Nef抗SERINC 5能力受损与HIV感染者血浆病毒血症降低有关

HIV-1 Nef通过拮抗宿主限制分子SERINC 5，在增强病毒传染性方面发挥着重要作用。由于nef是高度多态的，由于宿主细胞免疫的选择力，我们推测某些免疫逃逸多态性可能会损害nef对抗SERINC 5的能力，从而影响病毒在体内的适应性。.为了验证这一假设，我们确定了58个Nef多态性，这些基因在日本HIV感染者中被过度表达，他们的HLA基因型相同。免疫相关Nef基因多态性与血浆病毒载量呈负相关。通过分析特定的HLA等位基因相关突变，我们发现一些HLA-B*51：01相关的Y120F和Q125H突变与血浆病毒载量降低有关。一系列生化实验表明，Y120F/Q125H双突变，而不是单次突变，削弱了Nef拮抗SERINC 5的能力，并与降低病毒传染性和病毒复制有关。而其他NEF功能如CD4、CCR 5、CXCR 4、HLAⅠ类下调和CD 74上调无明显变化。综上所述，我们的结果表明，Nef通过自然发生的免疫相关突变来抵消SERINC 5的差异能力与体内血浆病毒载量有关。

NEF是hiv-1和其他灵长类免疫缺陷病毒的一种辅助性蛋白，对病毒在感染者中的高效复制和病毒的致病性至关重要。1,2。尽管nef的体积较小，约为27-35 kDa，但它仍具有相当多的功能，包括下调病毒进入受体(CD4、CCR 5和CXCR 4)和HLAⅠ类分子，上调细胞表面的HLAⅡ类不变链(CD 74)，以及刺激病毒在CD4中复制。+T细胞3,4,5,6,7,8。NEF还能增强子代病毒的传染性。9,10,11部分是通过对抗宿主丝氨酸结合因子(SERINC)3和5介导的，这两种分子限制了hiv-1的传染性，其中SERINC 5是最强的。12,13。SERINC 5被整合到病毒产生细胞的子代病毒膜上，并拮抗与靶细胞的融合。14。NEF通过内化产生病毒的细胞表面的SERINC 5来抑制这一过程。12.

尽管Nef是HIV-1最易变的蛋白质之一，但它仍然拥有几个重要的、高度保守的功能基元。在实验室适应的hiv-1菌株的诱变研究中，已确定了负责nef每种功能的单元。3,4,5,15,16,17,18,19。例如，Nef中高度保守的fpd基序(phe121-pro122-asp123)的突变被证明会导致nef抵抗SERINC 3/5的能力受到破坏，从而降低子代病毒的传染性。12,20。然而，目前尚不清楚高度多样化的自然发生(患者源性)nef序列是否也表现出不同的能力来对抗SERINC 3/5；如果是这样的话，患者源性nef的这种能力是否会影响病毒在体内的适应性仍是个未知数。因为Nef是宿主细胞免疫的主要靶点21,22某些免疫逃避多态性可能影响Nef功能和血浆病毒血症。事实上，最近的文献表明，在精英控制器中观察到的两个CTL逃逸突变K94E和H116N在一定程度上削弱了Nef将SERINC 5内化的能力。23。在本研究中，我们分析了日本375名HIV感染者HLA相关Nef多态性与血浆病毒载量的负相关，并进一步研究了这些多态性对Nef功能的影响。

