完整性。为了验证p-p70S6K和p-4EBP1是PPP2R2B-PP2A复合物的底物，我们进行了体外磷酸酶分析，将免疫沉淀的PPP2R2B-PP2A复合物与SKBR 3蛋白提取物共同孵育，进行体外去磷酸化实验。如所料，PPP2R2B相关的PP2A免疫共沉淀物可显著降低p-p70S6K和p-4EBP1的表达(图1)。三维空间)。相反，P-AKT、p-P44/42 MAPK和P-Myc不受相同免疫沉淀的影响(图1)。三维空间)。这一结果进一步支持PPP2R2B相关的PP2A在HER 2+乳腺癌细胞中对p70S6K和4EBP1底物具有特异性活性。

相反，击倒PPP2R2B在敏感的BT 474细胞中，Lapatinib和trastuzumab均耐药(见图)。3E和补充图。二维空间)，增加p-p70S6K、p-rpS6和p-4EBP1的水平，更明显地抑制雷帕替尼对p70S6K、rpS6和4EBP1磷酸化的抑制作用。3F)。重要的是，击倒PPP2R2B没有明显改变其他PP2A调节亚单位的表达水平(补充图)。2C)，建议PPP2R2B击倒不影响其他PP2A复合物。总之，这些功能增益或功能丧失研究提供了直接证据，证明PPP2R2B是mTOR活性的调节因子，是抗HER 2反应的关键决定因素。

EZH 2及相关染色质抑制介导PPP2R2B下调

我们以前报道过PPP2R2B结直肠癌DNA高甲基化沉默的研究24。探讨表观遗传机制PPP2R2B我们用DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂5-Aza-2‘-脱氧胞苷(5 AZA)、HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)、组蛋白甲基转移酶EZH 2抑制剂EPZ-6438(以下简称EPZ)和GSK 126对乳腺癌细胞株SKBR 3和UACC 812细胞进行下调。在这些表观遗传抑制剂中，EPZ和GSK 126，而不是其他两个化合物，明显地诱导了PPP2R2B在SKBR 3和UACC 812细胞中均有表达。4A，b)，虽然它们并没有影响PPP2R2A(无花果)4A)。此外，对PPP2R2B与BT 474细胞相比，启动子没有显示SKBR 3细胞DNA甲基化现象(补充图)。3)。这一发现表明，EZH 2，而不是dna甲基化，在抑制PPP2R2B乳腺癌中的表达。

EZH 2介导的进一步证据PPP2R2B染色质免疫共沉淀(芯片)检测显示EZH 2和相关组蛋白标记H3K27me3在PPP2R2BSKBR 3细胞与BT 474细胞启动子区的比较4C)，EPZ处理取消了H3K27me3的富集。4D)。此外，EZH 2一组结构域被删除的ezh 2的敲除或过表达，它是ezh 2的主导阴性抑制剂。40，也诱导了.的表达。PPP2R2B，但不是PPP2R2A(无花果)4E和补充图。4). EZH 2基因敲除也能有效抑制p70S6K、rpS 6和4EBP1的磷酸化(图1)。4F)并增强雷帕替尼的生长抑制作用。4G)。总的来说，这些发现表明EZH 2直接抑制PPP2R2B染色质修饰及小分子抑制EZH 2的表达PPP2R2B乳腺癌组织中p70S6K和4EBP 1活性的表达及消失。

EZH 2抑制剂与抗HER 2联合治疗在体内外均有较强的抗肿瘤作用。

以上结果提示，Ezh 2可能是抗her 2耐药的治疗靶点，而ezh 2抑制剂则具有恢复作用。PPP2R2B表达，可以克服抗HER 2的抗药性。为此，我们检测了EPZ和抗HER 2处理对抗HER 2耐药细胞系的联合作用。EPZ与trastuzumab或lamatinib共处理对抑制SKBR 3和UACC 812细胞的集落生长具有较强的联合作用，而后者对雷帕替尼和trastuzumab具有较强的抗药性(图一)。5A，b)。该组合还可诱导强烈的凋亡，这一点从亚G1分析中可以看出(补充图)。5)。与预期的一样，药物组合导致p70S6K、4EBP1和rpS 6磷酸化明显降低，而单用雷帕替尼或曲妥珠单抗治疗则明显降低(图1)。5C，d)。重要的是，我们证明了联合效应是通过epz诱导的。PPP2R2B表达，如PPP2R2B击倒显着地消除了这种组合效应(如图所示)。5E)。使用另一种EZH 2抑制剂GSK 126(补充图)也能看到这种联合效应。6).

