单细胞表观基因组景观与ChromSCAPE的交互分析

染色质修饰在发育和疾病中协调基因表达的动态调节。大量方法的特点是广泛的组蛋白改变跨细胞类型，详细说明了它们在塑造细胞身份的作用。然而，这些基于群体的方法并不能捕捉到染色质景观的细胞间异质性，限制了我们对染色质在动态生物过程中的作用的认识。最近的技术发展使组蛋白标记能够在单细胞分辨率上进行映射，开辟了前景来描述复杂生物系统中染色质标记的异质性。然而，现有的用于分析块状组蛋白修饰谱的工具并不适合于单细胞表观基因组数据集的低覆盖率和稀疏性。在这里，我们介绍了一个用户友好的交互式闪亮/R应用程序，作为一个生物导体包，处理单细胞表观基因组数据，以协助解释细胞内的染色质景观。ChromSCAPE分析了抑制性和活性组蛋白修饰的分布，以及来自单细胞数据集的染色质可访问性景观。利用ChromSCAPE技术，我们对肿瘤微环境中的染色质景观进行了解离，识别出与细胞同一性和乳腺肿瘤亚型相关的不同的H3K27me3景观。

组蛋白修饰是基因表达、染色质折叠和转录机制的关键调节因子。最近研究表观基因组的单细胞方法的发展使人们能够了解群体内染色质修饰的异质性。这些实验方法通过将下一代测序与高通量微流控dna条形码(scchip-seq)耦合来评估组蛋白标记的单细胞分辨率分布。1,2或原位反应(scchil-seq)3、scchic-seq4，scCUT&tag5)。相对于scATAC-seq方法，它识别染色质的开放区域。6,7,8这些方法可以捕捉不同的染色质状态，富集于抑制性或活性组蛋白标记(例如H3K27me3或H3K4me3)。利用这些方法，我们可以研究复杂生物样本(如肿瘤)中表观基因组的异质性。1，并开始了解表观基因组多样性和染色质在疾病和发育中的作用。

用于分析大量芯片-seq实验的现有工具不适合于这些单细胞组蛋白修饰数据集的低覆盖率和稀疏性，这是由于二倍体基因组中每个细胞的dna分子拷贝数固有的低-最多两个。针对单细胞DNA数据集的特殊性，发展了几种分析scATAC-seq的计算方法。他们最近被定为基准9，与SnapATAC10CisTopic11，以及Cusanovich 201812三大表演方法。这些工具最初专门用于scATAC-seq，没有图形界面，需要一些脚本技巧。具有有限计算训练的生物学家可以使用诸如“scOrange”之类的应用程序来操作和分析scrna-seq和scatac-seq数据集。13和“Scrat”14.

这里我们介绍了ChromSCAPE(图1)。1)，它是一个用户友好、一步一步、可定制的闪亮/R应用程序，用于分析所有类型稀疏的单细胞表观数据集，作为生物导体包分发。用户可以在异质样本中以交互的方式识别具有共同表观基因组的亚群体，找出亚群体间差异富集的区域，并通过连接相关基因和通路来解释表观基因组。该管道从对齐序列或计数表开始，是为高吞吐量单细胞数据集设计的，该数据集包含低至100个单元的样本，在标准膝上型计算机上每个单元至少读取1000个单元，最多可读取25000个单元。ChromSCAPE接受多个样本，以便在样本之间和内部对细胞群体进行比较。无论采用何种技术，它都可以从单细胞组蛋白修饰配置文件以及scATAC-seq数据集中确定细胞身份。我们展示了ChromSCAPE在肿瘤微环境中的应用；我们识别了与细胞特征和乳腺肿瘤亚型相关的不同的H3K27me3景观。

用户上传单细胞表观数据格式化为计数矩阵、单细胞BAM或单细胞床文件开始分析。应用程序包括质量控制(QC)、分类和解释工具。用户可以以PNG、pdf或CSV格式保存绘图和表，并以RData格式保存R分析对象。

