吸烟对慢性炎症、免疫功能及血细胞组成的影响

吸烟是癌症死亡的头号危险因素，但只有15-20%的重度吸烟者患肺癌。因此，尽早查明高危人群将是非常有益的，以便能够采取预防措施。为了研究这一点，我们评估了吸烟对炎症标志物、细菌和病毒挑战的先天免疫和适应性免疫反应以及血细胞组成的影响。我们发现，30名重度吸烟者(男性16名，女性14名)血浆CRP、纤维蛋白原、IL-6和CEA水平明显高于36名非吸烟对照组。在没有任何外源性刺激的情况下，吸烟者的全血在37℃下孵育7小时，其分泌的IL-8和许多其他细胞因子/趋化因子水平明显高于不吸烟者。当被挑战7小时时大肠杆菌，吸烟者的全血中分泌的许多炎性细胞因子/趋化因子水平明显降低。然而，当用hsv-1刺激时，两种pge的水平都显著升高。₂吸烟者血液中分泌的细胞因子/趋化因子比对照组多。在血细胞组成、红细胞、红细胞、血红蛋白水平、MCV、MCH、MCHC、pct、RDW水平等方面，吸烟者均有较高的肺容量。同时，白细胞总数也显著增加，这是由于粒细胞和单核细胞增多所致。此外，吸烟者有较低的NK细胞和更高的Tregs，这表明吸烟可能会降低杀死新生肿瘤细胞的能力。重要的是，吸烟者之间存在很大的人与人之间的差异，有些人与对照组之间的值有显著差异，而另一些人则显示出测量到的许多参数的正常水平，表明前者患肺癌的风险可能要高得多。

吸烟导致全世界600万人过早死亡，主要是肺癌、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和心血管疾病(CVD)。1。与不吸烟者相比，平均生命损失为10至15年，吸烟者开始患上与烟草有关的疾病，如心血管疾病、中风和痴呆症，大约比不吸烟者早10年。2,3。有趣的是，只有15-20%的烟民会患上肺癌。4,5。因此，及早发现最易患肺癌的人将是非常有帮助的，以便能够采取预防措施。由于慢性炎症(CI)已被证明是肺癌的主要因素。6,7,8,9已经开展了许多研究，将炎症生物标记物与随后的肺癌发展联系起来。从这些研究中，人们普遍认为，急性时相蛋白C反应蛋白(CRP)是一种敏感的香烟致炎生物标志物。10,11,12，并可能对风险预测有用。13。血浆中CRP、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的上游调节因子的水平也是如此。14在许多研究中，吸烟的人被证明是升高的。15,16。与此相关的是，最近有报道称，在随后诊断为肺癌的10,061例动脉粥样硬化患者中，CRP和IL-6水平显著高于后来未被诊断为肺癌的患者。17。重要的是，这些研究人员发现，用抗IL-1β的单克隆抗体canakinumab(一种抗IL-1β的单克隆抗体)减少炎症标志物CRP和IL-6(以及其他可能的促炎蛋白)，可以显著降低这些患者的肺癌发病率。17.

许多研究表明，重度吸烟者的白细胞水平以及CRP和另一种急性时相蛋白纤维蛋白原水平都在升高。13,18。一项研究对这三项进行了调查，结果表明，同时升高CRP、纤维蛋白原和白细胞计数不仅会增加患肺癌的风险，还会增加患结直肠癌和乳腺癌的风险。13。此外，在最近的一项研究中，从后来患肺癌的吸烟者的诊断前血样中发现，癌症抗原125(Ca 125)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白-19片段(cyfra 21-1)和表面活性蛋白B的前体形式(Pro-sftb)等4种蛋白的水平都较高，表明这一组生物标记物可能对吸烟所致肺癌风险的评估非常有用。19.

