4 NQO诱导的TSCC全外显子序列分析
4NQO在C57BL/16小鼠饮水(100 g/mL)中灌胃16周。小鼠被给予10周的正常饮用水。在此期间，我们每两周捕杀一次动物(n=75)(图1。1A)。病变的宏观鉴别和特征，福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)切片进行显微分析(图)。1D，补充图。1A，补充数据1和2)。我们对69个4 NQO处理的样本进行了全外显子测序(WES)，分类如下：舌组织学正常，但暴露于4 NQO(1级)；n增生(2级)；n轻度异型增生19例(3级)；n中度异型增生(4级)；n严重异型增生14例(5级)；n(3)侵袭性鳞状细胞癌(6级)；n=13)(图1。1C，d)。四个肿瘤的韦斯没有质量控制，因此对其进行了突变分析。n=65例肿瘤。鉴于严重异型增生的数量较少，且其组织学与中度异型增生相似，我们将4级和5级合并为后续分析。大多数病变发生在背侧舌和舌腹侧，而晚期肿瘤(4~6级)在背侧舌中的数量较多(如图4至6所示)。1C).
图1：4 NQO诱导的TSCCs的突变负担和特征。a4 NQO肿瘤发生方案原理图。从Pixabay获得的鼠标图像(Https://pixabay.com/service/terms/)，并按照Pixabay许可证的条款使用。在C57BL/6小鼠体内诱导OSCCs(n75)在小鼠饮水中给予4 NQO致癌物16周。每2周收集一次肿瘤，共26周。b按等级划分的肿瘤在舌头上的分布。c肿瘤分级的分布按4 NQO治疗周数表示(中间线为中间线，下铰链和上铰链为第一和第三四分位数，上部晶须由铰链延伸至最大值不超过1.5×四分位数范围，下部晶须从铰链延伸到最小值，在铰链最多1.5×四分位数范围内。晶须末端以外的数据是个别绘制的离群点)。d4 NQO诱导的TSCCs组织学异质性研究。舌部病变的代表图像：1级(正常4 NQO)，n=5，2级(增生，n=19，3级(轻度异型增生，n=15，4级(中度异型增生，n=14，5级(严重不典型增生，n=3)和6级(侵袭性SCC、n=13)。标尺100米e变异负担的等级差异。Barart描述了每个肿瘤级别的SNV总数(n=65个生物无关样本，条形图代表平均值±SD，*p < 0.0001, one-way ANOVA). f所有4 NQO诱导的OSCCs的突变特征(N=515,212突变，n=65个样本，条形图代表所有样本的平均±SD)。g新签名。h以已知宇宙特征的贡献为特征的相似热图，使用突变模式(r包)肿瘤分级4，5和6。每个数字对应于肿瘤分级(1-6)，肿瘤部位(D，背侧；L，侧位；V，腹侧)和肿瘤序列ID。
对于WES，我们对FFPE固定切片的上皮室进行了显微解剖，并提取了DNA(附图)。1A)。我们使用HiSeq 2000光照平台(平均深度105倍)对舌4 NQO处理的样本进行了WES，并与相同动物的快速冷冻正常耳部DNA进行了匹配。体细胞变异与穴居人(通过期望最大化的癌症变异)27，种系变异过滤和排除常见变异(补充图。1A)，我们共鉴定了515,212个突变(如图所示)。1E65个样品中的663个元素。中度异型增生和侵袭性SCCs的突变负担高于增生和轻度不典型增生(图1)。1E)。总之，C>T突变在CpG或其他二核苷酸中占主导地位。T>C和C>A突变也很常见(图1)。1F)。不同突变的相对丰度随病变从1级进展到6级没有明显变化(补充图)。1B).
该分析是在FFPE样品上进行的，因为单个肿瘤的区域可以比冷冻切片更精确地进行显微解剖，从而减少邻近基质对上皮室的污染。以前有报道说，甲醛固定会产生人工制品，它们具有较低的等位基因频率(<5%)，并且由于胞嘧啶脱胺而具有“C>T”突变特征。28,29。为了考虑到这些潜在的人工制品，我们在分析过程中使用了一种有效的过滤策略和相关的经验错误发现估计；我们对提取的dna进行了严格的质量控制，并评估了序列数据的质量、读取对齐、库复杂度、原始错误率和共识基调用。此外，我们还使用了不到6个月的样品，并证实它们在存档FFPE中所观察到的C>T跃迁没有典型的增加。30,31(补充图。1C)。因此，对我们的FFPE样本的等位基因频率的分析证实，它们不太可能是福尔马林固定的人工制品。31.