为了评价EPZ和trastuzumab在体内的联合应用，我们采用UACC 812细胞移植裸鼠进行抗肿瘤治疗。异种移植瘤对EPZ或trastuzumab单剂治疗的反应有限，而联合治疗则能抑制肿瘤生长，对动物的毒性最小(图一)。6A和补充图。7，左)。值得注意的是，大多数接受EPZ或trastuzumab治疗的肿瘤仍在进展中。相反，大量的肿瘤联合治疗显示部分反应(PD)或完全消退(CR)(如图所示)。6A)。免疫组织化学(IHC)分析证实，与未治疗或单独治疗的肿瘤相比，联合治疗后的残余肿瘤表现出明显的p70S6K和4EBP 1磷酸化(图1)。6C).

由于SKBR 3细胞在我们的动物模型中不能形成增殖性异种移植物，我们利用另一株HER 2+乳腺癌细胞系MB 361，用UACC 812异种移植来验证观察结果。我们发现MB 361细胞也有较低水平的PPP2R2B与BT 474(附图)比较。8A)，并对trastuzumab(补充图)具有抗性。8C)。重要的是，EPZ的反应性表达PPP2R2B(补充图。8B)并减轻其对抗HER 2抗体的耐药性(补充图)。8C)。如所料，MB 361异种接枝模型与未处理或单剂处理相比，EPZ和trastuzumab也显示了显著的组合效应(图1)。6B)，在动物模型中联合治疗未见体重减轻(补充图)。7，右)。

从小鼠模型中获得的数据表明，抗HER 2联合EZH 2抑制剂可以提高疗效。

PPP2R2B下调与抗HER 2治疗的获得性耐药有关。

在临床上，转移性肿瘤最初对HER 2靶向治疗是敏感的，但几乎不可避免地会产生耐药性。3,4。因此，我们研究了表观遗传抑制PPP2R2BEZH 2也有助于获得抗HER 2抗性。为了建立获得性耐药机制，我们用更高浓度的雷帕替尼或曲妥祖单抗处理BT 474细胞3~5个月，直到它们在高浓度药物(100 NM拉巴替尼或10μg/ml trastuzumab)存在时仍保持其活力。衍生的雷帕替尼耐药细胞系被命名为BT 474LR(如图所示)。7A)，并将其命名为BT474TR(图1)。7b)。如所料，表示PPP2R2B与亲代BT 474细胞相比，BT474LR和BT 474TR细胞的PP2A亚基均明显下调(图1)。7C)。因此，强迫表达PPP2R2B在获得性耐药细胞中，对雷帕替尼进行再敏化(补充图)。9A)。与此相一致，BT474LR细胞的p70S6K、rpS6和4EBP1磷酸化水平高于BT 474细胞(附图)。9B)，导致顽固性，导致雷帕替尼的治疗，然而，这种治疗却被PPP2R2B过度表达(附图)9B)。此外，芯片分析显示EZH 2和H3K27me3在PPP2R2B在BT 474LR与BT 474细胞相比较(见图)。7D)。因此，EZH 2抑制剂EPZ或GSK 126(但不包括其他表观遗传抑制剂)，或EZH 2敲除诱导表达PPP2R2B在获得的耐药细胞中。7E，f，与trastuzumab联合使用时，其生长受到强烈抑制(见图)。7g)。这些发现共同证明了ezh 2介导的参与。PPP2R2B抗HER 2治疗后获得性耐药的抑制。

克隆细胞异质性是获得性抗HER 2耐药的原因之一。

肿瘤异质性有助于获得耐药。已经显示了EZH 2介导的作用PPP2R2B在对抗HER 2治疗的获得性抗药性的抑制中，我们下一步要研究的是，最初敏感的散体细胞的亚群体中先前存在的表观遗传异质性是否导致了抗药性的发展，以及这种机制的存在是否会为治疗策略提供新的见解。我们研究了bt 474细胞，虽然在大体积水平上是敏感的，但是否携带表达不同水平的异种亚克隆。PPP2R2B从而赋予抗HER 2治疗的不同反应。我们通过显微镜下的单细胞采摘从BT 474中分离出单细胞，并将其扩展到由10株单细胞衍生的克隆中。在这些无性系中，无性系3号和4号表现出对PPP2R2B与其他克隆相比，其他候选PP2A亚基在不同克隆间的表达差异不大(图一)。8A)。为了测试克隆#3和#4是否代表耐受药物的亚克隆，我们给它们服用100 NM雷帕替尼三周。事实上，克隆#3和#4的药物耐受性明显高于其他克隆(图3和图4)。8B)。击倒PPP2R2B在BT 474细胞中高表达PPP2R2B表达诱导耐药表型对高浓度的trastuzumab或雷帕替尼(图)。8C)。此外，芯片分析表明，无性系#3和#4对EZH 2和H3K27m3具有较高的富集率。PPP2R2B与其他两个表达量较高的克隆相比，PPP2R2B(无花果)8D)，而持续的EPZ治疗导致了PPP2R2B在无性系#3和#4中。8E)。来自单个细胞克隆的累积数据表明，存在一个耐药细胞亚群，其特点是低表达PPP2R2B并增强了EZH 2和H3K27me3的染色质富集，导致抗HER 2耐药性的最终发生。

