CD8+T细胞的浸润遵循连续性
在这项研究中，我们首先建立了一套定量指标来描述卵巢癌的免疫表型。本文采用免疫组织化学方法(IHC)，对加入ICON 7试验的卵巢癌患者的370个档案组织(治疗-原始标本)进行了血氧素反染色的CD8免疫组织化学(IHC)检测。14,15。提出了一种用数字图像分析算法对CD8进行量化的方法。+肿瘤上皮中T细胞密度相对于间质室。具体来说，在病理学家的独立指导下，我们设计了一种算法，根据细胞核的形状和大小和苏木精染色来区分卵巢肿瘤上皮细胞和基质细胞。通过对肿瘤上皮区和基质区的严格区分，该算法量化了CD8总数。+T细胞计数及CD8+肿瘤上皮和基质区的T细胞计数(图)。1A、“方法”)。为了更好地捕捉和量化CD8的浸润模式，我们将这些CD8积分转化为极坐标，定义了两个新的定量指标：(1)CD8的数量。+T细胞与(2)CD8的空间分布+T细胞(“方法”)。接下来，我们使用这两个数字定义的定量指标来描述每个肿瘤的免疫表型。1B)。病理学家手工定义的浸润、排除和沙漠免疫表型的代表性肿瘤被强调，以验证这两种数字指标，其中沙漠肿瘤的CD8值较低。+T细胞数量(R评分)，排除与浸润肿瘤在CD8空间分布上的差异。+T细胞(θ评分)。CD8的不同形态+T细胞分布在数字表示的间质与肿瘤上皮区域的这些选定的肿瘤从图中。1B如图所示。1C。此外，我们的结果也证明了两者都是CD8+T细胞数量及其在TME中的空间分布在绝大多数肿瘤中更多的是连续体而不是离散实体(图1)。1B)。这些结果突出了使用我们的数字设计的二维定量指标来定义单个卵巢肿瘤的免疫表型的必要性和优势。
图1：CD8的空间量化+T单元采用数字图像分析算法。a数字病理学定量浸润CD8+T细胞位于间质和肿瘤上皮中。显示每个舱室的分数(n=155个样本)和b转换为极坐标，定义两个数字定量指标，以描述ICON 7训练集中每个肿瘤的免疫表型(n=155个样本)：(1)x轴，CD8的数量+T单元，定义为R=平方根[(CD8肿瘤)]2+(CD8间质)2]和(2)y轴，CD8的空间分布+T单元，定义为θ=atan(CD8间质/CD8肿瘤)。用彩色方格突出显示的点(蓝色代表沙漠，橙色代表排除在外，红色代表浸润)是显示在c. c有代表性的浸润、排除和沙漠肿瘤免疫表型的例子图像显示了它们独特的CD8。+T细胞在数字示间质与肿瘤区的分布。肿瘤区(绿色)，基质区(黄色)，CD8+肿瘤细胞(暗红色)，CD8+存在于基质中的细胞(粉红色)。对277例肿瘤标本进行了数字病理分析。源数据作为源数据文件提供。
免疫排斥肿瘤与不良预后有关。
接下来，我们将探讨一种基于基因表达的分子分类器是否可以用机器学习的方法来描述肿瘤免疫表型。图形2A总结了我们分析的发展工作流程。在这种方法中，转录组分析与数字病理学分析结合在ICON 7试验的同一组样本上。我们使用一套155的训练集，我们有数字病理学评分，我们鉴定了352个基因，这些基因的表达可以通过CD8的数量和/或空间分布来预测。+T细胞使用随机森林回归模型(“方法”，补充图。1A-c和补充数据1)。在这些基因中，103个基因与总CD8有关。+T细胞数量，56个基因在空间c8s中的表达变化。+T细胞分布和193个基因与总数量和空间分布均相关。2B和补充图。1C)。重点关注与CD8数量或空间分布完全相关的159个基因。+T细胞，我们对155个样本进行了一致聚类，并确定了6个具有不同分子图谱的簇(“方法”，补充图)。1D-f)。这六个集群都可以很容易地被划分为三种肿瘤免疫表型中的一种，即浸润型、排斥型和沙漠型，因为它们与低、中到高的CD8总数有关联。+T细胞数量，或有CD8+间质细胞与肿瘤细胞的T细胞富集。