表达抗人类免疫缺陷病毒抗体的工程B细胞可使记忆保持、同型转换和克隆扩展

艾滋病毒病毒血症可以通过慢性抗逆转录病毒疗法加以控制。作为一种潜在的一次性替代方案，CRISPR/Cas9设计的B细胞表达抗HIV广泛中和抗体(Bnbs)能够分泌高抗体滴度。在这里，我们证明，在小鼠免疫后，过继转移到生发中心(GC)的基因工程B细胞在进行类切换重组(CSR)时，占据了内源性反应的主导地位，并分化为记忆细胞和浆细胞。高亲和力抗原免疫可提高GCs和CSR率。增强免疫可以提高GCs中工程B细胞的比例和抗体的分泌，提示记忆保持。最后，脾脏工程B细胞的抗体序列显示克隆选择模式。因此，B细胞可以被工程成一种可能是活的和不断发展的药物。

慢性抗逆转录病毒疗法不能根除艾滋病毒感染。广泛中和抗体(Bnbs)可抑制病毒血症。1，但它们必须以更高的成本长期使用。另外，bnbs也可以从肌肉组织中表达。2,3，但抗药物抗体(ADA)经常被开发出来。4，可能是由于糖基化不当所致。此外，从肌肉中表达的抗体既不经历类切换重组(CSR)，也不经历亲和力成熟，这对于长期控制多种多样和不断演变的HIV感染是必要的。这些挑战可以通过B细胞工程来克服。人类CD 34的慢病毒转导首次完成了与治疗相关的治疗方案。+细胞继之体外分化5。成熟B细胞慢病毒转导使膜及分泌抗体亚型的发育调节表达6。最近，CRISPR/Cas9介导的抗体基因整合在原代人B细胞的Ig位点上得到了证实。7。将抗体可变重链整合到免疫球蛋白重链(IgH)位点进一步允许体外体细胞高突变(SHM)和类开关重组，利用适当的剪接信号利用内源性恒定片段。8。在免疫能力强的小鼠中，B细胞的过继转移，通过基因工程表达hIV-BNAb，促进了HIV中和抗体滴度的产生。9。将单链抗RSV抗体整合到IgH位点，可进一步防止感染。10。然而，在以往所有的体内研究中，免疫记忆和克隆选择都没有被证明，这严重阻碍了该技术在临床上对高度多样化和快速进化的艾滋病病毒的应用。

在这项工作中，我们克服了这些限制，结合Toll样受体(TLR)介导的体内外激活和体内一级促进免疫。我们证明，工程B细胞使免疫记忆和克隆选择，可能有助于解决患者之间的病毒变异和对抗病毒逃逸。

利用CRISPR/Cas9和AAV可以设计表达bNAb的B细胞

我们使用CRISPR/Cas9和重组腺相关病毒载体(RAAV)来整合3BNC 117。11HIV-bNAb在增强子依赖性Ig启动子下的作用12进入IgH位点的J-C内含子。1A和补充图。1)。我们选择了3bnc 117，这是一种强效的d4模拟hiv-bnab，因为结合10-1074 bNAb，它最近被证明能在病毒中毒个体中诱导病毒抑制。13在接受治疗中断的人中14。我们的双顺反子bNAb盒编码3BC 117重链(VH)的全轻链和可变段，该重链由糠醛切割位点和核糖体跳过的2A肽分离。VH之后是剪接供体序列，使bNAb作为膜B细胞受体(BCR)融合到恒定的片段和初始表达。我们的设计可能允许破坏内源性IgH链，同时促进免疫时抗原诱导的工程B细胞的激活，导致分化为记忆细胞和浆细胞，以及CSR、SHM和亲和力成熟(如图所示)。1A和补充图。1).