为了探讨是否有可能发现新的生物标志物，这些新的生物标志物可能有助于识别高危吸烟者患肺癌的可能性，我们在目前的研究中提出：(A)将重度吸烟者的CI、免疫功能和血细胞成分与对照组进行比较；(B)将这一队列的结果与我们先前公布的肥胖数据进行比较。20正常老化21队列。

吸烟与CRP、纤维蛋白原、IL-6和CEA有关，而与PGE无关。₂水平

本研究招募了30名重度吸烟者和36名非吸烟者(对照组)，他们的特征见表。1。为了测量CI的水平，我们首先分析了血浆中CRP的含量，因为这是一个公认的吸烟所致炎症的标志。10,11,12,13。如图所示。1A，CRP水平显著(p在吸烟者中升高。值得注意的是，所有吸烟者都被赋予了一个独特的识别符号，这样每个吸烟者就可以从一种检测方法被追踪到另一种检测方法。同样，所有的男性都被一个正方形所象征，所有的女性都被一个圆圈所代表。我们还比较了纤维蛋白原22另一种急性时相蛋白，以前曾被证明在吸烟者中升高。如图所示。1B，纤维蛋白原水平显著(p吸烟者中的纤维蛋白原水平也升高了，但与CRP一样，许多吸烟者的纤维蛋白原水平也是正常的。有趣的是，这两种蛋白质的水平之间没有相关性(R=0.046)。2，补充表沙一)。接下来我们来看看PGE。₂没有发现明显的(p吸烟人数增加(如图所示)。1c)。

采用中尺度分析法测定IL-1β、G-CSF、IL-10、IL-13、IL-17、MIP-1α、VEGF、IFNγ、IL-12、IFNα、IL-1 RA、TNF-α、IL-4和IL-8水平。白细胞介素10、白细胞介素13、白细胞介素17、血管内皮生长因子、干扰素γ、白细胞介素12或干扰素α水平无差异，如图所示。2吸烟者血浆中IL-1β、G-CSF、IL-1 RA、IL-4、MIP 1α和IL-8水平明显升高(P<0.0 5)，而IL-6水平仅显著升高(P<0.0 5)。p=0.049)升高。IL-6水平与CRP呈显著正相关(R=0.381，P<0.0 5)。p=0.006)，但与纤维蛋白原无相关性(R=-0.099)(表)2)。鉴于IL-1 RA与IL-1β竞争，与IL-1受体结合，并阻止IL-1β诱导的促炎信号，我们怀疑吸烟者IL-1 RA的增加是否与IL-1β水平升高有关。如表所示2，确实有一个重要的(pIL-1β水平与IL-1RA水平呈中度正相关(R=0.471，P<0.0 5).这也在图中得到了证明。2，其中3人的IL-1β水平最高(即， , , )IL-1RA水平最高。然而，有一个人的白细胞介素-1RA水平很高()IL-1β水平很低，提示其他因素可能与IL-1RA水平有关。

此外，由于一组由CEA、CA 125、Cyfra 21-1和Pro-SFTPB组成的生物标志物最近被发现对吸烟者随后发展为肺癌具有高度的预测作用。19我们对确定他们的价值观很感兴趣。然而，我们没有测试sftpb，因为没有商业上可用的试剂盒，而且据报道sftb与肺癌风险呈非线性的J型关联(NO和高水平的风险增加)，因此很难解释结果。23。如图中最后三个面板所示。2，只有CEA显著(p吸烟者高于不吸烟者。感兴趣的CEA水平与CRP水平显著相关(R=0.592，P<0.01)。p和IL-6(R=0.417，p=0.004)但与纤维蛋白原、IL-1β或IL-1RA无关(表)2).

吸烟者血液中的炎症细胞因子/趋化因子水平在HSV-1孵育或不含HSV-1时分泌升高，但与HSV-1孵育时大肠杆菌

为了确定吸烟者血液中的免疫细胞对体外挑战是否有或多或少的反应，我们将新鲜分离的全血样本孵育7小时(以获得早期和晚期细胞因子的水平)。21)在5%氧气(模拟体内条件)中，在37℃时，在存在或不存在免疫细胞挑战的情况下加湿孵化器。为了模拟体内细菌或病毒感染，我们使用了完整的大肠杆菌和HSV-1和我们早期的肥胖症一样20和老化研究21。如图所示。3(A)吸烟者的血液样本在没有任何外源刺激的情况下分泌显著(p < 0.0001) higher levels of the neutrophilic chemokine, IL-8, than whole blood from controls. A similar, albeit less robust, trend to higher cytokines/chemokines in 7 h incubated, unstimulated blood samples from smokers was also seen with IL-1β, G-CSF, IL-13, IL-17, VEGF, IFNγ, IL-12, IFNα, IL-4 and MIP1α (Fig S1).

