用单细胞RNA测序揭示NKT细胞在肝脏中的异质性

CD1d依赖型NKT细胞被脂类抗原激活，与Ⅱ型NKT细胞一样，在天然免疫和适应性免疫中发挥重要作用。然而，NKT细胞，特别是NKT样细胞的异质性，在很大程度上尚不清楚.在这里，我们报告NKT的特征(NK1.1)。+CD3e+)野生型(WT)小鼠、Jα18缺陷小鼠和CD1d缺乏小鼠肝脏中的细胞。无偏倚的转录聚类显示不同的细胞亚群。转录图谱鉴定了已知的CD1d依赖性NKT细胞，并定义了两个与CD1d无关的NKT细胞亚群.此外，标记基因的验证揭示了NKT细胞亚群在肝脏肿瘤进展过程中的差异器官分布和分布情况。更重要的是，我们发现与CD1d无关的sca-1−CD62L+NKT细胞与IL-2、IL-12和IL-18共刺激后，具有较强的分泌IFN-γ的能力.综上所述，我们的发现提供了NKT细胞异质性的综合特征，并揭示了一个以前未定义的功能NKT细胞子集。

自然杀伤T(NKT)细胞在控制天然免疫和适应性免疫反应中发挥着重要作用，以对抗癌症、炎症性疾病和传染病。1。NKT细胞一般被定义为CD1d依赖的自然杀伤T细胞.然而，先前的工作也表明CD1d独立的NK1.1+细胞和其他类似MAIT细胞的半不变T细胞亚群有时被称为NKT细胞。2。最近关于CD1d-无限制NKT细胞的研究表明，目前NKT细胞的分类将其分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和NKT样细胞。3。Ⅰ型NKT细胞，又称不变NKT(INKT)细胞，是CD1d限制性T细胞，能识别糖脂α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，并表达不变体T细胞受体(TCR；变量(V)和连接(J)V)。α14Jα18链及有限TCRβ链库)4,5。Ⅱ型NKT细胞也是CD1d限制性T细胞，具有不同用途的tcr、α和β链，与来自自身或微生物的多种脂类抗原反应。6。与iNKT细胞不同的是，只有一部分Ⅱ型NKT细胞由于发现了特异性抗原而被研究过，例如硫化物。7。NKT样细胞与CD1d无关2包括所有其他NKT细胞。例如，活化的CD8+T细胞衍生CD8+NK1.1+T细胞和MAIT细胞。活化CD8+T细胞衍生CD8+NK1.1+T细胞在异基因造血细胞移植后获得NK1.1的表达，而Ly-49C/I和Ly-49G2在小鼠肝脏中未表达Ly-49C/I和Ly-49G2受体8。由岛村等人用CD1d缺陷小鼠鉴定的MAIT细胞。9，在Jα18缺乏的小鼠中被耗尽。10.

现在大多数文献已经将NKT细胞定义为一种CD1d依赖的细胞类型。11。Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞在调节癌症和其他疾病的免疫反应中都发挥着重要作用。1。联合使用缺乏Ⅰ型NKT细胞的Jα18缺陷小鼠和缺乏Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞的CD1d缺陷小鼠，对体内研究Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞的生物学功能是有益的。2。一般来说，Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞在肿瘤免疫的免疫调节中起着相反的作用，这说明Ⅰ型NKT细胞对癌症有保护作用，而Ⅱ型NKT细胞则抑制肿瘤免疫。1。然而，一些报告显示I型NKT细胞具有抑制作用。12,13Ⅱ型NKT细胞在肿瘤免疫中的抗肿瘤作用14，这使得I型和Ⅱ型NKT细胞的功能关系在癌症中相互冲突。此外，CD1d依赖的NKT细胞亚群的定义仍然主要依赖于寻找特异性抗原，而且没有已知的抗原可以均匀地刺激所有Ⅱ型NKT细胞。1。此外，与CD1d依赖的NKT细胞相比，CD1d独立的NKT样细胞具有更多的异质性和更少的特征，这使得精确研究其生物学功能变得更加困难。到目前为止，NKT细胞的分类尚不清楚，NKT细胞的功能主要依靠发现特异性抗原来标记和激活这些细胞。