鉴于上述观察，我们建议与EPZ进行初步联合治疗，可能通过针对现有的低水平药物来抑制对trastuzumab的抗性获得。PPP2R2B表达克隆。为了达到这一目的，我们用trastuzumab治疗BT 474细胞25天，几乎完全消除了细胞的生长，然而，经过20天的药物清洗后，Bt 474细胞恢复得很好。然而，最初的EPZ与trastuzumab的共同治疗在很大程度上取消了细胞恢复(见图)。8F)。这些数据表明，使用ezh 2抑制剂的前期共治疗策略可以防止对her 2靶向治疗产生耐药性，这种疗法被认为会削弱剩余耐药亚克隆的生存能力，从而减少治疗难治性癌细胞的复发。

表观遗传调节使肿瘤在进展过程中对不断变化的环境作出反应，并促进治疗抗药性。在本研究中，我们发现了EZH 2介导的PP2A抑制介导的一种导致抗HER 2抵抗的表观遗传机制。我们证明了PP2A调节亚基PPP2R2BPP2A是PP2A的主要亚单位，其下调与HER 2+乳腺癌预后不良和抗HER 2耐药有关，包括HER 2靶向抗体trastuzumab和HER 2激酶抑制剂拉帕替尼。重要的是，我们发现一种临床上可用的EZH 2抑制剂可以恢复PPP2R2B允许有效治疗HER 2-靶向治疗。因此我们得出结论，表观遗传抑制PPP2R2BEZH 2是抗HER 2治疗的潜在耐药机制，EZH 2抑制剂在克服抗HER 2耐药方面具有潜在的实用价值(图1)。9).

这项工作揭示了PP2A在HER 2+乳腺癌中的重要作用，特别是在抗HER 2治疗方面。PP2A亚基和亚型由许多基因编码，组成不同的PP2A复合物，使不同的靶蛋白脱磷，从而具有明显的功能。32发挥抑癌作用23或调节药物敏感性37。观察到PPP2R2B在所有PP2A亚基中，HER 2+乳腺癌的预后最好，支持其在影响trastuzumab治疗结果中的作用。有趣的是，PPP2R2BDNA过甲基化导致的沉默与mTOR抑制剂的耐药有关。24。因此，表观遗传机制PPP2R2B沉默似乎是癌症类型的依赖，强调需要不同的表观基因化合物来激活。PPP2R2B在不同癌症类型中的表达。最近的一篇报道显示，ezh2 inhbitor能激活Ⅰ型干扰素信号，从而使免疫应答增强，从而提高小鼠抗ERbb 2的免疫能力。41。然而，我们的组合效应与这种机制不同，因为它发生在免疫决定的裸鼠身上。因此，EZH 2抑制剂与抗HER 2的结合，可通过调节肿瘤和免疫微环境机制而产生抗肿瘤作用。

目前，只有少数的临床研究已经调查了联合策略的有效性，以克服抗HER 2治疗的阻力，取得有限的成功。尽管PI3K/AKT/mTOR信号通路在抗HER 2抵抗中的作用是有希望的，但临床试验探索了trastuzumab与该途径抑制剂如mtor抑制剂everolimus的结合，并没有达到预期的改善效果。14,15。我们的研究表明，抗HER 2抗性与p70S6K和4EBP1的剩余磷酸化有关，而与其他已知的PP2A底物(如AKT、MYC或ERK)无关。已知PP2A与mTOR靶p70S6K和4EBP1相互作用，并直接去磷酸化。26,27,28。我们证实了PPP2R2B相关的PP2A靶向p70S6K和4EBP1去磷酸化，从而降低了pP2R2B的表达。PPP2R2B在乳腺癌细胞中，通过抗HER 2治疗，p70S6K和4EBP 1去磷酸化作用减弱。机械地，p70S6K和4EBP1调节mTOR的两个平行下游通路。42,43对于癌细胞的增殖和肿瘤的发生是至关重要的。42,43，因为同时抑制这两种途径可以阻止癌细胞周期的进展。43。我们认为抗HER 2治疗后p70S6K和4EBP1的持续残余信号在低水平时仍然存在。PPP2R2B-表达癌细胞可能会导致治疗失败，尽管其与抗HER 2治疗的临床耐药之间的相关性需要在临床样本中进一步验证。因此，通过恢复PP2A活性PPP2R2B表达可以完全抑制p70S6K和4EBP 1的磷酸化，似乎是增强抗HER 2治疗的有效手段。