刺激HSV-1后，G-CSF水平显著升高(p=0.012)，IL-8(p=0.002)，IL-1β(p=0.004)，干扰素γ(p=0.0002)，IL-1RA(p=0.0005)，IL-12(p < 0.0001), TNFα (p=0.003)和血管内皮生长因子(p < 0.0001), were observed with whole blood from smokers (Fig. 3b)。然而，作为对大肠杆菌刺激这一趋势被IL-1β水平显著降低(p=0.002)，IL-10(p=0.0003)、IL-6(p=0.0004)，MIP 1α(p=0.02)和肿瘤坏死因子α(p < 0.0001) in whole blood samples from smokers than from controls (Fig. 3b)。值得注意的是，两者之间有很强的相关性，如下所示大肠杆菌IL-6和MIP-1α(R=0.913)水平和IL-1β与肿瘤坏死因子α(R=0.822)水平之间的刺激(表)3，补充表S2).

有趣的是，尽管PGE的内源性水平₂不明显(p吸烟人数(即在零时间)增加(如图1所示)。1(C)或在没有外源刺激的情况下孵育7小时后，吸烟者血液中HSV-1的水平显著增加(图一)。4a)。这是看不见的大肠杆菌刺激。这一新的吸烟者生物标志物与纤维蛋白原(R=0.461)和HSV-1刺激的血管内皮生长因子(R=0.778)、白细胞介素-8(R=0.725)、干扰素γ(R=0.613)、白细胞介素-12(R=0.751)和白细胞介素-1RA(R=0.567)呈中度相关(R=0.567)。4，补充表S3).

吸烟可增加活化T细胞的干扰素γ分泌

为评价吸烟对T细胞活化的影响，用rpmi稀释吸烟者和对照组新鲜全血10倍。24用抗CD3+抗CD 28刺激或不刺激2d。如图所示。4B、在未刺激和刺激条件下，干扰素γ分泌水平均有升高的趋势。用分离的PBMCs(用10%的自体血浆模拟体内条件)代替稀释后的全血进行同样的实验时，抗CD3+抗CD 28刺激4天后，烟民中的抗CD3+抗CD 28水平也有升高的趋势(图2)。然而，在没有T细胞刺激的情况下，p0.007)吸烟者中干扰素γ水平较低(图1)。4(C)使用全血而不是更高的水平(图一)。4b)。这一差异表明，需要进一步的研究，以确定哪些体外测试更准确地反映体内条件。

吸烟增加红细胞的体积和血红蛋白水平。

血液中的差异细胞计数显示，虽然没有显着性(p吸烟者与对照组之间红细胞数量的差异(左上角，图1)。5)，血球(右上面板，图)。5, p=0.01)和血红蛋白水平(第二行左面板，图)。5, p在吸烟者中明显升高。同时，MCV(表示每个红细胞的平均体积)、MCH(表示血红蛋白/红细胞的平均质量)和MCHC(表示血红蛋白/红细胞的平均浓度)均有显著差异(P<0.01)。p < 0.05) elevated in smokers (Fig. 5)。综上所述，这些结果表明吸烟者中的红细胞比非吸烟对照组要大，并且有更多的血红蛋白/红细胞。同样值得注意的是，红细胞分布宽度(RDW)非常显著(p吸烟者的比例更高(左下角，图)。5)。皮尔逊分析显示，这些红细胞标志物与CRP或纤维蛋白原之间几乎没有相关性。2)，表明它们可能是用于风险评估的有用的独立生物标记物。我们还发现，虽然吸烟者的血小板计数只有轻微的上升趋势(图S3)，但血小板压积(pct，即血小板总质量)非常显著(见图3)。p在吸烟者中升高(右下角，图)。5)。皮尔逊分析显示吸烟人群血小板与纤维蛋白原水平呈中度相关(R=0.455)(表)2).

吸烟者单核细胞、粒细胞和胸腺增多，NK细胞减少。

用流式细胞仪观察吸烟者与对照组不同免疫细胞比例的差异。虽然没有明显的(p=0.058)淋巴细胞的差异(图1)。6A)，有一个显著的(p < 0.0001) increase in total white blood cells in smokers and this was attributable to a significant increase in monocytes (p < 0.0001) and granulocytes (p < 0.0001) (Fig. 6a)。皮尔逊分析表明，单核细胞和粒细胞的数量分别与C反应蛋白水平(R=0.316和0.370)和CEA水平(R=0.463和0.505)相关。除单核细胞和粒细胞数外，淋巴细胞数还与纤维蛋白原相关(R=443，R=0.323和R=0.517)(表)2)。图形6B显示每个吸烟者的单核细胞和粒细胞水平，以便与其他生物标志物进行比较。令人感兴趣的是，虽然大多数吸烟者有高粒细胞也有较高的单核细胞，但一个吸烟者的粒细胞水平较高()单核细胞水平很低，至少在一定程度上是独立调节的。皮尔逊分析证实单核细胞与粒细胞水平之间只有中度相关性(R=0.612)(表)2).