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从scchip-seq数据中识别单元标识。

测试ChromSCAPE的效率。1)在基于表观基因组(H3k27me3)的细胞亚群鉴定中，我们生成了一个已知真相的硅数据集，混合了4种不同类型的人类细胞：Jurkat B细胞、Ramos T细胞、mda-mb-468乳腺癌细胞和bbcx-22肿瘤细胞。1。有趣的是，Jurkat和Ramos细胞是在相同的微流控实验中处理的，防止了它们之间存在任何批次效应(见Grosselin等人)。1)。我们将ChromSCAPE与专为单细胞表观基因组数据集(scATAC-seq)设计的识别细胞身份的方法进行了比较。基于最近的scATAC-seq基准9，我们选择了性能最好的方法，即库萨诺维奇2018年12、SnapATAC10，以及CisTopic11。我们还对EpiScanpy进行了基准测试15，最近对各种单细胞表观基因组数据(scatac-seq，scdna甲基化，…)进行了分析。用Python开发的。我们将层次聚类应用于每种方法得到的约简特征空间，并使用ARI度量来评价它们识别细胞表型的能力。默认参数的ChromSCAPE能够很好地分离4种细胞类型，ARI为0.998(如图所示)。2A)，如库萨诺维奇2018年和CisTopic(都是0.996岁的ARI，图1)。2B)，紧随其后的是EpiScanpy(ARI为0.940，图1)。2B)。ChromSCAPE、EpiScanpy和SnapATAC都运行在50 KBP回收箱上，但SnapATAC有更多的噪音簇和稍差的ARI(0.822)。

我们还使用相同的参考数据集，比较了ChromSCAPE操纵和解释scChIP-seq数据集的灵活性，并将其与具有图形接口的两个应用程序进行了比较(图2)。2C)，使用默认设置或优化输入和设置。ScOrange是一个独立的平台，允许研究人员创建工作流来分析单细胞数据集，提供各种各样的分析模块。对于scrna-seq来说，许多工作流已经开发出来，可以随时使用，而对于表观基因组数据集，用户需要有事先的计算知识才能组织适当的工作流。我们设法根据原始样本对单元进行分组，只使用优化的工作流程(如图所示)。2C，默认与优化)。Scrat是一个闪亮的/R软件包，作为用户界面来分析单细胞表观基因组数据。Scrat的默认选择是计算“ENCODE集群”中的读取量，这些读取量对应于从dnase-seq数据集获得的共同调节的开放染色质区域，而不是用于分析H3K27me3这样的抑制性组蛋白标记。为了将Scrat用作参考scChIP-seq数据集，我们必须预先计算在“伪散”(见方法和“优化”面板)上调用的预定义峰值的计数，从而限制Scrat的可用性。此外，与ChromSCAPE相比，两种应用程序都没有提出将基因组区域与基因注释相关联的功能，从而限制了对差异分析结果的生物解释。

与单细胞转录技术一样，单细胞表观基因组技术也可能受到各种批量效应的影响，例如库的制备、水凝胶珠的批量制备或免疫沉淀或裂解的效果。为了克服这一问题，我们在ChromSCAPE中实现了一个基于快速MNN方法的批处理校正模块。16。为了测试这一功能，我们使用了三个数据集：两个来自我们之前的研究(HBCx-95和HBCx 95-Capar，用第1批珠子收集)和一个新的数据集，HBCx 95-批2，这是HBCx-95的生物复制，即来自同一个PDX模型的PDX肿瘤，但用一批新的珠子处理。用ChromSCAPE对3例H3K27me3肿瘤标本进行分析。如附图所示。2A强批处理效应在批次校正前将两个生物复制分离开来(左面板)。应用批式校正(右面板)后，未处理HBCx-95肿瘤的两个生物复制体的细胞成功混合，但未与耐药肿瘤的细胞混合，提示该模块校正批处理效应而不过度纠正生物学差异。

我们还评估了ChromSCAPE对其他类型的单细胞组蛋白修饰数据的可用性，这些数据是由scChIP-seq以外的其他技术获得的。我们分析了针对H3K27me3和H3K4me3标记的两个公共数据集scCUT&TAG和scChIC-seq。由于用户可以直接将GEO单细胞床文件上传到应用程序中，ChromSCAPE可以方便地分析这些公共数据集。我们建议H3K27me3标记--在宽峰中积累--将信号聚合到50 kbp的回收箱中，对于H3K4me3标记--在尖峰中积累--在5kbpb内或基因TSS附近计数(±2500 bp)。如附图所示。1A对于SCCUT&TAG数据集，两个K 562复制子没有批处理效应，分别与H1细胞聚在一起(ARI=0.976)。用于scchic-seq数据集(补充图。1B)，正如作者在他们的研究中所发现的那样，在UMAP表示上可以清楚地观察到7个星系团。4.