我们的研究表明，EZH 2-介导的PPP2R2B药物耐受性和抗HER 2治疗的获得性耐药都需要沉默，临床分析表明有潜在的预测价值。PPP2R2BHER 2-靶向治疗。对初对抗HER 2敏感的bt 474细胞进行单克隆分析，发现其异质性。PPP2R2B表达，低PPP2R2B-表达EZH 2和H3K27me3的亚克隆PPP2R2B启动子和较高的耐受性抗HER 2治疗。因此，我们的数据支持这一观点，即抗HER 2抗性可能来自于先前存在的容忍表观遗传状态。事实上，我们表明，预先与EZH 2抑制剂EPZ共处理可以防止BT 474抗药性的紧急情况后，特拉图祖马布或雷帕替尼治疗。因此，我们建议抑制EZH 2介导的PPP2R2B沉默可能通过恢复耐受状态的脆弱性来减轻抗HER 2抵抗。此外，鉴于EZH 2介导的细胞对耐药的异质性，如本研究所示，预先联合EPZ-6438和抗HER 2治疗可以预防肿瘤的复发和转移。EPZ-6438是一种领先的EZH 2抑制剂，目前正处于临床发展的高级阶段。我们的发现支持未来的临床研究，以研究这种联合策略在治疗HER 2+乳腺癌时的临床效用。PPP2R2B作为抗HER 2治疗的潜在预测指标。

细胞系和试剂

Bt 474、SKBR 3、MB 361、UACC 812和HEK293T分别来自美国型文化集(ATCC；Manassas，VA)，并根据ATCC指令进行鉴定。所有细胞系均在5%CO中37℃孵育。₂和95%的大气空气，并与DMEM(Hyclone；CAT)保持。没有。SH30243.01+10%(v/v)胎牛血清(CAT)。没有。Biowest；S181BH-500)和100 U/ml青霉素-链霉素(Gibco；CAT.(编号：15140-122号)。获得耐药细胞系BT474LR是通过在正常培养基中添加50 NM雷帕替尼培养5个月，再用100 NM雷帕替尼再培养4个月，而BT474TR在其正常培养基中添加10μg/ml trastuzumab，培养3个月后获得的耐药细胞系BT 474LR。定期对所有细胞系进行评估，以确保其不受支原体污染。

猫(猫)没有。S 2111)是从Selleck化学品公司(得克萨斯州休斯敦)购买，并与DMSO进行体外实验。EPZ-6438(CAT.没有。GC 14062)是从Glpbio TechnologyInc.(加利福尼亚州Montclair)购买的，并与DMSO一起进行体外实验。曲古菌素A(TSA；猫)没有。T 8552和5-Aza-2‘-脱氧胞苷(CAT)。没有。A 3656是从西格玛-奥尔德里奇(密苏里州圣路易斯)购买，分别用甲醇和无菌水配制而成。Trastuzumab及其溶剂是从罗氏(加州旧金山南部)收购的。

病人生存分析

采用KM-Plotter在线乳腺癌微阵列数据库(KM-Plotter)进行Kaplan-Meier(Km)生存分析。Https://kmplot.com/)44和基于基因表达的乳腺癌在线数据库(Gobo)的结果(Http://co.bmc.lu.se/gobo/)45。在KM-Plotter分析中，只使用最优的探针集，并为基因低表达组和高表达组之间的百分位数自动选择作为截断的基于计算的执行阈值。在Gobo分析中，选择基因符号作为标识符，将临床数据分为3个分位数，筛选出审查年份为10年。在这两个数据库中，基因表达水平与无复发生存率(RFS)、无远处转移生存期(DMFs)和乳腺癌各亚型(Lumina A、Lumina B、HER 2+和Basal)的总生存率(OS)之间的关系。