接下来，我们构建了一个157基因分类器来区分这三种肿瘤免疫表型，并应用微阵列预测分析(PAM)方法来区分这三种肿瘤免疫表型。16培训集(附图)。2、“方法”)。我们将此分类器应用于ICON 7收集的其余215个肿瘤样本(如图所示)。2C)作为一个独立的测试集。在ICON 7检测系统中，215份样本中有196份(91%)可进行分类，其中64份为浸润型(30%)，44份为排除型(20%)，88份为沙漠类(41%)。2C)。CD8IHC数据和数字病理分析仅适用于215个肿瘤样本中的122个。定义CD8的二维度量+这122个样本的T细胞数量和分布证实了分类器将它们分配给了一个合适的免疫表型。二维空间，右面板)。我们还选择了114个样本的子集，并将157基因分子分类器预测的肿瘤免疫表型与病理学家手工标注的肿瘤免疫表型进行了比较。对于排除在外的肿瘤，结果非常一致，但由于病理学家根据细胞数量确定浸润性的任意性质，浸润性和沙漠性肿瘤的一致性下降(补充图1)。二维空间).
图2：预测卵巢癌免疫表型的分子分类器。a分析工作流的示意图。b预测CD8的基因+随机森林算法识别的t单元数量和/或空间分布度量被过滤，以确定它们对每个度量指标的特异性(即，mse对于R或θ>3分位数)。c基于基因表达的预测免疫表型在训练中的分布n=155)和测试(n(2)来自ICON 7研究的一组卵巢肿瘤样本。d以CD8-IHC为基础的数字病理学定量指标一致地描述了预测的免疫表型。只提供具有平行rna-seq数据和CD8-IHC数字病理评分的样本；(左)训练。n=155个样本)和(右)测试集(n=122个样本)。e训练中肿瘤免疫表型与分子亚型的关系(英文)n=155个样本)和测试装置(n=196个样本)。每条显示特定分子亚型的肿瘤百分比，分类为浸润、排除或沙漠。未分类肿瘤(n不包括在分析中。IMR免疫反应阳性，MES间充质，促增殖，DIF分化。f无进展生存期的Kaplan-Meier曲线(Pfs)描述ICON 7化疗臂肿瘤免疫表型(左)和分子亚型(右)的预后价值(n=172个样本)。P数值是从Cox比例风险模型生成的，没有多重测试。c–e源数据作为源数据文件提供。
4种临床和生物学上相关的分子亚型，即免疫反应型(Imr)、间充质型(Mes)、增殖型(Pro)和分化型(DIF)，已在卵巢癌中得到证实。17,18,19。接下来，我们将评估本研究中定义的肿瘤免疫表型与基于先前开发的分类器的预测分子亚型之间的关系。18,19。如图所示。2E两种分类方案在ICON 7研究的训练和测试数据集上都有很强的一致性。具体来说，IMR分子亚型在浸润性免疫表型中高度富集，而MES肿瘤对于排除表型则高度富集。沙漠肿瘤主要为PRO或DIF分子亚型。
最后，我们发现肿瘤免疫表型与卵巢癌的临床结果有显著的关联.我们对纳入ICON 7临床试验的172名患者的数据进行了Cox比例风险分析，并进行了一致的随访。如图所示。2F与浸润型或沙漠型相比，T细胞排斥表型患者的无进展生存期(Pfs)明显缩短。同样，我们证明MES肿瘤是一种与T细胞排除的免疫表型显著重叠的分子亚型，与PRO或DIF亚型相比，PFS也表现出明显的恶化。另一方面，在我们的研究中，我们没有观察到浸润的和沙漠的免疫表型在PFS上的显著差异(图1)。2F)。部分原因可能是由于沙漠免疫表型所代表的混合固有生物学。支持这一观点的是沙漠免疫表型中富集的两种分子亚型DIF和PRO亚型的PFS趋势差异(图一)。2F)。最后，我们进行了多因素分析，以纳入几个已知的卵巢癌的预后因素，如分期，年龄和破乳状态。我们证实，晚期疾病(III和IV期)和次优治疗状态的患者在ICON 7队列中与不良预后显著相关。然而，排除的免疫表型与不良预后之间的关联即使在这些已知的预后因素的潜在影响校正后仍然显着(补充图)。3).
