粒子设计、合成与表征 SPNPs是通过电流体力学(EHD)喷射法制备的，这是一种利用聚合物稀溶液雾化产生定义良好的NPs的工艺。 1A 和补充图。 1 )39 ,40 ,41 。在电场中，粘弹射流的快速加速会导致尺寸减小几个数量级，从而促进溶剂的快速蒸发和非挥发性组分的凝固到NPs中。在此，喷射液由HSA和双功能OEG大分子(NHS-OEG-NHS，2 kDa)组成，与治疗性siRNA、聚乙烯亚胺(PEI)、siRNA络合剂(PEI)以及NP制备前的肿瘤穿透肽IRGD混合。类似于步进聚合，OEG大分子通过与其赖氨酸残基反应，与白蛋白分子结合，形成稳定的SPNPs。EHD喷射和收集后，其平均直径为115±23 nm，处于干燥状态(见图)。 1B )。通过动态光散射(DLS)测量，观察到SPNPs的平均直径为220±26 nm(附图)。 2 )。NP的溶胀程度通过改变HSA与OEG的比值(4：1~20：1)和OEG大分子的分子量(1~20 kDa)来控制。当OEG含量从5%增加到20%时，SPNP的溶胀率降低了20%。结果表明，在37°C条件下，SPNPs在37°C条件下至少稳定10天，颗粒大小和形态无明显变化(附图)。 3 )。在弱酸性条件(pH5.0)条件下，SPNPs直径增加到396±31 nm，与癌细胞内小体的观察结果相似。 1C )。我们注意到，定义粒子性质，如粒径、形状和溶胀行为，在误差范围内，对于满载SPNPs、空NPs和装载siRNA和/或IRGD的NPs是相同的。
图1：siRNA负载的SPNP在体外有效地抑制了STAT 3的表达. a 交联剂STAT 3喷射配方原理图 i -负载，IRGD-共轭的靶向白蛋白NPs(STAT 3) i (SPNPs) b 用扫描电子显微镜(SEM)对样品进行了粒度表征和分析。平均粒径115±23.4nm。标尺1m。 c 颗粒在水化状态下会膨胀，在pH降低时会进一步膨胀。平均直径：pH7.4,220±26.1 nm。PH5.0,396±31.2 nm。 d 在SPNPs存在下培养的细胞具有代表性的共聚焦z叠图像(蓝色=细胞核，绿色=肌动蛋白，黄色=溶酶体，红色=SPNPs)。从单个独立实验中采集SPNPs孵育细胞(有或不含IRGD)的复合图像，研究细胞内颗粒的命运。标尺=30m。 e , f 颗粒摄取和溶酶体-粒子共定位的定量。 e SPNPs局部释放IRGD可使GL26胶质瘤细胞颗粒摄取增加5倍以上(*) p < 0.0001). f 内部化的SPNPs与溶酶体共定位的程度低于非靶向粒子(*) p =0.0235)。数据以平均值±S.D表示。(SPNP) n =7，NPs n =8，独立合成z-堆栈图像；双尾未配对 t -测试)。 g STAT 3 siRNA - 负载SPNPs能显著降低GL26胶质瘤细胞靶蛋白的表达，与未处理组和空颗粒对照组比较差异有显着性(P<0.05)。数据以平均值±S.D表示。(SPNPs， n =3；脂质体+STAT 3 i 、STAT 3 i SPNPs(25和2.5g mL) −1 n =2个生物复制体)。每组均显示STAT 3(siRNA靶蛋白)和GAPDH(负载控制)的典型条带。
