疫苗对工程B细胞HIV广泛中和抗体的诱导作用

HIV广泛中和抗体(BNAbs)可以抑制病毒血症，防止HIV感染。然而，由于合适的前体B细胞受体的低频率以及从这些前体产生bNAb所需的复杂成熟途径，使其难以激发。抗体基因可以在B细胞中作为功能抗原受体在细胞表面表达，也可以作为分泌抗体在B细胞中表达。在这里，我们证明hIVbNab工程的原代小鼠B细胞可以在免疫能力强的小鼠中被过继转移和接种，从而使bNab记忆和长寿命的浆细胞得以扩展。免疫后的体细胞高突变表明，工程细胞有能力对进化的病原体作出反应。这些结果鼓励进一步探索工程B细胞疫苗作为持久激发HIV bNAb的一种策略，以防止感染，并作为一种功能性艾滋病毒治疗的贡献者。

对设计一种能产生广泛中和抗体(Bnbs)的hiv疫苗的关键支持来自于实验，这些实验表明，这种抗体能够在猕猴和人源化小鼠模型中提供对临床相关(所谓的二级)病毒挑战的绝育免疫。1,2,3。然而，人类B细胞抗原受体(BCRs)的遗传限制(必须从BCRs中产生)却严重阻碍了这些努力。在慢性感染患者中发现的各种bNAb的特征表明，它们通常来源于具有不寻常抗原受体特征的B细胞前体，例如长第三重链互补决定区(CDRH3s)，然后需要广泛的体细胞高度突变以促进广泛的中和。3,4。成熟的hIVbNAb和其他理想的抗体基因可以直接加入到体外激活的原代B细胞的基因组中，利用内源性hc常量基因作为功能bcrs表达。5,6,7。因此，工程BCRs可以进行类别切换，最终作为从浆细胞分泌的保护性抗体。以这种方式设计的B细胞已被证明能在体内赋予病原体特异性抗体的保护性水平，这是继过继转移到免疫缺陷小鼠后的几个星期。7，或转入免疫活性野生型(WT)小鼠后数天。6,7。疫苗从免疫能力强的宿主中的工程B细胞中激发持久的hiv bNab反应将是功能性HIV治疗的一个有吸引力的贡献者，因为在感染背景下被动使用bNAbs已被证明可以抑制病毒血症，杀死受感染的细胞，并增强宿主的免疫力。8,9,10。在此，我们发现hIVbNab工程的原代B细胞可以通过疫苗在体内扩增和亲合成熟，从而在野生型小鼠中产生持久的bNab记忆和长寿命的浆细胞。