在4 NQO治疗前，从耳朵皮肤冷冻切片中提取的DNA为每只小鼠的生殖细胞突变提供了对照。此外，对两只C57BL/6N小鼠(MD5547b和MD5548b)的未经治疗的舌进行FFPE切片。
突变过程产生特征点突变率谱(突变特征)，这些特征点突变率谱(突变特征)是根据突变数及其序列上下文识别出的常见模式。我们从我们的样本中提取了3个新的突变信号，标记为A、B和C(图1)。1g和补充图。1D)。较具侵略性的样本(4-6级)中有一半富集了签名C，而签名A在1-3级样品中富集。我们还分析了每一个突变剖面和30个重复碱基替换模式之间的相似性，这30个碱基替换模式被存档在癌症(宇宙)体细胞突变目录中。32(无花果)氢和补充图。1E，f)。中度和重度不典型增生和侵袭性SCCs(4-6级)显示与晚期人类口腔鳞状细胞癌相关的特征丰富。特别是，这些肿瘤与签名4、18和29(余弦>0.90)有很高的相似性(图4、18和29)。1g)。标记4、18和29在人类头部和颈部SCC、食道、胃和龈颊部口腔scc中有特异性观察，并已知与烟草使用引起的突变有关。33。对新签名与宇宙签名的比较表明，新签名C与宇宙签名4相关，新签名B与宇宙签名5相关(余弦分别为0.917和0.871)(补充图4)。1E).
4 NQO诱导的TSCCs突变基因
接下来我们分析了所有在样本中突变的基因，并将这些突变基因与相应的生物学信息相关联，包括肿瘤分级、分化程度和侵袭性、增殖指数和免疫细胞浸润程度(CD 45)。+，CD3+和CD 68+细胞)(如图所示)。2；补充图。2, 3和5A，d，补充数据1)。在分析的至少一个样本中，共有14 003个基因至少有一个突变(补充数据)2)。总的来说，单核苷酸变异体(SNVS)的总数随着肿瘤级别的增加而增加。1E，补充图。3)。然而，增生性病变的一部分增加了SNVS的数量，与4 NQO治疗的时间有关(治疗时间超过12周，见图)。2，补充图。3).
图2：数据矩阵显示4 NQO诱导的TSCCs与肿瘤生态学相比较的突变情况，包括反复的体细胞突变。上面的面板显示了关键的临床参数：颜色编码表示治疗周数、每舌病变数、顺序病变部位(背侧、腹侧)、诊断(肿瘤分级)、分化状态、外生肿瘤(YES/NO)、侵袭性肿瘤(YES/NO)、增殖指数和免疫浸润指数(CD 45)。+(补充数据)12和3)。中面板和下面板显示突变类型的显着突变基因(行；舌递归突变基因和DNDs基因的子集)。样本(柱)，n=65)是由诊断组织的，是通过增加等级来组织的。体突变是根据突变的类型(误解，无意义，外显子剪接消音器‘Ess_Splice’，删除或沉默突变；颜色定义为键)。所有突变都列在补充数据中3, 4和5。每个基因的体细胞改变类型之间的分布显示在直方图中(右图)。左边的百分比代表含有相应基因突变的肿瘤的比例。
在前100位突变基因中(补充图)。2)在人类头部和颈部鳞状细胞癌中已知发生突变的有几个，包括Trp53, ERBB 4和4个基因胖的一家人。然后，我们将重点放在已知的隐藏人类tscc中真正驱动突变的基因上。34(见方法和补充数据)3)。从小鼠舌头反复突变的基因(所有snv，包括误解，胡说，无剪接和indels)，排名最高的基因包括。Trp53, 法特1, Syne 2和NOTCH 1(无花果)2).
法特130%的肿瘤发生突变，尤其是中、重度异型增生和侵袭性鳞状细胞癌(图1)。2)。损失法特1与病人存活率的改善或降低有关。35,36为口腔鳞癌细胞的培养提供了竞争优势。12. Trp53是众所周知的抑癌基因37。在人类头部和颈部鳞状细胞癌中，TP 53突变率约为70%3,4,6但TSCCs的发病率较低，为38.3%。34。与人类数据一致，TP 5330%的标本发生突变，突变发生在侵袭性病变(异型增生和侵袭性SCC)中，提示该基因在肿瘤的进展中起着重要作用。Trp53在增生性病变中也发现了突变，但仅在长期使用4 NQO治疗的小鼠中才发现突变(见图)。2，补充图。3)，支持以下观点：p53单独不负责肿瘤的发生38. Syne 2和NOTCH 1突变率分别为23%和9%，法特1和Trp53，常在头颈部发生突变。3,4,5,6,7.