慢性HIV-1亚型B感染者NEF HLA相关基因多态性的研究

我们首先在375例治疗中寻找和表征HLA相关的Nef多态性--天真的、慢性的HIV-1亚型B型感染者，一个独特的HLA I类等位基因群体和主要为HIV-1亚型的B型流行病。共观察到108个HLAⅠ类等位基因，这些等位基因由四位数分辨率定义，频率与以往文献一致。24,25,26。其中，至少10人检测到49种等位基因(包括12种HLA-A、23种HLA-B和14种HLA-C)，并纳入HLA-相关多态性的统计分析。用系统校正的Logistic回归模型对hla相关多态性进行了鉴定，该模型纠正了潜在的混杂因素，包括宿主HLAⅠ类等位基因之间的HLA连锁不平衡、病毒序列之间的进化关系以及病毒密码子的变异。21,27。Nef中已鉴定的HLA相关氨基酸残基在特定HLA存在下富集或耗尽时，可分为适配性和非适应性关联。28。在错误发现率的临界值(q(值)<0.2，我们共鉴定出112个HLA相关的Nef多态性，其中58个为适配型，54个为非适应型，分布在206个密码子中的55个(表)。沙一)。这些数字与先前发表的一项研究结果基本一致，该研究表明，在一组感染艾滋病毒的日本人群中，共有104个HLA相关的Nef多态性发生在45个密码子上(N=306)。26。例如，两项研究都一致表明Nef密码子81与HLA-B*35：01和HLA-B*39：01相关，Nef密码子135与HLA-A*24：02相关联，这是该人群中最常见的HLA I类等位基因。但HLA-Nef密码子关联存在一定的差异，如本研究中密码子120和125的2个Nef多态性与HLA-B*51：01相关，Chikata等人未发现HLA-B*51：01-相关Nef多态性。26.

NefHLA适配多态性与血浆病毒载量呈负相关

然后我们试图研究Nef中HLA相关氨基酸变异体的存在与患者血浆病毒RNA载量(PVL)和CD4计数之间的关系。在本研究中，如果一个给定Nef序列中的氨基酸变体被确认为HLA适配性关联，则被算作HLA适配氨基酸变异，而不考虑患者所表达的HLA I类等位基因。例如，nef-8C是HLA-C*15：02相关的适配多态性(表)。沙一)；因此，任何在密码子8处含有Cys的NEF序列都被认为在这个位点上有一个HLA适配的氨基酸变异。PVL与HLA适应型Nef氨基酸变异体的总数目呈弱但有统计学意义的反向关联(β=−0.040，p=0.037；图1)。1a)。相反，我们观察到CD4计数与HLA适应的Nef氨基酸变异数之间没有显著的相关性(p=0.10)。虽然PVL的整体关联很弱，但这些结果可能提出了一个有趣的假设，即在Nef中选择某些HLA驱动的变体可以调节该人群的病毒血症。

我们假设，观察到的HLA适应NEF变异体与较低PVL之间关联的弱点可能主要归因于某些HLA适配变异。为了解决这一问题，我们将该队列中22个流行的HLAⅠ类等位基因(>10%的频率)相关的HLA适配Nef变异进行分层，并通过回归分析检验其与PVL值的相关性；然而，只有16个HLA I类等位基因与HLA适应的Nef变异体相关(图1)。1b)。观察到PVL之间有统计学意义的反向关联。对决HLA-B*51：01适应变异数(β=−0.35，p=0.011)和HLA-C*03：03适应变异数(β=−0.32，p=0.039)。1b)。因为有2个HLA-B*51：01适应变异体(120F和125 H)和一个HLA-C*03：03适应变异体(85F)(表)。沙一)，我们进一步研究了PVL与120 F和125 H变异数或85F变异数之间的关系，而不考虑研究对象所表达的HLA I类等位基因。感染Nef 120 F和125 H突变的人PVL明显低于编码一致氨基酸残基(Y 120和Q 125)或突变子集的人(p<0.02，Mann-Whitney检验)。1c)。与之相比，感染85F突变的血浆病毒与编码共识残基的人PVL差异无显着性意义(P>0.05)，Mann-Whitney检验。人们可能会担心HLA-B*51：01是这一人群中的保护性等位基因，表达这两种基因的患者具有优越的免疫介导的病毒控制能力；120YFPDWQNY125已被证明是HLA-B*51：01提出的CTL表位。29,30。但PVL与该等位基因之间无显著相关性(p>0.05，Mann-Whitney检验)。相反，因为F 121和D 123是高度保守的残基，对某些Nef函数很重要。31,32,33,34这些结果提示PVL的调节可能是由HLA适配的Nef Y120F和Q125H变异体介导的Nef功能的改变所致。

