丙型肝炎病毒清除重建T滤泡辅助体液免疫轴

丙型肝炎病毒(HCV)特异性T细胞的衰竭和B细胞功能的异常是慢性HCV感染的标志之一。直接作用抗病毒(DAA)疗法在获得持续病毒反应(SVR)方面是有效的，然而，成功的DAA治疗能否重建T滤泡助手(T)？_FH)-B细胞轴在HCV患者中尚不清楚。在此，我们的目的是评估全球和丙型肝炎病毒特异性CD4+cxr 5+T的免疫学变化。_FH20例HCV患者CD4+CXCR 5-T细胞和B细胞，并与15例健康对照者(HC)进行比较。全局和HCV特异性CD4+CXCR 5+T_FHCD4+CXCR5-T和CD 19+B细胞在DAA治疗后有明显的表型和功能重建。HCV患者在SVR 12时，效应细胞、中枢和终末分化记忆细胞群重组，ICOS和BCL 6表达增加。HCV特异性细胞因子在DAA后也有改善。DAA治疗后，精疲力竭和调节性B细胞减少，而记忆B细胞增多。重要的是，T的频率_FH细胞与HCVRNA的减少、记忆B和浆细胞的扩张显著相关，与耗尽/调节的B细胞呈负相关。我们的结果表明，SVR联合DAA治疗对T细胞表型和功能异常的重建是有效的。_FH-B细胞轴。

丙型肝炎病毒感染是一项全球性的健康负担，影响全球约7100万人。1。慢性丙型肝炎病毒感染可能导致肝硬化和肝细胞癌，这与这些患者的高死亡率有关。2。丙型肝炎病毒的持续存在可能是由于先天和适应性免疫反应的特殊缺陷所致。3。慢性感染导致CD4 T细胞迅速衰竭。4其特点是程序性死亡-1(pd-1)增加，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)表达增加，以及白细胞介素-21、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α等效应细胞因子减少。5,6,7。低T滤泡助手(T)_FH)细胞频率和功能与体液反应受损和病毒不受控制的复制有关，表明T的参与至关重要_FH控制病毒感染的细胞8。慢性丙型肝炎病毒感染时，循环白细胞介素-21产生T的频率降低。_FH细胞9。丙型肝炎病毒特异性分泌T_FH细胞在HIV/HCV混合感染中对HCV病毒的控制起着至关重要的作用。10。相反，丙型肝炎合并脑球性血管炎患者产生T的频率较高。_FH促进异常B细胞活化和产生具有类风湿因子活性的致病IgG和IgM的细胞11。这些发现证明了T的对比行为_FH丙型肝炎合并和不伴脑球性血管炎患者的细胞。

慢性丙型肝炎病毒感染期间，B细胞室发生了明显的改变。虽然循环B细胞的频率没有变化，但已经观察到活化B细胞的流行，特别是在与HCV病毒载量相关的记忆细胞室中。12。丙型肝炎合并血球性血管炎患者的自身反应记忆B细胞频率较高，而DAA治疗后则下降。11。有趣的是，与健康对照组相比，记忆细胞室在丙型肝炎患者中也表现出较高的耗竭标记fc受体样4(Fcrl 4)的表达；然而，这是一种防御丙型肝炎患者持续过度活动环境的有害作用的机制。13。丙型肝炎病毒还可上调B细胞受体信号，并与B淋巴细胞增生性疾病有关。14.

采用高效的无干扰素直接作用抗病毒(DAA)疗法导致了HCV治疗模式的转变，帮助更多的患者获得临床治愈，而非基于干扰素的治疗。DAA治疗是泛基因型的，抑制关键的HCV生命周期蛋白，当用于多种组合时，产生持续的病毒学应答(SVR)率接近99%，治疗时间较短(12周)，副作用最小。DAA治疗的新数据支持丙型肝炎患者的血液和肝实质中大多数天然免疫细胞的快速和完全恢复，并能解决肝脏炎症问题。15,16,17。然而，有关DAA治疗后适应性免疫反应重建的数据不足。此外，成功的DAA治疗是否能改善T_FHHCV患者的B细胞反应是否有助于病毒清除，目前尚不清楚。因此，在本研究中，我们旨在评估DAA治疗后HCV感染的清除是否会导致T的重建。_FHB细胞表型和功能。CD4+CXCR 5+T_FH对CD4+CXCR5-T细胞进行表型改变、病毒特异性和全局细胞因子反应的研究.检测B细胞异常的逆转。结果提示，DAA治疗后SVR能有效改善CD4+CXCR 5+T的表型和功能异常。_FHCD4+CXCR5-T细胞和B细胞。