首先，CRISPR/Cas9gRNAs被设计用来促进小鼠和人类IgH-J-C内含子的切割。我们选择特定的目标位置，以允许供体-载体设计与足够长的同源性臂，既不包含潜在的致癌基因增强子，也不包含与基因组片段相对应的序列，在VDJ重组过程中可能被删除。CRISPR/Cas9切割在永生化的ProB细胞系(ImProB)的IgH位点产生33%和21%的Indels15和Ramos人B细胞株(补充图)。2A)。为了避免链错配，采用不同的gRNAs干扰内源性卡帕轻链(IgK)。IgKgRNAs以IgK常量片段的剪接受体连接为靶点，以避免针对转基因bNAb的IgK链。CRISPR/Cas9切割后，IgK在小鼠和人细胞系中的表达分别达到19%和16%(附图)。2B)。然后，我们将CRISPR/CaS 9核蛋白(RNP)电穿孔与rAAV转导结合起来。我们首先使用编码gfp盒的rAAV来验证我们的Ig启动子变异的活性依赖于内含子增强子旁边的目标整合。事实上，在ImProB细胞中，gfp的高表达和稳定表达，但只有当适当的gRNA被共同传递时才能表达(补充图)。2C)。当使用bNAb盒式磁带时(如图所示)。1A和补充图。1CRISPR/Cas9电穿孔和rAAV联合转染分别使小鼠和人细胞系3BNC 117 BCR的表达率分别为9%和8%(附图)。二维空间)。MRNA分析证实了整合的3BNC 117与预期的恒定片段在每个细胞系中的剪接(补充图)。2E).

HIV抗原体外激活工程B细胞

原代B细胞的高效工程可能需要通过CD 40途径激活8,10或TLR通路9。CD 40结扎术可产生生发中心样B细胞及体外分泌抗体的浆细胞。16。然而，通过CD 40结扎术激活的B细胞表达较高水平的CD 80，这与免疫后体内进一步激活的可能性降低有关。17,18。特别是，这些细胞对GCs的能力降低，建立免疫记忆，并经历SHM和亲和力成熟。10,18。相反，TLR途径介导的来自转基因小鼠的供体B细胞的激活，最近被证明可以在免疫后归巢到受体的GCs。9。因此，我们用TLR 4激动剂脂多糖(LPS)激活小鼠脾脏B细胞，用抗TLR 4同源物RP 105的抗体激活人血B细胞(图1)。1B)。CRISPR/Cas9RNP电穿孔分别导致小鼠和人IgH位点30%和29%的Indel形成(附图)。3A)。在随后的rAAV转导后，多达74%和11%的细胞分别在激活的小鼠和人类细胞中表达3BNC 117 bcr(图1)。1C-E)。Sanger测序验证了正确的整合(补充图)。3B)。3BNC 117在表达细胞和不表达细胞中的表型和亚型分布相似(附图)。3C，D)。重要的是，当我们通过TLR而不是CD 40途径激活细胞时，工程细胞表达的CD 80水平较低。3E)，意味着抗原诱导激活的倾向增加。3 BNC 117的分泌较小，但可检测到(补充图)。3F)。此外，小鼠和人的细胞在激活、电穿孔和转导后仍能保持较高的存活率(附图)。3G-I)。通过与HIV gp 120抗原共同孵育，可以进一步激活这两个物种的工程B细胞，从而导致ERK磷酸化(图1)。1F)。我们验证了我们使用的启动子只有在CRISPR依赖的整合在内含子增强子旁边才能在原代细胞中发挥作用(补充图)。4A)。此外，我们的盒式编码强波利亚上游的ED启动子(图一)。1A)用内源性转录本防止异常剪接(附图)。4B、C)。通过共转染额外的gRNAs可以避免链错配，分别导致49%和45%的小鼠和人类IgH等位基因的IgK消融(图一)。2A)。将3BNC 117编码为单链抗体也可以减少转基因和内源链之间的错配。10(无花果)2B，c，顶部，2D)。为了进一步提高安全性，我们展示了一个无启动子的3BNC 117盒的高效B细胞工程，只有在整合到IgH位点后，再与内源性转录体剪接，才能表达。2B，c、底部)。虽然无启动设计与降低工程率有关，但单链设计允许较高的工程效率。重要的是，在人类基因组中仅有的四个位点中可以检测到低的indels率，这意味着目标的分裂，其中包含的序列与IgH靶位点的两个位置完全不同(补充图1)。4D-F)。在7号染色体INcRNA内含子中检测到Indel率较高的无统计学意义的趋势，它是与目标位点在三个位置上不同的三个位点之一，并被选择用于分析，因为它们与4个PAM-近端位置的目标位点相同。值得注意的是，非目标indel的活动以前已经被证明是发生在有多达六个错配的地点，即使是低的非目标率，当注入数百万的工程细胞时，也可能具有临床意义。补充图4G，H因此，报告了人和小鼠gRNAs每个错配数的潜在非目标位点的数量。CRISPR介导的B细胞工程在临床上的未来实施可能进一步要求对非目标切割分布进行深入无偏的分析。19。然后可以选择人类IgH J-C内含子的最终切割位点(补充数据)。1)在此基础上，将其与最小的离目标解理剖面相关联。