由于没有能够统一分离所有CD1d相关自然杀伤T细胞的特异性标记物。为了研究NKT细胞的异质性，我们对NKT(NK1.1)进行了scRNA-seq。+CD3e+)WT、Jα18缺陷小鼠和CD1d缺乏小鼠肝脏中的细胞。细胞转录序列的无偏聚类将细胞分为4个不同的簇，并对每个子集的转录谱进行了鉴定。将WT小鼠肝NKT细胞的scRNA-seq数据与Jα18-缺乏和CD1d缺乏的小鼠肝NKT细胞的scRNA-seq数据进行比较，鉴定Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞，并将CD1d独立的NKT细胞分为两大亚组。此外，我们还使用两种细胞表面标记分离NKT细胞亚群，并在肝脏肿瘤发展过程中确定其在不同器官中的分布情况。此外，我们还发现与CD1d无关的sca-1。−CD62L+NKT细胞在体外与IL-12、IL-18和IL-2共刺激后，具有分泌IFN-γ的特殊能力.总之，我们的研究揭示了NKT细胞在肝脏的景观，并重新定义了NKT细胞亚群。

小鼠肝脏单细胞RNA测序鉴定NKT细胞亚群的研究进展

为了研究NKT细胞的异质性，我们从肝中选择NKT细胞作为NKT细胞频率最高的外周器官，进行单细胞RNA测序。分离肝制备单细胞悬液，NK1.1细胞分选富集NKT细胞。+CD3e+细胞和受scrna-seq作用的细胞(如图所示)。1a)。经质量控制后，用小鼠肝脏623个细胞，Jα18缺陷小鼠肝脏725个细胞，CD1d缺乏小鼠387个细胞进行下游分析。在这些单个细胞中平均检测到62,895个UMIS和2,231个基因(补充图)。1)。经t-SNE分析，4组NKT细胞分离良好(图1)。1b)。第1群(C1)在WT小鼠中占7.4%，在Jα18缺陷小鼠中占20.4%，在CD1d缺乏小鼠中占61.0%，在WT小鼠中占3.8%，在Jα18缺陷小鼠中占13.5%，在CD1d缺陷小鼠中占14.7%；第3群(C3)在WT小鼠中占11.3%，在Jα18缺陷小鼠中占48.2%，在CD1d缺乏小鼠中占7.3%，在WT小鼠中占77.5%，在Jα18缺乏小鼠中占17.9%，在CD1d缺乏小鼠中占17.0%。归一化NKT细胞图谱显示了每个NKT细胞亚群中顶级可变基因的规范化表达(图一)。1c)。通过对WT小鼠NKT细胞与Jα18缺陷和CD1d缺陷小鼠NKT细胞聚集模式的比较，将NKT细胞分为4种不同的亚群，即C1、C2、C3和C4。我们鉴定了已知的CD1d依赖性NKT细胞(Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞)和两种独立于CD1d的NKT细胞(NKT样细胞)。1d)。C1和C2代表CD1d独立的NKT细胞的两个主要亚群。C3和C4分别代表CD1d依赖性Ⅱ型NKT细胞和Ⅰ型NKT细胞。这些不偏不倚的分析揭示了NKT细胞在小鼠肝脏中的多样性，并将NKT细胞重新分类为4个不同的亚组，而不需要特定的抗原。