丙型肝炎患者的特点

HCV患者的基线特征详见表1。在20例患者中，11例(55%)长期感染丙型肝炎病毒(1a)，9例(45%)感染1b型。基线病毒载量高(中位数-2.1×10)6，范围-7×104-1.2×107)治疗后明显下降，SVR 12仍未检测到。丙型肝炎患者DAA治疗前后的临床参数见表。2。基线时，丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平升高，在SVR 12时恢复正常。直接胆红素水平在基线时较高，在SVR 12时显著降低。

全球及HCV特异性CD4+CXCR 5+T的重建_FHDAA治疗丙型肝炎后HCV患者CD4+CXCR 5-T细胞表型的变化

CD4+CXCR 5+T_FH细胞在T细胞介导的B细胞帮助下发挥着重要作用，对生发中心(GC)的形成、记忆B细胞的发育和高亲和力抗体的形成具有重要作用，而这些抗体仍然是长期保护性体液反应的基础。我们观察到全球CD4+CXCR 5+T的可比频率。_FHHC-HCV患者DAA治疗后，HC-HCV患者之间的细胞数无明显变化。这表明HCV感染和DAA治疗均不会引起CD4+CXCR 5+T的改变。_FH细胞。我们还分析了全球CD4+CXCR5-T细胞，并获得了类似的数据。1a)。此外，探讨丙型肝炎病毒(HCV)根除对CD4+CXCR 5+T细胞亚群的影响。_FHCD4+CXCR 5-T细胞、中央记忆(CM)、效应记忆(EM)、天真和终末分化效应记忆(T)_埃姆拉)细胞分析。与HC相比，基线HCV样本中EM细胞的频率较低，CM、NA和T的变化不明显。_埃姆拉细胞。Cm，EM和T_埃姆拉DAA治疗后HCV清除率明显增加，但幼稚细胞仍具有可比性(图1)。1b)。当分析CD4+CXCR 5-T细胞群时，基线HCV样本显示CM和EM细胞的频率较高，而NA和T的频率较低。_埃姆拉细胞。T型_埃姆拉DAA治疗后细胞增多，CM细胞进一步扩增。1c)。此外，我们还检查了T的Th1、Th2和Th17类子集。_FH细胞。Th1和Th17样T的频率_FH丙型肝炎基线标本中细胞数较低，SVR 12时细胞数显著增加，Th2样T细胞百分比显著升高。_FHDAA治疗后细胞数量明显减少。循环存储器T的另一个子集_FH细胞，定义为CD4+CXCR 5+CXCR 3-PD-1+细胞，与GC T相似。_FH在DAA治疗前，HCV患者的B细胞帮助功能较强的细胞在DAA治疗前明显降低，在SVR 12时恢复正常，但未完全恢复正常。此外，我们还分析了HCV患者CD4+CXCR 5+CXCR 3+PD-1+细胞，并在SVR 12时进一步扩增。1d)。同样，对CD4+CXCR5-T细胞亚群的任何改变也进行了分析.DAA治疗后，Th1样CD4+CXCR 5-T细胞的百分比增加，而Th2样细胞减少，而Th17样细胞则无明显变化(图5)。1e)。

在慢性丙型肝炎病毒感染期间，主要是全球性的CD4+CXCR 5+T。_FH我们已经对细胞进行了研究，我们的数据并没有显示出全球T的频率有任何变化。_FH细胞。因此，研究丙型肝炎病毒特异性T细胞是否存在重组。_FH可能与抗病毒免疫相关的细胞；我们评估了丙型肝炎病毒特异性、四聚体阳性T细胞的差异。_FH丙型肝炎患者DAA治疗前后的细胞状况。结果表明，丙型肝炎病毒NS3四聚体阳性+T_FHHCV患者在基线时细胞减少，SVR 12呈上升趋势(图1)。1f)。此外，HCV特异性Th1，Th17和GC样T的频率_FHCD4+CXCR 5+CXCR 3+PD-1+T_FHHCV患者在基线时细胞减少，SVR 12明显重建；然而，Th2样细胞在DAA治疗前后仍可与之媲美(如图所示)。1g)。HCV特异性CD4+CXCR 5-T细胞及其亚群包括Th1和Th2的频率在DAA治疗后无明显变化；除Th17外，后者在DAA治疗后显著升高(图一)。1(H)总的来说，我们的数据表明，DAA疗法能复苏全球和丙型肝炎特异性T。_FH细胞及其亚型。丙型肝炎病毒特异性表型的改善可能有助于清除病毒，并提供抗再感染的免疫力。