体外细胞摄取和siRNA活性 在此之前，细胞穿透肽irgd的共同作用提高了小药物和氧化铁np对肿瘤的靶向性。 42 。Rgd肽的作用过程分为三个阶段，首先是与αvβ3和αvβ5整合素结合，然后是蛋白裂解步骤和与神经亲蛋白1(nrp-1)的次级结合事件，后者激活了内吞/外胞转运途径。 43 。在过去，irgd介导的肿瘤归巢被认为是以irgd与NPs的系统共转运的形式进行的。 44 ,45 或者用表面固定的irgd装饰NPs。 46 ,47 。在我们的案例中，IRGD肽在EHD喷射过程中被预先加载到SPNPs中，以促进BBB附近的局部释放。为了研究NPs的细胞内命运和IRGD作为靶向配体的作用，进行了体外摄取实验。当IRGD负载的SPNPs与GL26胶质瘤细胞共同孵育30 min时，其颗粒摄取量比未加入IRGD的胶质瘤细胞增加了5倍(见图)。 1E )。三维共焦图像的图像分析 1D 细胞轮廓显示与GL26胶质瘤细胞溶酶体共定位的颗粒明显少于没有IRGD的NPs(图1)。 1F )。这些数据表明，将IRGD加载到SPNPs中会导致胶质瘤细胞摄取较高的SPNP和较高的胞浆SPNP浓度。SPNPs的pH随pH变化的溶胀，以及先前假设的PEI的“质子海绵”效应。 48 ，可能有助于更有效的粒子从内吞囊泡中逃逸，增强sirna对胞浆的整体传递和rna诱导的沉默。 49 ,50 。然而，我们注意到，SPNPs中PEI的浓度比以前报道的对细胞有害的低约200倍。 51
我们接下来的评估，如果siRNA加载到SPNP在EHD喷射保持生物活性。首先，用Cy3标记的STAT 3来评估siRNA从spnp的装载和释放。 i 代孕母亲。利用受激发射耗尽(STED)显微镜，我们证实了siRNA在整个NP体积中的均匀分布(补充图)。 4 )。荧光标记siRNA的体外释放证实，96%的siRNA被包裹在SPNPs中，对应的siRNA载量为340 ng，即每毫克SPNPs中25 pmol的siRNA。此外，我们观察到60%的siRNA在前96h释放，然后持续释放21天(附图)。 5 )。当白蛋白NPs负载抗GFP的siRNA时，SPNPs明显抑制转染mCitrine的小鼠胶质瘤细胞GFP的表达(GL26-Cit，附图)。 6 )相对于控制白蛋白NPs，以脂质体为转染剂，负载干扰siRNA或游离GFP siRNA。此外，SPNP组的蛋白质敲除持续时间明显长于脂质体转染细胞(补充图)。 6 )。后者在两天后进入恢复阶段，第五天几乎恢复到正常水平，而细胞经gfp处理后几乎恢复正常。 i 在整个实验过程中，SPNPs显示了持续的蛋白质敲除。SiRNA负载的SPNPs与对照颗粒在粒径、表面电荷和形态上均无明显差异(附图)。 7 ).
与IRGD和STAT 3共同加载的SPNPs i 浓度为2.5和25μg mL −1 ，我们观察到STAT 3总蛋白的表达相对于未治疗的对照组或空的SPNPs显著降低(图1)。 1g )。此外，我们观察到一种剂量依赖性的反应，即较高的SPNP浓度导致STAT 3总表达进一步下降2倍。未发现任何NP组的细胞毒性迹象，我们认为这是因为所传递的siRNA浓度低于GL26细胞中游离STAT 3 siRNA的细胞毒性限度(补充图)。 8 )。在这些体外实验的基础上，我们选择了5μg kg的有效剂量。 −1 在随后的动物研究中。
为了同时评价颗粒在肿瘤微环境(TME)中的稳定性和扩散，我们在瘤内注射了AlexaFluor 647 SPNPs(附图)。 9 )。以前的研究已经证明，irgd可以促进共同传递的治疗药物在整个肿瘤体积中的渗透。 42 ,43 。这在肿瘤切除腔附近局部复发的GBM中变得越来越重要。肿瘤内注射SPNPs后，NPs广泛分布于肿瘤的各个部位。此外，我们观察到肿瘤内给药后数小时内与SPNPs相关的持续荧光信号。