这些发现突出了肿瘤免疫表型的临床相关性，并为其与分子亚型所涉及的内在生物学过程之间的联系提供了见解。
分子特征定义了不同的免疫表型。
接下来，我们确定了与定义不同免疫表型的两个定量指标相关的关键分子特征。在ICON 7训练集鉴定的159个基因中，我们发现103个基因与CD8总数有关。+T细胞数量主要是细胞毒性特征(例如，GZMA, GZMB, GMZH, CD40LG)，并作为主要特征，以区分沙漠肿瘤与浸润和排除肿瘤(图一)。3A)。另一方面，在与CD8相关的56个基因中，有多个不同的分子特征。+T细胞的空间分布，包括抗原表达(即，TAPBP, PSMB 10, 拉道布)，转化生长因子β/基质活性(即，FAP, TDO2)，神经内分泌样特征(即，LRRTM 3, ASTN 1, SLC4A4)和新陈代谢(即，UGT1A3, UGT1A5, UGT1A6)(图1.3A)。有趣的是，浸润型和排斥型均表现为细胞毒性免疫细胞基因信号，表达量从中到高不等，但抗原表达和间质基因表达差异显著(图一)。3A)。与浸润性肿瘤相比，排斥性肿瘤具有明显的高表达转化生长因子β相关的激活间质基因和下调抗原表达基因的特点。另一方面，沙漠肿瘤的细胞毒性基因特征如预期的那样低，但唯一表达的代谢基因和暗示神经内分泌状态的基因(图1)。3A).
图3：具有不同肿瘤免疫表型特征的关键分子特征。a热图表示z-与CD8相关的159个基因的评分表达数据+ICON 7训练数据集中T细胞数量或CD8空间分布(n=155个样本)。样本按分子亚型、六类共识聚类和三级肿瘤免疫表型标注。共鉴定出8个基因簇。三个簇显示相似的生物学代表细胞毒性效应功能，因此是手动汇集。详细的基因列表可以在补充数据中找到1。一张总结三种肿瘤免疫表型生物学特征的表格显示在热图下面。b整个ICON 7数据集中Hallmark路径的富集分析结果(n为(顶部)浸润肿瘤和排除肿瘤，(底部)沙漠与排除/浸润肿瘤描述为351个样本。相机是应用的统计方法。c, d来自hallmark数据库的特定途径(干扰素γ响应、wnt-β-catenin信号、转化生长因子β信号和血管生成)、kegg数据库(抗原处理和表达以及趋化因子信号)和定制的基因标记(β配体和F-tbr)。8)展示三种免疫表型的比较。n=351份样本，129份渗入样本，94份排除样本，128份沙漠样本)。特征浸润和沙漠表型的路径在c，以及那些被排除在外的肿瘤的特征d. e从ICON 7收集的大量RNAseq上用Xcell进行免疫和基质细胞类型分析(n=351个样本)。f对TCGA-OV采集的肿瘤免疫表型进行了预测。n每种表型的遗传成分包括新抗原、肿瘤突变负担(TMB)、同源重组缺陷(HRD)和错配修复缺陷(DMMR)。c–f晶须范围从最小到最大，中间和25%-75%的四分位数范围(IQR)所显示的方格图。这些点是离群点样本。两组间的显着性差异用双面法进行评估。t修正了多重性和精确性的测试P值显示在图表上。源数据作为源数据文件提供。