NKT细胞亚群的转录特征

接下来，我们试图探讨不同NKT细胞亚群的转录特征。我们通过单细胞RNA-seq鉴定了100多个在CD1d独立的NKT细胞亚群C1中特异表达的基因。有趣的是，许多基因与NK细胞的受体有关，包括NK细胞受体2B4(镉244)、NKP 46(Ncr1)，酪氨酸激酶结合蛋白(泰罗普)和一些杀伤细胞凝集素样受体(KLR)基因。2A，f)。此外，我们还发现一些基因与细胞毒性途径有关，包括颗粒酶。格兹马和格兹姆)(图1.2e)。我们还发现CD8α(CD8α)在c1细胞中的表达水平明显高于其他NKT细胞亚群，这与以前关于CD8细胞毒性和颗粒的研究相一致。+NKT细胞15,16。我们还通过单细胞RNA-seq鉴定了约100个在CD1d独立的NKT细胞亚群C2中特异表达的基因(见图)。2b)。与C1富集的基因不同，C2富集的基因与细胞粘附和细胞迁移有关。编码α4整合素的基因Itga 4)，据报道，这对T细胞的贩运和粘附至关重要。17，在C2中富集。此外，KLF2, S1PR1和卖C2组明显高于其他亚组。以前的研究报告说，Krueppel样因子2(KLF2)通过调节鞘氨醇1-磷酸受体1(S1PR1)和L-选择素(卖)18,19,20。因此，CD1d独立的NKT细胞亚群C2可能不是组织驻留细胞类型，可能参与免疫监测和宿主防御。对于CD1d依赖的NKT细胞，我们鉴定了在C3和C4细胞中特异表达的基因。2c，d)。与C1或C2中特异表达的基因不同，C3和C4富集的基因表现出相似的模式。NKT细胞亚群的相似性分析表明，C3和C4的相似性评分显著高于C1和C2。2g)。然而，以往关于NKT细胞的研究认为，Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞是功能相反的两种不同的NKT亚群。1。我们的数据表明，根据转录水平的详细分析，C3和C4可能被认为是一个单一的簇。为了更好地分析NKT细胞在转录上的不同亚群，我们将CD1d依赖的NKT细胞(C3和C4)组合成一个称为C0的子集。在C0中富集的基因与T细胞活化有关，包括Ly6a, ICOS, CD 28和Cd40lg(无花果)2h)。与其他亚群相比，C0表现出明显的高表达拉特，是TCR信号在T细胞发育和功能中的重要组成部分，也是FCGR 3介导的NK细胞信号传递的重要组成部分。21,22。此外，对转录因子表达的分析表明，NKT细胞亚群中存在明显的转录调控(图1)。2i)。值得注意的是，我们分析了CD1d非依赖性群体C1和C2中CD8α、Ly-49C/I和Ly-49G2等编码蛋白的转录模式(图1和图2)。2补充图A.2(A)并发现其转录模式与活化的CD8不相似。+T细胞衍生CD8+NK1.1+T细胞(CD8α)+Ly-49C/I−Ly-49G2−)8，表明C1和C2都不是活化的CD8。+T细胞衍生CD8+NK1.1+T细胞我们还比较了野生型Jα18缺陷型(缺乏mit细胞)中c1和c2的转录谱。10)和CD1d缺乏的小鼠，并发现这两个群体的转录图谱在不同的小鼠模型中是相似的(图一)。1(D)，表明MAIT细胞不是C1或C2的主要群体。这些结果与以前工作中激活CD8的结果是一致的。+T细胞衍生CD8+NK1.1+T细胞仅在病理状态下增殖，而不处于稳态状态。8在实验小鼠中，MAIT细胞的频率一般较低。23。这些结果表明，NKT细胞可分为3个转录明显的亚组，其中两个主要亚组为CD1d独立的NKT细胞(以下称为C1和C2)和CD1d依赖的NKT细胞的联合子集(称为C0)，其中包括C3和C4。