SPNPs在颅内GBM模型中的系统传递 过去，bbb对于通过IV注射系统管理的纳米载体来说是一个无法克服的交付挑战。 52 ,53 。为了评估，如果系统传递的SPNPs可以回家的脑肿瘤，SPNPs负载的AlexaFluor 647标记的白蛋白，如上文所述。在没有大型动物GBM模型的情况下，我们选择了极具攻击性的GL 26同基因小鼠胶质瘤模型，该模型具有人类GBM的组织病理学特征。 54 ，评价SPNPs的GBM靶向性。此外，由于STAT 3在下调免疫系统中所起的重要作用，该模型具有不受损害的免疫系统，这被认为是必不可少的。2.0×10剂量 13 胶质瘤细胞植入术后7天，通过单尾静脉注射将SPNPs注入GBM荷瘤小鼠(GL26-Citrine，近似肿瘤大小：10 mm)。 3 ，补充图。 10 )小鼠右侧纹状体。 2A )。4或24 h后，在共聚焦成像前，对动物进行灌注，取脑，切片，用F4/80(巨噬细胞标记物)染色。我们还观察到SPNPs被其他器官所吸收，如肝脏、肾脏、脾脏和肺(见图)。 二维空间 )。大量的SPNPs似乎跨越了BBB，并在两个时间点的大脑TME中被识别出来(如图所示)。 2B )。24小时后肿瘤靶向性明显增强，提示除了通过循环NPs直接靶向脑内皮外，转细胞或免疫细胞介导的BBB途径等二级转运过程也有助于SPNPs的脑归巢。多变异转运机制的概念与我们发现的SPNPs定位在肿瘤细胞(绿色)和巨噬细胞(红色)内是一致的，这表明这两种细胞类型都可以内化SPNPs(如图所示)。 2B ).
图2：SPNPs在体内的脑靶向性和生物分布。 a 肿瘤靶向研究的时间表。小鼠静脉滴注量为2.0×10。 13 GL26肿瘤细胞植入后7天，经尾静脉注入SPNPs或空NPs(无IRGD)。分别于给药后4h和24h对脑切片进行共聚焦成像。 b AlexaFluor 647标记的SPNPs(Cyan)与巨噬细胞(红色)和肿瘤细胞(绿色，mCitrine)共定位(用黄色箭头表示)。值得注意的是，与24小时相比，系统分娩后4h肿瘤微环境中的NPs较少，并显示了每组3个生物复制的单个实验的代表性图像。标尺=50m。 c 生物分布研究的时间线表示。小鼠静脉注射2.0×10 11 肿瘤细胞植入或生理盐水注射后第7、10和13天SPNPs或空NPs。 d Np分娩后24h肿瘤和荷瘤小鼠器官的荧光显像。 e 肿瘤及外周器官NP生物分布的定量分析。数据以平均值±S.D表示。( n =4个生物复制体，双向变异数；* p < 0.0001). f 定量流式细胞术检测Avβ3和avβ5整合素在正常脑组织和GL2 6肿瘤中的表达。数据以平均值±S.D表示。( n =5个生物复制；双尾未配对 t -试验；* p < 0.0001).
采用相同的颅内肿瘤模型，检测SPNPs的GBM特异性生物分布。荷瘤小鼠3次(植入后7、10和13天，DPI)注射Alexa Fluor 647标记的SPNPs或NPs，无IRGD(图1)。 2C )。此外，正常小鼠(非肿瘤荷瘤)接受相同的方案来描述肿瘤的特异性特征。14天后，对正常、非肿瘤荷瘤小鼠和荷瘤小鼠进行安乐死，采集其主要器官，荧光显像分析NP分布。 二维空间 )。在GBM荷瘤小鼠和非肿瘤荷瘤小鼠中，与无IRGD的NPs相比，在脑内观察到的SPNPs明显增多。正如预期的那样，SPNPs也在肺和肝脏中积累--不依赖于特定的实验组。前者可归因于静脉注射后NPs将遇到的第一条毛细管床，后者则是直径为10-250 nm的NPs的主要清除途径。 55 。与无IRGD NP组相比，携带IRGD的正常小鼠和GBM荷瘤小鼠SPNPs的脑蓄积均较高。当直接比较脑室内SPNP定位时，IRGD负载的SPNPs在荷瘤脑中的累积率高出40%(图1)。 2E )非肿瘤荷瘤小鼠。