如图所示。6吸烟者CD4+或CD8+T细胞无明显变化，CD4/CD8比值无明显变化(图二)。6c)。这与我们先前的研究形成了强烈的对比，表明bmi>35的人CD8+减少，CD4+T细胞增加，CD4/CD8比值是对照组的两倍多。20。另一方面，与我们的肥胖研究相似，我们发现p自然杀伤(NK)细胞(CD 56光明细胞和暗细胞)比例较低(CD4+CD127low/-CD 25+FoxP 3+细胞)(如图4+CD 127低/CD 25+FoxP 3+细胞)。7)，表明杀死癌细胞的能力可能较差。Pearson分析显示吸烟者NK细胞数与CRP或纤维蛋白原水平无相关性(表)2)。此外，Tregs与C反应蛋白之间没有相关性(R=−0.083)，只有Tregs与纤维蛋白原有中度相关性(R=0.308)(表)。2)，这表明NK细胞和Treg的数量都可能是癌症风险的独立生物标志物。

吸烟与CRP、纤维蛋白原、IL-6和CEA水平有关。

CRP和纤维蛋白原属于阳性急性期蛋白，这意味着炎症时肝组织中CRP和纤维蛋白原的产生和分泌增加。它们和其他阳性的急性期蛋白一样，具有促进和抗炎的特性，并通过调节免疫细胞来破坏感染性物质，清除受损的组织并促进修复。吸烟、肥胖和心血管疾病都与CRP和纤维蛋白原水平升高有关。22,25,26。而CRP升高的生理影响尚未完全解决。14,27，纤维蛋白原水平升高会导致血小板聚集、血液粘度增加、血栓形成和心血管疾病，部分原因是在凝血过程中将其转化为纤维蛋白。8,13。吸烟者血浆纤维蛋白原水平的增加被认为是对吸烟持续侮辱的一种普遍的炎症反应。28，典型的伤口愈合过程。能刺激这种反应的主要媒介之一是IL-6。28，我们在这项研究中证明，吸烟者的吸烟水平是升高的。

即使CRP和纤维蛋白原对IL-6的反应都是上调的。29我们只观察到IL-6与CRP水平之间存在中度相关性(R=0.381)，但无显着性差异(P>0.05)。p与纤维蛋白原水平相关(R=−0.099)，提示其他因素决定了这些急性时相蛋白的水平。例如，儿茶酚胺和游离脂肪酸也被报道能刺激纤维蛋白原的合成。22,28吸烟后会升高。

同样值得注意的是，现在已经确定IL-1β位于IL-6的上游。10,14我们发现IL-1β水平与IL-6或CRP水平(分别为−0.001和−0.079)和纤维蛋白原水平(R=−0.263)无关。这些结果至少在一定程度上是由于最近的研究发现，CRP通过抑制单核细胞产生IL-1β来抑制自身的产生，进而降低IL-6的产生。14。值得注意的是，我们发现内源性血浆中的PGE水平₂吸烟者中没有升高，这是令人惊讶的，因为以前有报道说PGE升高。₂吸烟者水平30,31。他们也令人惊讶，因为我们的结果显示血浆PGE升高。₂肥胖受试者的水平20，另一组易患CI。

新鲜血液样本的Luminex分析显示吸烟者中IL-1β、G-CSF、IL-1 RA、IL-4、MIP 1α、IL-8和IL-6水平呈上升趋势，但仅与IL-6有统计学意义。这种典型的促炎细胞因子是脑梗死的一个公认的标记物。32,33不仅触发肝细胞分泌纤维蛋白原和CRP的急性时相蛋白反应，而且促进抗体的产生和Th的分化。₁₇CD8+T细胞减少Tregs分化34。综合起来，这反过来又导致了CI。因此，我们和其他人观察到的内源性IL-6水平升高。35,36可能与吸烟者易患肺癌的风险增加有关。1。我们在吸烟者中观察到的更高的G-CSF水平的趋势以前已经报道过了。37而且是潜在的重要因素，因为给人类注射这种细胞因子可以增加粒细胞和单核细胞。38因此，吸烟者白细胞数量的增加至少有部分原因。