不同NKT细胞亚群间免疫调节的特性

为了探讨这些转录上不同的NKT细胞亚群是否表现出不同的免疫调节特性，我们首先检测了细胞因子和趋化因子在所定义的簇中的表达。3a)。C0有明显的高表达IL4与其他细胞亚群相一致，即Ⅰ型NKT细胞和部分Ⅱ型NKT细胞在刺激后均能分泌IL-4。14,24。C0也有明显的高表达Cd40lg，作为参与T细胞活化的共刺激分子。25。对于C1，具有炎症性质的趋化因子，如Ccl 3和CCl 4，在C1中表达水平明显高于其他亚组。表达Xcl 1，在树突状细胞介导的细胞毒性免疫反应中起重要作用。26，C1组显著高于其他亚组。与C0或C1不同，C2没有特异性表达细胞因子或趋化因子。此外，所有NKT细胞亚群均有高表达CCL 5，调节T细胞和中性粒细胞的募集，并参与iNKT细胞的抗肿瘤活性。27。其他免疫调节剂，如HMGB 1, LTB和MIF在NKT细胞中未被彻底研究，也在所有NKT细胞亚群中富集。关于细胞因子和趋化因子受体的差异表达(图)。3(B)，所有的子集都有较高的表达量CXCR 3，在天真T细胞激活T细胞后诱导，并在iNKT细胞中高表达。28,29。趋化因子受体Cxcr6，一种已知的受体，用于iNKT细胞在肝脏中的定位。30，C0和C1的表达水平显著高于C2。IL-2受体的成分，IL2Rb和IL2RG，在所有子集中都有很高的表达。此外，C0有显著的高表达CCR 2，促进T细胞分化为T-助手17细胞(Th17)。31。此外，C2有明显的高表达Il7r，它与内存签名相关。32，类似于其他丰富的基因，例如卖和Tcf7(无花果)2B，I)，在C2中比在其他NKT细胞亚群中。C2也有明显的高表达IL18r1和Il18RAP，介导IL-18信号的IL-18受体复合体的主要组成部分。33。NKT细胞亚群共同表达参与多种生物过程的不同分子，这可能反映了NKT细胞的组织定位和免疫调节的差异。

NKT细胞亚群在肝脏肿瘤发展过程中的分布

以前的工作没有报告NKT细胞亚群如上文所述的聚类。为了更好地研究这些NKT细胞亚群在体内的分布和功能，我们首先从mRNA水平分析了作为细胞表面标记的细胞膜蛋白。单细胞数据分析显示了每个聚类中的特定标记。2h，4a)。在这些候选表面蛋白中，我们选择了Ly6a(蛋白质名称：SCA-1)，卖(蛋白质名称：CD62L)和CD8α(蛋白质名称：CD8α)作为候选标记，将NKT细胞分离成代表单细胞数据分析中所鉴定的亚群(C0、C1和C2)的亚群。为了探讨这种可能性，我们首先通过流式细胞术分析了SCA-1、CD8α和CD62L的表达。4b)。Fcs数据显示出三个子集的频率相似的清晰模式，c0对应于sca-1。+CD62L−NKT细胞，C1，对应于SCA-1−CD62L−与SCA-1相对应的NKT细胞和C2−CD62L+NKT细胞，未观察到其他两种模式。

为了验证标记基因，我们列出了在每个簇中差异表达的基因(图)。4c)。通过SCA-1和CD62L作为细胞表面标记的细胞分类，我们证实了一些已鉴定的基因。2h，4用实时定量PCR(QPCR)技术在mRNA水平上进行分析。4d)。我们还在蛋白质水平上验证了一些丰富的基因(补充图)。2b)。此外，我们还观察了NKT细胞亚群在不同器官中的分布情况。4E；补充图。3a)。我们发现肝脏和血液中的nkt细胞大部分是cd1d依赖的nkt细胞，这与iNKT细胞在肝脏中占优势的发现是一致的。34。然而，SCA-1的频率−CD62L+NKT细胞在脾脏中增加，这是一种外周淋巴器官，在iNKT细胞的背景下已经得到了很好的研究。对于肺、骨髓和淋巴结等器官，至少40%的NKT细胞是sca-1。−CD62L+NKT细胞为了确定NKT细胞亚群在病理状态下的分布是否发生改变，我们采用水动力注射法建立了肝脏肿瘤模型。35。我们发现在肿瘤进展过程中，NKT细胞总数明显减少。4f)。详细地，sca-1的单元格数。+CD62L−NKT细胞在早期(2周)显著下降。Sca-1的细胞数。−CD62L−NKT细胞在早期(2周)和稳定状态下相当，晚期(4周)显著下降。有趣的是，sca-1的细胞数−CD62L+NKT细胞在早期(2周)显著增加，晚期(4周)下降，说明sca-1。−CD62L+NKT细胞可能参与肿瘤早期的免疫调节。我们共同鉴定了两个细胞表面标记基因作为标记基因，在蛋白水平上分离NKT细胞亚群，揭示了NKT细胞在稳定状态下和在肝脏肿瘤发展过程中的分布情况。