HIV-1 Nef变异体在原发性CD4中的病毒复制能力+细胞

我们首先测试了Nef中的Y120F和Q125H突变是否影响了原代CD4病毒的复制能力。+细胞。我们从2名HIV阴性供者中制备了PBMC，并将他们暴露于hiv-nef中。_SF2、艾滋病毒_∆Nef或HIV-Nef_Y120F/Q125H在第0天，并测量p24 gag抗原分泌到培养上清液中的时间过程变化(作为病毒复制的一种衡量标准)，直到第15天。如预期一样，艾滋病毒-NEF_SF2，与艾滋病毒相比_∆Nef，p24gag抗原在第9天两供者PBMC中均有显著增加。艾滋病毒-Nef_Y120F/Q125HP24 gag抗原显著增加，但第9天达到的高峰水平明显低于hiv-nef。_SF2两种供体的PBMC(p<0.03；图1)。2a)。我们对另外4名HIV阴性献血者进行了检测。数据表明，p24 gag抗原的峰值水平为hiv-nef。_Y120F/Q125H明显低于Nef_SF2(Wilcoxon配对检验，p=0.0313；图1)。2(B)，表明Nef Y120F和Q125H突变在联合作用下会影响病毒的复制。

观察到的Nef刺激病毒复制能力的差异可归因于所使用的病毒疫苗的病毒传染性，因为众所周知Nef可以增强病毒的传染性。35Y120F和Q125H突变可能影响Nef的功能。以TZM-bl报告细胞为靶细胞，以复制试验中所用的病毒疫苗制剂为靶细胞，检测病毒的传染性。如预期一样，艾滋病毒-NEF_SF2，与艾滋病毒相比_∆Nef，其传染性显著增加，传染性水平与病毒接种量成比例增加(图一)。2c)。NEF_Y120F/Q125H传染性显著增加，但与hiv-neef相比下降了20%。_SF2无论接种量如何(p<0.04；图1)。2c)。这些结果表明，这些突变损害了Nef增强病毒传染性和刺激病毒复制的能力。

Nef变异体对SERINC 3/5介导的HIV-1感染抑制作用的影响

SERINC 3和5(SERINC 3/5)分子最近被认为是HIV-1病毒传染性的抑制剂，并被HIV-1 Nef抵消。12,13。因此，我们想研究Y120F和Q125H突变是否会损害Nef对抗SERINC 3/5的能力。在直接测试这一点之前，我们首先进行了以下控制实验。我们用pnl 43-nef转染JTAG细胞。_SF2PNL 43-∆Nef质粒，收获含病毒上清液，然后将TZM-bl细胞暴露于其上清中.通过测量由HIV感染的TZM-bl细胞产生的发光强度，我们评估了病毒的传染性。以hiv-nef获得的发光强度计算相对传染性。_SF2归一化为100%。如预期一样，艾滋病毒的传染性-NEF_SF2与HIV相比有很大提高_∆Nef(无花果)3a)。此外，当我们转染JTAG细胞时，我们已经将SERINC 3/5(JTAG-SERINC 3/5)都敲除了。−/−)具有相同的pNL 43-Nef_SF2与pNL 43-∆Nef质粒相比，两种病毒制剂均具有相似的传染性(图1)。3(A)明确证实SERINC 3/5是Nef抵消的病毒感染抑制因子。我们通过计算亲代JTAG细胞分泌的病毒颗粒与JTAG-SERINC 3/5分离的病毒颗粒的传染性，确定了Nef对抗SERINC 3/5的特异性。−/−细胞值>1.0和<1.0表示Nef对抗SERINC 3/5的能力比NEF增强或降低_SF2，分别(图1.3a)。NEF中F121A和D123A突变的检测_SF2显示Nef抵抗SERINC 3/5的能力几乎完全中断(如图所示)。3(A)确认以前报告的调查结果12。然后我们测试了Nef_SF2Y120F、Q125H和Y120F/Q125H突变对SERINC 3/5具有拮抗作用。而Y120F/Q125H双突变的抗SERINC 3/5能力降低了20%(如图所示)。3b)。