工程B细胞可在体内进行抗原诱导活化

为了在体内评估功能，我们首先设计了CD45.1 C57BL/6小鼠活化脾B细胞表达3BNC 117，如图所示。1A，然后我们过继地将这些细胞转移到另一种同基因CD 45.2小鼠中。每只受体小鼠均接受1.5~2.2M的供体细胞，转移的3BNC 117的表达细胞数为112,500。不同的小鼠组随后只接受最优或两种主要免疫和增强免疫，并最终被放血以评估血清抗体浓度或牺牲以分析脾脏B细胞群(图一)。3A)。用YU2.DG HIV株的gp 120抗原免疫不同组，用3BNC 117或THRO4156.18 HIV株的gp 120抗原有效中和，3BNC 117对其中和效果较差。20。3BNC 117与YU2.DG抗原有较高的亲和力(附图)。5A)，但这些抗原在其他方面是相似的，两者都属于B型HIV-1株。CD45.1+供体细胞被发现在接受过继转移和后续免疫的小鼠的生发中心与任何一种抗原(补充图)。5B)。而不到10%的转移细胞是gp 120结合物，而绝大多数CD 45.1表达细胞在GCs结合的gp 120中(如图所示)。3B，c)，是抗原诱导GCs归巢的有力标志。此外，gp 120对小鼠具有免疫原性，而与B细胞工程无关(补充图)。5C，D第8天，供体细胞垄断相关脾GCs，90%以上的gp 120结合细胞表达CD 45.1。3D，e)。因此，在患者中，激活编码中和抗体的工程B细胞可以有效地与内源性反应竞争，而内源性反应往往是非中和的。21,22.

工程B细胞使记忆保持

用YU2.DGgp 120抗原免疫14天后，我们发现3BNC 117 Ab的血清浓度高于用THRO4156.18抗原免疫后的浓度(见图)。4A)。然而，重要的是，在增强免疫后14天，测得血清抗体浓度的对数增加，使用这两种抗原中的任何一种都可达到近1μg/ml(图1)。4A，补充图。5E)。如此之高的3BNC 117血清浓度曾被证明可以广泛中和HIV病毒。23。GCs中工程细胞的比例在任何一种抗原增强免疫后8天内也显著增加(如图所示)。4B，c和补充图。5F-G)。与接受初级免疫和增强免疫的小鼠相比，仅接受早期免疫后的小鼠和只接受晚期免疫的小鼠GCs中的工程细胞比例较低(补充图1)。6A，B)。因此，重要的是，增强效应可以严格归因于免疫记忆的保留。事实上，脾脏中供体细胞的免疫表型显示，该工程细胞正在分化为两种CD 38。+CD 138+IG分泌细胞与CD 38+CD 138−(其中包括内存B细胞)(如图所示。4D，e和补充图。6C)。有趣的是，在用YU2.DGgp 120抗原免疫后，我们发现CD 38的阳性率更高+CD 138−B细胞与THRO 4156.18抗原免疫后比较。此外，脾CD 38的比率+CD 138−两种抗原促进免疫后，B细胞数量增加，浆细胞率下降，这与小鼠的自然免疫反应相一致。24.