单细胞克隆分离

将分离的BT 474细胞悬液，用培养基稀释至2500细胞/ml，将2ml的稀释细胞悬液镀入60 mm的组织培养盘中。每个细胞在显微镜下用一根移液管取出，然后被镀进一个96井碟的一口井中，其中含有100μl生长培养基。然后这些细胞被培养2到3周，每隔5到7天进行一次培养基的刷新，直到它们可以扩展到更大尺寸的培养皿，最后是T75瓶。

逆转录定量PCR

细胞或组织在TRIzol(Invitrogen)中溶解，用直接zol™小片段预试剂盒(ZymoResearch；CAT)提取RNA。没有。根据用户手册。提取的RNA用T 100热循环(Bio-RAD)和大容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统；CAT)反转录成cDNA。根据用户手册，编号4368814)。用KAPA SYBR快速qPCR试剂盒(KAPA生物系统；CAT)进行定量PCR(QPCR)。没有。KK 4620)，根据用户手册。所有的反应都是用ViiA7实时PCR系统(ThermoFisher Science)在96井或386井板格式下在技术三重奏中进行的。GAPDH被用作内部控制。用2计算表达的折叠变化。−ΔΔCT方法。所使用的基因特异性引物列于补充表中。2.

CDNA预扩增

CDNA的预扩增用TaqMan预安培主混合试剂盒(Thermo Fisher Science；CAT)进行。根据用户手册第4384267号)。简单地说，相当于4ng RNA的cDNAs与混合的qPCR引物和商用试剂盒中含有酶的主混合物混合在一起。然后用热循环器将混合物放大10个循环。预扩增后用水稀释5倍后，再进行qPCR。

Westernblot

细胞用4%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)(1碱基；CAT)裂解。没有。解决方案。采用皮尔斯™蛋白测定试剂盒(ThermoFisher Science；CAT)测定蛋白质浓度。根据用户手册第23227号)。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离各样品中等量的蛋白质，并转移到PVDF膜(Merck Milli孔隙；CAT)上。没有。IPVH 00010)，然后用适当的阻滞剂阻断，并按照制造商的指示用特定的初级抗体涂抹。以下为抗p70S6K(CAT)的初级抗体。第9202号，抗膦-p70S6K(Thr 421/Ser424)(CAT)。第9204号，抗膦-p70S6K(Thr 389)(CAT)。第9234号，抗磷AKT(Ser473)(CAT)。第4058号，抗膦AKT(Thr 308)(CAT)。第2965号，抗AKT(CAT)。第4691号，抗rpS 6(CAT)。第2217号，抗膦-rpS6(S 235/236)(禁止酷刑公约)。第2211号，抗-4EBP1(CAT)。第9644号，抗膦-4EBP1(Ser65)(CAT)。第9451号，抗GAPDH(CAT)。第2118号，抗EZH 2(CAT)。第5246号，抗磷脂-p44/42 MAPK(CAT)。抗组蛋白H3(CAT)。第9715号，抗PP2A亚基(CAT)。和抗PP2A C亚基(CAT)。第2259号)是从细胞信号技术购买的。抗PPP2R2B(CAT.没有。AB 16447)和抗H3K27me3(CAT编号07-449)抗体分别从Abcamm和Merck Milli孔隙购买；抗磷Myc(S62)(CAT)。编号33A12E10)是从生物研究院获得的。为了检测内源性PPP2R2B，采用了从LSBio购买的抗PPP2R2B(LS-C761012)。与原代抗体杂交后，用辣根过氧化物酶连接的抗鼠IgG(NA931-1ml)或兔IgG(NA934-1ml)的辣根过氧化物酶连接的次级抗体(NA931-1ml)孵育膜，然后与化学发光基质(ThermoFisher Science；CAT)共同孵育。34096)和ChemiDocTM XRS+成像系统(Bio-Rad)所有原发抗体均以1：1000稀释，预期抗GAPDH为1：2500，次级抗体为1：4000稀释。补充文件中提供了所有完整的污迹。

软琼脂试验

实验采用覆盖0.6%(w/v)琼脂(BectonDickinson；CAT)的生长培养基基板。(第214010号)。细胞在含0.3%(w/v)琼脂的培养基中，在12孔或24孔板上，以每孔5000细胞或2500个细胞的密度镀膜。在镀膜细胞后使用药物，并配上培养基。根据一口井中所含的培养基和琼脂总量测定药物浓度。培养14~21d后，用氯化碘四唑盐(Sigma-Aldrich；CAT)对菌落进行染色。没有。I 10406)，0.25毫克/毫升，4小时，然后根据制造商的指示用GelCount(牛津Optronix)定量。药物的IC 50值由Compusyn(可从Http://www.combosyn.com/)遵照软件开发人员的指示。

