敲除INcRNA NEAT 1对脑缺血再灌注后小胶质细胞活化和AKT信号转导及神经元凋亡的影响

急性脑缺血可能导致严重的后果，包括不受控制的再灌注所造成的脑损伤。长非编码RNA(INcRNA)核丰富丰富转录本1(NEAT 1)在免疫系统中起着重要作用。然而，NEAT 1在脑缺血再灌注(I/R)损伤中的潜在作用及其分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨INcRNA NEAT 1在脑I/R损伤中的作用及其对神经元的潜在作用。本研究采用氧-葡萄糖剥夺(OGD)/复氧(OGD/R)模型模拟脑缺血再灌注损伤。用胆囊收缩素-八肽(CCK-8)测定细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡。实时定量PCR(qRT-PCR)检测经典激活(M1)和交替激活(M2)小胶质细胞表型标记的表达，Western印迹检测与AKT/STAT 3通路相关的蛋白水平。缺血脑卒中患者INcRNA NEAT 1表达明显上调，INcRNA NEAT 1基因敲除可减轻OGD/R诱导的细胞凋亡，提高神经元活力。此外，INcRNA NEAT 1可抑制向M1表型的小胶质细胞极化，从而减少OGD/R所致的损伤，降低AKT/STAT 3通路的活性。因此，INcRNA NEAT 1可能成为脑缺血再灌注治疗新的靶点。

脑血管病是一种高致残率和高死亡率的疾病，在老年人中越来越普遍。1。预防永久性脑缺血所致损伤的唯一方法是尽快恢复脑缺血区的血流量。然而，动脉再通后会出现严重的损伤，称为缺血再灌注(I/R)损伤。2。I/R损伤的主要病理生理特征包括免疫应答和凋亡。3。然而，由于对I/R损伤的机制缺乏了解，临床上无法获得治疗I/R损伤的特定药物。4.

长的非编码RNA(IncRNAs)是指超过200个不编码蛋白质的核苷酸的RNA。5。近年来，incRNAs被证明参与了各种病理和生理过程，如凋亡、细胞周期进程、分化和炎症。6。据报道，incRNA核丰富转录本1(Neat 1)与各种疾病有关。7,8，已被证实与心肌I/R损伤有关。9，并被建议促进巨噬细胞内炎症小体的活化。10。有趣的是，NEAT 1最近被证明被阴阳1(Yy1)转录激活，并通过激活wnt/β-catenin信号通路来促进小胶质细胞的氧-葡萄糖剥夺/复氧(ogd/r)损伤。11.

小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的主要免疫细胞，在各种神经系统疾病的发病过程中发挥着多种功能。12。小胶质细胞一旦被激活，就在中枢神经系统疾病的病理过程中起着双刃剑的作用。13。急性脑损伤时，经典激活的小胶质细胞释放一些细胞因子，加重炎症损害。13。另外，激活的(M2)小胶质细胞通过吞噬和清除细胞碎片，减轻局部炎症，以及参与组织重塑，发挥神经保护作用。14.

因此，在本实验中，我们假设INcRNA NEAT 1在脑I/R损伤后调节小胶质细胞活化，促进神经元凋亡。本研究为脑I/R损伤新的治疗措施提供了一个潜在的靶点。

病人和血样

本文收集了哈尔滨医科大学第一附属医院神经内科2019年至2020年间急性缺血性脑卒中(AIS)患者的血液标本和临床资料。在哈尔滨医科大学附属第一医院体检中心采集正常人血液标本。这项研究是根据有关规定进行的，并获得所有参与者的知情同意。该协议经哈尔滨医科大学第一附属医院机构研究伦理委员会批准。

细胞培养

BV-2细胞在1×α最低必需培养基中加入Eagle‘s盐类、核糖核酸、脱氧核糖核酸和L-谷氨酰胺(MEM、Corning、NY、USA)，添加10%胎牛血清(FBS、Hyclone、LA、USA)、1%丙酮酸钠(SP，100 mmol、吉布科、CA、美国)和1%青霉素/链霉素(PS；100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素)。N2a细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Corning)中加入10%的FBS(HyClone)和1%的青霉素/链霉素(PS；100 IU/ml青霉素和100 g/ml链霉素)。细胞在5%CO的孵化器中培养。2在37°C。

慢病毒载体的制备及感染

表达NEAT 1 siRNA(si-NEAT 1)或对照siRNA(si-CON)的慢病毒是由中国上海Hanbio包装的。将包装好的重组慢病毒转染BV-2细胞进行NEAT 1基因敲除，并应用普罗霉素进行筛选，至少15天。补充资料).