工程B细胞在体内进行CSR、SHM和克隆扩增

CSR可能是必要的，以确保体液和黏膜保护免受艾滋病毒激增。的确，IgG1、IgG2，除IgM亚型外，3BNC 117 bNAb在小鼠血清中也有IgA亚型。5A和补充图。7A-C)。用YU2.DGgp 120抗原免疫时，3BNC 117抗体在血清中普遍存在，经YU2.DGgp 120抗原原代免疫后，免疫小鼠GCs中才发现表达IgA亚型的工程细胞。5B)。因为CSR通常先于GC归零25这一趋势与用YU2.DG抗原免疫小鼠的GcB细胞比例较高相一致。值得注意的是，用YU2.DG免疫后，供体细胞中IgA的表达率高于植入前的比率，这意味着抗原诱导的体内CSR(图1)。5B和补充图。7D).

最后，为了评估在体SHM和工程B细胞的克隆扩增，我们使用了一个同义词编码的3BNC 117等位基因，丰富了激活诱导的胞苷脱氨酶(AID，催化SHM)的序列热点(补充图)。8)。工程B细胞在GCs中的积累(附图)8C)和血清中的抗体浓度(附图)。8D，E)在免疫后，无论是将过继转移的B细胞设计成表达3BNC 117-WT.还是重组变异体：3BNC 117-OPT。我们从接受工程细胞的小鼠脾脏中提取RNA，并扩增出bNAb。VHCDNA序列(附图)9A)进行Illumina测序分析。我们找到了克隆扩增的有力证据。在AAV制备和B细胞工程过程中发现了一些突变。26突变在3BNC 117序列上的分布在过继转移和免疫后发生了变化，这意味着体内选择(补充图)。9B)。意料之中，AID序列热点的富集增加了突变序列的总比例(附图)。9C)。SHM和/或体内选择进一步暗示在过继转移时，非同义突变与同义突变的比率降低，然后用YU2.DGgp 120抗原进行质性和增强免疫(如图所示)。5C)。此外，YU2.DGgp 120免疫后的克隆扩展明显，10个最丰富的克隆的相对份额明显增加(图1)。5D和补充图。10A在同一群小鼠中，克隆的选择是相似的(附图)。10b-E)。特别是在10%以上的变异体中发现的三个氨基酸差异分别是CDR 3中的D97Y、FR3/CDR 3中的A89T和CDR 2中的K46R(图1)。5E，补充图。10F)。克隆扩增的K46R和A89T替换是支持他们与多个附加的替换(补充图)。11A-C)在它们各自的老鼠身上。所有这些替换组合都不能在任何其他老鼠身上找到，包括五只通过同一组工程B细胞过继转移的小鼠。这有力地表明了新的SHM。相关的VRC 01和NIH45-46抗体序列中相应的R和T氨基酸的存在进一步支持了K46R和A89T的克隆扩增。27(补充图。10F)。有趣的是，具有较高亲和力抗原YU2.DG的免疫以及增强免疫，会引起更多的氨基酸替换积累(如图所示)。5F)。用THRO 4156.18 gp 120抗原免疫后的有限克隆扩张可能意味着3BNC 117序列中的多个或罕见的替换是必要的，以使与该抗原的亲和力得到充分的改善。

总之，我们已经证明，表达bNAbs的B细胞可以在小鼠体内经历抗原诱导的激活，然后是记忆保留、CSR、SHM和克隆扩张。这一结论得到了一项独立的平行研究的证实，该研究表明，工程B细胞可以作为一种持久和不断发展的战略来保护人类免疫缺损病毒。28。在人类环境中，bNAb SHM可能促进亲和力的成熟，以对抗HIV的多样性和高突变率。此外，病人或供体B细胞可能被设计成表达两个或多个bnAb。14针对不同的病毒表位，进一步降低逃逸的风险。通过将bnb表示为单链和使用更严格防止表达脱离目标集成的无启动子结构，可以提高安全性和效率。29。我们的方法的治疗潜力最好的评估可能是非人类灵长类动物感染艾滋病毒。最后，B细胞工程作为一种平台技术，可以应用于多种持续感染以及先天性疾病、自身免疫性疾病和癌症的治疗。

用于Spca 9切割的crRNA和sgRNA

这份手稿中使用的gRNAs列表出现在补充表中。1。文件补充数据中列出了小鼠J-C igh内含子的另一种spCas9切割位点。1.