修饰原代B细胞作为抗原受体表达HIV VRC 01 bNab

野生型(WT)c57bl/6j(或b6)小鼠由于小鼠和人类体液免疫系统的相似之处，是探索从工程细胞中激发hIVbNAb疫苗的有用模型，也是因为这类bnbs不能从自然循环中获得。11,12,13。因此，我们开发了将VRC 01 HIV bNab敲入成熟的原代C57BL/6J B细胞的方法。我们之所以选择vrc 01，是因为pd4受体结合位点bNab作为一种重组单克隆抗体，在临床上已被广泛测试，因为它具有抑制病人病毒血症和预防感染的能力。14,15,16(ClinicalTrials.gov NCT 02568215，NCT 02716675)。在我们的第一个基因组编辑策略中，供体dna携带一个V基因启动子vrc 01 hiv bNab。17,18将轻链(Lc)、hc可变区(Vdj)和恒定基因剪接供体位点引入crispr-ca 9 dna断裂位点。IgH-J4在活化细胞中使用同源定向修复(HDR)的基因。在这里，插入的vrc 01基因是从单个mRNA中表达的，转录剪接到下游内源。IgH恒定的基因。Vrc 01小鼠kappa(κ)常数基因下游的P2A自切割肽序列分离了光和hcs，使它们能够配对形成一个功能细胞表面表达的bcr(H-目标)(图1.1A)。在第二个工程策略中，vrc 01重链区和κ可变区分别针对其内源性基因位点，将V-基因启动子控制的转录子剪接到细胞原生H或κ常数基因上。H + κ靶向)(图1.1B)。使用hvc 01的基于包膜糖蛋白的流式细胞仪探针对原代B细胞的靶向成功进行了监测：eOD-gt8是gp 120的一个“工程外域”，它呈现CD4结合位点，并具有KD=16 pm与vrc 01的单价亲和力；ko 11带有一个氨基酸替换，从而破坏vrc 01的结合。19,20。瞄准H或H + κ用电穿孔法将质粒供体DNA和CRISPR-Cas9核蛋白(RNP)导入LPS激活细胞时，常规策略的工程效率分别为10%和1%。1C，补充图。1)。而腺相关病毒(AAV)载体供体DNA经RNP电穿孔后导入细胞，毒性较小(附图)。1)，我们更倾向于质粒捐赠者，因为它的靶向效率是相当的，因为这种格式允许快速和廉价地开发大量供测试用的供体DNA。切削效率IgH-J4和IgK-J5经潮汐分析，RNPs分别为80%和55%。21(补充图。1B)。这些DNA断裂的非目标修复要么是惰性的，要么产生bcr基因敲除，从而导致细胞凋亡。小鼠12和6号染色体端粒末端的易位(涉及在H + k(靶向细胞)也会导致bcr表达丧失和细胞凋亡。

体外靶向B细胞在体内恢复自我耐受记忆

这些工程策略可导致自反应性bcrs的表达，这是由于工程的ig链与目标细胞产生的内源性基因配对所致。5,6,7。尤其是对于H-目标在至少34%的VRC 01表达细胞表面呈现自然LCS的细胞(补充图)。2A)。而小鼠和人类周围的耐受机制通常确保自身反应的B细胞不起作用。22,23,24,25我们试图确保这仍然是工程B细胞的情况，它需要体内外脂多糖(LPS)激活步骤，以实现高效的基于HDR的基因组编辑。因此，我们将未接触或体内外的脂多糖激活的B细胞转移到在肝细胞表面表达igκ链反应超抗原的转基因小鼠(palb小鼠)中。26。在这种情况下，所有捐助者Igκ+B细胞是自反应性的。在此寄主28天后，无论是未接触还是脂多糖激活的igκ。+细胞被删除，这意味着在工程过程中产生的自反应B细胞在体内仍应受制于外周耐受机制(附图)。2B，c).

用阴性选择法从WT供体小鼠脾脏中分离纯化的B细胞，用LPS激活，靶向，14d后转入WT受体，进行体内状态评估。直接转移到对照组小鼠的未接触供者B细胞具有低频率的记忆B细胞(MBCs)，而70-80%的体外靶向细胞获得了独立的生发中心(CD 73)。−)记忆表型27,28(无花果)1D-f，补充图。3)。在体内14天后产生记忆的偶然效应，是体内外LPS激活基因组编辑的结果，这表明工程B细胞在这个时候应该为疫苗接种做好准备。