为了更全面地了解这些肿瘤免疫表型背后的生物学，我们接下来对351个ICON 7样本进行了差异途径富集分析，这些样本被分类为不同的免疫表型(19个未分类)。基于两个数据库，KEGG和Hallmark，在每种肿瘤免疫表型中显着地富集了分子通路，如图所示。3B和补充图。4。这一分析证实了与T细胞排除表型相关的关键生物学特征，如图所示。3A，包括与抗原处理和呈递相关的基因的下调(如图所示)。3C)，和一个强烈的信号，转化生长因子β活性增加表达转化生长因子β配体，转化生长因子β反应信号在成纤维细胞(F-TBRs)。8)和总体增加的基因指示的积极转化生长因子β信号(图。三维空间)。此外，路径分析还揭示了不同肿瘤免疫表型的额外分子特征.例如，浸润的肿瘤表现出丰富的干扰素-α和伽马反应(图一)。3B，c)，合理地解释了抗原呈递基因在这个表型中的高表达。我们还观察到免疫排斥肿瘤中血管生成途径的富集(图一)。3B和d)。对于免疫沙漠肿瘤，我们发现这种表型不仅与其他两种肿瘤免疫表型相比，在干扰素-γ反应和抗原提呈中的表达最低，而且表现出与趋化性相关的基因(趋化因子信号)的显著下调(如图所示)。3C)，提示T细胞征集能力存在缺陷。有趣的是，我们还观察到，与浸润肿瘤相比，沙漠肿瘤中的wnt-β-catenin信号通路有轻微但显著的富集。在黑色素瘤中，该通路的激活与T细胞基因信号的低表达之间存在相关性。20.
为了更详细地评估哪些特定的免疫和基质细胞类型与特定的免疫表型相关，我们使用xcell进行了细胞型富集分析。21，一种基于基因签名的反褶积方法，对ICON 7样本的大量rna-seq数据集进行了分析。这些结果证实了机器学习和路径富集分析的许多发现，包括浸润和排除肿瘤的整体免疫评分较高，排除肿瘤的总基质评分最高(图一)。3E)。此外，反褶积分析表明许多免疫细胞类型(包括CD8)明显富集。+与沙漠肿瘤相比，T细胞、调节性T细胞(Treg)和巨噬细胞在浸润性和排斥性肿瘤中均明显富集。另一方面，排除的肿瘤是专门富集成纤维细胞(图1)。3E).
最后，基因成分，如肿瘤突变负担(Tmb)、新抗原负担和高基因组不稳定性，包括微卫星不稳定性高(msi-h)和缺陷错配修复(Dmmr)，已被证明与某些癌症类型的T细胞浸润增加和对检查点抑制剂的更好反应有关。22,23,24,25。由于icon 7在基因组范围内的突变分析和hrd评估中的组织可用性有限，我们对88个癌基因(包括这两个基因)进行了靶向测序。BRCA 1和BRCA 2)在216个样本中使用MMP-seq面板。26。BRCA突变状态与肿瘤免疫表型之间无显著关联(附图)。5A)。为了进一步研究肿瘤免疫表型背景下基因成分在卵巢癌中的影响，我们利用已发表的卵巢癌TCGA数据集，其中包括大量的rna-seq和全外显子测序数据。在rna-seq数据的基础上，应用我们的157-基因分子分类器(附图)，首次对TCGA数据集中412例高级别浆液性卵巢肿瘤的肿瘤免疫表型进行了预测。5B和补充数据2)。我们的分析显示，在HGS卵巢癌中，肿瘤免疫表型与TMB、新抗原负荷、dMMR或同源重组缺乏症(HRD)之间没有显著的相关性，但沙漠中的新抗原载量比浸润性肿瘤略低(图1)。3F)。我们的结果表明，这些基因改变可能不是HGS卵巢癌中CD8+T细胞浸润或排除的主要驱动因素。
排除在外的肿瘤有低的mhc-i和高的间质fap表达。