为了检测额外的癌症驱动基因(即在癌症中处于阳性选择下的基因)，我们使用dNdScv方法来计算dn/ds比(非同义突变与同义突变的归一化比率)。39。结果显示，有35个基因处于阳性选择(p-价值<0.001)(如图所示)。2，补充数据4)。这些数据显示了人类口腔鳞状细胞癌和小鼠口腔鳞状细胞癌中反复突变的基因之间的相似性，并确定了其他可能的驱动基因，如丘克，一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与核因子κ-B(NF-κB)的激活，并通过控制cyclinD 1的周转发挥抑癌作用。40,41。先前的一项研究表明，与NF-κB通路有关的基因包括丘克，在皮肤SCCs中被上调。42。在OSCC中，Chuk以前与ELAVL1相关联。43，它是一种rna结合蛋白，能稳定许多癌症相关基因的转录本，同时也是一种可能的驱动基因。44(补充数据)4). 克拉斯中的一个基因RAS参与信号转导和细胞周期调控的家族也在12%的样本中发生突变。2).
抗体标记支持识别其中两个基因的突变(图)。3A-d)。突变的肿瘤喇嘛3有从基底膜缺失蛋白质的区域，这与功能突变的丧失是一致的(如图所示)。3A，b)，导致上皮间质边界的多焦点断裂。喇嘛3仅在中、重度异型增生和侵袭性SCC中观察到突变(如图所示)。3A，补充图。2)，这意味着喇嘛3表达可能导致更多的侵袭性表型。45。肿瘤突变p53抗p53染色增强。3C，d)暗示他们有稳定的突变Trp53。为肿瘤生态系统的变化提供更广阔的视角46，我们进行了基因本体(GO术语)分析的基础上，我们发现的驱动基因(图)。3C；补充数据5)。除了上皮室的变化(GO术语：形态发生，解剖结构)，GO定期分析预测细胞因子介导的信号和免疫浸润的改变。
图3：层粘连蛋白α3和p53在突变性肿瘤中的表达。a, c有代表性的免疫染色图像层粘连蛋白α3 (a)和p53 (c)在正常组织中，野生型和变异的肿瘤。箭头表示损失的区域层粘连蛋白α3在突变肿瘤中的表达(n=6个病变层粘连蛋白α3)。用核染料DAPI(4‘，6-二氨基-2-苯基吲哚)(a)或与苏木精(c)。虚线描绘基底膜。标尺，100米。b表达的量化层粘连蛋白α3在基底膜(n=3个正常样本n=量化的7个感兴趣区域，n=3肿瘤拉玛3wt样品n=5 Rois量化，n=4肿瘤喇嘛3突变样本n=9 Rois数量化)。d量化p53阳性细胞(n=3例正常，3例肿瘤P53 wt样本，4个肿瘤p53变异样本)。条形图表示均值±sd，**p≤0.05，*p≤0.001，p=0.0014p53, p=0.0010层粘连蛋白α3、单向方差分析、Kruskal-Wallis检验。e驱动基因的基因本体分析。每个矩形是一个代表GO类(生物过程)的单个簇，分为三大类(超集群)：细胞因子介导的信号通路、上皮的形态发生和免疫系统过程。调整矩形的大小以反映底层GO分析数据库中GO项的频率。
高度突变性增生缺乏癌症驱动基因突变
尽管总的来说，SNV的数量随着肿瘤分级的增加而增加(图中所示)。2)，我们观察到一组增生性病变，有大量的SNVS。这与4 NQO长期治疗(4 NQO治疗>10周)而未发展为侵袭性肿瘤的舌部病变相对应。结合正常舌的RNAseq数据23)和突变分析。4我们分析了这些增生性病变中突变基因的表达水平(logCPM-每百万正常读计数)。4A)。根据平均CPM值将基因分为三类：(1)低表达(log CPM<4.5)；(2)培养基表达(logCPM在4.5~10之间)；(3)高表达(log CPM>10)。每个类别的基因数目如图所示。4B，c.