免疫可从H靶细胞中获得持久的vrc 01血清效价。

在使用H或H + κ采用工程策略，将40,000只VRC 01 BCR表达细胞移植到WT受体小鼠体内.这相当于体内滞留14天后10万个B细胞中的~3(补充图)。3B)。有两个模拟目标的老鼠，H + K靶向，或H-目标B细胞在细胞转移后14天用MD 39-铁蛋白(MD 39-ferritin)作为启动剂，这是一种可溶性的稳定的HIV包膜，本征三聚体以多价形式呈现在铁蛋白基纳米颗粒上。MD39与vrc 01具有单聚亲和力KD=124海里29,30。6周后(W6)，小鼠体重增加。三只老鼠H-目标一项长期研究所涉及的细胞在第13周和第32周后进一步增强(如图所示)。2A)。用ELISA法和病毒中和法检测血清中总抗原特异性抗体和工程抗体反应。接受模拟工程或H + κ靶向细胞产生最低的总抗原特异性和VRC 01竞争性抗体反应。小鼠H-目标第一次刺激后一周，细胞的总抗原特异性滴度平均提高了10倍，同时血清中的VRC 01竞争抗体水平也明显升高(图一)。2B，c)。由于vrc 01-竞争性抗体反应可在有模拟靶细胞的对照小鼠中产生，所以vrc 01在含有rrc 01的小鼠血清中可引起。H-目标用P2A酶联免疫吸附法(P2A ELISA)对细胞进行检测，因为从这些细胞中表达的VRC 01κ链在C端用P2A自裂解肽标记。小白鼠H-目标细胞在每次刺激后产生P2A滴度(如图所示)。二维空间，补充图。4)。最高应答者(H-6)，在第三次刺激后一周血清中产生~2.4mg/ml的VRC 01，用重组LC P2A标记的VRC 01小鼠IgG 1标准计算。2E，补充图。4)。从这些小鼠血清中纯化的IgG还显示vrc 01样中和来自不同类型的带有典型循环病毒标记的假病毒，例如相对中和抗性。31(无花果)2F，补充图。5)。利用重组LC P2A标记的VRC 01小鼠IgG 1标准，对一株对VRC 01中和特别敏感的病毒株(BG505-N276A)，用IC 50对该假病毒进行定量，将其作为应答小鼠血清总IgG的一部分进行定量。在最佳应答者(H-6)中，即使在休息5个月后(W32)，血清VRC 01仍占总IgG的0.15%，在第三次增强后1周，这一比例提高到总IgG的10%(如图1所示)。2G，补充图。5)。我们的结论是H-目标工程B细胞能在免疫活性B6小鼠模型中产生持久的记忆和血清抗体。需要进一步调查以了解为什么H + κ靶向细胞对疫苗没有反应。

免疫后的VRC01-B细胞成熟成依赖于GC的记忆细胞和浆细胞。

与血清分析一致的是，第一次升压两周后，只有小鼠接受了。H-目标细胞表现出高频率的VRC 01工程GC B细胞(图一)。3A-c脾和骨髓浆细胞。3D，e)和MCs(图1.3F)。这组小鼠的基因工程细胞在鼎盛期和升压期扩大了20至70倍(如图所示)。第三代)和vrc 01-表达记忆(GT 8)++、KO11−，捐献者+)细胞主要变成CD 73+，这意味着他们在接种疫苗后进入GCs，不像GT8。−保留CD 73的供体细胞−LPS治疗后(如图所示)。3H，I).

重复实验和原协议的变异也成功地激发了其他组小鼠的VRC 01记忆反应。H-目标单元(补充表)1)。变异包括：(1)转移前仅富集抗原特异性工程细胞；(2)用CD40L、IL-4和其他MyD 88诱导剂如CpG DNA(而不是LPS)体外激活B细胞；(3)通过预先存在的免疫原特异性T细胞帮助将工程细胞接种到小鼠体内，以及(4)使用不同佐剂进行免疫接种。

疫苗接种后vrc 01基因的编码突变被选择。

对几只小鼠脾脏(记忆)和骨髓(长寿命浆细胞)的工程免疫球蛋白基因序列进行了序列分析。H-目标细胞在最终升华35天后。序列大部分保存了原始的VRC 01氨基酸序列，但存在丰富的编码变异，包括在记忆室中出现的一些高度变异的谱系(图1)。4A)。工程细胞转移时主要为IgM，接种后的VRC 01细胞几乎完全改变了类，IgG 1和IgG 2亚型如预期一样占主导地位(图1)。4A，b)。免疫后工程库中IgM和IgG 3的突变较少，而所有其他亚型的大部分序列均发生突变，部分IgG 1序列与原供体DNA序列的差异高达4%(图二)。4B，补充图。6)。在基因工程的VRC 01 LC和HC可变区，特别是在κ常量基因中，可以观察到编码突变，这通常不在突变体的路径上(图1)。4C，补充图。7A)。结构模型显示，这些κ常数突变主要发生在与免疫球蛋白折叠的β链相连的溶剂暴露环中，并且在功能上是无害的(补充图)。7b)。P2A肽的编码变化明显缺失，因为这个序列必须高度保守，才能在工程细胞中表达功能性bcr。在不同的空间和动物之间可以观察到相同的突变，一些编码变化似乎在同一动物体内的一个隔间而另一个室中富集(如图所示)。4C)。Vrc 01的hcdr 2区，形成了该抗体与病毒的主要相互作用面。17，疫苗接种后出现编码变化(图二)。4D)表明工程反应在抗原结合特异性上产生一定的变异，有利于抵御高度多样的病毒库，证实了工程B细胞进行体细胞突变和亲和力成熟的能力。