接下来，我们的工作重点是获得对免疫排斥背后的生物学的更机械的洞察。如前所述，我们的综合数字病理学和转录分析揭示了T细胞排除表型的几个关键生物途径和免疫特征，包括FAP、活化间质标记物和下调抗原提呈基因。为了验证这些发现并区分哪些细胞室经历了这些分子改变，我们对一个由84例卵巢肿瘤样本从供应商获得的独立卵巢肿瘤样本进行了原位分析。对这些样本进行RNA-seq转录组分析，并根据本研究开发的157-基因分类器预测其肿瘤免疫表型(附图)。5C，d)。有趣的是，我们观察到复发肿瘤中排除表型的发生率比原发肿瘤高得多(补充图)。5C)，提示免疫表型可能在化疗后或随着疾病的进展而进化。进一步验证在一个更大的数据集配对原发肿瘤和复发肿瘤，以及治疗-天真的和化疗后的样本是需要确认这些发现。用CD8-IHC、MHC-I、FAP原位杂交(ISH)分析肿瘤标本的全片。将本研究提出的数字病理学算法应用于CD8图像，量化CD8的数量和空间分布。+T细胞这些标记的代表性染色图像来自三种肿瘤免疫表型中的每一种，如图所示。4A。图中显示了所有样本的所有IHC或ISH分数的摘要。4B。与icon 7数据集的结果一致，我们发现浸润型和排除型肿瘤免疫表型具有相似数量的CD8。+原位分析T细胞(附图)。5E)，用RNAseq技术检测CD8 mRNA的表达水平(见图)。4C、顶部)。然而，它们在肿瘤上皮和基质区的分布模式不同，CD8的频率较低。+在排除性肿瘤的肿瘤上皮中发现的细胞(图)。4A，b、顶部)。
图4：T细胞排除肿瘤关键特征的原位验证.供货商收集的肿瘤免疫表型(包括原发肿瘤和复发肿瘤，n根据基因表达预测84个样本)。CD8型+用免疫组织化学和原位杂交(ISH)方法对FFPE肿瘤组织进行T细胞浸润和与排除肿瘤相关的分子特征验证。aCD8-IHC(顶)、MHC-I-IHC(中)和FAP ISH(底部)是三种肿瘤免疫表型的代表图像。b肿瘤/基质区CD8染色百分率(n=72个样本)，MHC-I的H值(n=77个样本)和FAP在肿瘤或基质中的表达(n(77份)由三种肿瘤免疫表型显示。cRna-seq基因表达水平，表示为log。2(RPKM+1)CD8A, Hla-A和FAP，呈三种肿瘤免疫表型。b, c晶须范围从最小到最大，中值和25%-75%的IQR显示由盒图显示；每个点是肿瘤样本(原发肿瘤和复发肿瘤合并)。统计意义用精确的P图上的值，用Kruskal-Wallis检验计算，经多次比较修正(Dunn‘s检验)。源数据作为源数据文件提供。
由于新抗原的出现和T细胞的溶解反应是由mhcⅠ类分子决定的，而mhcⅠ类分子在几乎所有有核细胞(包括肿瘤细胞)的细胞表面都有内源性抗原，因此我们假设CD8的浸润和分布。+T细胞可能通过mhcⅠ类分子直接受到新抗原提呈能力对CD8的影响。+T细胞事实上，原位分析证实MHC-I的下调与被排除的沙漠肿瘤和沙漠肿瘤的子集有关(图1)。4B、中排)。此外，FAP ISH分析显示在排除肿瘤的基质中有很强的富集(如图所示)。4B、下排)。这些发现与rna-seq转录组分析的结果是一致的。4C)。更重要的是，这些原位分析确定了有助于这些观察到的调制的特定细胞室。例如，MHC-I在排除的肿瘤中的下调仅限于肿瘤室.与此形成对照的是，浸润的肿瘤在肿瘤细胞上表现出强烈且均匀的MHC-I染色.另一方面，沙漠肿瘤在MHC-I的表达中表现为肿瘤内异质性和肿瘤间异质性.这种异质性表现为肿瘤上皮中MHC-I的中间H评分(图一)。4B)。这些发现共同提供了更多关于介导免疫排斥的潜在机制的见解，这可能涉及肿瘤、基质和免疫间隔之间的广泛串扰。