对新鲜血液样本的Luminex分析还发现，在先前建立的三种肺癌危险生物标志物中，CEA、CA 125、Cyfra 21-1。19吸烟者中只有CEA含量较高。有趣的是，Pearson相关分析(表)2CEA水平与单核细胞数(R=0.463)和粒细胞数(R=0.505)相关。

值得注意的是，尽管文献表明患有慢性阻塞性肺病的吸烟者可能比没有慢性阻塞性肺疾病的吸烟者更容易发炎。39,40,419名COPD吸烟者与21名非COPD吸烟者的IL-6、CRP、VEGF或IL-17水平没有明显差异。然而，这可能是由于我们的小样本规模。另一方面，我们发现患有慢性阻塞性肺疾病的人粒细胞明显增加，并且在HIV-1刺激下，IL-1β水平显著降低。

我们还比较了男性和女性吸烟者的所有测试，不像Melanica等人。(2017)，在血液学参数上没有发现明显的性别依赖性差异。51这也可能是因为与Melanica等人使用的样品相比，样品的数量要小得多。(2017年)。然而，我们确实发现，女性吸烟者在HSV-1刺激的血液中具有较高的CEA水平和较高的IL-1β水平。另一方面，我们发现男性吸烟者有较高的CD8/CD3 T细胞比率和较高的血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子α和MIP 1α。大肠杆菌-受刺激的血液

吸烟改变先天和后天免疫反应

在我们的研究中，一个新的发现是，仅仅在没有任何外源刺激的情况下，将吸烟者新鲜的全血孵育7小时，就会增加许多促炎细胞因子/趋化因子的水平，其中最健壮的是IL-8。这种在体外产生的促炎细胞因子可能与吸烟者体内较高水平的氧化应激有关。42,43。吸烟会产生许多活性物质，这可能会压倒抗氧化防御系统。而低分子量抗氧化剂，如维生素E和C，据报道在吸烟者中较低。42，血谷胱甘肽水平升高8-10%。44。因此，吸烟者有可能产生还原型谷胱甘肽，以维持体内细胞因子/趋化因子与不吸烟者的水平相当。然而，体内外的情况可能不是这样，可能是因为半胱氨酸水平的限制，这可能是我们观察到吸烟者体内外产生的促炎细胞因子增加的原因。

在15种细胞因子/趋化因子的检查中，经过7小时的刺激大肠杆菌我们发现吸烟者中的吸烟人数较少，这表明，消除细菌感染的能力可能受到损害。这与众所周知的吸烟者对感染的易感性增加是一致的.然而，这种易感性增加的部分原因可能是香烟烟雾对呼吸道上皮完整性的有害影响，这为病原体的进入提供了便利。45,46.

另一方面，HSV-1刺激显示吸烟者的血液中有更强的细胞因子/趋化因子反应，这可能意味着对细胞因子风暴的易感性增加。与此相关，我们没有发现hsv-1刺激的干扰素α增加，这是一种重要的细胞因子，参与限制病毒感染。47。同时，我们观察到PGE明显增加。₂对HSV-1刺激吸烟者的反应。自PGE以来₂已经证明可以抑制B细胞和T细胞的分化和激活48,49，这可能会降低清除病毒感染的能力。这与人们普遍接受的吸烟通常是免疫抑制的观点是一致的。50。再加上我们观察到的对病毒挑战的更强烈的炎症反应，这可能解释了为什么吸烟者的病毒感染更严重。51并可作为一种警告，在治疗肺癌患者的肿瘤病毒治疗。

吸烟和血细胞

我们发现吸烟会增加红细胞的体积和血红蛋白水平，这与文献相符。52,53并且与烟草烟雾中的一氧化碳相一致，使氧从血红蛋白中置换出来。54。我们在吸烟者中观察到的rdw增加可能是一个有用的癌症危险指标，因为高rdw与代谢综合征、cvd和全因死亡率有关。55。在没有血小板数量增加的情况下，我们在吸烟者身上观察到的血小板压积增加，也可能有助于评估风险，因为这种血小板总质量的测量最近已被证明是用于治疗各种炎症相关疾病的生物标志物，包括克罗恩病和妊娠期糖尿病。56,57。因此，我们在吸烟者身上观察到的更高的血小板临界值可能表明，这一未充分利用、但易于获得的生物标志物值得进一步研究，作为吸烟者癌症风险的一种可能的生物标志物。

