酮己糖激酶-A作为一种核蛋白激酶，介导果糖诱导的乳腺癌转移

高果糖摄入对健康的有害影响已被广泛报道。虽然已知果糖能促进癌症，但对其潜在机制知之甚少。在这里，我们发现果糖通过酮己糖-A信号通路触发乳腺癌转移.分子实验表明，酮己糖激酶A而非酮己糖激酶C对果糖诱导的细胞侵袭是必要和充分的.酮己糖激酶-A过表达乳腺癌在果糖喂养小鼠中被发现是高转移的.在果糖刺激过程中，细胞质酮己糖激酶-A进入细胞核，这是由LRC 59和KPNB 1介导的。在细胞核中，酮己糖激酶-A在Ser25处磷酸化YWHAH，而YWHAH则在Cdh 1启动子触发细胞迁移。本研究提供营养对乳腺癌转移的影响。在癌症患者中应限制高摄入果糖，以降低转移的风险。从治疗的角度来看，酮己糖激酶-A信号通路可能是预防肿瘤转移的潜在靶点。

果糖天然存在于水果中，是一种很受欢迎的烹调和烘焙用甜味剂。1。许多报告警告人们不要过量摄入果糖，因为果糖会加重肥胖、糖尿病和肝脏脂肪变性。2,3,4。除了代谢紊乱之外，高摄入果糖还会导致子宫内膜的高风险。5、乳房6食管7小肠7胸膜7，以及结直肠癌8。果糖引起的癌变被认为是由于能量代谢改变、氧化应激增加和炎症所致。9,10,11.

葡萄糖提供氨基酸和核酸合成所需的能量和中间代谢物。癌细胞的代谢被重新编程以消耗大量的葡萄糖，从而导致肿瘤微环境中葡萄糖的消耗。为了弥补葡萄糖不足，癌细胞使用果糖作为替代能源。例如，胰腺癌细胞的果糖通量增加，通过非氧化戊糖磷酸途径加速核酸的合成。12。除细胞增殖外，果糖还与肿瘤转移有关。果糖通过酮己糖激酶-醛缩酶B途径促进结肠癌向肝转移11。在其他癌症中，也有报道说果糖可以增加转移潜能。13,14,15,16。然而，果糖的亚稳作用的确切机制尚不清楚。

酮己糖激酶(Keto己okinase，KHK)是在果糖代谢速率受限的第一步，将果糖转化为1-磷酸果糖的酶.这个KHK基因表达两种亚型KHK-A和KHK-C，这是由于外显子3的选择性剪接而产生的。KHK-C是在包括肝脏在内的少数几个组织中唯一表达的，它驱动上述代谢。相反，KHK-A被认为对这种代谢没有贡献，因为在果糖的生理水平上，它的酶功能非常低。尽管如此，由于khk-A在大多数组织中都有表达，所以相信khk-A除了能量代谢外，还具有其他一些生物学功能。17,18。最近，KHK-A在肝细胞癌中的作用被报道.KHK-A通过直接磷酸化磷酸核糖焦磷酸合成酶1(PRPS 1)促进核酸合成，从而促进细胞增殖。19。考虑到KHK-A作为蛋白激酶的作用，KHK-A有望参与多种信号通路的研究。

乳腺癌细胞高表达果糖转运体GLUT 520，以及对高果糖的反应16。然而，人们对果糖诱导乳腺癌转移的分子机制知之甚少.在此，我们测试了KHK-A介导乳腺癌转移对果糖反应的可能性.在果糖刺激下，LRC 59与KPNB 1协同，将KHK-A转运到细胞核，KHK-A在Ser 25处磷酸化了YWHAH。磷酸化YWHAH促进段塞抑制Cdh 1基因，从而导致乳腺癌细胞侵袭。本工作为果糖诱导肿瘤转移提供了分子机制。