DNA甲基化导致癌细胞mhc-i丢失
然后，我们询问了降低卵巢肿瘤细胞中MHC-I表达的机制是什么？通过基因突变或表观遗传抑制抑制mhc-i的表达而导致肿瘤细胞抗原呈递机制的缺陷已被证明是多种癌症免疫逃逸的重要机制。27,28,29,30,31。人类白细胞抗原(HLA)基因中体细胞突变的检测已经在不同的TCGA队列中进行了研究，其中包括卵巢队列。与结肠癌和头颈癌不同，HLA基因突变在卵巢癌中是罕见的。32，表明MHC-I的缺失不太可能是由于基因突变引起的。因此，我们研究了这一损失是否是由于表观遗传调控。为了具体地检测肿瘤细胞上的甲基化，我们使用Infinium人甲基化450 K芯片为48种卵巢癌细胞系生成了DNA甲基化图谱。基因启动子区甲基化水平与甲基化水平呈强的负相关关系。Hla-A基因及其表达水平。5A)，这意味着下调了对……的监管。Hla-A卵巢癌的表达很可能是通过表观遗传机制介导的。事实上，这一假设得到了多条额外证据的进一步支持。首先，我们证明了观察到的MHC-I在卵巢癌细胞中的下调是可逆的.高甲基化卵巢癌细胞株/MHC-I低层(OWA 42)或低甲基化/MHC-I高(SK-OV-3和OVCA-420)用干扰素γ处理，这是一种良好的诱导mhc-i表达的细胞因子。33,34，显示MHC-I蛋白在肿瘤细胞表面的表达增加。5B和补充图。6a，b)，支持一种可逆的表观遗传机制，而不是对mhc-i的表达进行硬连线的不可逆转的遗传调控.更具体地说，我们证明在卵巢癌细胞株中，Hla-ADNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂5-Aza-2‘-脱氧胞苷(5-Aza)能诱导肿瘤细胞表面MHC-I蛋白的表达。5C和补充图。6C)。这些结果表明表观遗传调控可能是下调卵巢癌细胞抗原表达以促进免疫逃逸的重要机制之一。
图5：转化生长因子β对卵巢癌细胞和成纤维细胞的多方面作用。a相互关系Hla-A48株卵巢癌细胞的基因表达及其启动子甲基化(β值)。b干扰素ɣ处理后mhc-Ⅰ表面表达的变化cDNA甲基化抑制剂5-Aza对OWA 42(MHC-I)的处理分析低层)流式细胞仪检测卵巢癌细胞株。d转化生长因子β1或β1+Galunisertib对SK-OV-3和OVCA-420(MHC-I)表面表达的影响高)流式细胞仪检测卵巢癌细胞株。e不同剂量的转化生长因子β1和半胱甘肽对原代膀胱成纤维细胞Smad 2/3磷酸化水平的Westernblot研究f–i3例正常人卵巢、结肠、膀胱成纤维细胞均未予治疗，分别用TGFβ1或β1+Galunisertib治疗。f原代成纤维细胞增殖72h。g热图概述了转化生长因子β1特异诱导的前77个基因。h转化生长因子β1上调原代成纤维细胞基因的例子。i检测正常成纤维细胞在转化生长因子β1存在时分泌的细胞因子，包括IL-6蛋白(n=两个来自一个实验的技术复制)和IL6mRNAjICON 7每种肿瘤免疫表型突出基因的表达(n=351个样本)。k转化生长因子β促进卵巢癌T细胞排斥作用的模型研究。(ϕ)未处理和分子量(MW)。