BCL 6和ICOS对全球及HCV特异性CD4+CXCR 5+T的上调作用_FHDAA治疗后细胞

B细胞淋巴瘤6(Bcl 6)是CD4+CXCR 5+T形成中不可缺少的转录抑制因子。_FH细胞和GC B细胞18缺乏BCL 6的小鼠不能产生GC。19。我们注意到丙型肝炎患者在全球和丙型肝炎特异性T上的bcl 6表达明显降低。_FH细胞在基线，在SVR 12时有所改善(见图)。2A、B)。CD4+CXCR 5+T的过程_FH细胞介导的B细胞分化成熟为高亲和力记忆B细胞，产生抗体的长寿命浆细胞受到icos的调控。20。ICOS敲除/ICOS缺陷小鼠的CD4+CXCR 5+T非常少_FH细胞和很小的GC21导致抗原特异性免疫球蛋白严重受损。我们的数据显示，在DAA治疗前，HCV患者的ICOS表达明显降低，但SVR 12却使ICOS表达增加并恢复正常。一般情况下，pd-1在T细胞上的高表达与功能衰竭有关。22,23。相反，CD4+CXCR 5+T_FH高pd-1表达细胞被认为是高功能的细胞24。丙型肝炎患者CD4+CXCR 5+T细胞Pd-1高表达_FH细胞比HC更高，即使在SVR 12也维持在较高水平。ICOS和PD-1在HCV患者中的共同表达也较高，在SVR 12时进一步上调.丙型肝炎病毒特异性T细胞ICOS与ICOS+pd-1共表达增强_FH细胞；然而，PD-1本身并没有改变DAA治疗后的变化(如图所示)。2c，D)。

同样，还分析了BCL 6、ICOS和PD-1在全球及HCV特异性CD4+CXCR 5-T细胞中的表达.在基线标本中，CD4+CXCR 5-T细胞表现为BCL 6和ICOS低表达，PD-1表达高于HC。Bcl 6表达扩增，pd-1在SVR 12时显著下降，ICOS表达无明显变化。CD4+CXCR 5-细胞上Pd-1的下降可能导致细胞功能的恢复，从而帮助病毒清除。对HCV特异性CD4+CXCR5-T细胞的分析显示，DAA治疗后BCL 6和ICOS+Pd-1共表达较高，但ICOS和Pd-1的表达无明显变化(图一)。2(e-G)这些数据共同揭示了DAA治疗后全球细胞和HCV特异性细胞免疫表型的显著变化。

DAA治疗后HCV特异性细胞因子的重建

了解CD4+CXCR 5+T的改良情况_FH细胞表型改善这些细胞的功能能力，我们分析了HCV特异性以及全球细胞因子的分泌。我们的数据证实了CD4+cxcr 5+T对hcv特异性细胞因子如IL-21、IL-17A、IL-22、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的显著增强作用。_FHHCV患者SVR 12细胞。丙型肝炎患者的全球白细胞介素-21的产生也受到影响，这在DAA治疗后有所改善.IL-22和IFN-γ的产生也有提高，但其他无变化(图1)。3A、B)。PMA/离子霉素可降低T细胞CXCR 5的表达_FH因此，我们还检查了分类CD4+CXCR 5+T中全局细胞因子的生成。_FH然而，结果与总PBMCs相似(补充图)。1A、B)。

同时分析CD4+CXCR 5-T细胞中细胞因子的产生情况.丙型肝炎病毒特异性干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的产生在svr 12时明显增强.当我们观察全球细胞因子反应时，仅在SVR 12扩增出IFN-γ。比较HC-17A患者血清IL-17A水平，发现HCVIL-17A水平明显升高，而TNF-α水平下降，即使在SVR 12时，这种细胞因子模式也没有改变。其他细胞因子在HC和HCV患者中具有可比性。(无花果)3c，D)。

同时检测血浆细胞因子。与HC相比，HCV患者IL-21水平明显降低，在SVR 12时恢复正常.丙型肝炎患者血清IL-17A在基线水平和SVR 12水平持续升高。IFN-γ和TNF-α水平在HC和HCV患者之间相当，TNF-α在SVR 12时升高，而IFN-γ无明显变化(图1)。3e)。