其次，我们评价了荷瘤小鼠脑内SPNPs的增加是否是由肿瘤细胞上整合素的表达介导的。具体来说，我们关注的是αvβ3和αvβ5整合素的相对表达，因为这些配体在irgd诱导的肿瘤中NPs和小药物的积累中起着关键的作用。 31 ，并在胶质瘤中过度表达。 32 。采用GBM模型和生物分布研究中的给药程序，在23 DPI采集GBM荷瘤小鼠的脑组织。取正常脑组织和肿瘤组织，用αvβ3和αvβ5抗体进行流式细胞术分析。60%以上的GBM肿瘤细胞高水平表达αvβ3和αvβ5整合素，而正常脑细胞中这些蛋白的表达很少。这些结果，以及在生物分布研究中观察到的大脑累积量的差异，似乎与先前假设的IRGD促进脑内SPNPs积累的假设是一致的。 43
活体生存研究 以前的数据表明，STAT 3转录因子是介导肿瘤进展和免疫功能的多种信号通路的枢纽。 6 ,56 ,57 ,58 。目前尚无抗STAT 3药物对脑的有效传递策略。 6 。我们观察到单剂量STAT 3的全身性交付 i SPNPs对GMB荷瘤小鼠的MS(补充图)显著增加。 11 )。为了进一步验证spnp在体内的有效性，我们用多剂量的stat 3静脉注射gbm荷瘤小鼠。 i SPNPs在为期三周的治疗过程中(补充图)。 12 )。肿瘤植入后，未治疗小鼠的MS值约为28d。在接受多剂量空SPNPs的小鼠中，MS保持不变(28天)。相反，当SPNP加载STAT 3时 i 给药后，MS增加到41天，有统计学意义(45%)。提供相同剂量的免费STAT 3 i 导致MS的适度延长5天，这可能是太低，以获得一个显着的治疗效果。游离STAT 3的低效 i 除了siRNA无法通过bbb之外，系统给药后遗传物质的迅速降解也可以解释。 59
对STAT 3 NP配方的前景感到鼓舞 i 给药具有显著的体内效果，我们联合STAT 3。 i SPNPs符合目前的护理标准，即聚焦放射治疗(IR)。以前的研究发现，STAT 3过表达与其他癌症的放射抵抗有直接关系。 60 ,61 表明其击倒可能有助于提高药效。因此，我们建立了一个治疗方案，将先前评估的多剂量方案与重复的、为期两周的聚焦放疗方案相结合(图一)。 3A )62 ,63 。GBM肿瘤形成后，小鼠接受7剂STAT 3。 i 为期三周的SPNPs。在治疗的头两周，小鼠每天接受5次2Gy的IR治疗，共治疗10次(如图所示)。 3A )。实验组包括接受STAT 3的小鼠。 i SPNP，空SPNPs，免费STAT 3 i 、加或不加放疗的生理盐水。在所有病例中，放射治疗增加了MS，仅IR就使MS从28延长到44 DPI(图1)。 3B )。结合IR和空的SPNPs没有进一步改变MS与我们以前的实验一致，游离siRNA提供了一个轻微的，统计上有意义的好处，当MS增加到58 DPI，当结合IR时(如图所示)。 3B ，棕色线)。然而，对STAT 3的组合效果最为显著。 i 带有IR的SPNP。在该组的8只小鼠中，有7只达到标准的90 DPI长期存活时间点，此后显示完全无肿瘤(图1)。 3B 、蓝线)。接受这种治疗但没有长期存活的单只老鼠在67 DPI被冻死，比所有其他组中的任何其他非存活对象的寿命都要长。