果糖促进乳腺癌细胞侵袭

我们首先检查了哪些癌细胞对果糖的反应更具有侵袭性。与生理盐水或葡萄糖相比，果糖促进了Matrigel对乳腺癌、脑、肺、胰腺、结肠、前列腺和子宫颈细胞的侵袭，但对卵巢、肾脏、骨骼和肝脏的癌细胞株没有促进作用(图1)。1A和补充图。1)。为了研究KHK在这一过程中的作用，我们测量了不同癌细胞株中两种KHK亚型的细胞水平。除HepG 2外，大多数细胞株主要表达KHK-A(图1)。1B)。利用TCGA进行的信息学分析显示，KHK-A而不是KHK-C主要表达在大多数人类癌症中，包括乳腺癌(图1)。1C和补充图。2)。接下来，我们将探讨KHK-A在乳腺癌中的转移作用，因为在所有三种乳腺癌细胞系中，细胞对果糖的侵袭反应都很强。葡萄糖和果糖都会影响细胞行为。21,22在相同浓度(最终为5mm)葡萄糖或果糖下进行侵袭试验。果糖有力地刺激细胞侵袭，但葡萄糖在这种浓度下对细胞侵袭表现出边缘效应(附图)。3A)。为了研究果糖诱导的细胞侵袭是由哪一种亚型引起的，我们使用针对第3外显子中的同类型特异性序列的siRNAs沉默了KHK-A或KHK-C，从而通过沉默KHK-A来减弱果糖诱导的细胞侵袭。此外，KHK-A过表达增强了细胞的侵袭能力。1D和补充图。3B)。为研究细胞骨架的结构，采用phalloidin对F-肌动蛋白进行染色.在果糖孵育过程中，MDA-MB-231细胞形态发生改变，前后极化增强，F-actin重排增强。1E和补充图。3C)，表明细胞经历了上皮间充质转换(EMT)。在典型的EMT标记中，细胞粘附分子Cdh 1(又称E cadherin)被果糖抑制，KHK-A过表达增强了这一效应。1F和补充图。三维空间)。因此，我们的结果提示，果糖可能通过KHK-A介导，在乳腺癌中触发EMT。鉴于已知KHK-A在果糖利用方面的活性较低，我们需要确定果糖引起的入侵是否可归因于KHK-A的酶功能。在果糖刺激下，KHK特异性激酶抑制剂嘧啶嘧啶(PyPy)抑制MDA-MB-231细胞骨架重排和细胞侵袭。1g，h和补充图。3E)。我们还通过测定果糖-1-磷酸和活性氧来检查KHK-A是否参与果糖通量.如预期一样，KHK-C提高了他们的水平，但KHK-A(补充图)没有提高他们的水平.3F，g)。这些结果表明，KHK-A通过激酶功能促进细胞侵袭，而不考虑果糖代谢。

另一方面，先前报道ALDOB和ALOX 12在果糖诱导的结肠转移中起作用。11和乳腺癌15。因此，我们还研究了这些蛋白质是否参与果糖刺激的乳腺癌细胞侵袭.然而，ALDOB或ALOX 12的基因敲除不能减弱果糖刺激下细胞的侵袭(补充图1)。4A，b)。对于与以往报道不一致的结论，我们认为是由于使用不同类型的细胞系或在不同环境下的实验导致了细胞代谢的改变。如前所述，khk-A通过磷酸化prps 1来促进肝细胞癌的发生。19。因此，我们探讨了PRPS 1介导KHK-A对细胞侵袭作用的可能性。即使PRPS 1被击倒，MDA-MB-231细胞对果糖也表现出良好的侵袭性(补充图)。4C)。综上所述，这些数据表明KHK-A似乎促进了细胞的侵袭.

KHK-A增强果糖诱导的转移

为了评价KHK-A是否促进乳腺癌在体内转移，我们将小鼠MTV-TM-011细胞系植入小鼠乳腺脂肪垫中。建立了稳定表达KHK-A或KHK-C/sh-的细胞系。KHK-a用荧光素酶和。荧光素酶活性、KHK-A/C表达及小鼠KHK-A基因敲除均如附图所示。5A和6A。实验时间表在图中作了总结。2A和补充图。6B。我们发现“f”组小鼠体重严重下降(KHK-A高表达肿瘤在喂果糖的小鼠中)(见图)。2B)。3个KHK-A高表达组肿瘤生长快于3个对照组.在KHK-A组中，摄入果糖会促进肿瘤的生长，而对照组则不然。2C)。然而，当内源性KHK-A被沉默或被异位KHK-C所取代时，摄入果糖对肿瘤生长和体重没有更大的影响(补充图1)。6C，d)。由于肿瘤体积影响转移的机会，当肿瘤体积达到500~600 mm时，原发肿瘤被清晰切除。3。两周后，f组6只小鼠胸部转移，而其他组很少发生转移。二维空间和附图。5B和6E)。为了进一步评价肺转移，我们测定了切除肺组织的生物发光发射。在大多数来自f组的肺中，生物发光在整个区域都有很强的发射(图一)。2E)。“c”组和“h”组的肺局部检测到微弱的放射(如图1所示)，即喂果糖的小鼠的对照肿瘤。2E和补充图。6f)。组织学检查证实了两个果糖喂养组的肺转移。2F，以及附图。6g)。除肺外，“f”组肝、心、后腿、胃肠道均有肿瘤转移(图二)。2G)。然而，当KHK-A被沉默或被KHK-C取代时，摄入果糖不能促进肿瘤转移(附图)。6e-g)。总的来说，果糖喂养促进乳腺癌转移，KHK-A过度表达加剧了乳腺癌的转移.