在第一次抗体活性展示中，贝林和北斗在1890年表明，免疫小鼠的血清可以保护天真小鼠免受白喉和破伤风毒素的致命攻击。我们在这里展示，在Nahmed等人的补充研究中。32可以被动地将遗传信息传递到适应性免疫系统，从而促进高亲和力、高度进化和进一步进化的HIV bNab反应--这实际上证明了一个人可以编程免疫记忆。因此，我们认为，我们的研究代表了被动免疫发展的一个新阶段，从抗体本身的发现开始。

细胞培养

从美国型培养物(ATCC，#CRL-3216)中获得293 T细胞，培养于含10%胎牛血清(Invitrogen，#26140-079)、2mm L-谷氨酰胺(Invitrogen，#2503008)、100单位青霉素和0.1mg/ml链霉菌素(Invittomycin，#15140122)的DMEM(Invitrogen，#10313021)中。从美国国立卫生研究院(NIH)艾滋病试剂项目(#8129)中获得TZM-bl细胞，在DMEM中添加10%的FBS、100单位的青霉素和0.1mg/ml的链霉素。从LifeTechnologies(#R 79007)获得™293 F细胞，在自由式™293表达培养基(LifeTechnologies，#12338018)中培养。化学活性DH5a大肠杆菌质粒繁殖来源于NEB(#C2987H)。

小鼠

根据向斯克里普斯研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)提供的协议(La Jolla，CA)批准并进行了小鼠研究，批准号为18-0004。这些老鼠按照“动物福利法”和其他有关动物的联邦法规和条例，按照“保护和使用实验动物指南”(国家研究委员会，1996年)，在斯克里普斯饲养、免疫和流血。所有实验均在野生型或pAlb 3月龄雌性C57BL/6J(CD 45.1/Ly5.1或CD 45.2/Ly5.2)动物资源设施Scripps研究室(DAR)中进行。在12小时的光循环中，小鼠被安置在环境温度和湿度下。不超过5只或少于2只小鼠被安置在一起。所有手术均用异氟醚麻醉动物。

Cas9-RNP选择

靶向于IgH-J4和IgK-J5参考C57BL/6J基因组区(GRCm 38)用GPP工具(Https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)。用IDT法合成gRNAs。CRISPR-Cas9tracrRNA和HiFi Cas9核酸酶V3购自IDT(#1072534，#1081061)。CrRNA：tracrRNA复合物是根据制造商的指示制造的。用vrc 01工程效率直接评价不同gRNAs在LPS激活的原代B-细胞中的靶向性(如下所述)，并筛选出最佳的gRNAs。IgH-J4和伊格克-J5目标。以RNPs的形式将单个gRNA转染到细胞中，以此评价单个gRNA的靶向性。培养48h后，纯化gDNA(前5‘)，并扩增目标切割位点(H靶PCR引物：前5’)。-Tcttggggacaccaggaattggcat-3‘，反向5’-ccccagccataggattatagca-3‘。目标PCR引物：正向5‘-cttgtggtgacattttct-3’，反向：5‘-acgctagaagacacccctacctca-3’)。用正向和反向引物(H靶序列引物：For 5‘)对PCR产物进行纯化(齐根，28004)和Sanger序列测定(Eton生物科学)。-3‘，反向5’-cccatccacggactccaccaaca-3‘。K目的序列引物：正向5‘-agaagagtagtgaaagctgagcga-3’，反向：5‘-ttcccgatccatctcttggatggtg-3’)。根据发展商的指示，色谱图已上载到潮汐中，以便进行INDEL分析(Http://shinyapps.datacurators.nl/tide/)21.