图3：STAT3i SPNPs+IR可提高存活率，并启动适应性免疫反应。 a NP+IR联合生存研究的治疗时间表。 b Kaplan-Meier生存曲线。在所有接受IR的组中，中位生存期明显增加。STAT 3处理小鼠(7/8) i SPNPs+IR可达到长期生存时间点(100 DPI)，无残留肿瘤的迹象(Log-秩(Mantel-Cox)检验)；* p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01). c 定量的STAT 3表达对切除的大脑进行生存研究，当小鼠出现神经功能缺损的迹象时，收集大脑。STAT 3(黑色)和pSTAT 3(红色)在STAT 3中的表达显著降低。 i SPNP组与未治疗对照组比较。可溶性STAT 3 i 空的SPNPs(不含siRNA)不具有较高的STAT 3总表达，但其活性磷酸化STAT 3表达(PSTAT 3)增加。数据以平均值±S.D表示。相对于未处理的控制( n =每组2次生物复制)。由于可用的生物样本最少，对每个样本进行了三个技术复制，以验证实验协议并排除测量误差。 d 未处理对照和STAT 3的IHC染色 i SPNP+IR长期存活者。(顶部)H&E染色显示生理盐水对照组(28 DPI)肿瘤完全形成。用STAT 3组合处理 i SPNPs+IR，无肿瘤或坏死征象。(中)MBP染色显示接受STAT 3的小鼠保留脑结构，而少突胶质细胞完整性无明显变化。 i SPNPs+IR处理与生理盐水对照组比较。标尺=1毫米。(下方)CD8染色显示接受STAT 3的小鼠没有明显的炎症反应。 i SPNPs+IR处理与生理盐水对照组比较。展示了由每组三个生物复制体组成的单个实验的代表性图像。标尺=100公厘(内嵌，20米)。 e 流式细胞术检测TME免疫细胞的时间线。 f TME中CD8细胞的流式细胞术分析。显示每个组的有代表性的流图。 g 肿瘤特异性CD8的定量分析 + TME内的T细胞。对GL26-OVA肿瘤进行SIINFEKL-K染色分析。 b 四聚体。CD8活化状态 + 用肿瘤裂解液刺激TME内T细胞，进行颗粒酶B(GZB)和干扰素γ染色。数据以平均值±S.D表示。( n =5个生物复制；单向方差分析和图基多重比较试验；* p < 0.0001).
为了表征联合治疗的效果，还进行了额外的研究。遵循图中概述的相同的治疗方法。 3A ，我们阐明了STAT 3及其活化磷酸化形式pSTAT 3在脑组织中的表达。 3C )。正如预期的那样，在STAT 3中，蛋白质的总形式和磷酸化形式都出现了最大的下降。 i SPNP组STAT 3对GBM荷瘤小鼠的总STAT 3蛋白降低幅度大于50% i SPNP，与生理盐水对照组比较。用STAT 3处理的GBM小鼠pSTAT 3水平降低了10倍以上。 i SPNP，与生理盐水对照组比较。相比之下，STAT 3的总水平在两种情况下都相对不变，即免费STAT 3。 i 空SPNP组与生理盐水对照组比较。在这里，pSTAT 3在接受空SPNPs的队列中增加了110%，表明这两种蛋白形式的平衡发生了变化，这可能是由于激酶活性的局部上调所致。
采用免疫组织化学(IHC)方法对长期存活者与其他治疗组的脑组织进行比较.图形 三维空间 显示长期存活者的大脑与未接受治疗的对照动物的大脑的直接比较。苏木精和伊红(H&E)染色清楚地显示在生理盐水处理小鼠的单个半球内存在一个完全发育的肿瘤。相反，用STAT 3治疗小鼠 i SPNP+IR没有发现颅内肿瘤的证据。 三维空间 、顶部)。此外，这些动物在接受了完整疗程的治疗后，没有出现明显的坏死、栅栏或出血区域。髓鞘碱性蛋白(MBP)染色评价髓鞘的完整性，这是周围脑结构破坏的指标。联合STAT 3对小鼠髓鞘形态无明显影响。 i SPNP+IR治疗与生理盐水对照组小鼠无癌右面比较(图1)。 三维空间 (中)此外，CD8 T细胞在TME中稀疏(图1)。 三维空间 )，其总数在STAT 3中显著减少。 i SPNP+IR组小鼠与生理盐水对照组比较(附图)。 13 )-表明由于治疗而缺乏炎症反应。