OGD/R

如前所述，OGD在小胶质细胞和神经元中被诱导。15。首先去除原培养基，代之以无糖/无血清的DMEM。然后，将反应器转移到含5%CO的厌氧室。2和95%的氮237°C缺氧2h后，BV-2细胞在常规培养基下恢复正常状态，终止OGD并开始再灌注。用不同的OGD/R处理BV-2细胞上清液，使N2a细胞恢复正常状态，终止OGD并启动再灌注。

定量实时PCR

用TRIzol(LifeTechnologies Carlsbad，CA，USA)从细胞中提取总RNA，用TRIzol LS试剂(LifeTechnologies Carlsbad)从血液中提取总RNA。利用日本大阪的ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO CO.)，用FastStart通用SYBR Green Master(Rox)一式三份进行实时PCR分析(Roche，Mannheim，德国)。所有的qRT-PCR实验和数据分析程序都是根据定量实时PCR实验(MIQE)指南发布的最小信息进行的。

蛋白质分离与westernblot分析

细胞在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Beyotime，中国)的RIPA裂解缓冲液中，经超声作用于冰上，间隔30s。细胞裂解液经12,000 rpm离心，4℃离心10 min，上清液保留为总蛋白。蛋白质的定量使用双软骨酸(BCA)试剂盒(Sigma Aldrich，美国)。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质.然后通过电印迹将这些蛋白质转移到硝基纤维素膜上。用5%的封闭液(脱脂乳)阻断膜，然后在4°C下用含以下抗体的阻断缓冲液孵育：AKT、STAT 3、P-AKT、P-STAT 3和β-actin。第二天，在阻断缓冲液(1：1,000，脱脂奶)中加入辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊次级抗体，用化学发光试剂盒(美国费舍尔科学公司(Thermo Fisher Science，USA))检测蛋白质。塔农凝胶图像系统(塔农科技有限公司)用于摄影和量化。

胆囊收缩素-八肽(CCK-8)测定

用CCK-8来验证INcRNA NEAT 1是否影响神经元的存活。如前所述，N2a细胞暴露于OGD中。OGD暴露后，N2a细胞与OGD/R暴露的INcRNA NEAT 1敲除BV-2细胞或未处理的INcRNA NEAT 1敲除BV-2细胞的上清液共同培养24h，然后加入10μ1的CCK-8试剂(Beyotime，中国)，在37°C下孵育2h，用微板阅读器(Tecan，瑞士)在450 nm处检测吸光度。

流式细胞术

流式细胞术检测神经细胞凋亡。N2a细胞按上述处理，然后收集并重新悬浮在结合缓冲液中。采用FITC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(BD pharmingen，USA)对细胞进行FITC-Annexin V和碘化丙啶(PI)染色。采用BD-FACS流式细胞仪对凋亡细胞进行分析。

统计分析

所有数据用GraphPad Prism 7.0软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA)进行统计分析。两组采用双尾学生t检验，单因素方差分析与Dunnett多重比较试验对3组以上进行统计学比较。*、**、*和*分别表示p<0.0 5、p<0.0 1、p<0.001、p<0.0001。

INcRNA NEAT 1在脑缺血中的表达

采用qRT-PCR技术检测AIS患者NEAT 1的相对表达，探讨NEAT 1与脑缺血脑卒中的关系。表1提供了参与者的基本特征。在我们的研究中，AIS患者血液中NEAT 1的表达水平明显高于对照组(图1)。1a)。此外，NEAT 1的表达与发病时间呈正相关(图一)。1(B)和脑梗死体积(图1)。1c)。此外，NEAT 1的表达与脑卒中严重程度呈正相关。1(D)梗死体积(图1)。1e)。