Nef Y120F和Q125H突变对SERINC 3/5介导的传染性抑制作用的影响(A)JTAG细胞和JTAG-SERINC 3/5产生的病毒的传染性−/−细胞(左边)。这些细胞被导入缺乏nef(Δnef)或携带nef的hiv-1 nl43前体细胞。_SF2突变体(F121A和D123A)，TZM-bl细胞暴露于病毒中，检测病毒的传染性。结果表示为三份评估的平均值，标准化为对照菌株nl4.3-nef。_SF2。采用配对t检验进行统计学分析。NEF能力_SF2并通过将JTAG细胞分泌的病毒颗粒的相对传染性与JTAG-SERINC 3/5的相对传染性划分，确定了所指示的突变体(F121A和D123A)对SERINC 3/5的拮抗作用。−/−细胞(正确的)。(B)Nef的特异性SERINC 3/5反作用功能_SF2所指示的突变体(Y120F，Q125H，Y120F/Q125H)。数据为3个独立实验的平均结果±SD。用方差分析和多重比较进行统计分析。VSNEF_SF2. 注：没什么意义。

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Nef变异体在患者源性NEF序列中的功能效应

突变对NEF功能的影响通常取决于主干序列或遗传谱系。我们首先分析了扩增的序列NEF在12份HLA-B*51：01中10份中克隆到质粒中的基因片段(每个受试者平均有8个克隆)。+自身病毒有Y120F/Q125H突变的患者。在系统发育树中，NEF克隆与它们各自的大量血浆HIV RNA序列紧密地聚在一起(如图所示)。沙一a)。在6例患者中，所有测序克隆均有Y120F/Q125H突变，而在其他患者中，少数Nef克隆有Y120F突变(图一)。沙一b)。其次，采用基于转染的方法，检测了含有Y120F/Q125H突变的2或3个Nef序列对细胞表面SERINC 5的下调能力。JTAG-SERINC 3/5增强SERINC 5-IHA的表达−/−细胞共转染SERINC 5-IHA和Nef基因，共转染SERINC 5-IHA和Nef基因。_SF2-GFP导致SERINC5-IHA的细胞表面表达显著减少(图1)。4(A)确认Nef下调SERINC 5的能力23,36,37。所有来自患者的Nef克隆在SERINC 5-IHA下调功能方面都是功能性的，但在宿主内活性水平的差异相对较小，但在不同宿主之间有很大的差异(图一)。4b)。一个NEF克隆来自每个病人(如图中的红色情节所示)。4B和它们的氨基酸序列如图所示。S2)亚克隆到pNL 43中，并测定了携带患者源性Nef克隆的重组病毒的传染性。我们观察到在传染性试验中SERINC5-IHA下调与SERINC 3/5特异性对抗作用之间Nef功能的相关性很弱，但有统计学意义(SpearmanR=0.6606，p=0.0438；图1)。4c)。

最后，为了验证Y120F/Q125H突变对Nef功能的影响，我们将每个Nef克隆恢复到一致的Y 120和Q 125，生成一对突变/反转录结构。配对比较显示，Nef在120 F/125~Y 120/Q 125之间的逆转后，其抗SERINC 3/5的能力得到恢复(Wilcoxon配对检验，P=0.002；图1)。5a)。相反，Nef下调CD4、CCR 5、CXCR 4、HLA-A*02和上调CD 74的能力不受逆转的影响(图1)。5b)。这些结果表明，HLA-B*51：01-适配的Y120F/Q125H突变选择性地损害了Nef对抗SERINC 3/5的能力，而CD4、CCR 5、CXCR 4和HLA下调功能及CD 74上调功能未受到影响。