为了进一步研究适应性免疫系统的潜在作用，我们通过流式细胞术更仔细地观察了TME中CD8 T细胞的数量。我们用含有替代肿瘤抗原卵清蛋白(OVA)的GBM细胞在小鼠体内建立了肿瘤，并比较了各种治疗制剂所引起的反应(图1)。 3E )。由于OVA特异性MHC四聚体的存在，基于OVA的GBM模型被用来评估GBM微环境中肿瘤抗原特异性T细胞的频率。肿瘤特异性T细胞的SIINFEKL-H2K染色 b -OVA四聚体，CD8 T细胞群中的一种OVA同源抗原。肿瘤特异性CD8 T细胞(CD3+/CD8+/SIINFEKL-H2K) b (STAT 3中的四聚体) i SPNP+IR组较其他各组均增加两倍(图1)。 3F 、顶部)。用干扰素-γ(IFN-γ)和颗粒酶B(GZB)染色显示TME细胞毒性T细胞增加了两倍。 3F (在STAT 3中) i SPNP+IR组相对于其他各组。本研究中采用的流式细胞术门控策略在附图中有介绍。 14 。在生存研究中，结合GL26GBM小鼠MS的增加，这些结果表明联合STAT 3诱导的抗GBM反应强烈。 i SPNP+IR治疗可能有助于观察到的治疗成功。
认识到重要的SPNPs聚集在肝脏中(见图)。 二维空间 )、全血细胞计数、血清生化及肝组织病理学分析，观察联合治疗策略的潜在非靶点副作用。STAT 3的全身毒性 i SPNPs+IR治疗按图所示的治疗计划进行评估。 4A 。在接受SPNP、STAT 3的动物的全血细胞计数分析中，血液的细胞成分没有显著差异。 i 、STAT 3 i SPNP，或STAT 3 i SPNP+IR治疗组与生理盐水治疗组动物比较。 4B -i)。此外，接受SPNP、STAT 3的动物肾脏(肌酐、血尿素氮)和肝脏(转氨酶、天冬氨酸转氨酶)的重要生物标志物也没有显著差异。 i 、STAT 3 i SPNP，或STAT 3 i SPNP+IR治疗与生理盐水治疗组动物比较(补充表) 1 )，表明这些组织没有出现明显的不良反应。
图4：STAT3i SPNPs+IR无异常毒性。 a 评估STAT3i SPNP+IR治疗的疗效。用生理盐水(STAT 3)治疗GL26 GBM荷瘤小鼠，取血、肝标本。 i 、SPNP、STAT 3 i SPNP或STAT 3 i SPNP+IR在23 DPI时完全治疗。 b –i 对于每个治疗组，水平为( b )血红蛋白，( c )红细胞压积，( d )淋巴细胞，( e )单核细胞，( f )中性粒细胞，( g )血小板，( h )红细胞(RBC)，和( i )白细胞计数。数据以平均值±S.D表示。( n =3次生物复制；单向方差分析和Tukey‘s多重比较试验；ns= p >0.05)。 j 在对GMB荷瘤小鼠进行完全治疗后对切除的肝脏进行组织学检查，发现有轻微凝血性坏死的孤立区域被认为是良好的，因此不会对肝功能产生生物学效应。除生理盐水对照组外，所有组均观察到肝细胞坏死的迹象.这是由于肝细胞中水或糖原的积累与能量平衡的变化有关，而不是退化的变化。显示了由独立的生物复制体组成的单个实验的代表性图像。标度为100×m(20×)，50m(40×)。 k , l 以下是完整的STAT 3 i SPNPs+IR治疗，循环抗体抗( k )GL26荷瘤小鼠血清中未见小鼠血清白蛋白纳米粒。交换时( l )人血清白蛋白在配方中，维持所有其他成分，可测血清HSA特异性抗体水平。数据以平均值±S.D表示。( n =3个生物复制；单向方差分析和图基多重比较试验；* p < 0.0001).