果糖促进KHK-A与LRC 59和YWHAH的结合

鉴于KHK-C对细胞侵袭没有影响，我们推测KHK-A通过某种独特的途径促进细胞侵袭，而不依赖果糖代谢。为了鉴定KHK-A通路，我们寻找与KHK-A相互作用的蛋白质。在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，三种蛋白-乙醛酶结构域蛋白4(GLOD 4)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸单加氧酶激活蛋白Eta(YWHAH)和富含亮氨酸重复序列的蛋白59(LRRC 59)均以果糖依赖的方式与KHK-A相互作用(Fig)。3A)。为了确定这三种蛋白质中的哪一种参与KHK-A促进的细胞侵袭，我们击倒了每一个候选蛋白。沉默YWHAH或LRRC 59可减轻果糖对MCF-7和MDA-231的侵袭作用，但对GLOD 4的抑制作用不明显(图4)。3B和补充图。7A)。提示LRRC 59和YWHAH参与了细胞侵袭KHK-A通路。免疫共沉淀分析证实了KHK-A的果糖依赖性相互作用，而不是KHK-C与这两种蛋白质的相互作用(图)。3C和补充图。7b，c)。为了检查蛋白质在哪里相互作用，我们用亚细胞组分进行了免疫沉淀。KHK-A与LRC 59同时存在于细胞质和细胞核中，而与YWHAH相关的只有细胞核(如图所示)。三维空间)。有趣的是，输入结果表明果糖诱导KHK-A和LRRC 59的核易位，这鼓励我们测试核转运体LRC 59是否能帮助KHK-A进入细胞核。

LRRC 59和KPNB 1向细胞核转运KHK-A

在免疫印迹和免疫荧光分析中，果糖引起的KHK-A核易位呈剂量和时间依赖性。4A，b和补充图。8A，c-e)。相反，不管果糖治疗，KHK-C都留在细胞质中(补充图).8B-e)。与KHK-C相比，KHK-A具有更高的性能。Km果糖对酶动力学的影响18。基于这一酶学性质，KHK-A被认为与果糖的亲和力较低，因此人们质疑果糖是如何引发KHK-A核易位的。因此，我们测量了与放射性果糖结合的KHK-A或KHK-C的物理亲和力.在HEPES和磷酸盐缓冲器中，KdKHK-A对果糖的测定值(Mm)分别为0.53和0.55，KHK-C的值分别为0.40和0.47(附图)。8F)。这些结果表明，KHK-A与果糖的相互作用与KHK-C一样敏感，但在磷酸化果糖方面效果不佳.由于果糖依赖的核易位KHK-A是通过沉默LRC 59来减弱的(见图)。4C)，LRC 59可能作为KHK-A的核进口国。体外结合实验表明，果糖的存在是KHK-A与LRC 59结合的前提条件。4D)。众所周知，LRRC 59可以与KPNB 1协同运输蛋白质。23，我们调查了KPNB 1在KHK-A易位中的参与情况。因此，KPNB 1也加入了果糖依赖的LRC 59和KHK-A复合物。4E和补充图。8gKPNB 1的结合也依赖于LRC 59。4F和补充图。8H)。KPNB 1基因敲除可阻断KHK-A和LRC 59的核易位。4G和补充图。8I)，KPNB 1也是果糖依赖的核易位所必需的.接下来，我们研究了khk-A疏水基序中的leu 83残基是否对lrrc 59相互作用是必不可少的，就像对prps 1相互作用一样。19。KHK-A_L83A突变体不能与核进口商相互作用。4H和补充图。8j)。此外，KHK-A_L83A即使在果糖刺激下也不能进入细胞核(图1)。4I，补充图。8K)，也不促进果糖依赖性细胞的侵袭(图一)。4J，补充图。8L)。应该注意的是，亮氨酸83只存在于KHK-A中，因为它是由第3外显子编码的，它在KHK-A中与KHK-C有不同的剪接。该异构体特异性外显子3基序提供了独特的作用，KHK-A对果糖的反应.