OGD/R暴露及INcRNA NEAT 1表达的初步分析

BV-2细胞在无血清和无糖培养基中培养，模拟脑缺血再灌注损伤。OGD作用2h后，BV-2细胞再灌注2、6、12、24、48或72h，然后检测INcRNA NEAT1在BV-2细胞中的表达。INcRNA NEAT 1在OGD/R暴露后表达明显增加，再灌注48h达高峰(图1)。2因此，我们使用了2h的OGD和48h的再灌注来进行后续的实验。我们使用一种包装在慢病毒载体中的siRNA来敲除INcRNA NEAT 1。如图所示。2B.NEAT 1基因敲除BV-2细胞后，INcRNA NEAT 1的表达下调，与si-conc处理的BV-2细胞相比，表达下调。经si-NEAT 1处理的BV-2细胞和si-conc细胞经OGD处理2h，再灌注48h后，收集细胞，提取RNA和蛋白质，收集细胞上清液，供OGD作用后与N2a细胞一起使用。

INcRNA NEAT 1对脑I/R损伤神经元的影响

用OGD/R处理的INcRNA NEAT 1敲除细胞上清液培养N2a细胞，对照BV-2细胞或未处理的BV-2细胞在OGD暴露后24h，观察INcRNA NEAT 1在脑I/R损伤中的作用。然后用CCK-8检测神经元活力。CCK-8法显示，两组OGD/R暴露细胞上清液培养的N2a细胞与未处理细胞上清液培养的N2a细胞相比，存活率有显着性差异(图一)。3c)。我们还用流式细胞仪检测细胞凋亡，与未处理细胞上清液培养的N2a细胞相比，两组细胞上清培养的N2a细胞凋亡有显着性差异(图一)。3a，b)。因此，INcRNA NEAT 1的敲除可保护N2a细胞免受脑I/R损伤，INcRNA NEAT 1具有抗凋亡作用。

INcRNA NEAT 1抑制小胶质细胞向促炎症(M1)表型分化

将NEAT 1基因敲除的BV-2细胞置于OGD/R中，检测M1和M2小胶质细胞的mRNA表达。在OGD/R处理前，NEAT 1基因敲除细胞与对照细胞之间CD 16和CD 32的表达无显着性差异，而CD 86在NEAT 1基因敲除细胞中的表达水平高于对照组。经OGD/R处理后，NEAT 1基因敲除细胞中M1标记CD 16、CD 32和CD 86的表达水平低于对照组(图1)。4(a-c)并对M2标记物(BDNF、PDGF和Arg-1)的表达进行了分析。在OGD/R处理前，NEAT 1基因敲除细胞与对照细胞之间Arg-1表达无显着性差异，BDNF在NEAT 1基因敲除细胞中表达水平低于对照组，PDGF在NEAT 1基因敲除细胞中表达水平高于对照组。经OGD/R处理后，NEAT 1基因敲除细胞与对照组相比，Arg-1表达无显着性差异(P>0.0 5)，BDNF在NEAT 1基因敲除细胞中的表达水平仍低于对照组，PDGF在NEAT 1基因敲除细胞中的表达水平低于对照组(如图1所示)。4(d-f)基于这些数据，NEAT 1抑制了OGD/R暴露的小胶质细胞M1小胶质细胞极化，但不促进M2小胶质细胞极化。

INcRNA NEAT 1降低AKT/STAT 3通路活性

AKT和STAT 3在许多生理过程中都起着重要的作用。采用Westernblotting分析AKT/STAT 3通路。如图所示。5A，c，总STAT 3和AKT蛋白水平不变。此外，与对照组相比，NEAT 1基因敲除BV-2细胞在OGD/R后AKT和STAT 3的磷酸化均降低(图1)。5b，d)。因此，在OGD/R条件下培养的BV-2细胞中，INcRNA NEAT 1抑制了AKT和STAT 3的活性。

最近，大量的incRNAs被证明参与了脑I/R损伤。16。因此，识别脑I/R损伤的预后信息是必要和重要的。此外，韩和周已经证实NEAT 1参与了小胶质细胞的OGD/R损伤。11，为我们的研究提供了理论依据。本研究用OGD模拟BV-2和N2a细胞的缺血性脑卒中条件，探讨脑I/R损伤的可能机制。再灌注48h后BV-2细胞NEAT 1表达上调，提示INcRNA NEAT 1可能在脑I/R损伤中起重要作用。此外，采用qRT-PCR、Westernblotting、流式细胞仪和细胞活力测定等方法对INcRNA NEAT 1的功能进行了评价。