质粒克隆

对小鼠供体质粒，从ImProB细胞株中扩增出与小鼠靶gRNA(同源臂)直接相邻的两个内含子序列。片段由内聚变组件插入到pba 270中。29与Nhei和Spei合影。最后，我们将3 BNC 117-WT供体的序列或3 BNC 117-opt供体的序列插入到吉布森聚合体(E 2611，NEB)的XhoI限制性位点上。

对人供体质粒，扩增内含子序列，并将吉布森组装成pAB 270 NheI-Spei限制性片段。人3BNC 117供体DNA序列在XhoI酶切位点整合。

对于无启动子的供者，我们从C57/BL6基因组DNA中扩增出IgM剪接受体，并将Polya-ED启动子盒替换成产物，直接用Furin-GSG-P2A盒。

对于单链供体，我们用先前描述的序列的一个变体替换了两个链编码序列之间的Furin-GSG-P2A。30(补充数据)2).

RAAV生产

在293 t细胞(ATCC CRL-3216)上瞬时转染rAAV-DJ和rAAV-6供体。总之，当pAd5(辅助质粒)、rAAV-DJ或rAAV-6基因组质粒和供体质粒以3：1：1的比例在聚乙烯亚胺(PEI)(24765~1 PolyScience Inc.)中转染时，可转染10-1415个培养皿。共转染41,250 ng DNA。用AAVpro提取试剂盒(6666，Takara)进行纯化，然后用SYBRGreen(4309155，热Fisher或PB20.12 PCRBiossystems)进行定量。

细胞株

细胞株，ImProB15，A-2031、Ramos和I.29IgA32在Neon电穿孔系统(Invitrogen)中，用18.3pmolCas9和22 pmolgRNA在OptiMEM(31985~047，GIBCO)中用1.0E5细胞/μ1进行电穿孔。人类细胞系的参数为：1350 v 30 ms 1脉冲，小鼠细胞1600v 20 ms，1脉冲。所有细胞系在1640 RPMI(01-1001A，生物产业)中添加10%的HI FBS(04-127-1A，生物产业)，50μMβ-巯基乙醇和P/S(03-031-1B，生物工业)。分别用50,000 moi的rAAV-DJ和130,000 moi的rAAV-DJ分别对小鼠细胞株和人细胞系进行了RAAV-DJ基因的转导。电穿孔后3d测定编辑效率。

质粒电穿孔采用3g质粒DNA/1E06细胞/10μl霓虹灯尖。

拉莫斯细胞系(ATCC CRL-1596)由特拉维夫大学本哈尔实验室提供。I.29细胞系由特拉维夫大学赞巴实验室提供。ImProB细胞系由巴斯德研究所德里亚诺实验室提供。A-20细胞系是商业提供的(ATCC，TiB-208)。

原始人类文化

对于人类细胞，根据特拉维夫大学审查委员会的规定，经以色列血库(MagenDavidAdom，Sheiba医疗中心)同意获得全血，用淋巴细胞分离培养基(0850494-CF，MPBIO)提取PBMCs。红细胞裂解(420301，Biolegend)。B细胞用负选择Easysep人B细胞分离试剂盒(17954，Stemcell)富集，在1640个RPMI(01-100-1A，生物工业)中添加10%HI FBS(04-127-1A，生物工业)，50μMβ-巯基乙醇，P/S(03-031-1B，生物工业)，2μg/ml RP 105(312907，Biolegend)和10 ng/mlIL 7(200-07，PeproTech)。