KHK-A作为YWHAH的丝氨酸激酶

首先，我们排除了YWHAH参与果糖引起的核易位的可能性。9A)。当激酶KHK-A与细胞核中的YWHAH相互作用时，我们假设KHK-A的月光可磷酸化YWHAH.体外结合试验表明，KHK-A与YWHAH直接相互作用。5A)。令人惊讶的是，KHK-A可诱导YWHAH的Ser/Thr-磷酸化。5B)。然而，激酶死亡突变体KHK-A_dATP缺乏ATP结合基序，即使它在果糖的作用下进入细胞核，也不能诱导YWHAH的磷酸化(图一)。5B和补充图。9B)。此外，PyPy还减弱了YWHAH的磷酸化(补充图)。9C)。这些结果进一步支持了我们的观点，即YWHAH磷酸化是由KHK-A的激酶反应介导的。体外激酶测定证实KHK-A直接磷酸化YWHAH，而KHK-C不直接磷酸化YWHAH(图1)。5C，补充图。9d)。出乎意料的是，与1mm果糖共同孵育可抑制YWHAH的磷酸化.果糖与KHK-A催化位点的结合似乎干扰了KHK-A对YWHAH磷酸化的作用.我们进一步研究了果糖对YWHAH KHK-A磷酸化的影响.在酶动力学分析中，KmYWHAH的KHK-A值为246 NM(补充图)9E)。集成电路50和Ki果糖对YWHAH KHK-A磷酸化的抑制值分别为0.91和0.72mm(附图)。9F，g)。为了验证果糖抑制核内KHK-A的YWHAH激酶活性的可能性，我们用气相色谱法对果糖的核浓度进行了定量测定。当细胞与果糖一起孵育时，细胞质组分中检测到大量的果糖，而核组分中却没有检测到大量的果糖(附图)。9H)。这些结果表明，果糖对YWHAH磷酸化的抑制作用不存在于细胞核内。

为了确定YWHAH磷酸化的位点，我们进行了轨道串联质量分析，结果表明KHK-A在试管的丝氨酸25处磷酸化了YWHAH。5D)和细胞(补充图。9I)。为了验证S25磷酸化，我们表达了YWHAH_S25A突变体，发现突变体没有被KHK-A更多的磷酸化。5E)。这一结果表明，Ser 25是KHK-A依赖磷酸化的唯一残基.为了评估YWHAH在细胞侵袭中的作用，我们检查了果糖依赖的F-actin重排，发现YWHAH促进丝状足的形成。5F)。接下来，我们用针对3‘-UTR的siRNA去除了MDA-MB-231细胞中的内源性YWHAH，然后恢复野生型YWHAH或YWHAH_S25A。因此，YWHAH促进了果糖依赖的人类入侵(图一)。5G和补充图。9J)和鼠(附图。9K)乳腺癌细胞，而YWHAH_S25A突变体没有。综上所述，这些数据表明KHK-A通过在S25磷酸化YWHAH来介导果糖依赖性细胞的侵袭.

由于rps 1和p62曾被报道为肝癌中khk-A的底物。19,24，我们研究了果糖是否促进PRPS 1和p62磷酸化。果糖不影响Hep3B中PRPS 1的磷酸化，但对MCF-7和MDA-MB-231的磷酸化作用略有降低。10A-c)。正如以前报道的，在肝脏和乳腺癌细胞缺氧的情况下，发现p62在Ser28被磷酸化。检测HIF-1α作为缺氧指标.因此，果糖不能诱导p62磷酸化(补充图)。10d-f)。因此，果糖不能提高KHK-A的蛋白激酶活性。