ChromSCAPE从scatac-seq数据中对细胞进行分类。

为了评估ChromSCAPE分析所有类型单细胞表观基因组数据的能力，我们重新分析了包含8个细胞系和4个患者来源细胞的scATAC-seq数据集(GSE 99172)。该数据集部分是在一项使用chromVar(一种专用scatac-seq分析工具)的研究中产生和分析的。17我们使用的颜色代码与原来的研究相同。该数据集包含多种生物样本，以及K 562和GM 12878两个细胞系的技术复制，分别有6个和4个技术复制。由于每个样本的细胞数量相对较少(n=96)，我们将包含在分析中的单元格的读取计数阈值设置为1000。我们用每个样本的分配分数来测量ChromSCAPE根据细胞来源的细胞类型对细胞进行分类的能力。X和每一组Y (样本X中分配给聚类Y的细胞数目/样本X的细胞总数).

在无监督分析中，我们确定了最优的聚类数。k=5根据cf曲线下面积的相对变化(图1)。3A和补充图。3A)。不同技术复制的K 562和GM 12878细胞均聚为第5组和第2组，分配分数分别为99.7%和98.3%(图二)。3B)。对所有样本进行聚类分析后，ChromSCAPE可明显识别TF1、K 562和GM 12878细胞--即一致聚类为稳定的分离簇，平均影响99.4%的细胞进行聚类校正。簇C1将AML、Mono和LMPP样本与HL 60细胞株聚在一起，该细胞系也是从AML患者的白细胞中提取的。

(a)相关滤波后的t-SNE表示(n=1309个单元格)，根据原始样本(左)或ChromSCap确定的簇对点进行着色(k=5)(右)。GM 12878和K 562样品分别有4个和6个重复。(b)对于所有样本的分析，每个样本/聚类对的分配分数。(c, d)如(a)和(b)仅对AML、LSC、单核细胞、LMPP和HL 60细胞进行分析。n=347个细胞)。

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为了更深入地了解C1簇内的细胞同一性，我们用ChromSCAPE对C1中的细胞进行了重新分析。与第一轮分析相比，ChromSCAPE能够区分样本内的细胞同一性，并能检测出单个细胞簇，两个正常样本(LMPP&单核细胞)和HL-60(平均分配分数为98.3%)的分配得分较高，如图所示。3C，d)。此外，来自患者SU070的AML细胞显示出比患者SU353更大比例的单核细胞(如图所示)。三维空间, p-数值=0.0025，Fisher‘s精确检验，SU 070和SU 353细胞中有单核细胞的比例分别为85.0%和25.7%)，如上文对这些细胞的描述18。ChromSCAPE根据其染色质的可获得性来识别正常免疫细胞环境中的不同群体。在AML患者样本中，ChromSCAPE将每个癌细胞与健康人群中最相似的细胞相匹配。

ChromSCAPE解聚肿瘤微环境的表观基因组

为了进一步展示ChromSCAPE的应用，我们询问了两种乳腺肿瘤亚型：腔型和三阴性(TNBC)乳腺肿瘤在肿瘤微环境中染色质状态的异质性。肿瘤微环境是肿瘤演化过程中的关键因素，随着肿瘤治疗的不同，肿瘤的类型也会发生变化。我们的目的是比较H3K27me3细胞景观的肿瘤微环境的腔型和TNBC亚型，是否对癌症的治疗。HBCx-22和HBCx-22-Tamr数据集对应于来自一对腔ER的小鼠细胞。+乳腺PDX1对他莫昔芬和抗他莫昔芬的HBCx-22-Tamr有反应的HBCx-22。HBcx-95和HBCx-95-capar与获得性耐药乳腺癌(Tnbc)肿瘤模型相对应。1。我们分析了这四个h3k27me3小鼠scchip-seq数据集，其中两个在我们之前的研究中没有被分析过。1。利用ChromSCAPE，我们提出了一种基于染色质分布的细胞群的综合观点，并展示了肿瘤类型和治疗特异性细胞群的识别和各自的染色质特征。图中的所有情节。4由应用程序自动生成，并可从接口下载。在质量过滤步骤中，每个单元格的读取阈值为2000，这是由于初始单元数相对较高(n=5516个细胞)。