DAA治疗后精疲力竭和免疫抑制性B细胞显著减少，而记忆B细胞增多

我们检测了DAA治疗后总B细胞及其亚群的频率是否发生了变化。我们在HC和HCV患者中发现了相似的总B细胞频率；然而，HCV患者在基线时表现出较低的幼稚B细胞频率，而在SVR 12时恢复正常。HC-HCV患者的血浆成纤维细胞仍可与之媲美(如图所示)。4(A)在HCV中，记忆B细胞明显改变：在基线时，HCV患者的记忆B细胞在SVR 12时扩张的频率较低(图1)。4b)。记忆B细胞群体中不典型记忆B细胞比例较高，表现为精疲力竭和衰老，静息记忆细胞数量较少，SVR 12则相反，非典型性记忆明显减少，静息记忆细胞增多。在基线和SVR 12之间，HC和HCV样本之间的激活记忆细胞保持相当(图1)。4c)。

调节性B细胞(Bregs)是慢性病毒感染免疫应答的关键调节因子。25、自身免疫性疾病26和癌症27。它们通过降低干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的产生而抑制效应T细胞的功能.以前的数据报道CD 19+CD24hiCD38hi B细胞促进Tregs，抑制Th1和其他T细胞的效应功能。28并与慢性乙型肝炎病毒感染中的疾病爆发有关。29，其耗竭导致效应T细胞功能恢复。30。这些发现证实了Bregs在病毒感染中的潜在免疫抑制作用。然而，在HCV感染中，Bregs的状况以及DAA治疗是否对Bregs有任何影响仍然没有得到充分的描述。我们的结果表明，HCV患者Bregs的频率明显增高，SVR 12显著降低了Bregs的频率(如图12所示)。4d)。这一数据表明Bregs的减少可能与CD4+CXCR 5+T的改善有关。_FHDAA治疗后CD4+CXCR 5-T细胞反应。

体液免疫，特别是分泌中和抗体，对于消除病毒感染和保护身体免受这些感染具有重要意义。因此，我们分析了丙型肝炎患者DAA治疗前后血浆中IgG、IgM、IgA等B细胞抗体，并与HC进行了比较。基线时，HCV患者有较高的IgG和IgM抗体，在SVR 12时仍较高。HC-HCV患者IgA水平无明显变化(图二)。4e)。HCV患者IgG、IgM水平升高可能与DAA介导的病毒清除有关。

DAA治疗后归巢受体CXCR 4和飞艇-1的改进

趋化因子受体CXCR 4在B细胞发育过程中表达，但在发育阶段具有不同的功能。它在B细胞的成熟和转运中起着至关重要的作用，调节B细胞室内平衡和体液免疫。31。我们的数据显示，所有B细胞亚群，包括总B、记忆及其亚型，包括非典型记忆、激活记忆和静息记忆，以及血浆成纤维细胞在HCV患者中表达CXCR 4，但其表达明显低于HC。CXCR 4在记忆B及其亚群(包括激活记忆、非典型记忆和浆细胞)上的表达明显增强，而总B和静息记忆细胞在SVR 12上的表达无明显变化(见图12)。5A、B)。

飞利浦-1对免疫球蛋白分泌细胞的发育和维持长寿命的浆细胞至关重要。在对HC的压迫中，HCV患者在总B、记忆B(包括静息记忆)上表现出较高的Blimp-1表达，在SVR 12时仍保持高表达。而其他由非典型性记忆和激活记忆组成的记忆子集则在基线时表达较低的Blimp-1，并在SVR 12保持相似的特征。与HC相比，HCV患者血浆成纤维细胞的Blimp-1表达降低，DAA治疗后恢复正常。5c，D)。

CD4+CXCR 5+T_FH细胞与B细胞和HCV病毒载量降低有关

接下来，我们试图确定CD4+CXCR 5+T的基线频率_FH细胞与B细胞的不同亚群相关。我们的结果表明CD4+CXCR 5+T_FH细胞频率与记忆B细胞(r=0.5 8p=0.0 1)和浆细胞(r=0.5 0 p=0.0 3)呈正相关。CD4+CXCR 5+T与CD4+CXCR 5+T呈负相关。_FH非典型记忆B细胞(r=-0.5 2 p=0.0 2)和Bregs(r=0.5 2 p=0.0 3)与静息记忆B细胞和激活记忆B细胞无相关性。随后，我们检测了CD4+CXCR 5+T的频率。_FH细胞与HCVRNA，ALT和AST水平有关，是HCV患者肝脏炎症的标志。6a)。结果表明，CD4+CXCR 5+T与CD4+CXCR 5+T呈显著相关_FHHCV病毒载量降低的细胞与ALT、AST水平无相关性(图一)。6b)。CD4+CXCR5-T细胞仅与记忆B细胞相关(r=-0.57p=0.007)。6(C)但与其他B细胞亚群无关。此外，CD4+CXCR5-T细胞与临床指标无相关性(图)。6d)。结果汇总在图(图)中。6e)。