YWHAH磷酸化促进乳腺癌转移

为了对乳腺癌转移进行体内评价，我们建立了稳定表达荧光素酶和YWHAH或YWHAH25A的MTV-TM-011细胞株。11A)。小鼠(每组7只)随机分为6组，进行肿瘤移植。6A)。D组体重明显下降(图1)。6B)。YWHAH高表达组肿瘤生长速度快于其他各组(图1)。6C)。原发肿瘤切除后，d组7只小鼠和b组2只小鼠胸部均有转移瘤，而其他组则很少发生转移。6d和补充图。11B)。在d组中，生物发光在切除肺的整个区域强烈发射，在b组和f组的几个肺中局部检测到微弱的放射(如图1所示)。6E)。组织学检查证实了来自果糖喂养的小鼠肺组织中的转移性肿瘤结节(图一)。6f)。D组肝、脾、脑和胃肠道也有转移性肿瘤(图一)。6g)。鉴于这些结果，KHK-A介导的YWHAH磷酸化对果糖诱导的乳腺癌转移至关重要.

KHK-A介导磷酸化的结构分析

考虑到KHK-C磷酸化一个小分子(果糖)，似乎奇怪的是KHK-A磷酸化了蛋白质中的氨基酸残基，如PRPS 1和YWHAH。为了澄清这种冲突，我们用一个11-残基肽模型对YWHAH在S25附近(从Y20到V30)的局部片段进行了分子动力学模拟，即YWHAH-11。伞式取样技术25,26计算了YWHAH-11(S25-OH)在s25处的羟基接近γ-γPO的自由能变化所对应的平均力势(Pmf)。3)关于KHK-A。PMF配置文件作为距离的函数(d)S25-OH的氧与ATP-γPO的磷之间的关系。3(无花果)7A)指示YWHAH-11能与KHK-A结合的ATP形成三元配合物，在d ≅3.5奥尔三元配合物YWHAH-11/ATP/KHK-A的结构如图所示.7b。这种P-O距离是磷酸化反应发生前的最近距离(即反应物状态)，与以往的量子力学方法一致。27,28 (d=3.2-3.3)，它还确定了磷酸化反应的过渡和产物状态。d=2.2-2.3d分别=1.7-1.8奥尔。获得了YWHAH-11/ATP/KHK-A复合物的PMF，研究了YWHAH/ATP/KHK-C和PRPS 1/ATP/KHK-A复合物PMF的变化规律。用同样的方法对这些系统进行了建模，并在图中对它们的PMF进行了比较。7A。对于PRPS 1/ATP/KHK-A模型，对T 225前后的PRPS 1片段(从D 219到I 229)采用了PRPS1-11残基模型，与YWHAH-11相似。值得注意的是，PRPS 1-11/ATP/KHK-A的PMF具有类似于YWHAH-11/ATP/KHK-A的特征，其局部最小值为d ≅3.6，而YWHAH-11/ATP/KHK-C的剖面在整个剖面中没有最小值。为了进一步分析YWHAH-11/ATP/KHK-A和PRPS1-11/ATP/KHK-A的这一剖面相似性，我们计算了YWHAH-11/ATP/KHK-A和PRPS1-11/ATP/KHK-A在局部最小状态下的残基-残基接触图(图)。7C)。在接触图中，KHK-A(AA)之间的链间接触区域.(3-298)和YWHAH-11或PRPS1-11是特别重点。KHK-A/YWHAH-11和KHK-A/PRPS 1-11的联系图具有相似的链间结构，揭示了YWHAH-11和PRPS 1-11与KHK-A区域(AA)共同接触的特点。，位于与khk-c不同的外显子3衍生片段中。29。这些结果表明，KHK-A区在YWHAH和PRPS 1的磷酸化中起着重要的作用，可能是在ATP位点附近保持YWHAH和PRPS 1的辅助结合剂。特别是，在YWHAH中，D21和D22与KHK-A结合区的平均原子数很高(图中为顶部)。7D)以及PRPS 1中的D 220和D 221(图中底部)。7D)。有趣的是，在YWHAH和PRPS 1中，氨基酸‘DDMA’通常位于KHK-A目标残基之前。我们的MD模拟结果还表明，DDMA中的双天冬氨酸残基在YWHAH或PRPS 1向与KHK-A结合的ATP方向航行中起着至关重要的作用。这通过对YWHAH-11与D21A(YWHAH-11_D21A)突变的PMF剖面进行了验证，清楚地显示了距离的移动。d在局部最小值到更大的值(如图所示)。7A)。利用MD模拟的这一信息，我们实验验证了D21残基对YWHAH的KHK-A磷酸化至关重要的可能性。YWHAH_D21A突变体既不与KHK-A相互作用，也不与KHK-A磷酸化。7E，f)。综上所述，这些数据进一步支持了我们的观点，即KHK-A可以磷酸化YWHAH的S25或PRPS 1的T 225。