HIVbNab供体DNA制备

H-靶向vrc 01供体dna从5‘到3’设计如下：(1)小鼠上游的498碱基(Bp)同源性臂。IgH-J4(在种系结构中)。(2)小鼠IgHV 1−82HC启动子区(整个5‘-UTR)。(3)小鼠IgKV 4-53先导(内含子去除)和人VRC 01轻链可变基因，其次为小鼠κ恒定区，无终止密码子。(4)GSG连接子，其次为P2A自切肽序列。(5)小鼠IgHV 1−82先导缺乏内含子，其次是人VRC 01重链可变基因和恒定的基因供体剪接位点。(6)与IgH-J4内含子开始后JH4。从B6gDNA中扩增出同源区和V基因启动子。合成了VRC 01 LC-P2A-HCVDJ基因(Geneart)。H + κ针对供体质粒的设计如下：H-目标通过删除LC和P2A肽，并加入IgHV1-82内含子，对质粒进行修饰。LC供体DNA从5‘到3’设计如下：(1)小鼠上游510 bp同源性臂。IgK-J5；(2)小鼠IgKV 4-53LC启动子(全5‘UTR)、先导和V基因内含子；(3)vrc 01 vj和恒定基因供体剪接位点(4)Jκ5。所有片段都是根据制造商的指示使用吉布森组装(neb，#E5510S)组装成由IDT合成的PICOZ(pMID：31124712)载体载体，并转化为DH5a。大肠杆菌。(Neb，C2987H)。从含Zeocin琼脂上的细菌中培养单个菌落，用几个引物分离质粒(齐根，#27106)和测序(EtonBioscience)，获得高质量的供体DNA覆盖范围。供体DNA质粒用无内皮质粒maxi试剂盒(齐根，#12362)纯化，用于工程实验。

B细胞活化与工程

所有工作均在无菌条件下进行。用阴性选择法(Miltenyi，#130-090-862)从CD 45.1或CD 45.2同型小鼠脾脏分离B-细胞，分别在RPMI-1640(Invitrogen，#21870076)中添加1xNEAA(Invitrogen，#11140050)，1x丙酮酸钠(Invitrogen，#11360070)，55μM2-Me(Invitrogen，#21985023)，10%FBS(Invitrogen，#26140-079)，或(1)50μg/ml LPS(mA，#L2880-100mg)，或(2)CpGODN 2006，1μ(从IDT合成)，IL-4浓度为50 ng/ml(Biolegend，#574306)，抗CD 40浓度为5μg/ml(Thermo，#16-0401-86)，作用30 h，用Alt-R CRISPR-Cas9系统组分按制造商的指示制备Cas9-RNP复合物。GRNA序列H或κ目标分别为5‘-gagaggccattcttacctg-3’和5‘-ttacgtttcagctccagct-3’。活化细胞用1xDPBS(Invitrogen，#14190-144)冲洗3次，在NeonR缓冲液(Invitrogen，#MPK 10096)中以500万细胞/100μ1再悬浮。为H-目标，5μlH-目标将CAS9-RNP复合物、2.16μl 100μM CRISPR电穿孔增强剂和20μg供体DNA(4μ1)混合加入再悬浮细胞中。为H + κ-目标，每个5μlH-和κ-以Cas9-RNP复合物为靶标，将4.32μl 100μM CRISPR电穿孔增强剂和15μg的HC和LC供体DNA混合加入再悬浮细胞中。用1 0 0μl尖端(Invitrogen，MPK 10 0 96)电穿孔细胞，电压16 5 0V，20 ms，1次脉冲。核细胞在不含抗生素或细胞活化成分的培养基中培养1h，再加入这些成分进行体外培养。当供体DNA以AAV的形式导入细胞时，VRC 01 AAV 2供体用相同的载体生物标记产生。H-目标设计采用。在10μl rpmi-1640无血清培养基中，细胞浓度为100万，在摩尔浓度为2×10的条件下，与等体积aAV混合。5如上文所述，电穿孔1小时。