我们已经证明，一些自然发生的Nef变异体(Y120F和Q125H)与某些HLA I类等位基因(HLA-B*51：01)呈负相关，与携带该HLA等位基因的HIV感染者的血浆病毒载量呈负相关。此外，对Nef变异体的体外功能分析表明，这2种突变联合作用选择性地削弱了Nef拮抗SERINC 5限制性功能的能力，与病毒复制和病毒感染性降低有关，同时保留了其他NEF功能，包括HLA I类、CD4、CCR 5和CXCR 4的下调以及CD 74的上调。我们的研究结果表明，某些与HLA相关的Nef变异体与血浆病毒载量降低有关，并削弱了Nef拮抗SERINC 5功能的能力。

有大量文献表明，通过突变分析，高度保守的Nef残基，包括PxxP 72、D 123和DD 174、175，分别负责Nef的重要功能，如HLA下调、二聚和CD4下调。19,33,38,39,40,41。此外，对病人源性nef序列的分析还揭示了nef中自然发生的多态性对患者nef功能的贡献。42,43,44,45,46,47。在本研究中，免疫逃逸突变Y120F、Q125H和双突变(Y120F/Q125H)的患病率分别为39.2%、13.1%和9.3%，在本研究中，日本的B亚型突变值明显高于LOS Alamos数据库中的B亚型序列，分别为13.6%、5.2%和1.6%。这表明，与B亚型流行地区相比，这一群体在日本具有独特的HLAⅠ类等位基因，并暗示在没有HLA驱动的选择压力下，双重突变是不可能普遍存在的。然而，在LOS Alamos数据库的数据中，D亚型的双重突变(11.9%)相对于A和C亚型(3.9%和1.3%)比较普遍。需要进一步详细研究Y120F和Q125H突变对不同亚型骨干骨Nef功能的影响。

高度保守的D 123残基(在A、B、C和D亚型中的流行率>99%)包含在Y120F和Q125H的免疫逃逸突变位点。一些研究表明，这种残基的突变会导致多种Nef功能的损害，包括CD4和HLA的下调，以及病毒传染性和复制性的增强。31,32,33,48,49。此外，如本研究所示，D123A突变体会削弱Nef抵抗SERINC 3/5的能力。Nef核区的晶体结构分析表明，d 123涉及向R 105方向的二聚界面。48。事实上，d123n突变阻止nef核心二聚体的形成，当它与Src家族激酶的hck sh3结合时。50。因此，研究Y120F和Q125H相邻残基的免疫逃逸突变是否以及在多大程度上在Nef二聚中起次要作用是很有趣的。

我们研究的一些局限性值得提一提。虽然我们调查了从375例治疗中分离到的NEF克隆--日本的天真HIV感染者，但这个小组并没有捕捉到B型Nef亚型的全部遗传多样性。此外，375个个体的队列没有捕捉到该群体中HLAⅠ类位点的全部宿主遗传多样性。利用携带HLA相关突变的Nef变异，在体外检测了几种关键的Nef功能，包括增强病毒复制和病毒传染性，下调SERINC 5、CD4、CCR 5、CXCR 4和HLA I类分子以及上调CD 74，但我们不能排除其他已知或未知Nef功能的作用。例如，SERINC 3也限制了hiv-1的传染性。12,13,51,52与SERINC 5相比，虽然程度要小得多，但被HIV-1 NEF所抵消。在此测试的Nef突变可能会对SERINC 3和5的对抗作用产生不同的影响。由于从HIV感染者那里获得的PBMC样本有限，对Nef变异体的HLA I类限制免疫反应无法在实验上得到解决。此外，由于在本研究中对患者标本进行横断面取样，宿主内部发生了变化。NEF随着时间的推移，序列无法测试。尽管有这些限制，我们的研究提供了强有力的证据，证明Nef介导的SERINC 5对抗作用功能的自然变化至少在某种程度上有助于HIV-1感染的临床结果。我们的结果突出了Nef由于抗病毒免疫与宿主内在限制之间的相互作用而产生的相互冲突的适应性效应。