对人原代细胞，电穿孔参数为：1 750 v 2 0 mS 1脉冲在Neon电穿孔系统(Invitrogen)中，用10μ1 TIPS在缓冲液R中以4.0E5/μ1为单位。对于rNP，每1E06细胞分别转染18.3 pmolCas9和66 pmolgRNA，在转染前20 min产生复合物组装，其中Cas9(1081059，idt)和gRNA(GRNA)。在电穿孔后不迟于5 min用10,000 moi的rAAV-6进行换能器。电穿孔后2天测定编辑效率。

原代小鼠培养

对于小鼠细胞，从供体(CD 45.1)小鼠中提取全脾，机械地压碎，在70μm细胞滤器(Corning)中过滤。红细胞裂解(420301，Biolegend)后，在1640年的RPMI(01-100-1A，生物工业)中，在3.0E6细胞/ml的条件下，加入10%的HI FBS(04-127-1A，生物工业)，50μMβ-巯基乙醇，P/S(03-031-1B，生物工业)，10μg/ml LPS(sc-3535，SantaCruz生物技术)和10 ng/mlIL4(214~14，PeproTech)。

细胞培养16~24h，转染前在PBS中洗净，电穿孔后8~16h，在相同的活化培养基中进行电穿孔，不含P/S。缓冲液R中4.0E5细胞/μ1，10μ1时，参数为1350 v，30 ms 1脉冲。对于rNP：每1E06细胞分别转染18.3 pmolCas9和38 pmolgRNA，在转染前20 min产生Cas9(1081059，IDT)和gRNA(GRNA)复合物。在50,000 mI的rAAV-DJ电穿孔后5 min内进行细胞转移，并于电穿孔后2天对细胞进行分析。为了与cd40lb供体共培养，我们按照前面描述的方法播种了脾淋巴细胞。17.

流式细胞术

从受体(CD 45.2)小鼠的样品，细胞在提取后立即染色。样品经洗涤后再悬浮于细胞染色缓冲液(420201，Biolegend)中。加入抗体，室温下在黑暗中孵育20 min进行结合。然后，样品被清洗并重新悬浮在染色缓冲液中，然后在AttuneNXT(生命技术)流式细胞仪中阅读。间接流式细胞术：用1g YU2.DGgp 120抗原孵育5 min，100 l加入DGgp 120抗原，100μl加入洗涤结合抗体15 min，再进行洗涤和采集。

为评估ERK磷酸化程度，将细胞在37℃下孵育3 min，再加入5 g YU2.DGgp 120抗原，在37℃下孵育3 min，再孵育1 min，立即加冰，用冰凉1：1 metoh：丙酮稀释10倍，在−20°C孵育20 min后，按上述方法对细胞进行洗涤和染色。

存活染色采用碘化丙啶(00~6990~50，eBioscience)。

在IgK消融的评估中，我们使用了(Eq)。(1)).

ERK磷酸化被评估为先前所描述的。33。总之，以200万个细胞/ml的浓度洗涤和再悬浮于PBS中，细胞在37℃下孵育3 min，再加入5克YU2.DGgp 120抗原，再孵育1分钟，立即放入冰中，用甲酚稀释1倍，在−20°C下孵育15 min后染色。

对所有抗体进行1：100稀释染色。所有实验的预选可以在附图中找到.12。数据用KaluzaAnalysis2.1(贝克曼库尔特)编制和分析。使用的抗体清单可在补充表中找到2.

ELISA法

用5μg/ml抗3 BNC 117抗体或2μg/ml YU2DGgp 120抗原包被高结合微板(Greiner Bio-One)。然后将检测抗体、抗鼠IgA(ABCAM)、抗鼠IgG 1或抗鼠IgM(杰克逊免疫研究)以2μg/ml接种于平板上，孵育2h，可在补充表中找到使用的抗体清单。2。根据制造商协议，在用全塔Blu(15169，热费雪)检测之前，需要再清洗一轮。检测是在协同M1板块阅读器(Biotek)进行的。当提出绝对定量时，参照标准曲线的稀释系数测定3BNC 117的浓度。