图4：中度增生组织突变的功能分析。a正常舌样本5个数据集的表达特征(logCPM-每百万标准化阅读计数)23。图表示CPM值的平均值；x轴分为3类：低表达基因、中表达基因和高表达基因。b在增生样本中，每一类基因中表达基因的数量的饼形图。c中、长时间处理的中、长期增生和侵袭性鳞状细胞癌中(左板)和右面(右板)的总样本数和突变基因的数量在舌组织中的中、高表达基因的筛选中均有显着性差异。d10条富含舌的KEGG途径表达的基因在中、长时间处理后的增生和侵袭性SCC中发生突变。指出了该通路中突变基因的数量以及该通路中的基因总数。
中高表达基因的KEGG(京都基因和基因组百科全书)途径分析(图1。4D)无论是增生还是侵袭性SCC，在肿瘤相关通路上均表现出明显的富集：“灶性粘附”、“癌中蛋白多糖”和“Axon导向”(与细胞迁移和凋亡相关的基因)。然而，只有少数在增生性病变中发生突变的基因(1691年中有243个)在与癌症进展相关的途径(“ECM-受体相互作用”，“钙信号”)中富集，而所有在侵袭性SCC和非增生组织中突变的基因都在与癌症相关的通路中富集。47。这些结果表明，具有大量SNV的增生之所以没有进展为侵袭性SCC，是因为突变的基因对肿瘤的进展并不重要。
突变景观与肿瘤生态学的相关性
为了确定单个肿瘤的突变情况是否与肿瘤表型相关，我们用抗CD 45(全免疫细胞)、CD3(T-细胞)和CD 68(巨噬细胞)的抗体标记免疫细胞浸润，并测量增殖细胞(Edu)的比例。+)在所有测序的肿瘤中(如图所示)。5A-d；补充图。4A，b，补充表1和补充数据1)。各年级之间差异有显着性，不同年级间差异无统计学意义。
图5：突变景观与肿瘤生态学的相关性。a–c免疫浸润定量(CD 45)+细胞/毫米2，T细胞浸润(CD3)+细胞/毫米2)和巨噬细胞浸润(CD 68)+细胞/毫米2不同肿瘤级别(增生)n=18，轻度异型增生n=12，中/重度异型增生n=16，侵袭性SCCn=12只小鼠，2只/鼠，>6个字段，每节量化，均值±SD，无显着性，单因素方差分析(ANOVA)。d扩散的量化(EDU)+细胞/毫米2不同肿瘤级别(增生)n=15，轻度异型增生n=12，中/重度异型增生n=14，侵袭性SCCn=11，2节/鼠标，>6个字段，每节量化，平均值±SD。与单因素方差分析比较，无显着性差异。多重比较：未配对t-各年级之间的测试，除侵袭性鳞状细胞癌和增生之间外，均无显着性差异，*p < 0.05, p=0.0262)。e线性回归分析建立各基因突变总数(列)与临床参数(行)之间的关系。热图显示p-每项相关的数值(补充数据)7). f免疫浸润(CD 45)的比较+/毫米2)之间NOTCH 1突变和NOTCH 1非突变(Wt)肿瘤n=56NOTCH 1野生型病变n=6NOTCH 1突变性病变。条形图表示均值±sd，*p < 0.05, p=0.0083，未配对单尾t-测试)。g, hCD 45免疫浸润的定量研究+细胞(gT细胞浸润(CD3)+)(h)在NOTCH 1突变的肿瘤。代表切片的免疫荧光染色NOTCH 1WT和NOTCH 1突变肿瘤标记为抗Krt 14(绿色)、抗CD 45或抗CD3(红色)，核染料DAPI染色。免疫浸润用CD 45计数。+或CD3+细胞/毫米2(补充图。4A，b)。对所有肿瘤进行了分析，并对每个肿瘤的≥6个区域进行了每节量化(n=2-3节/肿瘤/染色)。gIdx 2，CD 45+免疫浸润指数2(2000-5000个/mm)2)；idx 3，指数3(5000-10,000个单元/毫米)2IDX 4，指数4(>10,000个单元格/mm)2). hIdx 1，CD3+免疫浸润指数1(<500细胞/mm)2)；idx 2，指数2(500-1000个单元/毫米)2)；IDX 3，指数3(>1000个单元/毫米)2)。标尺100米，放大广场20米。
接下来我们进行线性回归分析，比较多个生物学参数(线性Mod，pvalue截断<0.05)(补充数据1)与单个基因的突变频率和变异等位基因频率(图1)。5E；补充图。4C，d，补充数据6)。突变基因总数与外分泌肿瘤(中、重度异型增生)、侵袭性病变(4-6级)和增殖指数(附图)显著相关。4D)。虽然在不同级别的病变中增殖性基底细胞的数量没有显着性差异(图1)。5D)增殖性Krt 14的丰度增加+基底层以上的细胞(附图)。4B)。此外，虽然所有肿瘤分级的增殖没有显着性差异，但SCC与增生相比有显着性增加(p=0.0262，图1。5D).