克隆形成试验

细胞接种于6孔或12孔培养皿上，以最佳密度接种，第二天用指示药物处理，共培养24~28天，直至对照组达到80%的汇合度。药物和培养基在处理过程中每4~7天刷新一次，然后用甲醇固定细胞集落，用0.5%(w/v)结晶紫染色。用GelCount(牛津Optronix)拍摄菌落的图像，用ImageJ 1.51u(下载)对每口井中菌落覆盖面积的百分比进行量化。Https://imagej.net/Downloads)。药物的IC 50值用Compusyn 1.0测定(可从Http://www.combosyn.com/)，遵循软件开发人员的指示。

亚G1凋亡试验

简单地说，将细胞接种在6孔培养皿上，用指示化合物处理两天，然后收获漂浮细胞和附着细胞。用70%乙醇固定，用PBS洗涤两次，再用RNase A处理，碘化丙酸染色。然后用流式细胞仪分析亚G1期细胞群，并将其与整个细胞组进行比较。

耐药细胞试验

Guler等人描述的程序。46产生和量化耐药细胞。简单地说，细胞在12孔培养皿中以最佳密度播种，第二天在指定浓度下用指示药物处理，共3周。在处理过程中，每隔4~7天刷新一次培养基和药物，然后用甲醇固定，用300 NM4‘，6-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI)染色(Thermo Fisher Science；CAT)。(第62248号)。根据生产厂家的指示，用Perkinelmer和谐4.8(Opera phenix高含量筛选系统)的成像系统和分析软件对染色细胞核进行定量分析。对每口井，在×5放大率下获得25幅图像，并计算出每一图像的平均原子核数。从失去焦点的图像中提取的数据被排除在外。

细胞再生试验

在12孔培养皿上以最佳密度接种细胞，第二天进行处理，共25天。在处理过程中，每隔4~6天刷新一次培养基和药物，然后去除含有药物的培养基，并将剩余的存活细胞置于无药物的生长培养基中培养20天。细胞集落用甲醇固定，用0.5%(w/v)结晶紫染色，用GelCount 1.2.1.0(Oxford Optronix)拍摄菌落图像。每口井的菌落覆盖面积的百分比用ImageJ量化。

RNA干扰

用脂质体RNA iMAX(Invitrogen)将小干扰RNA(SiRNAs)转染细胞，最终浓度为100 nm。所有siRNA都是从Sigma-Aldrich购买的。非靶向控制siRNAs(CAT)。没有。(SIC 001)被指定为sinc，siRNAs被指定为EZH 2被指定为siEZH 2它们的目标序列列在补充表中3.

要生成稳定的shRNA细胞，请使用表中列出的具有目标序列的shRNA3克隆入pLKO1.-puro载体(Addgene；cat)。第8453号)使用Addgene上可用的协议(Http://www.addgene.org/tools/protocols/plko/)。以萤火虫荧光素酶为靶标的一对shRNA作为阴性对照，命名为shNC。靶向的shRNAsPPP2R2B或EZH 2被指定为shPPP2R2B或什EZH 2分别。将克隆载体和包装质粒pMDLg/pRRE(Addgene；CAT)转染HEK293T细胞，产生病毒进行转导。(编号：12251)，pRSV-Rev(Addgene；CAT.和pMD2.G(Addgene；CAT)。第12259号)，载于“2000年脂质体”(Invitrogen；CAT)。根据制造商的指示，编号11668019)。转染后48~72h采集病毒上清液。将病毒上清液4μg/ml的聚丁烯(Sigma-Aldrich；CAT)导入靶细胞。没有。H 9268)，用0.5μg/ml普罗霉素筛选细胞进行进一步分析。

稳定细胞系PPP2R2B过度表达

全长逆转录病毒表达质粒PPP2R2B构建了稳定的细胞株，并在此基础上构建了稳定的细胞株。PPP2R2BTan等人描述了过度表达。24。用脂质体2000(Invitrogen；CAT)转染铂-A细胞。(编号：11668019)，与质粒PPP2R2B或者空载体产生逆转录病毒。然后用4μg/ml的聚丁烯(Sigma-Aldrich；CAT)感染靶细胞。没有。并对GPF阳性细胞进行分类分析。