S25-磷酸化的YWHAH在cdh 1启动子上招募鼻涕虫

在典型的EMT标记物中，Cdh 1的表达在乳腺癌细胞系中以果糖的表达变化最为明显。KHK-A过表达可增强果糖依赖性抑制Cdh 1的作用，而YWHAH基因敲除则可逆转这种抑制作用。8A和补充图。12A，b)。Cdh 1的表达在转录水平上受到调节(如图所示)。8B和补充图。12C，d)。先前的一项研究表明，YWHAH通过与转录因子蜗牛相互作用来调节Cdh 1的表达。30因此，我们研究了YWHAH是否与蜗牛和其他Cdh 1抑制剂相互作用。据报道，YWHAH与蜗牛相互作用，但这种相互作用与果糖或KHK-A无关。相比之下，在果糖和KHK-A依赖方式中，鼻涕虫与YWHAH相互作用(图1)。8C，以及附图。12E，f)。在染色质免疫共沉淀分析中，YWHAH和鼻塞的吸收Cdh 1启动子被证明依赖于果糖和KHK-A。8D，e，补充图。12H，i)，但蜗牛的招募不是(附图)。12g)。尽管它存在于细胞核中(附图)。12JYWHAH_S25A对果糖无反应。8F，补充图。12K)。这表明YWHAH的S25磷酸化是鼻塞相互作用的关键。果糖依赖性抑制Cdh 1的作用在YWHAH存在下被抑制，而在YWHAH_S25A存在时，抑制作用减弱(图1)。8g和补充图。12L)。这些结果也在mrna水平上得到验证。Cdh 1(无花果)8H和补充图。12米，n)。接下来，我们研究了果糖依赖的S25残基磷酸化是否对YWHAH的合成起着至关重要的作用。Cdh 1启动子。YWHAH与Cdh 1果糖能增强YWHAH_S25A的启动子，而果糖对YWHAH_S25A的启动子没有影响。8I)。同样，果糖也促进了与Cdh 1启动子，也被野生型YWHAH所增强。8j)。如所料，蜗牛与Cdh 1启动子不受S25磷酸化的调控(附图)。12O)。我们评估了蛋白质的顺序结合是否也会影响细胞的侵袭性。对稳定表达KHK-A的MTV-MB-231或MTV-TM-011细胞进行侵袭实验。果糖对YWHAH表达细胞的侵袭力以鼻塞法测定，而对YWHAH_S25A表达细胞则无明显影响。8K和补充图。12p，q)。为了研究Cdh 1抑制在果糖诱导的侵袭中的作用，我们在KHK-A高表达细胞中恢复了Cdh 1的表达，几乎完全阻断了果糖诱导的侵袭。8L和补充图。12R，s)。提示Cdh 1抑制是细胞侵袭的关键事件。最后，我们检测了乳腺癌组织中的KHK-A信号通路，这是从图中所示的小鼠身上获得的.2，以及附图。5。免疫组织化学分析显示，在果糖喂养的小鼠肿瘤中，Cdh 1的表达受到抑制，KHK和LRC 59的核表达也受到抑制(图一)。8m和补充图。13A，b)。我们也证实了YWHAH磷酸化在细胞核免疫染色乳腺癌移植，主要是从小鼠移除在图。6(补充图。13C)。综上所述，这些数据表明果糖通过KHK-A-YWHAH-Frog-Cdh1途径诱导肿瘤侵袭。

KHK-A-YWHAH-pSer25轴与转移相关

接下来，我们研究了YWHAH的KHK-A磷酸化是否与乳腺癌转移有关.为了研究KHK-A和S25-磷酸化YWHAH的相关性，我们对人乳腺癌阵列进行了免疫染色(图1)。9A)。根据诺丁汉分级系统对肿瘤标本进行组织学分级(图一)。9B)。3级组细胞核KHK-A和S25-磷酸化的YWHAH水平均显著高于2级组(图2)。9C)。即使将乳腺癌标本分为无转移组和转移组，转移组的KHK-A和S25磷酸化的YWHAH水平也明显高于无转移组(图1)。9d)。Spearman相关分析表明，核KHK-A的表达与S25磷酸化的YWHAH表达相关。9E)。总的来说，KHK-A介导的YWHAH磷酸化可能与乳腺癌转移有关.