工程细胞过继转移

转染后18小时，激活的模拟细胞或工程细胞用DPBS(Invitrogen，#14190-144)冲洗四次，将其过继转移到受体小鼠体内。部分细胞经48 h流式细胞仪进一步培养，以确定成功靶向细胞的数量。Vrc 01基因工程B细胞经染色鉴定(碘化丙酸丙啶阴性)，EOD-GT8。+、EOD-GT8-KO11−细胞。在一些实验中(表)沙一)，在转染18-h后，fcs对转染成功的靶细胞进行门控，gt 8。++KO11−人口。为制备EOD-GT8探针，将1.1μg生物素化GT8-单体(用EZ链NHS-生物素进行生物素化)与0.88μg链霉亲和素-488/6 4 7混合。

休息细胞免疫

四百万H + κ靶向VRC 01细胞或100万细胞H-目标将VRC 01细胞(相当于40,000种表达VRC 01的基因工程细胞)转入受体小鼠。用2 0 0μ1混合20μg免疫原和Ribi佐剂(按照制造商的指示，S6 32 2-1VL)或5μg的IscoMPLA(由麻省理工学院达雷尔实验室提供)免疫14天。注射。启动后6周、13周和32周用相同的免疫原刺激小鼠。在图中所示的时间间隔内，通过小鼠眼出血采集血清样本。2。所有程序均在异氟醚麻醉小鼠上进行。

T细胞免疫

受体小鼠为I.P。2 0 0μ1混合10μg的鲁米嗪合酶或铁蛋白碱在DPBS和Ribi佐剂中免疫。7天后，将含有65,000种VRC 01基因工程细胞的靶向细胞转入预启动宿主小鼠。用20μg EOD-GT8-60分子免疫鲁曼津合成酶预启动小鼠，同时给予铁蛋白预启动小鼠20μg MD 39-铁蛋白免疫原。对于FACS富集组，按照相同的T-启动免疫方式，将300,000个分类抗原特异性细胞转移到受体小鼠体内。所有程序均在异氟醚麻醉小鼠上进行。

流式细胞术分析和单细胞分类

脾悬液是通过粉碎结霜玻璃玻片间的脾脏而产生的。骨髓是从没有组织的胫骨和股骨中释放出来的。用氯化铵(0.83%)溶解红细胞，再用40μM细胞过滤器过滤细胞产生单细胞悬液。在单细胞悬液中加入fc阻断剂(国产mAb 2.4g2)，浓度为0.5μ/10。6抗体染色前的细胞。抗原特异性分析：生物素化氨基转移酶GT8单体与链霉亲和素-AF 488(Thermo，S 32354)或链霉亲和素-AF 647(Thermo，S 32357)预络合30 min，GT8-KO11与链霉亲和素-BV 421(BD，BDB563259)络合。荧光载体-CD45.1(Biolegend，#110728)，CD 45.2(Biolegend，#109806)，GL7(Biolegend，#144608，#144610)TCRb(Biolegend，#109228)，F4/80(Biolegend，#123128)，Ter119(Biolegend，#116228)，CD 38(Biolegend，#102718)，IGD(Biolegend，#405710)，IgM(Biolegend，#406512)，IgG 1(Biolegend，#406620)，CD 138(Biolegend，#1425)，-1(6A/E)用CD 19(Biolegend，#152408)、CD 80(Biolegend，#104712)、CD 73(Biolegend，#127210)、PD-L2(Biolegend，#107216)、抗鼠Kappa(克隆187.1 AF647)、抗小鼠Lambda(Biolegend，#407306)定义不同的细胞群体。CD 45.1和CD 45.2mAb用于区分宿主和转移的B细胞。用IgG 1染色鉴定B细胞.Vrc 01表达记忆细胞(MCs)作为GT 8活细胞。+KO11−CD 19+CD 38高SIgD−GL7−生发中心(GC)B-细胞作为CD 19活细胞。+CD 38−GL7+血浆细胞(Pc)为CD 138门控。+SCA 1+TCRB−T 119−SIgD−西格姆−GL7−F4/80−用GT 8、KO11和IgG 1探针进行细胞内染色。抗体染色均稀释100×入细胞样品。细胞用LSRⅡ(BD生物科学)、极光(Cytek)进行分析，或在Scripps流动核心用BD FACSAria(BD生物科学)进行分类。用FlowJov10.7分析所有流式细胞仪数据并生成图形。