在降维步骤之后(如图所示)。4A，b)，我们将协商一致的聚类方法应用于过滤后的数据集。k=2至k=10组。我们选择将数据划分为k=4簇，基于膝部法，作为一个平台，在cf曲线下观察到面积的相对变化。k=4和k=5组(图1)。4C，d和补充图。4A，b)。图中的共识得分矩阵。4D结果表明，大多数细胞被稳定地分配给四个染色质群体(所选簇群的平均一致性评分为0.91，显著高于其他组群的平均一致性评分，0.17，p-数值=2.2e-16，双面学生的t-测试)。细胞分配给C2和C4簇的稳定性明显低于C1和C3(p-数值<2.2e-16，学生的双面t-检验，C1-C3和C2-C4分别为0.84和0.90，C2-C4分别为0.70和0.71，参见补充图。3AC2和C4的细胞可能具有H3K27me3的特征，而C1和C3的细胞具有明显的H3K27me3景观。簇C1、C2和C4含有来自所有四个样本的细胞，其中HBCx-22-Tamr的比例明显高于C1(p-数值=3E-05，Pearson‘s X-平方检验)(图.4E)。另一方面，C3簇几乎完全由HBCx-95型细胞组成。4C，e)，揭示了三阴性乳腺癌模型(HBCx-95)所特有的基质细胞群体。

为了进一步识别每个基于染色质的群体的具体特征，我们使用默认参数进行了峰值呼叫、差异分析和基因集富集分析(见方法)。由于H3K27me3是一个抑制性组蛋白标记，我们重点分析了在H3K27me3中缺失的基因转录位点。差异分析分别确定了189个、210个、83个和9个显著贫化区域，用于簇C1至C4(图1至图4)。4G，logFC<1，调整后p-数值<0.01)。我们发现没有h3k27me3特异于C2簇的基因位点，丰富了与顶端连接相关的基因，如BCAR 1(无花果)4F)和Ptk 2，这是成纤维细胞表达基因的特征。我们发现h3k27me3在基因上与C3簇有特异性的缺失。恩罗斯(无花果)4F)和Il10ra、免疫表达程序的两个特征基因。H3K27me3在H3K27me3转录起始点的缺失Rap1Gap2一个在内皮细胞中表达的基因，是C4簇的一个重要特征。4F)。对于C1和C2簇，我们发现H3K27me3在ELN，一种在成纤维细胞中表达的基因。

对位于H3K27me3富集区的基因进行的基因集富集分析只显示了很少的丰富基因列表，主要是针对C2(q-数值<0.1，如图所示。4H、多个与干细胞和癌细胞相关的基因集)和一个C1基因列表(“LPS_VS_Controlmoncell_up”)。将H3K27me3的富集与转录联系起来确实是间接的，我们设想这种富集分析更适合于H3K4me3 scChIP-seq，其中富集区与基因转录直接相关。

总的来说，这些结果与我们先前对hbcx-95 scrna-seq数据集的分析是一致的，在这些数据集中，亚群体有差异地表达成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞的标记。1。由HBCx-22数据集组成的这一分析使我们能够识别潜在内皮细胞的H3K27me3特征(C4簇)。这些单元在每个模型中都存在，但由于单元表示较低，以前的scChIP-seq分析中可能没有检测到这些单元。此外，潜在免疫细胞的H3K27me3特征仅限于来自TNBC模型的细胞(簇C3)，提示这些免疫细胞不存在于腔内肿瘤。

ChromSCAPE是为生物学家和生物信息学家设计的一个闪亮的/R应用程序，用于分析复杂的染色质分析数据集，如scchip-seq数据集。综合应用快速接管，直接可视化单元簇，结合可配置参数，增量节省中间R对象，方便了参数的台架标注。我们表明，ChromSCAPE在从H3K27me3 scChIP-seq数据集的硅混合物中识别细胞同一性方面，表现得与最先进的单细胞表观分析工具一样好或更好。它还能够识别复杂的scATAC-seq基准数据集中的亚群体，显示其在表观基因组分析中的广泛应用。此外，利用ChromSCAPE技术研究乳腺肿瘤中小鼠基质细胞的表观基因组，可以识别肿瘤微环境中的各种表观基因组。总之，我们认为ChromSCAPE是一种有用的工具，可以在不同的生物环境下探测染色质剖面的异质性和动力学，不仅在癌症的发展中，而且在细胞的发育和细胞分化中。