与CD1d无关的SCA-1的独特功能−CD62L+NKT细胞体外培养

由于sca-1细胞数的特殊改变−CD62L+Nkt细胞在肝癌进展过程中的独特作用−CD62L+NKT细胞我们的上述数据表明，在sca-1中，IL-18受体复合物的组分表达显著增加。−CD62L+NKT细胞比其他NKT细胞亚群。IL-18是一种在小鼠肿瘤模型中具有抗肿瘤活性的干扰素-γ诱导因子，具有促进NK细胞和T细胞增殖、杀伤和分泌IFN-γ的作用。36,37,38,39,40。已知IL-12和IL-18可诱导Th1细胞和NK细胞产生IFN-γ。41。我们首先从单细胞RNA水平分析NKT细胞亚群中的IL-12受体和IL-18受体。5a)。表达Il12rb1和IL12rb2在NKT细胞亚群中几乎检测不到。但是，Il18rb1和Il18RAPC2组明显高于其他亚组。流式细胞仪在蛋白水平上进一步证实了上述结果。5b)。因此，我们假设SCA-1−CD62L+在IL-12和IL-18联合刺激下，NKT细胞可能具有较强的IFN-γ反应。

为了确定NKT细胞亚群的干扰素-γ分泌能力，我们从肝脏和总NKT细胞和sca-1中分离出常规T细胞、NK细胞、总NKT细胞和NKT细胞亚群。−CD62L+脾脏NKT细胞，用IL-12/IL-18和IL-2(一种已知促进T和NK细胞增殖的细胞因子)刺激其增殖。刺激48h后，分析干扰素-γ的产生情况，如预期的那样，sca-1。−CD62L+NKT细胞分泌IFN-γ明显高于其他NK细胞亚群和T细胞，IFN-γ分泌略高于NK细胞(见图)。5c)。此外，SCA-1−CD62L+脾脏NKT细胞在体外产生的pn-γ与肝中的nkt细胞相当，说明sca-1−CD62L+NKT细胞可能作为免疫调节因子，在不同器官间传播。然而，SCA-1的转录组是否−CD62L+NKT细胞在不同器官中的变化有待于进一步探索。此外，我们还可以使用sca-1。−CD62L+脾脏NKT细胞，每只小鼠的总细胞比肝脏多(附图)。3(B)进行详细研究。

进一步分析白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)和白细胞介素-18(IL-18)对sca-1干扰素γ反应的影响。−CD62L+NKT细胞，我们首先检查了白细胞介素2，白细胞介素12和白细胞介素18的需要(见图).5d)。单用IL-12或IL-18的刺激不能在sca-1中诱导出较强的IFN-γ反应。−CD62L+NKT细胞细胞因子IL-2可轻微增强sca-1的IFN-γ应答。−CD62L+NKT细胞已有研究表明，IL-18的作用是诱导干扰素-γ的产生。36。因此，我们假设sca-1−CD62L+NKT细胞可能参与IL-12和IL-2的表达，上调IL-18受体的表达，以扩增IFN-γ反应，这在T细胞中有报道。41。如预期一样，SCA-1的处理−CD62L+IL-2和IL-12单独作用24 h后，NKT细胞IL-18R1表达上调(图1)。5(E)和刺激SCA-1−CD62L+IL-2和IL-12预处理NKT细胞24h后，IFN-γ的产生略有增强(图1)。5f)。总的来说，我们的结论是sca-1−CD62L+IL-2、IL-12和IL-18联合刺激后，NKT细胞产生特异性的IFN-γ反应.