等位基因包裹体

用人κ常数链检测内源性lcs在rrc 01+细胞和敲入小鼠B细胞中的表达33使用H-目标战略。在单细胞悬液中加入fc(自制mAb 2.4g2)，浓度为0.5 mg/10。6抗体染色前的细胞。用抗鼠Kappa(BD，#561353)、抗人Kappa(Biolegend，#316506)、抗鼠Lambda(Biolegend，#407308)、EOD-GT8-AF 647四分仪对工程B细胞进行染色，并进行流式细胞仪分析。

外周公差

用阴性选择法(Miltenyi，130-090-862)从CD 45.2同型小鼠脾中分离出800万个B细胞，于第0天直接或在体外LPS激活24h后转入CD 45.1、pAlb和WT受体小鼠。在过继转移前，用AF 647标记的抗-κ抗体(国产)流式细胞术检测B细胞携带κLC的频率。分别于移植后第1、8、15、28天分析受体小鼠脾B细胞CD 45.2(供体)的κ频率。

总应答ELISA

384-well ELISA平板(Corning，#3700)最初包被12.4μl/孔链霉亲和素(Jackson免疫研究实验室，#016-000-084)，在pBS中稀释2μg/ml，在4℃下孵育一夜。用含0.0 5%吐温(PBS-T)的1 0 0μl/孔PBS冲洗3×平板，在RT下用40μl/孔PBS+3%BSA封闭1 h，加入12.4μl/Well生物素标记的BG 505 SOSIP(自制，Pugach等)。病毒学杂志(2015年)2μg/ml稀释在PBS-T和1%BSA中。用PBS-T和1%牛血清白蛋白(1：10和12.4μl/L)连续稀释(3×)小鼠血清，室温(RT)孵育1h，洗涤后用12.4μ1/孔碱性磷酸酶结合羊抗鼠IgG(H+L)(Jackson免疫研究实验室，#115-055-146)稀释1：5000，加入1%牛血清，在RT下孵育30 min。对硝基苯磷酸盐(PNPP)底物(Sigma Aldrich，s 0942)在底物缓冲液(10 Mm MgCl)中溶解至1mg/mL。2含钠80毫米2协和315毫米NaN3在12.4μl/Well条件下加入pH9.8，观察抗原特异性小鼠IgG的结合情况。在405 nm处的光密度(OD)被读取在一个SPECTRAMAX PLUS(分子器件)平板阅读器上，允许每个板的开发时间相同。欧共体50每一样本的吸光度值曲线与血清稀释度的对数曲线拟合而得。