此外，对STAT 3治疗小鼠肝脏的潜在副作用进行了独立的病理分析。 i SPNP+IR治疗显示所有组均有轻微至轻度的核周毛细血管炎，其特点是自发背景，而不是直接治疗的结果。(无花果) 4J )。除生理盐水对照组外，所有治疗组均出现轻微至轻度凝固性坏死。治疗组给予STAT 3免费治疗。 i 一只动物出现多个凝固性坏死灶，这与整个研究队列中的所有其他动物(包括联合STAT 3中的动物)不同。 i SPNP+IR组，坏死区一般较小，对肝功能无明显的生物效应。
其次，用改良的酶联免疫吸附试验(ELISA)评价SPNP诱导的免疫应答. 15 )。为了避免因HSA在小鼠体内的使用而引起的种间错配，我们合成了相同的NPs，用小鼠血清白蛋白(MSA)代替HSA。在任何一组治疗组中，均未观察到与msa spnp特异性的循环抗体，表明对spnp的任何单独组分(如og、stat 3)具有可忽略的免疫原性。i 、IRGD，或PEI(图1. 4K )。正如预期的那样，用hsa代替msa导致两者的hsa抗体水平升高，STAT 3。 i SPNP和空SPNP治疗组(图1)。 4L )。免费STAT 3 i 治疗没有引起同样的反应，这表明抗体是针对NPs的暴露而形成的，而不是主动的治疗成分。
综上所述，我们的结果表明连续静脉滴注STAT 3 i SPNP联合辐射不会引起全身毒性。有充分的文献证明，包括肝和肾组织在内的单核吞噬细胞系统接受静脉注射的NPs。 64 。血清肌酐、血尿素氮、转氨酶、天冬氨酸转氨酶等生化指标是肝、肾急性炎症的较好指标。在我们的研究中，没有由STAT 3引起的炎症反应。 i SPNP+IR治疗 4 和补充表 1 )，表明我们的治疗策略不会引起短期毒性。为了阐明STAT 3潜在的长期副作用，还需要进行进一步的研究。 i SPNP+IR治疗。
流式细胞术分析肿瘤浸润的巨噬细胞和常规树突状细胞(CDCs：CD 45+/CD11c+/B 220−)，比较含游离STAT 3的治疗组。 i 、空SPNP和STAT 3 i SPNPs与IR(图1)相结合。 5 A和 b )。CD 45共染色 + 用含F4/80和CD 206抗体的细胞建立肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)的亚群。在TAM群体中，所有队列均发现M1(CD 45+/F4/80+/CD 206−)和M2(CD 45+/F4/80+/CD 206+)巨噬细胞表型，但其相对丰度在STAT 3中差异显著。 i SPNP+IR组与其他各组比较。在STAT 3中 i SPNP+IR组M1巨噬细胞增加2.5倍。 5C ，而M2巨噬细胞的数量却减少了3至4倍(如图所示)。 5C (中)这些发现与STAT 3的观点是一致的。 i SPNP+IR可选择性地降低免疫抑制性M2巨噬细胞亚群。此外，在接受STAT 3的动物中，CDCs的抗原呈递量显著增加。 i SPNPs与游离siRNA和空SPNPs比较(图1)。 5C ，右)。IR治疗进一步提高了这一效应，导致STAT 3的数量最多。 i SPNP+IR组。CD 45和F4/80的共染色 高 STAT 3中CD 206和Arg 1抗体的细胞 i SPNP+IR组证实TAMS绝大多数为M2表型(附图)。 16 )。在所有TME CD 45中 + 免疫细胞中，只有M2的巨噬细胞表现出远红色的Alexa Fluor 647信号，提示免疫抑制的M2巨噬细胞是主要的TME基础免疫细胞，可内化SPNPs(补充图)。 17 ).