在本研究中，利用单细胞RNA-seq的优势，我们展示了来自小鼠肝脏的NKT细胞的异质性，而不考虑抗原特异性。我们鉴定了已知的CD1d依赖性NKT细胞(Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞)，并将CD1d独立的NKT细胞分为两个主要亚群。转录组分析揭示了在不同的生物学过程和免疫调节中每个子集的不同特征。此外，SCA-1和CD62L作为细胞表面标记物的验证和应用有助于我们探索NKT细胞亚群在不同器官和肝癌发生过程中的分布。此外，我们在sca-1中发现了一种独特的γ反应。−CD62L+CD1d-非依赖性NKT细胞，而其他NKT细胞亚群无反应。总之，我们的工作提供了一份完整的NKT细胞在小鼠肝脏中不同亚群的基因表达图谱，这将有助于了解NKT细胞的异质性和CD1d无关NKT细胞的研究。

由于α-GalCer和硫化物等特异性抗原的发现，对NKT细胞的研究主要集中在CD1d依赖的NKT细胞的发育和功能上。迄今为止，已知的CD1d依赖性NKT细胞包括Ⅰ型NKT细胞(α-GalCer-反应性)、Ⅱ型NKT细胞(硫化物反应性)的一个子集和Ⅱ型NKT细胞的另一个子集(β-Glcer-反应性)。4,7,14。由于缺乏分离II型NKT细胞所有亚群的特异性标记，Ⅱ型NKT细胞的转录谱仍然不清楚，CD1d无关的NKT细胞也是如此。联合使用缺乏Ⅰ型NKT细胞的Jα18缺陷小鼠和缺乏Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞的CD1d缺陷小鼠，在体内广泛应用于研究Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞的生物学功能。2。通过对WT，Jα18缺陷小鼠和CD1d缺陷小鼠数据的比较(图1)。1(D)我们的工作提供了已知的Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞的转录谱，以及两个独立于CD1d的NKT细胞亚群，除了Ⅰ型NKT细胞外，没有对它们进行描述。42,43。虽然最近的工作已经指出了这些鼠标模型的一些局限性。原始的Jα18缺陷小鼠有多个Jα元件被删除，从而限制了T细胞受体的功能。44。同样，CD1d缺乏的小鼠中是否存在CD1d2，可能会改变CD1d非依赖性NKT细胞的池，而CD1d缺乏的小鼠没有删除CD1d2。45。此外，缺乏Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞可能影响细胞因子环境，从而可能影响其余CD1d无关NKT细胞的转录水平。尽管如此，我们工作中来自WT、Jα18缺陷小鼠和CD1d缺陷小鼠的单细胞rna测序数据的组合显示出类似的模式(图1)。1D)，表明NKT细胞亚群的转录谱在不同小鼠模型上具有可比性。

由于tcr在Ⅱ型NKT细胞中使用的多样性，很难完全理解CD1d依赖的NKT细胞。6。因为我们的分类策略主要集中在NK1.1+NKT细胞，我们排除了NK1.1中的少数−肝脏I型NKT细胞，约占我们系统中I型NKT细胞总数的15%(补充图)。3c，d)。尽管如此，我们还是分析了NK1.1的转录+Ⅰ型NKT细胞和Ⅱ型NKT细胞，发现它们彼此相似。这一出乎意料的发现表明，对肝中CD1d依赖的NKT细胞的理解可能不够全面，至少在mRNA水平上是如此。许多关于肿瘤中NKT细胞功能的研究表明，Ⅰ型NKT细胞具有抗肿瘤能力，Ⅱ型NKT细胞的作用主要与肿瘤抑制有关。1,46,47,48,49,50。然而，赵洁等。在B16黑色素瘤模型中，Ⅱ型NKT细胞的一部分也参与了CpG的抗肿瘤作用。14。I型与Ⅱ型NKT细胞之间的功能关系仍存在争议。我们的I型和II型NKT细胞的rna-seq数据可能提供一个机会，在转录水平上确定这两种CD1d依赖性NKT细胞之间的异同。此外，Ⅱ型NKT细胞在人类中的分布比Ⅰ型NKT细胞更广泛，这不同于Ⅰ型NKT细胞在小鼠体内的优势。6,51。因此，在未来更全面地理解CD1d依赖的NKT细胞方面还需要做出很大的努力，这就需要对来自小鼠和人类的NKT细胞进行更多的单细胞分辨研究。