为了解释果糖如何促进癌症的发展和进展，许多研究人员将重点放在KHK-C启动的能量代谢中的果糖通量上。果糖代谢似乎为癌细胞提供了结肠癌和胶质瘤的增殖和转移所需的补充燃料。11,12,13。然而，根据我们的结果，大多数癌细胞株主要表达KHK-A而不是KHK-C，KHK-A介导果糖诱导的细胞侵袭.因为KHK-A在生理浓度下对果糖的磷酸化作用很小，这是因为它的含量很高。Km价值18，果糖通过缺乏khk-c的癌细胞的代谢再编程来促进癌症的进展，这一点仍然有些神秘。14,15,16。在此，我们证实了KHK-A核蛋白激酶在果糖诱导的乳腺癌转移中的作用.在果糖刺激下，KHK-A由进口商LRRC 59和KPNB 1转运到细胞核，在S25处有磷酸化的YWHAH。磷YWHAH通过向Cdh 1启动子，从而促进细胞迁移。总之，果糖提示KHK-A启动细胞运动促进工作.图中概述了果糖诱导转移的信号通路。10.

由果糖刺激引起的酮己糖激酶-A的核转运，伴随着与核进口商LRRC 59和KPNB 1的相互作用。在细胞核中，KHK-A在Ser25处磷酸化YWHAH，而YWHAH则在CDH 1启动子中激活段塞，从而对E-钙粘附素的表达产生负调控作用。果糖触发的KHK-A信号促进细胞迁移，从而使癌细胞获得转移能力.

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KHK-C驱动的果糖代谢作为一种病理途径，由于过量摄入果糖而加重代谢紊乱。2,3,4。果糖代谢的有害影响也在癌症的发展过程中被研究过。11。相反，KHK-A对果糖介导的代谢紊乱有很小的贡献.有趣的是，最近的一份报告表明khk-A在果糖药物代谢紊乱中具有负作用。31。KHK-A基因敲除加重了AldoB敲除小鼠的代谢状况，提示KHK-A在果糖介导的代谢紊乱中起保护作用。然而，KHK-A这种功能背后的机制尚未被理解.前两次报告19,24我们的数据，KHK-A可能是一种蛋白激酶，负责细胞生长，应激反应和运动.因此，推测KHK-A微调果糖驱动的代谢重组，这一功能与KHK-A的蛋白激酶活性有关。

虽然KHK-C和KHK-A在分子结构上非常相似，但它们分别磷酸化了不同的底物：一种小的代谢物(果糖)和一种多肽(YWHAH)。KHK-A作为蛋白激酶的作用与先前的报道一致，表明KHK-A磷酸化PRPS 1。Khk-A磷酸化细胞质中Thr 225处的prps 1，并激活它，通过戊糖磷酸途径促进新的核酸合成，从而促进肝癌的形成。19。综上所述，我们的数据表明，KHK-A似乎本质上是一种Ser/Thr蛋白激酶，而不是果糖激酶。那么，KHK-A是否有针对的保守域？比较磷酸化Ser/Thr残基周围的氨基酸序列，在YWHAH和PRPS 1中，DDMA序列通常先于磷酸化残基。通过分子动力学分析，我们认为保守模体中的两个D在KHK-A的结合中起着关键作用，这也得到了实验的支持。DDMA基序可能是识别KHK-A靶向新蛋白底物的里程碑，值得进一步研究。

LRC 59最初被认为是位于内质网的核糖体受体，但其生物学功能尚不完全清楚。LRRC 59不是核糖体受体，现在被认为是细胞内吞的生长因子fgf 1的核转运体，它与kpnb 1一起发生。23。我们发现KHK-A的核易位是果糖依赖于LRRC 59-KPNB1复合物。在此过程中，果糖在形成KHK-A、LRRC 59和KPNB1三聚体中起着至关重要的作用。果糖在这种相互作用中的确切作用仍然是一个悬而未决的问题。推测果糖可能改变KHK-A的构象，形成一个有利于与LRC 59和KPNB 1相互作用的结构。