研究对象

从1996年至2012年在日本东京国立全球卫生和医学中心和日本东京大学医学研究所监测的446名艾滋病毒-1亚型B型慢性感染和治疗患者中采集了血浆样本。这些患者的HLA I类分型是按照前面描述的基于高分辨率序列的分型协议进行的。25。在队列的一个子集(N=375)中，CD4计数的数据(中位数：307[IQR：190.3至400.5]/mm)3)和血浆病毒载量(中位数：45,000份[IQR：16,000至165,000份]/ml)。这项研究得到了国家全球卫生和医学中心人类研究道德委员会和东京大学机构审查委员会的批准，并根据“赫尔辛基宣言”中表达的原则在日本熊本大学熊本大学人类逆转录病毒感染联合研究中心进行。从所有研究参与者那里获得书面知情同意。

自体NEF基因序列分析

用病人血浆超离心(50,000 rpm，15分钟)沉淀hiv-1颗粒后，用qIAamp病毒rna Min试剂盒(Chiagen)纯化病毒rna，然后用克隆的amv第一链cDNA合成试剂盒(cdna合成试剂盒)，如前面所述。24。通过巢式PCR，DNA片段跨越NEF用前面描述的引物对基因进行了扩增。53。用自动测序仪对PCR产物进行纯化和直接测序(ABI 3500/3500XL；应用生物系统，Carlsbad，CA)。利用Seqscape软件Version 2.7和Los Alamos序列数据库中的基因切割器工具对序列数据进行了分析和比对。Https://www.hiv.lanl.gov/)与参考株HXB 2有关。促进一致的密码子编号方案(基于NEF)_{HXB 2}(参考应变)，我们成对对齐。NEF序列NEF_{HXB 2}使用基于hyfy平台的内部算法。54插入物被剥去。

克隆与质粒构建

病人衍生NEF利用零BluntTopo PCR克隆试剂盒(Invitrogen)将上述基因克隆到质粒中。中位数为8NEF克隆按病人排序。检查NEF在pcDNA3.1-gfp质粒中亚克隆了基因产物、对照株sf 2和患者源性nef序列。55和艾滋病毒-1_{NL 43}如前所述43,56,57。然后使用重叠PCR方法引入所定义的感兴趣的突变。22,58。所有对照、病人来源和突变导入的质粒都通过dna测序重新确认。NEF区域。

Nef介导的细胞表面分子调控分析

NEF介导的细胞表面CD4和HLA-I分子的下调在CEM中的作用。+稳定转染HLA-A*02：01(CEM-A*02细胞)基因的T细胞株。CEM-A*02细胞(2×10)6)在脉冲X细胞方波条件(250 V，25 ms)和1脉冲(Bio-Rad实验室，Inc.)条件下，分别在0.4mm铜箱中电穿孔，与单独编码GFP的8个μg质粒DNA或Nef-GFP融合蛋白电穿孔。24小时后，用明亮的紫罗兰结合抗人CD4单抗和HLA-A2血清型特异性单抗和7-氨基放线菌素D(均来自BioLegend)染色。46,47,57,59。观察NEF介导的TZM-bl细胞表面CCR 5和CXCR 4分子的下调作用。TZM-bl细胞(1×10)5)分别用脂质体2000转染GFP或Nef-GFP融合蛋白的质粒DNA。48小时后，用藻红蛋白结合的抗人ccr 5 mAb、藻蓝蛋白结合的抗人cxcr 4单抗(BioLegend)和7-add染色。46。在721.221个细胞中检测了NEF介导的细胞表面CD 74分子的上调。721.221细胞(1×10)5)暴露于携带病人源性Nef序列的重组病毒。48小时后，用藻红蛋白结合抗CD 74(BioLegend)、7-AAD和抗p24 gag-fITC(贝克曼库尔特)染色。57。经SERINC 3/5敲除的JTAG细胞中，NEF介导的SERINC 5从细胞表面内化(称为JTAG-SERINC 3/5)。−/−)12。JTAG-SERINC 3/5−/−细胞(3×10)6)用5μg的pBJ5-SERINC 5-内HA标记(S5-IHA；由H.Gottlinger提供)电穿孔。135μg的DNA单独编码gfp或Nef-gfp融合蛋白，利用上述基因脉冲X细胞方波条件。24小时后，这些细胞被Alexa Fluor 647抗HA.11和Zombie Aqua染色，以去除死细胞组分(全部来自生物传说)。36.