与CD1d依赖的NKT细胞不同，NKT样细胞以不依赖CD1d的方式构成NKT细胞的其余部分。2。他们现在是最异质的子集，没有标准的分类，这使得对CD1d无关的NKT细胞的研究变得更加困难和有争议。在我们的研究中，我们发现与CD1d无关的NKT细胞可以分为两个主要的亚群。其中一部分的转录组与细胞毒途径密切相关，在mrna水平上有丰富的颗粒，CD8α的表达较高，这与以往关于CD8的研究结果一致。+NKT细胞15,16。另一组细胞的转录组与细胞粘附和迁移密切相关，与非循环和组织驻留的iNKT细胞不同。52,53。因此，我们对CD1d独立的NKT细胞进行了研究，并展示了两种完全不同的CD1d无关NKT细胞亚群的转录谱。

最近对iNKT细胞的组织特异性功能进行了全面的综述。28。INKT细胞功能不同的亚群，如NKT 1、NKT 2、NKT 17和NKT 10，优先定位于淋巴组织和非淋巴组织。28。本研究利用经验证的细胞表面标记技术，对NKT细胞在不同器官中的亚组进行了研究，发现NKT细胞的不同亚型有明显的分布。特别是SCA-1−CD62L+与肝脏相比，NKT细胞在脾脏、骨髓、淋巴结和肺中的表达增加。然而，转录体是否在不同的位置被改变还有待于阐明。未来的工作需要绘制NKT细胞在不同器官的地图，为组织特异性功能的研究提供更加准确和全面的前景。

白细胞介素18(IL-18)作为干扰素-γ分泌的诱导剂，在肿瘤的发生发展过程中，具有增强NK细胞和T细胞活性的作用，并具有抗肿瘤作用。36,37,38,39,40。在我们的工作中，我们发现sca-1的数量有一个特定的变化模式。−CD62L+NKT细胞在肝癌发展过程中的作用(图)。4F)，提示其在肿瘤进展中的作用。我们还发现sca-1中IL-18受体复合物的成分水平显著升高。−CD62L+NKT细胞比其他NKT细胞亚群。IL-12，IL 18，IL-2，SCA-1−CD62L+CD1d非依赖性NKT细胞表现出较强的IFN-γ分泌能力，与其他NKT细胞亚群不同.IL-2和IL-12单独作用可上调IL-18受体的表达，促进IFN-γ的分泌。以往的研究表明，将脾中的IL-12/IL-18 NKT细胞过继转移到同基因宿主中，可以发挥较强的抗肿瘤作用，抑制ALC和MC57X同基因肿瘤的生长。54。NKT细胞分泌IL-2和IFN-γ在这些抗肿瘤作用中起着重要作用。54。此外，我们还发现tcf 1的特异性高表达，这是一种转录因子，是肿瘤浸润CD8的干细胞样功能所必需的。+T淋巴细胞55，在SCA-1中−CD62L+CD1d-非依赖性NKT细胞较其他NKT细胞亚群。结合我们的发现，我们推测sca-1−CD62L+CD1d非依赖性NKT细胞可能通过分泌IFN-γ而影响免疫肿瘤的微环境。这些结果显示NKT细胞亚群有可能用于肿瘤免疫治疗。

鉴于NKT细胞在先天免疫系统和适应性免疫系统中的重要性，我们的工作以单细胞分辨率重新分类NKT细胞，并对CD1d依赖和CD1d无关的NKT细胞提供了新的见解。

动物

C57BL/6小鼠是从灵昌生物技术公司(上海)购买的野生型对照。Jα18缺陷小鼠和CD1d缺陷小鼠56,57，原为中国科学技术大学教授。实验用8~10周龄小鼠。实验前，所有小鼠均在无病原体条件下进行PCR分型。所有动物实验均按照国家卫生研究院的指导原则进行，并经上海生物科学研究所(中国科学院)动物保护和使用机构委员会批准。

抗体和试剂

用于细胞表面染色和细胞内染色的荧光结合抗体列于补充表。1。CD1d-PBS57(与PE结合)是从美国国立卫生研究院的四聚体设施中获得的，如前所述。27。我用于组织消化的胶原酶是从吉布科购买的。从PeproTech获得小鼠IL-2和小鼠IL-12 p70.从BioLegend中获得重组小鼠IL-18。