实施

ChromSCAPE是在SIGH/R中开发的生物导体R软件包，它使用各种闪亮的相关软件包(shinyjs、shinydashboard、shinyDirectoryInput)作为用户界面。该应用程序利用公共R库进行数据虚拟化(Rcolor Brewer、着色Ramps、Rtsne、UMAP、采色机、kableExtra、针织品、viridis、ggplot 2、gplts、PNG、Grid、gridExtra、DT)以及数据操作(矩阵、dplyr、tidyr、string r、irlba、rlist、qualv、tracdisr)。ChromSCAPE使用生物导体封装(I)处理单细胞数据与单细胞实验19斯兰20，(Ii)利用IRERER和GenomicRange处理基因组区域21，(Iii)使用Rsamtools和BiocParline操纵基因组文件，(Iv)用Bat螯合物纠正批处理效应16和(V)用ConsensusClusterPlus确定最优簇数22。此外，ChromSCAPE还使用自定义的R函数，用于数据集的操作和可视化。简短的命令行使没有任何生物信息学技能的用户能够安装所有R依赖项并在Web浏览器中运行应用程序。

示范应用

有关ChromSCapi的演示可在Https://vallotlab.shinyapps.io/ChromSCape/.

输入数据集、质量控制和预处理

ChromSCAPE的输入文件是一个或多个计数矩阵，其中包含行中的基因组区域、列中的单元格、单细胞BAM或BEAD文件。在这种情况下，必须指定包含单细胞BAM或BEAD文件的目录，并通过将信号聚合到连续的基因组桶、峰值(BEAD文件必须由用户提供)或基因转录起始点(TSS)周围的区域来创建计数矩阵。对于具有宽峰分布的H3K27me3 scChIP-seq数据集，我们建议使用50 kbp的回收箱，而对于H3K4me3 scChIP-seq或scATAC-seq数据集，我们建议使用较小的回收箱(例如，5kb)、已知峰值或TSS周围的区域。然后使用文件名和用户指定的条件数来启发式地确定每个单元格的“条件”或“标签”。用户指南中给出了指向数据集的指南和链接(Https://vallotlab.github.io/ChromSCape/ChromSCape_guide.html).

为了有效地从分析中删除孤立点单元，例如复盖度过高或过低的单元，用户设置每个单元格的最低读取计数的阈值和要删除的单元格的上百分位数。后者可以对应于双链，例如，一个液滴中的两个细胞，而低覆盖的细胞信息不够丰富，或者可能对应于与污染DNA或图书馆伪影连接的条形码。不受用户定义的、覆盖范围大于1000的单元格的最小百分比支持的区域将被过滤掉。默认参数是根据我们以前的研究中对多个scchip-seq数据集的分析而选择的。1：：每个细胞的最低覆盖范围为1600条唯一读取，过滤出覆盖率最高的5%的细胞，并保持至少1%的细胞中检测到区域。后质量控制滤波，矩阵按读取总数和区域大小进行归一化。在这一步骤中，用户可以提供一组基因组区域的列表，例如，在细胞间已知拷贝数变化区域的情况下，在随后的分析中排除基因组区域。

为了进一步分析归一化矩阵的维数，将主成分分析(PCA)应用于该矩阵，并以中心为中心，保留50台第一台计算机进行进一步分析。用户可以在PC空间中对质量控制后的scChIP-seq数据进行可视化。T分布随机邻居嵌入(t-SNE)算法23和UMAP24应用于主成分分析，对数据进行二维可视化。PCA和t-SNE图是一种方便的方法，可以检查单元是否以任何聚类方法之前所期望的方式形成簇。例如，用户应该通过检查PC1和PC2空间中单元的分布情况来验证QC过滤步骤和规范化过程是否有效。单元格应独立于规范化覆盖范围进行分组。在我们手中，对于scchip-seq h3k27me3数据集，每个单元格至少需要1,600个唯一读取的覆盖范围，才能独立于覆盖标准化后的单元格进行分离。1。一种使用相互最近邻“FastMNN”函数的批处理方法16实现以删除缩减特征空间中的任何已知批处理效果。