喇嘛3突变与肿瘤分级相关(p=0.00233，总免疫浸润(CD 45)+, p=0.029824)，外间肿瘤生长(p=0.05172)和肿瘤侵袭性(p=0.02748)(图1。5E，补充数据6)。突变法特1与增殖呈正相关(p=0.04094)，与肿瘤分级成反比。35 (p=0.00128)和外分泌肿瘤生长(p=0.02702)(图1。5E). Trp53突变与高级别肿瘤呈正相关(p=0.05160)但没有其他参数，而NOTCH 1突变与总免疫细胞浸润显著相关(CD 45)。+, pT细胞浸润(CD3)+, p=0.02019)和高肿瘤级别(p=0.01288)(图1。5E，补充数据6)。我们证实了这些观察结果，证实了这些肿瘤NOTCH 1突变有较高的间质CD 45+和CD3+比野生型肿瘤NOTCH 1(无花果)5F-h)。两者之间没有关联NOTCH 1突变状态与巨噬细胞浸润(CD 68)+细胞)(如图所示)。5E).
肿瘤克隆动力学
癌症的体细胞突变理论援引了肿瘤的克隆起源，其病变是由单个细胞后代的顺序突变引起的。48。然而，现在很明显的是，基因上不同的克隆亚群体可以在单个肿瘤中共存很长一段时间。49,50,51,52。为了研究4 NQO诱导的TSCCs的克隆动态和结构，我们首先分析了4 NQO在收获时有多个不同损伤的小鼠。8只小鼠分析病变处于不同的发展阶段，舌不同部位有增生、不典型增生和/或鳞状细胞癌(附图)。5)。8只动物中有4只无共同突变，8只动物中有2只存在≤3突变。在剩下的两只老鼠中，只有一只在两个病变之间有大量的突变。n=1189，附图。5A)。在这只老鼠中，这两个病变都位于舌的背侧区域(补充图)。5B，2_D_MD5534c和4_D_MD5534a)。这些观察表明，在同一舌的不同区域的病变并不是克隆相关的，除非位于彼此靠近的地方。
接下来，我们使用克隆选择的计算方法，分析每个突变的变异等位基因频率(Vaf)，评估单个病变内突变的克隆性。53,54,55。由于低中位VAF(0.11)，大多数病例无法对亚阵挛性进行详细分析。这可能是由于低肿瘤纯度或存在多个低频克隆。然而，在一些较高级别的病变中，我们观察到克隆突变(vAF>0.25)数量的增加，以及高频假定的驱动突变的富集(如图所示)。6C，样本6_L_MD 5541，侵袭性SCC；图3。6B，样本4_V_MD5538A，中度/重度异型增生)。这可能是由于具有多个驱动程序的适配克隆的克隆扩展所致。
图6：肿瘤克隆性。a热图显示至少检测到一个突变(行)的样本中每个基因(列)突变的平均VAF值。基因按层次聚类排序，样本按诊断排序(见颜色代码)。b对于每一个诊断，VAF的体细胞突变的分布显示在一个样本。灰色条形图表示每个基因的突变数。c带有驱动突变注释的高级样本体突变VAF分布的代表性图。频率相对较高的突变(f>0.25)可能是克隆的(公共)。
在反映不同病变的进化历史的样本间，VAF的分布也有其他明显的差异。主要的是，一些样本有大量的克隆突变，而另一些样本则很少(图1)。6B，c)。克隆突变的数量是衡量抽样群体最近的共同祖先(MRCA)突变负担的一个指标。因此，高克隆突变负担可能是优胜劣汰克隆选择性扫描的结果，突变负担越大，扫描越晚，因此也就越适合克隆。55。与此假设一致的是，当我们将肿瘤分级与肿瘤克隆选择进行比较时，大多数轻度异型增生几乎没有克隆突变，而高级别肿瘤的一个子集表现出与克隆突变相一致的模式(图一)。6C)。然而，我们观察到，带有亚克隆突变的肿瘤早在3级轻度不典型增生时就开始出现(见图)。6C).
为了全面评估每个克隆中存在哪些突变基因，我们对每个VAF峰中的突变基因进行了注释。我们观察到在高级别的肿瘤中有一个克隆体，NOTCH 1, 法特1和Syne 2突变有类似的VAF(图1)。6C)，而在低级别病变中，则有亚克隆突变。克拉斯(无花果)6B)和TP 53(无花果)6C)观察。我们推测，高度的遗传异质性可能是那些轻微的异型增生的一个特征，这些发育不良很可能发展为更具有侵袭性的肿瘤。综合起来，这些数据揭示了肿瘤进展的进化动力学。