虽然我们发现吸烟者的淋巴细胞没有升高，但与最近的一些报道形成了对比。18,58，我们发现吸烟者的粒细胞和单核细胞增多，这与文献相符。59。部分原因可能是我们在吸烟者血浆中观察到的内源性G-CSF水平升高，这可能是由于香烟烟雾对支气管上皮细胞的损伤所致。60因为这增加了骨髓增生。G-CSF最近也被认为是慢性阻塞性肺疾病(COPD)炎症的一种调节因子。61，并在吸烟者的支气管肺泡灌洗液中被发现升高。61。因为COPD增加了患肺癌的风险62，吸烟人群中G-CSF含量的增加可能是未来癌症风险的一个生物标志。G-CSF除了促进骨髓生成外，还能改善肺内中性粒细胞的存活。60。重要的是，较高的中性粒细胞已被证明与非小细胞肺癌患者的生存不良有关。63,64,65因此，这可能是未来吸烟者患肺癌风险增加的一个预测因素。

除单核细胞和中性粒细胞增多外，我们还观察到吸烟者外周血Tregs和NK细胞较低。升高的Tregs可以降低免疫反应，以前曾在吸烟者中报道过。66,67并可作为平衡吸烟引发的CI。我们观察到的NK细胞减少的原因可能是骨髓中NK细胞增殖减少，或NK细胞在进入组织中丢失增加，或者半衰期缩短。68。Tregs和NK细胞水平的这些变化不仅预示着体内平衡的失衡，还可能通过减少免疫细胞对新生肿瘤细胞的杀伤作用来促进肿瘤生长的环境。因此，它们仍可作为未来肺癌风险增加的有价值的生物标志物。

吸烟与肥胖对炎症标志物影响的比较

重度吸烟者，像bmi>35的人一样，有升高的CRP水平，尽管这些水平在肥胖中更高(平均=10克/毫升，烟民是3克/毫升)。20，与先前的研究一致，表明CRP水平对BMI变化最敏感。69。同样，与BMI>35的吸烟者一样，吸烟者也会升高Tregs、粒细胞和单核细胞，减少NK细胞的数量。然而，与吸烟者不同，bmi>35的人CD4/CD8比值升高。20。我们的发现，吸烟不影响CD4或CD8 T细胞水平或CD4/CD8比值与几项研究不一致，综述了70，但与71。因此，目前关于吸烟者CD4和CD8频率的数据似乎相互矛盾。吸烟强度可能导致这一差异，因为外周血T细胞亚群在轻度(10-19包年)与中度吸烟者(20-49包年)之间没有差异。71,72，但在重度吸烟者(50-120包年)中，CD4/CD8水平却没有增加，反而有所下降。72,73。与bmi>35的人相比，我们还发现重度吸烟者的内源性前列腺素E没有升高。₂他们血浆中的水平与正常人相比20.

吸烟者个体差异与癌症风险

每一个吸烟者都有一个独特的符号，这使得我们能够通过不同的测试来追踪每个人，并在某种程度上确定他们的相对风险。然而，对我们研究的一个重要警告是，我们的样本规模相对较小，而且我们的数据集只从一个时间点导出。同时，目前难以确定的是不同生物标记物的相对权重，包括那些可能对抗CI的生物标志物。随着时间的推移，扩大样本规模并跟踪这些人，看看谁会患上肺癌，就像我们打算做的那样，应该有助于澄清这一点。

人体与血液采集

30名重度吸烟者(定义为目前吸烟者每天吸烟≥1包至少20年)和36名健康的从不吸烟志愿者被招募。取血于K2EDTA真空保持管(CAT)。编号367861，BD，Mississauga，on)和一份无内毒素的74玻璃肝素钠真空保持管(CAT)编号366480，BD，Mississauga，on)。所有参与者都给予知情的书面同意参加这些研究。所有的实验都是按照指导方针/条例进行的，这些准则和条例是由不列颠哥伦比亚省大学和BC癌症联合临床研究伦理委员会(#H12-00727)审查和批准的。所有志愿者在抽血前两天内不要服用非甾体抗炎药物。所有的血液样本都是由BC癌症的训练有素的手术人员在早上8：30到10：00之间采集的，以避免细胞因子分泌随昼夜节律的变化而发生的变化。75.