分层聚类、过滤和一致聚类

以前50台计算机主成分分析的前50台作为输入，以1-Pearson相关评分为距离度量，进行层次聚类。为了提高聚类方法的稳定性，并从分析中剔除不属于任何子群的分离细胞，显示Pearson两两相关分数低于阈值的细胞t至少有p有%的细胞被过滤掉(p默认设置为1%)。相关阈值t计算为随机数据集的Pearson配对相关分数的用户定义百分位数(建议将百分位数设置为第99百分位数)。显示相关滤波前后的相关热图和剩余单元数，以通知用户有关过滤过程的信息。

ChromSCAPE使用生物导体ConsensusClusterPlus软件包22确定什么是合适的k-将筛选的数据集划分为k集群。为此，它评估集群的稳定性，并为每个可能的分区计算每个单元的项目一致性得分。k=2至10。k数据集的一致性划分是基于层次聚类的1000次重采样迭代(每次迭代采样的单元数的80%)，以Pearson的不同度作为距离度量和Ward的连锁分析方法。然后用户选择最优的簇数；一种选择是根据处理后显示在“协商一致聚类”选项卡上的图形，最大限度地提高簇内相关分数。聚类成员关系可以用t-SNE或UMAP图在二维中可视化。

基因组区域标注的峰值呼唤

分析的这一步是可选的，但建议在丰富分析之前细化峰值注释。为了能够运行这个模块，MACS 2是必需的。25。用户需要输入样本的BAM文件(每个示例一个单独的BAM文件)，每个读取都标记为条形码ID。ChromSCAPE根据先前确定的单元格集群(每个集群一个单独的BAM文件)合并所有文件并再次拆分它们。可自定义的峰值检测意义阈值和峰值合并距离(默认值为p-值=0.05，峰值合并距离为5,000)，可以识别接近基因转录起始点(TSS)的峰值(<1000 bp)；这些基因稍后将用作富集分析的输入。对于注释，ChromSCAPE使用参考人类转录组GENCODE_hg38v26，仅限于蛋白质编码、反义和incRNA基因。

微分分析与路径富集分析

为了识别特定集群中单个细胞间的差异富集区域，chromSCAPE可以执行(I)一个非参数的双边Wilcoxon秩和检验，比较来自一个集群的单个细胞与所有其他细胞的归一化计数，或者使用edger进行一个参数测试，比较来自单个细胞的原始计数，或(Ii)一个参数测试，比较单个细胞的原始计数。26，基于数据服从负二项分布的假设。我们检验了一个零假设，即两个比较组归一化计数的分布具有相同的中位数，置信区间为0.95。计算p-值由bjamini-hoch修正。eBerg程序27。用户可以设置日志2倍的变化阈值并进行校正。p-将被视为显著差异丰富的区域的值阈值(默认设置为p-数值和log 2-变化阈值分别为0.01和1)。如果用户指定了批处理，则使用scran包中的“pairwiseWilcox”函数进行差异分析。20，将原批次设置为每个单元格的“阻塞级别”。

对于前100个最重要的差异区域，单个细胞H3K27me3的富集水平可以被可视化地叠加在一个t-SNE图上，每个细胞在选定基因处的H3K27me3计数。使用上一步完成的对峰值的精细注释，最后一步是查找mSigdb v5数据库的丰富基因集。28在不同的富集区域内(研究组蛋白标记中的富集区或贫化区)。我们应用超几何测试从MSigDB v5数据库中识别基因集，该数据库在差异富集区域过度表示，用Benjamin amini-Hochberg程序对多重测试进行校正。然后，用户可以可视化与每个集群的表观遗传标记相对应的最显着富集或耗竭的基因集，并下载基因集富集表。

数据集

H3K27me3 scChIP-seq人 硅中 混合4种细胞类型：样品符合n=326个未经处理的PDX人肿瘤细胞(HBCx-22)，n=201人T细胞(Jurkat)和n=306个B细胞(Ramos)1和n=454个mda-mb-468三阴性乳腺癌细胞系(HBCx-22、Jurkat和Ramos的数据来自“GSE 117309“)，mda-MB-468可在”GSE 152502”).