I/R可引起细胞凋亡、自噬、坏死和坏死。17,18,19。严重I/R损伤通过凋亡或坏死途径诱导细胞死亡20。本研究表明，INcRNA NEAT 1的基因敲除可减轻OGD/R诱导的N2a细胞凋亡，提高N2a细胞的存活率。

AHA/ASA指南建议早期重建AIS21。此外，维持I/R损伤后神经和器官的功能对医生来说是一个挑战。22。脑缺血再灌注损伤后最重要的策略是控制细胞损伤和保护器官功能。23。I/R损伤机制复杂多样，免疫应答可能是其中最重要的机制之一。当缺血后血液供应重新建立时，炎症就会增加。15。因此，针对免疫激活的方法是治疗I/R损伤的一种新的治疗策略。22。小胶质细胞在中枢神经系统中起重要作用，对缺血性损伤后脑内的免疫和炎症反应有调节作用。23。小胶质细胞通常表现为神经特异性表型，并保持相对静止的监视表型，以不断监测脑实质。24,25,26。在神经炎症过程中，小胶质细胞通过对不同表型的极化来发挥不同的功能。27。在我们的研究中，INcRNA NEAT 1可能抑制了小胶质细胞向促炎症(M1)表型的极化，但其调控小胶质细胞M1的详细机制尚不清楚，有待进一步研究。

AKT又称蛋白激酶B(PKB)，是调节细胞死亡和生长的重要因子。28,29。根据最近的证据，AKT激活STAT 3，因为它在STAT 3上游活动。30，STAT 3在细胞增殖和星形胶质细胞增生中起着重要作用。31。AKT/STAT 3也是IL-6通路的一部分，在免疫反应中起重要作用，可能参与脑I/R损伤。值得注意的是，根据我们的westernblot分析，与OGD/R暴露的对照细胞相比，与OGD/R暴露的对照细胞相比，OGD/R暴露的NEAT 1基因敲除细胞中AKT和STAT 3的磷酸化水平降低，但AKT和STAT 3的总蛋白水平保持不变。OGDR处理的NEAT 1基因敲除细胞与OGD/R对照细胞之间未见磷酸化和总AKT、STAT 3蛋白水平的变化。因此，NEAT 1与AKT/STAT 3通路之间的联系可能与NEAT 1对信号分子表达的直接调控无关。

小胶质细胞作为中枢神经系统中的巨噬细胞，具有与单核吞噬细胞相同的功能。31。然而，与巨噬细胞相比，小胶质细胞在采用M2表型和细胞因子谱方面受到更大的限制。32。巨噬细胞和小胶质细胞对m1极化的诱导作用均大于M2极化。31。这些发现可能解释了为什么小胶质细胞M2表型在我们的研究中没有明显改变。

总之，INcRNA NEAT 1具有神经保护作用，显著抑制小胶质细胞向M1表型的极化，降低AKT/STAT 3通路的活性。然而，我们尚不清楚NEAT 1是否促进小胶质细胞向M2表型极化，NEAT 1调控小胶质细胞极化的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

脑缺血损伤后INcRNA NEAT 1表达上调。脑缺血再灌注损伤可能比脑缺血更为严重。在OGD/R暴露后，INcRNA NEAT 1的敲除明显减少了小胶质细胞向促炎症(M1)表型的极化和细胞凋亡，增加了神经细胞的活性。另外，INcRNA NEAT 1的敲除抑制了促炎AKT/STAT 3通路的活性。这些发现为从表观遗传学角度治疗脑缺血/再灌注提供了新的策略。

临床观点

脑I/R损伤在临床上可引起比缺血性脑卒中更严重的症状。然而，脑I/R损伤的生物学机制尚不完全清楚。

在我们的研究中，INcRNA NEAT 1在缺血性脑卒中患者中的表达水平高于正常人，且与脑梗死体积有关。另外，INcRNA NEAT 1的基因敲除可减少神经元的凋亡，抑制小胶质细胞向促炎症(M1)表型的极化。

INcRNA NEAT 1可能是脑I/R的潜在治疗靶点，我们的研究为新的临床策略提供了依据。