从THRO 4156克隆18 SVPB 15(从GenBankAY 835448获得的数据)中克隆gp 120 Env蛋白。先前曾描述过YU2.DGgp 120载体34(在人CD5序列下表达，C端标记为His-标记(6×))。将编码gp 120的质粒转染到Expi293F细胞(由特拉维夫大学葡萄酒实验室提供)，用ExpiFectamine(热Fisher)转染ExpiFectamine(热Fisher)，浓度为2E6细胞/ml。7天后收集上清液，在20 mm磷酸钠、0.5M NaCl、10 mm咪唑(ID)中与Ni-NTA琼脂糖(30210，琼脂)结合。在重力流聚丙烯柱(Biorad)上安装之前，用相同的缓冲器清洗两次珠子.色谱洗脱分为5 0、10 0和2 0 0mm ID，在0.2 2μm过滤单元(MILLEX)过滤后，用AmonUltra-15离心过滤单元(MOCK)将Elutes缓冲液交换到PBS上。

对于3BNC 117和抗独特型抗体，分别将轻链质粒7.5g和重链质粒22.5g共转染Expi293F细胞，浓度为2.0E6细胞/ml，用ExpiFectamine(A 14525，热Fisher)作为表达培养基。转染后7天，用MabSelect(GE Healthcare)对上清液进行纯化，遵循制造商的建议。

小鼠实验

所有小鼠实验都是在特拉维夫大学实验动物使用和治疗委员会的批准下完成的。6~10周龄雌性CD 45.1或CD 45.2C57BL/6JOlaHsd小鼠，在环境温度19~23°C，湿度45-65%，光照12h/12h暗周期。

以1.5~2.2M细胞/鼠为单位，在100μ1 mg条件下，将工程脾B细胞移植到受体(CD 45.2)小鼠(Envigo)体内。+2钙+2添加5%马血清的PBS。转移前分别以0.1mg/g氯胺酮和0.01mg/g Xylazine麻醉小鼠。移植细胞数为112,500 gp 120结合细胞，输注前用流式细胞仪测定细胞比例。细胞在模拟细胞中稀释(在没有gRNA的情况下电穿孔，然后在需要时进行转导)，并在TC-20自动细胞计数器(Biorad)中计数。PBS中gp 120(200μg/ml，100μg/20 g/鼠)按1：1的比例与Alhygel 2%(vac-alu-250，Invitrogen)混合，腹腔注射。接受非工程细胞的小鼠接受1.5M细胞/鼠过继转移。接受工程细胞但未免疫的小鼠接受PBS注射，其比例为1：1，与水凝胶混合。

用肝素晚期出血法采集血样。用反复光离心法提取不同小鼠血清，收集上清液，直至未发现红细胞。

核酸操纵

用QuickRNA微准备试剂盒(Zymo Research)提取总RNA，在转染CRISPR-RNPs和AAV转导后3天，对2E06细胞进行反转录。未转染gRNA的细胞作为对照。提取RNA 500~1500 ng，分别用M-MLV(M170A，Promega)或Revertaid(K 1621，热Fisher)逆转录酶与寡糖DT进行RT反应。在RT反应后，用Maxima HotStart GreenMix在35个周期内进行PCR反应。用于扩增的引物清单列于补充表中。3.

为评估gRNA的活性，采用快速DNA迷你准备试剂盒(Zymo Research)提取基因组DNA，用PrimeStar MAX(R045A，Takara)扩增出300-500 ng基因组DNA，周期为30-35个周期。用于这些反应的引物列在补充表中。4。在37°C下，用T7内切酶1(NewEngland Biolabs)裂解30 min，在热循环器中对扩增产物DNA进行变性和再退火。蛋白酶K加入到反应中，37℃下再孵育15 min，琼脂糖凝胶电泳分析裂解，生物视觉(Vilber Lourmat)用滚动球进行背景减法定量。用(Eq)计算效率。(2)).

为评估HDR介导的整合作用，对转染后2天提取的基因组DNA进行PCR。用于扩增的引物清单列于补充表中。5.