H3k4me3 scchic-seq人类白细胞数据集4: n来自人类男性供体的285个白血球被下载为gzip单细胞床文件GSE 105012“，直接输入ChromSCAPE，并聚合成50 kbp的回收箱(默认)。

H3K27me3 ScCUT&Tag人H1和K 562细胞5:K 562细胞株的复制n=908个来自“GSE 124680“，又一次复制了n=479个K 562细胞n=486个H1细胞来自“GSE 124690“以gzip单细胞床文件的形式下载，直接输入ChromSCAPE，并聚集在tss基因周围(±2500 bp)。

H3K27me3 scChIP-seq人类数据集：这些样本与来自两种不同供体的异种移植(Pdx)中的人细胞相对应。1。在本研究中，我们添加了一个新的scchip-seq数据集，对应于HBCx-95的生物复制。GSE 152502“)，用一批新的水凝胶珠处理。

ScATAC-seq数据集：Scatac-seq数据集由两种来自急性髓系白血病(AML)的细胞类型(SU 070和SU353囊胚细胞(BLAST)和白血病干细胞(LSC))组成。18)以及多个细胞系：GM 12878(4个重复)，TF1，BJ，H1，HL 60，K 562(3个重复)29，K 562(3次复制)17；单核细胞(Mono)和淋巴启动多能祖细胞(LMPP)18。读取峰值的计数矩阵是从GEO登录号下载的。“GSE 99172“，将每个样本划分为不同的矩阵，并格式化为ChromSCAPE的输入。

H3k27me3 scchip-seq小鼠数据集：样本对应于来自两种不同人类供体的患者源性异种移植(Pdx)的小鼠细胞。1。使用scchip-seq数据工程管道(见上文)的最新版本处理原始FASTQ读取，生成50 kbp的二进制计数矩阵，作为ChromSCAPE的输入(矩阵可在Https://figshare.com/projects/Single-Cell_ChIP-seq_of_Mouse_Stromal_Cells_in_PDX_tumour_models_of_resistance/66419).

细胞株

用ATCC(HTB-132™)获得mDA-MB-468细胞，在DMEM 1640(吉布科-BRL)中培养，加入10%热灭活胎牛血清.细胞数，如台盼蓝排斥试验所判断的，是通过使用伯爵夫人自动细胞计数器(Invitrogen)计数细胞来确定的。细胞在37℃加湿5%CO中培养2大气层。细胞株为支原体阴性。采用胰蛋白酶(胰蛋白酶、吉布科-BRL)对MDA-MB-468细胞进行胰蛋白酶处理.在单细胞芯片seq之前，细胞被重新悬浮在pbs/0.04%的BSA(热费舍尔科学，#AM 2616)中。

患者源性异种移植(PDX)

瑞士雌性裸鼠从查尔斯河实验室购买，并在特定的无病原体条件下饲养。他们的照料和住房符合机构准则和法国道德委员会的规则(项目授权编号02163.02)。来自新辅助化疗后残留三阴性乳腺癌(HBCx-95)的PDX是在居里研究所(Institut Curie)建立的，得到患者的知情同意。1。在单细胞芯片seq之前，用胶原酶Ⅰ(Roche，#11088793001)和透明质酸酶(Sigma，#H 3506)在37℃下消化2h。然后用0.25%胰蛋白酶/Versen(热费舍尔科学，#15040-033)、Dispase II(Sigma，#D 4693)和DNase I(#11284932001)的混合物在37°C下进行个体化。然后加入红细胞裂解缓冲液(热Fisher科学，#00-4333-57)降解红细胞。为了提高细胞悬液的活力，使用“死亡细胞清除试剂盒”(Miltenyi Biotec)去除死细胞。细胞在pBS/0.04%BSA(热Fisher科学，#AM 2616)中重新悬浮。

单细胞芯片

ScChIP-seq的协议与Grosselin等人的协议严格相同。1，并且可以通过以下主要步骤恢复。首先在微流控芯片中将细胞分成含有Mnase的液滴，然后与条形码水凝胶珠进行融合。将含细胞液滴与含珠液滴融合后，用快速连接DNA连接酶[Lucgen，#LK0750H]将片段DNA连接到条形码上。用2.5μl抗H3K27me3抗体([细胞信号技术，#9733])将液滴集合用于染色质免疫沉淀。用RNase A(热Fisher科学，#EN 0531)和蛋白酶K(热Fisher科学，#EO 0491)处理后，用T7 MegaScript试剂盒(热Fisher科学，#AM 1334)进行体外转录，并进行反向转录。RNA酶切后，PCR扩增DNA。最后产物经凝胶电泳筛选。最后在IlluminaNextSeq 500 MidOutput 150周期上对单细胞芯片-seq库进行了排序。