虽然DAA疗法在清除HCV感染方面是非常有效的，但它们并不能抵抗再感染，而且在高危人群中再感染率可能更高。保护性免疫反应是避免感染和提供长期免疫的关键。在这方面，CD4+T细胞是非常重要的。它们不仅增强CD8 T细胞介导的应答和细胞毒性，而且促进B细胞介导的体液免疫。特别是T_FH细胞可以帮助B细胞产生体液免疫反应。尽管如此，一些研究集中于HCV特异性CD4+T细胞在急、慢性丙型肝炎病毒感染中的作用。32T的作用_FH慢性HCV感染时细胞不足。因此，在本研究中，我们研究了全球及丙型肝炎病毒特异性T。_FHHCV患者的细胞反应。我们发现全球及丙型肝炎病毒特异性CD4+CXCR 5+T有明显异常。_FH在慢性HCV感染过程中，可能与疾病的发病机制有关。因此，我们进一步研究了DAA治疗对这些细胞是否有影响。我们的数据显示丙型肝炎病毒特异性T_FHHCV患者在基线时细胞缺乏，SVR 12明显恢复。此外，HCV特异性T的不同亚型_FH细胞包括Th1，Th17，GC样T_FHCD4+CXCR 5+CXCR 3+PD-1+T_FHDAA处理后细胞重建。T型_FH建立T所需的包括BCL 6在内的分子_FH细胞和GC B细胞，以及ICOS，对T至关重要_FHDAA治疗后B细胞分化成熟为高亲和力记忆B细胞，抗体产生长寿命浆细胞。T的改进_FH频率可能与BCL 6和ICOS的表达增加有关。丙型肝炎病毒特异性T细胞的存在_FH成功消除病毒后的细胞对HCV患者可能是有益的，因为它可以防止慢性再感染。

很少有研究对全球T进行研究。_FH慢性丙型肝炎病毒感染过程中的细胞9,33。我们的数据没有发现全球T的频率有任何变化。_FH细胞。然而，不管全局T的正常频率如何_FH在基线时，这一群体的效应细胞数量不足，经DAA治疗病毒清除后重组。虽然，T_FH细胞群含有正常比例的CM、天真和T。_埃姆拉细胞；CM和T_埃姆拉DAA治疗后细胞增多。此外，全球T的改进_FHDAA治疗后观察细胞活化和功能，BCL 6和ICOS分子增强，对T起关键作用。_FH细胞活化、增殖、分化和维持、GC反应及进一步激活B细胞。总的来说，我们的数据表明，全球以及丙型肝炎病毒特异性CD4+cxr 5+T_FH细胞表型改善后DAA治疗可能有助于DAA介导的病毒清除。最近的一项研究也报道了抗病毒治疗后两周内HCV特异性CD4+T细胞的扩增。有趣的是，这些HCV特异性CD4+T细胞向T极化。_FH细胞。虽然CD4+T细胞的频率逐渐下降，但T细胞仍有下降趋势。_FH细胞在治疗后的几个月内被持续感染消除，表明这一子集的抗原无关存活。这项研究进一步表明T_FH细胞作为疫苗接种的重要靶标，预防再感染和持续病毒感染的免疫治疗方法34。DAA治疗后，还可观察到耗竭和激活标志物的下调和记忆相关分子的上调。

丙型肝炎患者由于精疲力竭的表型，其T细胞反应减弱甚至缺失。35,36，增殖能力减弱37产生细胞因子38。CD4+CXCR 5+T_FHHCV患者细胞介导的IL-21分泌严重受损9与缺陷的B细胞增殖和成熟有关39。因此，我们评估了CD4+CXCR 5+T是否有改善。_FHDAA治疗后的细胞表型对其功能的实现有任何贡献，我们发现CD4+CXCR 5+T的功能恢复。_FHDAA治疗后的细胞表现为HCV特异性和全球性的IL-21分泌增强。有趣的是，DAA治疗不仅提高了IL-21的分泌，而且增强了丙型肝炎特异性IL-17A、IL-22、IFN-γ和肿瘤坏死因子-α的产生，表明DAA治疗提高了丙型肝炎病毒特异性CD4+cxcr 5+T的多功能。_FHHCV患者的细胞反应此外，CD4+CXCR 5+T能促进IFN-γ、IL-17A和IL-22的产生。_FH细胞可能提示CD4+CXCR 5+T内存在HCV特异性Th1、Th17和Th22细胞。_FH细胞。