抗P2A ELISA

3 84孔板在4°C下用12.4μl/孔预涂，2μg/ml BG 505 SOSIP2JD6纳米粒子在室内制备。34。用40μl/井pBS加3%牛血清白蛋白(3%BSA)冲洗1 h，再冲洗1 h。用PBS-T和1%牛血清白蛋白(1：10)连续稀释(2×)，加入(12.4μl/孔)，RT孵育1h，加入1μg/mL的P2A-LC标记的鼠VRC 01 IgG单克隆抗体标准，连续稀释(2×)，RT孵育1h，用12.4μl/well生物素标记的抗肽2A(3H4)小鼠抗体(NovusBio，#NBP 2-59627)在1μg/ml的pBS-T中和1%的BSA中孵育1μg/ml的小鼠抗体(NovusBio，#NBP 2-59627)。用12.4μl/Well碱性磷酸酶结合链霉亲和素(Jackson免疫研究室，#016-050-084)在PBS-T中稀释1：3000，RT下1%BSA孵育1 h，洗涤平板，加入pNPP底物。在上面405 nm处阅读之前，所有的版材都是在同一时间内发展起来的。以P2A滴度为曲线下面积，对每个样品进行吸光度曲线与对数稀释系数曲线下面积的比较。当最大Abs 405 nm值在1.5以上时，将样品EC 50与小鼠-VRC 01标准相乘，计算血清中P2A抗体量。

小鼠VRC 01−P2AIgG制备

从工程C57BL/6J小鼠cDNA中扩增了VRC 01 LC-P2A-HC结构，并利用吉布森组装技术将其克隆到小鼠IgG2b HC表达载体(InvivoGen，#pfue-mchg2b)的启动子和恒定区之间。一个先导序列(5‘-ATGGGATGG TCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCA-3′))也被包含到LC区.P2A-VRC 01抗体的瞬时表达是按照制造商的指导原则，通过转染自由式™293-F细胞实现的。转染后5天收集上清，用蛋白A Sepharose亲和纯化IgG(GE Healthcare，#17)。−5280-02)。用SDS-PAGE法鉴定IgG的纯度和P2A肽的适切性。该抗体的活性与人VRC 01 IgG单克隆抗体在病毒中和试验中的活性相当。

竞争ELISA

3 84孔板在4°C下用12.4μ1的BG 505 SOSIP2JD6在PBS中稀释2μg/ml预涂。用PBS-T连续稀释(2×)小鼠血清12.4μ1/孔，加入1%BSA(1：10)，在RT下孵育1h，将人VRC 01单克隆抗体200 ng/ml的12.4μ1/孔直接加入稀释血清中。混合后，平板再孵育一个小时，非结合抗体被冲走。用碱性磷酸酶结合羊抗人IgG、FCγ片段特异性抗体(Jackson免疫研究室，#109-055-098)稀释1：5000稀释1：5000和1%牛血清白蛋白检测抗体。如上文所述，在添加pNPP底物之前，在RT中孵育1小时。在405 nm处读取OD值，生成标准曲线。通过取样品Abs 405 nm减去非竞争性负对照井Abs 405 nm的绝对值来转换吸光度值。曲线下面积由Abs与对数血清稀释图生成。

中和试验

在BSL 2/3无菌条件下，PSG 335质粒共转染293 T细胞及不同的hiv包膜质粒。31使用脂质体2000转染试剂(热费舍尔科学，#11668019)生产单轮感染合格假病毒，代表多个类别的艾滋病病毒。293 T细胞经DMEM培养基+10%FBS+1%Pen/Strep+1%L-谷氨酰胺预镀。用Opti-MEM转染培养基(吉布科，#31985)进行脂质体转染.转染后12h加入新鲜培养基。72h后收获含有病毒的上清液。在无菌96孔板中，立即将20μ1病毒与小鼠血清(4 0 0μg/ml)中的2 0μ1串联稀释(3×)μ1混合，在37℃下孵育1h，使假病毒抗体中和。在含100μg/ml右旋糖酐的40μ1培养基中，直接加入5000个TZM-bl细胞/孔。平板在37℃下孵育48h，感染后用1×荧光素酶裂解缓冲液(25 mm Gly-Gly pH 7.8，15 mm MgSO)溶解Tzm-bl细胞。4，4毫米EGTA，1%Triton X-100)。然后，根据制造商的指示(Promega，#PR-E2620)，在含有荧光素酶底物的Biotek Synergy 2(Biotek)上读取与荧光素酶强度不成比例的中和能力。