琼脂糖(Hy-labs)添加到40 mm Tris，20 mm醋酸，1mm EDTA中，终浓度为1~2%.凝胶在160 V下运行20~30 min.采用100 bp的DNA梯子H3 RTU或1kb的DNA梯状RTU(GeneDireX)。

为了排除内源性转录体的剪接，我们从原代小鼠脾细胞中提取RNA。利用Revertaid逆转录酶(K 1621，热Fisher)进行cDNA扩增。用HS Taq红(PB10.23-02，PCRBIO)和补充表中列出的引物进行了35个周期的PCR扩增。6.

非目标分析是使用COSMID进行的。35在附加表中列出了用于扩增的默认参数和引物7.

CAS-OFFinder36用于>3失配目标分析。用Benchling方法测定人IgHJ-C位点中附加的gRNA切割位点(补充数据)。1)。对来自两个只电穿孔细胞(−gRNA)或来自Cas9和gRNA电穿孔细胞(+gRNA)的PCR扩增产物进行了分析。

光照序列分析

从小鼠中提取整个脾脏，机械地压碎，然后在70μm细胞过滤器(Corning)中过滤。该制剂经红细胞裂解(401301，Biolegend)。以Revertaid逆转录酶(K 1621，热Fisher)为模板，利用Oligo-DT引物，从快速RNA微预防(Zymo)中提取脾淋巴细胞总RNA。初步PCR扩增，用PrimeStarMAX聚合酶(R045A，Takara)扩增3BNC 117.W.T.VH片段，共40个周期。用AMPureXP微珠(A 63881，贝克曼库尔特)按0.7：1的比例纯化扩增产物。随后用PrimeStarMax聚合酶(R045A，Takara)进行8个周期的PCR反应。用于这些反应的引物清单列在补充表中。8.

利用AMPureXP微珠按0.7：1的比例纯化文库。在下午5点加载组合库，使用25%的PhiX控件(FC-110-3001，Illumina)。在一台高通量MiSeq机上，使用V2 Nano试剂试剂盒2×250 bp或V3试剂试剂盒2×300 bp(MS-102-3003和MS-103-1003，Illumina)在特拉维夫大学生命科学学院基因组研究单元(GRU)进行测序。原始的FASTQ文件被提交给短读的快速长度调整(FLASH)37并将结果成对的Fasta文件提交给国际免疫遗传学数据库(IMGT)提供的V基因序列比对和生殖系基因分配的高VQuest文件。38。IMGT对齐序列由一系列质量控制过滤器进行处理。氨基酸分析包括：去除截短序列、含有终止密码子的序列和与原3BNC 117序列的相似性小于95%的序列。对于核酸和氨基酸序列，我们修剪了5‘和3’端，以减少测序偏差(附图)。10F)。对于核酸分析，我们保留了非生产性序列，但删除了高INDEL计数序列。在极性分析中，我们总结了突变序列中前十位克隆的频率。在分析同义突变和非同义突变时，我们使用了39Needleman-Wunsch算法对齐突变体的比对实现VH具有VH3BNC 117-OPT序列。

对于N-Syn/Syn比，我们使用了(Eq)。(3)).

哪里α序列中的非同义突变数，γ是序列的频率β是该序列中同义突变的数目。

团簇欧米茄40用于树木构造(附图)。11A)。序列比对是通过Snapgene v5.0.7进行的。

免疫荧光染色

幻灯片的编写如前所述41。总之，提取的组织被浸泡在4%的PFA中，然后被浸泡在20%的蔗糖中。冷冻保存于O.C.T(SCIgen)。阻断后，用APC-共轭抗鼠CD3(100235，Biolegend)、PE-共轭抗鼠/人B 220(103207，Biolegend)和FITC-共轭抗鼠CD 45.1(110705，Biolegend)染色。使用的抗体清单可在补充表中找到2.

统计分析

使用GraphPad棱镜8进行统计分析。p-具有双向或三向方差或两个尾部学生的数值t-测试。一个样本t-通过设定体外对照的期望值进行试验。在方差分析中，图基或邓尼特的多重比较按指示进行。