一般认为，抗病毒T细胞反应决定了HCV感染的解决还是持续。在这方面，在对HCV特异性T细胞反应进行分类方面取得了很大进展.然而，新出现的数据表明，体液B细胞反应在提供对各种病原体的保护方面起着关键作用。40,41,42。B细胞是诱导抗病毒T细胞应答的关键细胞，其途径是捕获特异性抗原并向T细胞呈递抗原。43。慢性炎症性疾病时循环B细胞及其亚群的频率改变，并与疾病结局有关。44,45。特别是在HCV感染过程中，多克隆B细胞活化可引起红细胞球蛋白血症，诱发关节炎。46并发展为恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤47。尽管B细胞在HCV感染中起着至关重要的作用，但它们还没有得到广泛的研究。此外，关于可用的治疗药物对不同B细胞室和功能的影响的数据也不多。我们发现，虽然HCV患者的总B细胞频率是正常的，但不同的B细胞亚群存在明显的倾斜。这些患者有较低的天真和记忆B细胞群体，其中记忆细胞室表现出较高的非典型，而较低的静息记忆细胞。此外，Bregs在HCV患者中有明显的扩展。DAA治疗通过增强总记忆、静息记忆和幼稚B细胞的频率以及减少非典型记忆和Bregs来调节B细胞室。有趣的是，活化记忆B细胞在DAA治疗后没有扩张，这可能降低这些患者发生脑球蛋白血症和相关疾病的风险。

CXCR 4在B细胞发育的多个阶段表达，并发挥不同的功能。31。浆细胞迁移到骨髓小生境是适当发展长寿命的浆细胞和维持有效的体液免疫的前提；这一过程需要cxr 4，并且已经证明cxr 4的缺失降低了抗体分泌细胞的频率和循环血清免疫球蛋白的水平，从而损害了体液免疫。31。CXCR 4在HCV患者B细胞亚群中的表达尚未见报道。我们证明，在DAA治疗后恢复的HCV患者中，B细胞亚群表达的CXCR 4水平较低，这可能有助于HCV患者正常功能的B细胞恢复。

此外，我们还发现了CD4+CXCR 5+T之间的相关性。_FHB细胞亚群。CD4+CXCR 5+T_FH细胞与总记忆B细胞和浆细胞呈正相关，与非典型记忆和Bregs呈负相关。这些观察有力地支持了CD4+CXCR 5+T的假设。_FH慢性HCV感染过程中细胞对不同B细胞亚型的分布有调节作用。CD4+CXCR 5+T_FH细胞频率与非典型记忆减少有关，Bregs可能有助于非典型记忆B细胞的耗尽，而Bregs是免疫抑制的，因此这些亚型的减少可能促进HCV特异性T细胞的应答，并有助于病毒的消除。事实上，在HIV感染者体内扩增非典型记忆B细胞与抗HIV感染抗体反应不佳有关，因为它们没有在B细胞受体信号、CD40L、CpG和TLR激动剂的作用下增殖，而且分化为分泌抗体的细胞的能力降低。48。我们的数据进一步揭示了CD4+CXCR 5+T的频率_FH细胞与HCV病毒载量减少有关，但与肝脏炎症标志物无关，提示CD4+CXCR 5+T_FH细胞在不引起肝脏炎症的情况下，可能参与降低HCV病毒血症。

此外，我们还研究了DAA治疗对CD4+CXCR5-T细胞是否有影响.我们没有看到CD4+CXCR 5-T细胞的频率有任何变化，但是CM和T。_埃姆拉DAA治疗后细胞增强。我们还观察到在DAA治疗后，Th2样CD4+CXCR 5-T细胞明显减少，而HCV特异性CD4+CXCR 5-T细胞及其亚群的频率在DAA治疗后未发生改变，但Th17未增强。DAA治疗后BCL 6表达明显改善，PD-1表达明显下降.DAA治疗后Pd-1水平下降可能导致CD4+CXCR5-T人群丙型肝炎病毒特异性及全局细胞因子应答功能的恢复，因此我们分析了这些细胞分泌的细胞因子，发现治疗后HCV-1IFN-γ和TNF-α产生明显增强。这表明DAA治疗不仅能改善CD4+CXCR 5+T_FH在HCV患者接受DAA治疗后，CD4+CXCR5-T细胞反应也有可能增加，这可能进一步促进SVR的实现。