与对照(未处理或DMSO)相比，变化的百分比在b–d和f。数据表示为b–d, f, h，和i当一个盒子和胡言乱语j。胡须范围从最小到最大，中位数和25%-75%的IQR显示的方块。P的双尾Mann-Whitney检验值b和c，Kruskal-Wallis接Dunn的多重比较检验d、双向方差分析f单因素方差分析j接着是图基的多重比较测试。结果是n=2(b)和n=3(c, d)独立实验。提供的数据e均来自一次实验，重复观察3-h和24-h后进行.所描述的数据来自n=2(g–i)和n=3(f)生物复制来自一个实验。源数据作为源数据文件提供。
转化生长因子β在促进T细胞排斥方面具有多方面的功能。
在肿瘤细胞MHC-I下调的同时，T细胞排除肿瘤的另一个主要特征是TGF-β/反应性间质的上调。转化生长因子β在体外可下调葡萄膜黑色素瘤细胞的mhc-i，而mhc-i和mhc-Ⅱ在组织中有异常表达。35,36,37。基于上述结果，我们推测转化生长因子β可能在下调卵巢肿瘤细胞中MHC-1的表达中起直接作用。为了验证这一假设，我们治疗了两个mhc-i。高流式细胞仪分析显示，与未处理的卵巢癌细胞相比，转化生长因子β-1在SK-OV-3和OVCA-420细胞中的表面表达分别下降了37.7±3.2%和40.45±14.2%。5D)。此外，在一种针对TGF-βRI的小分子β抑制剂Galunisertib的存在下，MHC-I的表达恢复到未处理的水平(如图所示)。5D).
接下来我们评估转化生长因子β是否在调节成纤维细胞以促进T细胞排斥方面也有特定的作用。为此，我们分析了转化生长因子β处理对正常卵巢、膀胱和结肠成纤维细胞特异诱导的转录反应。我们证实了转化生长因子β途径的激活是通过以TGF-β剂量依赖的方式显示出增加的磷-Smad 2/3，并通过半胱甘肽治疗证实了该途径的激活(如图1所示)。5E)。我们还发现，转化生长因子β处理促进了这些原代人成纤维细胞的增殖。5F)。更重要的是，我们在这些人原代成纤维细胞中发现了一个由转化生长因子β诱导的共同的77-基因转录程序(图1)。5G和补充图。6C)。这个转录程序由各种ECM相关基因组成，包括胶原(Col4A4, COL4A2, COL16A1)，ECM糖蛋白(CTGF, TGF-BI, SPARC)、蛋白多糖(BGN, DCN, VCAN)，以及反应性基质标记(ACTA 2, TNC, LOX, TIMP 3)(图1.5G，h)。这些发现提示转化生长因子β可能介导T细胞排斥，至少部分途径是通过激活成纤维细胞和促进致密的ECM产生而建立物理屏障。此外，这些转化生长因子激活的成纤维细胞可能通过产生免疫调节分子而对免疫抑制环境作出贡献，包括IL 11和TNFAIP 6(无花果)5G，h)。此外，转化生长因子β在上清液中的表达水平和蛋白分泌水平上也增加了IL-6水平(见图)。5I)。最后，为了支持体外研究的结果，我们证明许多转化生长因子β诱导的细胞外基质和免疫调节基因也在ICON 7数据集中的T细胞排除的肿瘤中得到了特异性的富集(如图7所示)。5J).
综上所述，我们的数据阐明了转化生长因子β在介导肿瘤细胞与癌相关成纤维细胞之间的间接串扰中的多方面作用，以形成肿瘤免疫背景，如图所示的模型所概述的那样。5K.