组织制备与细胞分离

组织制备和细胞分离按前面所述进行。27。简单地说，胸腺或淋巴结中的单细胞悬浮液是通过尼龙筛过滤得到的。用尼龙筛挤压过滤制备脾细胞，第二次过滤前用红细胞溶解法制备脾细胞。抽取前用PBS灌流肝脏或肺，去除血细胞。然后，将肝脏切碎并通过细胞过滤器(40μm；BD生物科学)过滤。肺切成~2mm片，37℃摇动200 rpm，在含10%FBS(日出)70 U ml的RPMI培养基(吉布科)中孵育50 min。−1胶原酶I(吉布科)用不连续的40%~70%Percoll(GE Healthcare)梯度从肝或消化肺细胞悬液中分离白细胞，过滤前红细胞溶解。滤过前先冲洗胫骨和股骨获得骨髓细胞，然后再溶解红细胞。

FACS分析与细胞分类

细胞表面染色采用5ml聚苯乙烯圆形底管(BD生物科学)，Fc阻断后4°C(抗CD 16/CD 32，BD生物科学)标记抗体染色40 min，检测前用活性染色(固定活性染色450或780，BD生物科学)染色。生物素结合抗体用PE链亲和素(BD生物科学)染色。转录因子(TCF-7)的细胞内染色是根据制造商的协议使用Foxp 3染色试剂盒(EBioscience)进行的，如前所述。27。细胞荧光在四激光bdlsrfortessa II上进行，数据用Flowjo软件(瑞士Olten，treestar，inc.)进行分析。27。如上文所述，细胞表面染色后用BD FACSAriaⅡ进行细胞分类。27。分选细胞纯度大于95%。

定量实时PCR分析

定量实时聚合酶链反应如前所述。27。总RNA用TRIzol(Invitrogen)提取，用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)进行反向转录。采用实时RT-PCR(QuantStudio6Flex；Fujifilm)和SYBR绿色QPCR主混合(Toyobo)技术，将所指示基因的mRNA水平归一化为GAPDH。用于qPCR的引物列在补充表中2.

体外细胞刺激和细胞富集

为了体外产生干扰素-γ，将分离的细胞与指示的细胞因子孵育在NUNC 96井中，Nunclon Delta处理的U形底微板(ThermoFisher Science)在指定的时间内培养，然后收集细胞上清液进行ELISA。丰富Sca 1−CD62L+NKT细胞从脾脏中获得细胞刺激，细胞悬液中的B 220被耗尽。+(Ra3-6b2)细胞在使用生物素化抗体(BioLegend，103204)分选之前，与Dynabeads生物素结合剂(Invitrogen)结合。

ELISA法

用小鼠IFN-γELISA试剂盒(R&D系统)检测细胞上清中的细胞因子。

水动力尾静脉注入

水动力注入是按照前面的描述进行的。35。将编码MYR-AKT 1和N-RasV 12质粒的10μg和1.8μg睡眠美转座酶稀释于2mL生理盐水(0.9%NaCl)中，经0.22-μm滤池过滤，5~7 s注入6~8周的侧尾静脉，处死小鼠。

单细胞RNA-seq文库的构建

首先，人工挑选、裂解单个细胞并进行第一链cdna合成。58,59。在此基础上，合成第二链cDNA，并对其进行扩增和片段化。RNA-seq文库是根据KAPA超预试剂盒(KAPA生物系统)的说明书编写的.最后，在一个IlluminaHiSeqX-ten平台上，对这些库进行了检查、集合和配对的150-BP读取。

处理单细胞RNA-seq数据。

首先用CutAdapter(v1.15)对原始读码进行修剪，然后根据读2上的细胞条形码对单个细胞的读码进行分类，然后通过tophat(v2.0.12)对读1与MM9小鼠的转录组进行比对。以UMIS为基础进行去复制后，用HTseq计数每个基因的转录拷贝数(v0.10.0)。检测到500多个基因的细胞，以及1万至60万个转录本被保留下来。然后，R包“散射体”中的“isOutlier”功能进一步去除了ERCC尖峰蛋白比率高的细胞。采用R软件包“Seurat”进行下游分析，包括鉴定差异表达基因(DEGS，折叠变化>0.25和调节，P<0.05)和计算相似性评分。