虽然目前的研究广泛地证明了全球范围以及丙型肝炎病毒特异性T。_FH在HCV患者DAA治疗前后细胞表型和功能的观察是有希望的，存在一些局限性。作为一项回顾性调查，储存样本的可用性有限，因此，仅对全球B细胞群体和抗体进行了研究。今后，研究丙型肝炎患者DAA治疗前后抗原特异性B细胞反应的研究具有重要意义。此外，为了增强数据，HCV特异性B细胞的类转换特性是今后HCV患者DAA治疗前后研究的另一个关键领域。由于样品有限，DAA治疗是否对T有任何影响_FHHCV患者B细胞相互作用未被研究。此外，本研究的重点是循环T。_FHB组，由于从HCV患者中提取淋巴器官并在生发中心进行分析是不可行的。更好地理解T_FH-B细胞相互作用可以通过探索生发中心T来实现。_FH和B群体，这可以纳入未来的研究。

总之，我们的研究表明，DAA治疗通过增强HCV特异性和全局细胞因子反应，显著改善这些细胞的表型和功能，这可能大大提高病毒清除率。丙型肝炎病毒特异性T细胞的存在_FH即使在病毒清除成功之后，也可能提供对再感染的免疫力。我们还发现DAA治疗与HCV患者SVR时B细胞稳态基线异常的改善密切相关，包括非典型记忆B细胞和Bregs的频率较低，并伴有T细胞反应缺陷。最后，我们的结果提示DAA治疗不仅可以有效地降低HCV病毒载量，具有直接的抗病毒作用，而且还可能改善T和B细胞的功能反应。

受试者与治疗

在这项回顾性研究中，我们评估了2013年1月11日至12月17日在美国国家卫生研究院(NIH)贝塞斯达临床研究中心登记的20名丙型肝炎病毒患者，他们是我们2A期临床试验编号NCT 01805882的对照组。49。15例健康对照(HC)，无肝病史。在丙型肝炎患者中，肝硬化是经肝活检或经纤维SURE试验和天冬氨酸转氨酶/血小板比率(APRI)联合证实的。49。收到了所有与会者的书面和口头知情同意。HCV治疗的关键目标是实现SVR，即治疗结束后12周血清中未检测到HCVRNA。因此，将索福韦(400 Mg)和利地帕斯韦(90 Mg)联合使用，每日一次，共12周。

学习批准

美国巴尔的摩市马里兰大学医学院的机构审查委员会批准了这项研究方案。所有调查都是根据“赫尔辛基原则宣言”进行的。收到了所有与会者的书面知情同意。

样本

为了进行表型和功能免疫分析，在基线和SVR 12和HC的基础上，使用保存的外周血单个核细胞(PBMCs)和血浆样本。血浆经4000 rpm离心5 min后分离，在-80°C保存至使用。用密度梯度离心法分离PBMC，冷冻于含10%二甲基亚砜的胎牛血清中，保存在−140°C液氮中。

HCVRNA定量

我们用COBAS TaqMan HCVRNA法测定血清中HCVRNA的浓度，其定量下限为43 IU/mL，检测下限为15 IU/mL(美国印第安纳波利斯罗氏诊断学2.0版)。

流式细胞术

用完整的Rosewell Park纪念研究所1640培养基(RPMI-1640，Sigma-Aldrich)(含10%FBS，吉布科)，2mm L-谷氨酰胺(CelGro)和1%青霉素/链霉素(Himedia)解冻丙型肝炎病毒(HCV)患者外周血单个核细胞(基线和SVR 12)和HC。细胞在完整的RPMI-1640培养基中洗两次，每次1300 rpm，洗7 min，然后过夜休息。用台盼蓝排斥法测定细胞数和活率。然后按照实验要求使用细胞。CD4+CXCR 5+T细胞频率的测定_FH用抗人CD3AF700、CD4PerCP-Cy5.5、CXCR5BV421、CXCR3FITC、CCR6APC-Cy7 CD45RABV605、CCR7BV510、Pd-1PeCy7和ICOSPE抗体在96孔圆底板上进行室温暗染30 min。细胞用1 XPBS清洗。细胞经eBioscience Foxp 3/转录因子染色缓冲液固定和渗透后，按照制造商的指示，对转录因子BCL6-APC进行核内染色。B细胞分析采用抗体。CD19FITC、CD27BV510、CD38PerCP-Cy5.5、IgDAF 700、CD24BV605和CXCR4APC/Cy7，用blimp-1APC进行核内染色。两次PBS洗涤后，加入多聚甲醛(0.5%)，用流式细胞仪(BD FACSARIA II)获取细胞。用Flow JoV 10软件进行数据分析。有关抗体的详情已列於补充表格内。1.