人血测定

全血检测按先前的描述进行。20。在含玻璃管的肝素钠中采集的人血样本，轻轻混合，保存在23℃，收集后2h内放入96孔圆形底组织培养板中。将50μL的血加入到单个井中，同时加入10μL的PBS(对照组)，大肠杆菌 (大肠杆菌，一枪INV 110，生命技术，Burlington，ON)，最终浓度为2×104细胞/mL或HSV-1G 207，感染多样性(MOI)为0.06(相对白细胞总数)。然后在5%的氧气中孵育7小时，37℃加湿保温箱，在每口井中加入100升的PBS，然后将细胞完全再悬浮，然后在424×离心机中离心。g4℃，5分钟。收集上清液后立即在−80℃冷冻。

Luminex分析

一个来自生命技术的自定义磁性Luminex测试面板被用于前面描述的20检测人血浆中IL-1β、G-CSF、IL-10、IL-13、IL-6、IL-17、MIP 1α、VEGF、IFN-γ、IL-12 p70、IFNα、IL-1 RA、TNF-α、IL-4和IL-8水平。用Milliplex地图人循环癌生物标记板测定肿瘤标志物CA 125、CEA和Cyfra21-1。冷冻样品在测试前进行解冻和离心(4℃下1000×g，10 min)。血浆样品在4℃时与抗体珠一起孵育一夜。利用Bio-Plex Manager 6.0软件使用BioPlex 100仪器读取检测板(Bio-Rad实验室，Mississauga，ON)。

中尺度分析

采用中尺度发现(MSD)V-PLEX临炎症小组1(人)IL-6定量试剂盒和细胞因子面板1(人)IL-17和VEGF定量(K15049D&K15050D，中尺度发现，盖瑟斯堡，MD)对未稀释血浆样品进行分析。20,76。简单地说，样品在MSD板上孵育2h，在23°C下摇动。洗盘子，用检测抗体孵育2小时。洗涤后，在每口井中加入2×读缓冲器T，并在QuickPlex SQ 120型1300型中进行分析。对校准器和血浆样品进行了复式分析。利用MSD工作台软件，将校准器浓度的响应绘制为垂直(Y)轴上的测井信号单元和水平(X)轴上的测井浓度。

PGE₂、纤维蛋白原和CRP的测定

PGE的ELISAs₂(CAT#514010，开曼化工公司，安阿伯，MI)，纤维蛋白原(CAT#AB 208036，ABCAM)和CRP(CAT#DCRP 00，研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州)21按照制造商的指示执行。

血差计数

用edta代替肝素管采集新鲜全血进行血细胞计数，以避免肝素引起血小板聚集。77，使用Coulter ac·T Diff2™血液学分析仪(贝克曼-库尔特公司，迈阿密，佛罗里达州)。

免疫表型

采用密度梯度离心法(StemcellTechnologies，温哥华，BC)从肝素化全血中分离出人外周血单个核细胞(PBMCs)，并按上述方法进行免疫分型。21。PBMCs用GhostDye Violet 450活力染料染色(圣迭戈市Tonbo生物科学)在4℃下染色30 min，用含2%FBS和0.05%叠氮化钠(PFN)的PBS冲洗一次，用抗人CD 32克隆IV.3(Stemcell Technologies，温哥华，BC)在23℃阻断15 min，然后在23℃染色30 min。为鉴定调节性T细胞，采用FoxP 3染色缓冲液集(eBioscience，San Diego，CA)固定和渗透细胞。细胞在4℃下用FoxP 3抗体染色，用PFN冲洗一次，用流式细胞仪进行分析。所有分析用BD LSR Fortessa流式细胞仪(BD生物科学)进行，数据分析用Flowjo软件V10.2(Flowjo，Ashland，OR)进行。抗体来源于加拿大温哥华的Stemcell Technologies公司的CD8-PE(克隆SK1)和CD3-FITC(克隆SK7)；CD 45-FITC(Hle1)、CD 28-APC(克隆CD 28.2)、CD4-PE-Cy7(克隆SK3)、CD 25-BB 515(克隆2A3)、CD 127-AF647(克隆HIL-7R-M21)和FoxP3-PE(克隆236A/E7)。