染色质免疫沉淀(芯片)-qPCR

前面描述的程序40用于芯片实验。细胞经37%甲醛处理后，用SDS溶解，再经超声处理。然后用G蛋白琼脂糖对细胞裂解物进行预处理(Roche；CAT)。抗兔IgG抗体(圣克鲁斯生物技术；猫。没有。然后用抗H3K27me3抗体隔夜孵育(细胞信号技术；CAT。或抗EZH 2抗体(活性基序；CAT)。(第39901号)。与抗体孵育后，磁性蛋白-G(Invitrogen；CAT)。采用10004D和磁架进行免疫沉淀。提取DNA后，在68℃下进行一夜反向交联，然后用QIAQuickPCR纯化试剂盒(QIAGEN；CAT)进行DNA清除。(第28104号)。用qPCR技术对纯化的免疫沉淀DNA和输入DNA进行了分析，并对目的蛋白的启动子结合丰度与输入DNA进行了定量比较。相对于ACTB提出了启动子。用于扩增PPP2R2B列在补充表中4.

PPP2R2B-PP2A体外磷酸酶测定

带标志融合的慢病毒表达质粒PPP2R2B在载体Plenti-puro(Addgene；cat)上构建。39481)通过EcoRV和XhoI。PPP2R2B从含全长的pmn gfp/iRES载体中扩增pmn gfp/iRESPPP2R2B，由Tan等人建造。24。标记标记(DNA序列：GACTACAAAGAGGATGACGACAAG)分别通过正向PCR引物或反向PCR引物添加到PPP2R2B的N-末端或C-末端。用脂质体2000(Invitrogen；CAT)转染铂-A细胞。(第11668019号)包含标志融合的向量PPP2R2B或者空载体来生成扁豆病毒。然后用4μg/ml的聚乙烯(Sigma-Aldrich；CAT)感染SKBR 3细胞。没有。H 9268)，并在载体中用选择标记选择，即普罗霉素。取细胞用10μg/ml trastuzumab处理6h后，在磷酸酶分析缓冲液(20 mm咪唑-HCl，2mm EDTA，2mm EGTA，1mm Na3VO4，全蛋白酶抑制剂，0.1%NP-40[pH 7.0])中溶解。以4°C最大速度离心10 min，收集上清液，测定蛋白质浓度。用抗标记M2亲和凝胶(Sigma-Aldrich；cat)孵育相同量的裂解液。没有。A 2220)在4℃下培养3h，离心收集免疫沉淀，用磷酸酶检测缓冲液洗涤4次。洗涤后的免疫沉淀分别与SKBR 3细胞的全细胞裂解液在30℃磷酸酶缓冲液中孵育25 min。加入3×SDS负载缓冲液，在100℃下孵育4 min，反应停止。然后用离心法去除凝胶，将上清液装入Westernblot分析。

亚硫酸亚铁焦测序

用QIAamp DNA迷你试剂盒(QIAGEN；CAT)从细胞中提取基因组DNA。根据用户手册第51306号)。然后用EZ DNA甲基化对DNA进行亚硫酸亚铁修饰-黄金试剂盒(Zymo Research；CAT)。没有。(D 5006)根据说明书。然后利用PyroMark PCR试剂盒(QIAGEN；CAT)，用专为亚硫酸氢钠修饰的DNA设计的引物对感兴趣的区域进行扩增。根据用户手册第978703号)。每对引物包含1个生物素化引物和1个非生物素化引物。利用PyroMark Q24系统(QIAGEN；CAT)，从每个PCR扩增产物中分离得到生物素化的ssDNA，并进行焦测序。(第9001514号)带有特定的测序引物。数据用Pryomark Q 24软件2.0进行分析。所有PCR和测序引物均采用PyroMark设计软件SW 2.0(QIAGEN)设计，并在补充表中列出。5.