主要组织相容性复合物II类(MHCⅡ)四聚体染色

Hla-DRA*01：01/DRB 1*15：01限制性HCV NS3(GINAVAYYRGLDVSV)-PE结合四聚体作为制造商的指示。简略，2×106丙型肝炎患者外周血单个核细胞在37℃黑暗条件下与HLA-DRA*01：01/DRB 1*15：01配型四聚体孵育2h。细胞用洗涤缓冲液洗两次，用T染色。_FH细胞标记物CD3AF700、CD4PerCP-Cy5.5、CXCR5BV605、CXCR3FITC、Pd-1BV510和ICOSBV 421抗体在96孔圆底板上在室温下持续30 min。四聚体可以与B细胞非特异性结合，因此CD19APC抗体在进行分析时也被用于排斥B细胞。BCL6-PE-Cy7核内染色按上述方法进行。在BD、FACS、ARIA上获取细胞，用流式细胞仪进行分析。

CD4+CXCR 5+T的分类_FH细胞

CD4+CXCR 5+T_FH将HC和HCV患者的PBMC解冻，用完整的RPMI 1640培养基冲洗，37°过夜休息。第二天，用1x pbs清洗两次细胞，用抗人CD3 AF 700、CD4 PerCP-Cy5.5和CXCR 5 bv 421染色，分类为T。_FH细胞。在BD-FACSARIAⅡ型流式细胞仪上对细胞进行分类，在2ml FBS中采集细胞，用PMA/离子霉素作进一步的刺激试验，并对细胞因子进行分析。

细胞内细胞因子检测

为探讨慢性丙型肝炎(HCV)患者HCV特异性反应，采用HCV重叠肽刺激试验.根据丙型肝炎患者存在的病毒基因型(1a型或1b型)，分别用基因型1a或1b特异性重叠肽(5g/ml)和CD49d/CD 28(2μg/ml)(Biolegend，San Diego，CA)在96孔平底板中5天，在5%CO2孵化器中刺激PBMCs。1μg/ml的Bregeldin A，(BD生物科学，圣何塞，CA)在孵育时间结束前12小时加入。HCV基因型1a或1b肽为15~18肽，有11个或12个氨基酸重叠，覆盖整个HCV蛋白(BEI资源、NIAID、NIH：肽阵列、丙型肝炎病毒)。所有肽均溶于二甲基亚砜中，稀释至1xPBS中。我们分别将基因型1a和基因型1b重叠肽组合在一起，在-80°C保存，直到使用为止。不同的公司。分别检测1、2、5g丙型肝炎病毒(HCV)的免疫应答和细胞毒性。5g CONC的反应较好。没有任何细胞毒性，因此，5克康克。被用来做最后的实验。在37°和5%CO2条件下，用500 ng/ml聚甲基丙烯酸甲酯和1μg/ml离子霉素刺激PBMCs 18h。孵育2h后加入Bregeldin A。用PBS冲洗两次，用活/死可固定的远红色死细胞染色(Invitrogen，Waltham，MA)染色30 min，用CD3AF700、CD4PerCP-Cy5.5、CXCR5BV421、IL-17APE、IL-21AF647、IL-22PeCy7、IFN-γBV 605和TNF-αBV 510进行进一步染色。

多重细胞因子珠阵列

采用多重细胞因子珠阵列法(Invitrogen，Waltham，MA)检测血清IL-21、IL-17A、IL-22、IFN-γ和TNF-α水平。数据分析采用试剂盒中给出的标准曲线，计算各细胞因子的浓度。

ELISA法

采用ELISA法(Invitrogen，Waltham，MA)，根据生产厂家的指示，对血浆IgG、IgM和IGA进行检测。总之，用1x试验缓冲液稀释血浆样品，IgG为1：500，IgM和IgA为1：100 000。用400升洗涤缓冲液冲洗两次井。100份标准加入100份标准，100份预稀释样品和50份HRP结合抗体。然后将盘子密封在摇床上，每分钟400转，室温下孵育1小时。用洗涤缓冲液冲洗四次，加入100 ml TMB底物溶液，在黑暗中继续孵育30 min。加入100μl的停液后，反应停止。以450 nm为主波长，620 nm为参比波长，在分光光度计上进行吸光度读数。

统计分析

使用GraphPad Prism 5.0软件(美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad公司)进行统计分析。用D‘Agostino检验和Pearson综合检验检验各参数的正态分布。测定CD4+CXCR 5+T的变化_FHHCV患者DAA治疗前后CD4+CXCR 5+T细胞和B细胞分别进行配对T检验和Wilcoxon配对符号秩检验。HC和HCV患者分别用未配对T检验和Mann-WhitneyU检验对参数数据和非参数数据进行比较。相关分析采用Pearson相关系数进行相关分析。P值<0.05为显着性。