图5：SPNP对GBM再挑战的防护作用。 a , b 肿瘤浸润的血流分析(英文) a )巨噬细胞和( b NP+IR治疗方案后TME中的常规树突状细胞(CDCs)群。显示每个组的有代表性的流图。 c 对免疫细胞浸润的定量分析显示相对巨噬细胞(M1VS)发生了变化。M2)存在于TME中。在自由的siRNA中，空的SPNPs和STAT 3 i SPNPs组巨噬细胞数量无明显变化。反之，STAT 3 i SPNPs+IR处理可引起M1细胞数量增加2.5倍，M2巨噬细胞急剧减少3~4倍。在CDCs中，观察到越来越多的细胞从游离siRNA转移到SPNPs组。STAT 3的联合治疗 i 伴有IR的SPNPs显示脑TME中CDCs的数量最多。数据以平均值±S.D表示。(=5个生物复制；单向方差分析和图基多重比较试验；*) p < 0.0001, ***p < 0.001, *p (M2)=0.028，0.013，* p (Cdc)=0.038，0.011)。 d 为STAT 3重新挑战长期幸存者的时间表 i SPNPs+IR生存研究再次受到挑战，肿瘤植入后不再提供进一步的治疗。 e Kaplan-Meier生存曲线显示，在没有任何治疗干预的情况下，所有被重新挑战的幸存者达到第二个长期生存时间点(90 DPI)。 f H&E(顶，鳞条=1mm)，MBP(中，刻度条=1mm)和CD8(底部，鳞条，100μm(内嵌20m))IHC染色比较未治疗和再挑战的长期存活者的大脑。展示了由每组三个生物复制体组成的单个实验的代表性图像。在接受重新挑战的长期存活的STAT 3患者中，未观察到残留肿瘤、坏死、炎症或正常脑结构中断的明显迹象。 i SPNPs治疗组。
最后，我们分析了DC在游离STAT 3引流淋巴结(DLNs)中的成熟状态。 i 、SPNPs、STAT 3 i SPNP和STAT 3 i SPNPs+IR应用流式细胞术治疗GL26-OVA荷瘤小鼠。为了观察SPNPs对DLN中DC活化的影响，检测MHCⅡ的表达。我们观察到DC的频率增加：CD 45+/CD11c+/MHC II+(~1.5倍)， p < 0.0001), in the dLN of STAT3i SPNPs治疗小鼠与游离STAT 3比较 i SPNP治疗小鼠。在IR存在下，这一性能进一步提高了1.3倍( p < 0.0001) (Supplementary Fig. 18 )。这些数据表明STAT 3 i SPNPs与辐射结合，通过增强MHCⅡ的表达而诱导DC的活化，MHCⅡ参与抗原的提呈。
肿瘤再挑战研究 目前的标准护理方法，包括手术切除联合聚焦放疗和化疗替莫唑胺，已用于治疗原发性GBM肿瘤。然而，由于GBM的侵袭性和浸润性，这些患者通常会经历复发，导致高死亡率和低生存率。根据我们在生存研究中观察到的令人鼓舞的免疫反应，我们选择重新挑战来自STAT 3的幸存者。 i SPNP+IR治疗组。肿瘤被植入小鼠对侧大脑半球，这些小鼠此前已被STAT 3治愈。 i SPNP+IR治疗。这些小鼠没有接受任何额外的干预治疗。 5D )。作为对照组，正常小鼠也在同一时间点植入肿瘤，同样没有接受任何治疗。如预期的那样，对照组肿瘤生长迅速，病征增多，MS为27 DPI。尽管没有接受任何额外的治疗，所有的再挑战小鼠存活到第二个长期生存点90 DPI(相对于第二次肿瘤植入，180天后，最初的肿瘤植入)(如图所示)。 5E )。对大脑的IHC分析得出了类似的结果(图1)。 5F )。H&E染色清楚地显示对照组肿瘤形成完全发育，而再挑战组的成员在任何半球均无坏死、栅栏或出血区域(图1)。 5F 、顶部)。MBP染色证实周围脑结构没有明显破坏(图)。 5F (中)最后，观察到CD8 T细胞的存在降低了5倍(补充数)。 19 )在STAT 3中 i SPNP再刺激组与对照组比较(图1)。 5F 、底部)。重要的是，我们没有发现在再挑战幸存者的大脑中有任何不良影响。以往的研究表明，胶质瘤细胞死亡与伴随抗原的释放和损伤相关分子模式(DAPS)有关，可导致肿瘤抗原特异性T细胞的扩增和适应性的抗胶质瘤免疫。 65 。我们的研究结果表明，类似的适应性免疫反应似乎能预防继发性肿瘤；这是任何成功的GBM治疗的基本条件，这将需要长期根除移行和耐药的CSCs，而传统治疗通常忽略了这一点。