动物研究

所有实验或手术规程都是在获得新加坡动物保护和使用机构委员会(IACUC)、科学、技术和研究机构(A*STAR)的批准后进行的。6周龄雌性NCR裸鼠植入17β-雌二醇60天释放颗粒(美国创新研究；CAT)。没有。在脖子的外侧。植入后4天，小鼠两侧皮下注射3×10。6UACC 812或MB 361细胞，再悬浮于50倍的PBS中，与基质混合1：1(BD生物科学；CAT)。(第354248号)。当肿瘤达到65毫米时3将小鼠随机分为4组，分别给予EPZ-6438(EPZ)、trastuzumab和EPZ+trastuzumab联合用药。将肿瘤负荷相似的荷瘤小鼠平均分成两组进行随机化处理。EPZ用0.5%羧甲基纤维素钠+0.1%吐温80溶液配制，每日一次，经口灌胃，剂量为250 mg/kg。Trastuzumab由其溶剂配制(由罗氏提供)，每周腹腔注射一次，剂量为30 mg/kg，随后为15 mg/kg。47。EPZ或trastuzumab剂量分别为10μl/g和5μl/g。最后一次治疗后6小时，肿瘤切除进行IHC。在治疗的前七天每天测量小鼠的体重，然后每周两次，直到实验结束。用游标卡尺每周测量两次肿瘤体积，计算公式如下：V = L × W × W/2.肿瘤大小为S.D的两倍以上。随机化点的平均值排除分析，死于意外疾病的小鼠也被排除在外。肿瘤大小的测量是由一名对治疗组视而不见的人进行的。采用实体肿瘤反应评价标准(RECIST)将肿瘤分为进行性疾病(PD)、稳定疾病(SD)、部分反应(PR)或完全反应(CR)，其中PD：肿瘤大小至少增加20%；SD：肿瘤大小增加<20%至<30%；PR：肿瘤大小至少减少30%；CR：肿瘤消失。所有小鼠均维持在21°C±1，55~70%的湿度下，每天早上7点至晚上7点，光照/黑暗周期为12小时。

免疫组织化学(IHC)

简单地说，肿瘤组织被石蜡包埋并切片，然后用抗原回收器(Sigma-Aldrich；CAT)提取抗原。没有。(C 9999)。肿瘤切片用3%H孵育。₂O₂阻断内源性过氧化物酶，用3%BSA进一步阻断，再用抗磷酸酶原单抗rpS 6(血清235/236)(CAT)孵育。第2211号，抗膦-4EBP1(Ser65)(CAT)。或抗膦-4EBP1(Thr 37/46)(CAT)。(第2855号)从信元信令技术购买。切片与山羊抗兔IgG(H+L)-HRP结合(Bio-Rad；CAT)孵育。1706515号，苏木精染色，Axio扫描Z1(蔡司)扫描。每个肿瘤的一幅有代表性的图像被一位对治疗组视而不见的人挑选出来进行量化。量化是用ImageJ进行的，插件颜色反褶积可在线下载(Https://beardatashare.bham.ac.uk/getlink/fiGsh6oznHZG4BvQ84YSetim/colour_deconvolution.zip)。采用棕色层反褶积进行定量。数据显示为染色面积占整个图像的百分比。每组5只以上小鼠的肿瘤进行定量。

临床样本和数据

人体组织样本由欧登塞大学医院(丹麦)和国立大学医院(新加坡)提供。对这些材料的研究得到了各相应机构的审查委员会的批准。每个同意为研究目的提供组织样本的人都获得了知情的书面同意。

治疗后复发的原发肿瘤和远处转移肿瘤的队列样本来自丹麦欧登塞大学医院。得到了丹麦南部道德委员会(丹麦欧登塞)和丹麦数据保护局(丹麦哥本哈根)的批准。用组织学Ⅱ(QIAGEN；CAT)从冷冻切口活检组织中提取肿瘤RNA。(第85300号)，遵照制造商的指示。然后对提取的RNA进行RT-qPCR检测基因表达.

新佐剂雷帕替尼方案治疗组包括34例Ⅰ-Ⅲ期HER 2+乳腺癌患者，他们参加了单臂Ⅱ期临床试验(ClinicalTrials.gov；标识符：NCT 01309607)，并用新佐剂雷帕替尼加化疗(紫杉醇和卡铂)治疗，共4个周期。治疗前后临床测量肿瘤大小。将基线肿瘤和正常乳腺组织的RNA反向转录为cDNAs，并在进行qPCR前对cDNAs进行预扩增。QPCR分析由一位不了解肿瘤大小变化的人进行。

Triulzi等人描述了新佐剂trastuzumab方案(trastuzumab和紫杉醇)治疗的队列。38其中24例局部晚期HER 2+乳腺癌患者术前应用一剂曲妥珠单抗及随后4个周期的曲妥珠单抗和紫杉醇治疗。这些数据可在基因表达总括(GEO)数据库(Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)作为数据集GSE 62327。

统计分析

除另有说明外，所有体外实验至少重复两次。所有的测量都是从不同的样本中获得的，而不是重复测量的。所有数据用GraphPad Prism版本8(图盘软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行分析，表示为平均值±S.D.，除非另有说明。用双尾学生统计显着性。t-测试，除非另有说明。一个P小于0.05的数值被视为具有统计意义，除非另有说明，因此，N.S.不显着；*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.