H3K27me3 scChIP-seq数据集的解复用与比对

原始的fastq读取使用scchip-seq数据工程管道的最新版本进行处理，该管道允许更精确地删除pcr和rt副本(代码可在Https://github.com/vallotlab/scChIPseq_DataEngineering)生成50 KBP绑定计数矩阵，作为ChromSCAPE的输入(矩阵可在Https://figshare.com/projects/Single-Cell_ChIP-seq_of_Mouse_Stromal_Cells_in_PDX_tumour_models_of_resistance/66419)。快速地，Read 2的前56 bp被分成三个指标，并分别用Bowtie 2对96条16 bp长指数的3个池进行比对。读取包含所有三个可识别的指标(一个完整的细胞条形码)，Read 2和READ 1的基因组部分用STAR v2.7.0以成对方式对齐。对每个条形码，依次删除：(I)PCR重复，确定#READ 1+#READ 2是否映射在同一位置；(Ii)RT重复，识别是否#READ 1映射在同一位置；(Iii)窗口重复：所有落在同一50 bp窗口中的读被叠加为一个读，可能来自同一个核小体。在跨越基因组的不重叠的50 kb的垃圾箱中，结合读取，生成一个n×m覆盖矩阵，其中含有n个条形码，m个基因组桶用于下游分析。

Scchip-seq数据分析工具的基准测试

根据Chen等人，2019年，致力于分析性能最好的scATAC-seq的三种方法。9，在H3K27me3 scChIP-seq数据集(见下文数据集)中进行了测试，即“SnapATAC”、“CisTopic”和“Cusanovich2018”。这些脚本取自基准文件的GitHub存储库(Https://github.com/pinellolab/scATAC-benchmarking)。对于“CisTopic”和“Cusanovich2018”，峰值是使用带有选项的MACS 2命名的接近5000 bp的峰用BEDTools合并在一起。对于“SnapATAC”，使用“SnapTools”从BAM文件中计数50 kbp的回收箱。此外，我们还测试了一种最近用于单细胞表观基因组分析的方法，“EpiScanpy”，遵循scATAC-seq教程中描述的基本步骤(Https://github.com/colomemaria/epiScanpy/blob/master/docs/tutorials/Tutorial_Hackathon_Buenrostro_2.html)与用于ChromSCAPE的50 KBP矩阵相同。从每种方法中提取约简特征空间的矩阵，并采用以Pearson的不同度为距离度量的层次聚类和Ward的链接方法。调整后的兰德指数(ARI)是一种被广泛使用的量化聚类精度的方法，每种方法都使用R包“mclust”计算。30，以原产样本为“真”簇。

此外，两个具有图形界面的软件，专门用于分析单细胞数据，“scOrange”。13和“Scrat”14，还在同一组单元格上进行了测试，这些单元格具有“默认”参数和手动“优化”参数。默认的“scOrange”对应于使用名为“从10×协议加载数据”的模板，这是一个用于分析骨髓细胞scRNA-seq的工作流程，替代了我们在50 kbp回收箱中选择的细胞的矩阵输入。“优化”工作流可在Www.github.com/vallotlab/ChromSCape_benchmarking并且可以用“scOrange”软件打开。对于“Scrat”，我们发现“优化”计数方法与在“伪散”上调用的峰值内的计数信号相对应(见上文)。

为了比较不同的方法，首先在原始计数矩阵上运行ChromSCAPE，并选择一组超过质量控制阈值的1287个细胞作为所有方法的输入。由于每个样本中的细胞数量不平衡(例如，含有mda-mb-468的原始mda-mb468)n=3 382个细胞，而其他细胞最多为3 382个n从MDA-MB-468中随机抽样500个细胞，使用ChromSCAPE“执行次采样”选项。我们从分析中删除了与已知扩增片段和三阴性乳腺癌细胞mda-mbb-468的dna纯合丢失相对应的片段，这些片段总共相当于77 mbp，之前是通过分析同一细胞的大容量芯片-seq的输入而发现的(见补充说明)。2).