请注意，在上述所有系统中，活细胞都是门控的，nef表达细胞(定义为gfp)中cd4、ccr 5、cxr 4、hla-i或cd 74的平均荧光强度(Mfi)。+或P24 Gag+传感器细胞中的子集，表示MFI Nef+在下面的计算中)和非Nef表达的细胞(定义为gfp)。−或P24 Gag−传感器细胞中的子集，表示MFI Nef−)流式细胞术(FACS Verse：BD生物科学)。用以下公式计算每个Nef克隆的CD4、CCR 5、CXCR 4和HLA-Ⅰ下调活性及CD 74上调活性：(MFI Nef)−−MFINEF+)/MFI Nef−×100每个nef克隆的SERINC 5-IHA下调活性的MFI值被归一化为阴性(Gfp)。+/S5-IHA+)和正(Nef)_SF2-绿色伙伴关系+/S5-IHA+)使用以下公式进行控制：(MFI)_负−MFI_克隆)/(MFI)_负−MFI_阳性)×100。所有的Nef函数值都被报告为最小三份实验的平均值。

SERINC 3/5活性的感染性测定

重组病毒由JTAG或JTAG-SERINC 3/5电穿孔而成。−/−以NL 43为基础的前体细胞缺乏或携带不同类型的前体细胞NEF序列。24小时后，收集含病毒上清液，用基于SYBR绿色i的产品增强逆转录酶一步法测定逆转录酶活性，如上文所述。60,61。将tzm-bl报告细胞(nih艾滋病研究和参考试剂计划)接种到96孔板中，暴露于病毒中24小时，然后用Galacto-Star Reporter分析系统(应用生物系统)进行裂解，以测定β-半乳糖苷酶的活性。57。为了获得病毒的相对传染性，我们将感染细胞的数量(以发光值来衡量)除以输入病毒的数量(以逆转录酶活性来衡量)，然后将其归一化为对照菌株nl4.3-nef。_SF2。此外，为了定量Nef对抗SERINC 3/5的能力，将JTAG细胞衍生病毒的相对传染性值除以JTAG-SERINC 3/5。−/−细胞衍生病毒。因此，NEF>1.0和<1.0分别表明NEF对抗SERINC 3/5能力的增强和减弱。所有NEF功能值均被报道为最小三份实验的平均值。

病毒复制试验

将HEK293T细胞接种于6孔板上，转染NL 43前体细胞。NEF序列。48小时后，收集含有病毒的上清液，量化为p24的数量。卡格AG的ELISA法(ZeptoMetrix Corp.)保存在−80°C处，直至使用。刚从HIV阴性献血者中分离出PBMC(10例)6细胞暴露于病毒制剂(P24 10 Ng)中。卡格(AG)6小时，洗涤两次，再悬浮在培养基(RPMI 1640，10%胎牛血清)中，如前所述。22,57。3天后，用PHA刺激PBMC。收集培养上清液，每3天用添加人rIL-2的新鲜培养基代替培养上清液。通过检测p24来监测病毒复制。卡格用酶联免疫吸附试验(ELISA)对培养上清液中的AG进行为期15天的检测。在病毒复制初期(第9天)，用ELISA值作为我们的复制能力的衡量标准。结果表示为对每个供体进行四次评估的平均值，归一化为对照菌株nl4.3-nef。