YWHA(或14-3-3)家族由7个成员(β，γ，ε，σ，ζ，τ和η)组成，广泛表达于所有真核细胞中。家族成员被上游激酶磷酸化，然后与下游效应子的磷酸丝氨酸/苏氨酸基序结合。因此，它们被认为是介导蛋白激酶信号通路的适配器。C-jun N-末端激酶(JNK)作为凋亡的一部分，在Ser186时磷酸化14-3-3ζ，在Ser184时磷酸化β，在Ser184时磷酸化14-3-3σ.这种磷酸化将14-3-3-3蛋白从bax中分离出来，而游离bax则通过释放细胞色素c而进入线粒体诱导凋亡。32。在gm-csf刺激下，src激酶在Tyr 179处磷酸化14-3-3ζ，而磷酸-14-3-3ζ激活磷酸肌醇3-激酶(Pi3k)以增加存活潜能。33。除了上述功能，14-3-3蛋白被认为参与了不同的细胞过程。在本研究中，我们在14-3-3η(YWHAH)中发现了一个磷酸化位点(Ser25).令人惊讶的是，14-3-3η的上游激酶是一种代谢酶，KHK-A，14-3-3η的下游效应是转录抑制子。在许多功能中，14-3-3蛋白可能是调控基因表达的转录适配器.

据报道，在YWHA家族中，有五名成员与蜗牛的snag和zf(锌指)域中的rxxpS/txp基序进行交互，并将蜗牛招募到电子盒元素中。Cdh 1启动子30。鼻涕虫，又称SNAIL 2，也有两个与RXXXpS/TXP基序高度同源的14-3-3结合基序。正如所料，我们发现鼻涕虫与YWHAH相互作用。有趣的是，只有在KHK-A在Ser25处磷酸化后，YWHAH才获得与鼻塞的结合亲和力。因此，YWHAH引导弹头进入Cdh 1启动子。相比之下，无论果糖的刺激还是YWHAH的磷酸化，蜗牛和YWHAH都是持续存在的。以上结果提示蜗牛控制Cdh 1的基础水平，而弹状虫则参与果糖刺激对Cdh 1表达的动态调控。分子动力学必须进一步研究，以阐明S25磷酸化是如何允许YWHAH与鼻塞相互作用的。

综上所述，我们观察到KHK-A在果糖刺激下促进乳腺癌转移，同时也显示了一种参与果糖诱导转移的信号通路。本工作为果糖致肿瘤加重的临床证据提供了合理的机制支持。根据我们的研究结果，应限制癌症患者摄入大量果糖，以降低转移的风险。从治疗的角度来看，KHK-A信号通路可能是预防肿瘤转移的潜在靶点.

细胞株与细胞培养

人乳腺癌(MDA-MB-231和MCF-7)、胚胎肾(HEK293T)、胶质母细胞瘤(U87和U 251)、肺腺癌(H 1299和A 549)、结肠癌(HCT 116和DLD-1)、肾癌(786O和RCC4)、宫颈癌(SIHA和HeLa)、卵巢癌(SKOV 3)、骨癌(U2OS)和肝细胞癌(HepG 2和Hep3B)的美国类型培养集(ATCC；Manassas，VA)；人胰腺癌(MIAPaca 2和PanC 1)，人前列腺癌(PC3和DU 145)和小鼠乳腺癌(MTV-TM-011)细胞系(韩国首尔)。MDA-MB-231、MCF-7、MTV-TM-011、U 251、H 1299、A 549、DU 145、PC3、786O、RCC4、HeLa、SKOV 3、U2OS和Hep3B分别在RPMI 1640、U87和HepG 2、HEK293T、MIApaca2、PanC1、DLD-1、HCT 116和HA中培养，分别加入10%的热灭活FBS。细胞生长或形态改变时，常规检查支原体污染情况。解冻后细胞的培养时间一般不超过3个月。细胞在含5%CO的加湿气氛中生长。2在37°C.荧光素酶表达，荧光素酶/KHK-A，荧光素酶/KHK-C-共表达MCF-7，MDA-MB-231和MTV-TM-011稳定的细胞系中，分别建立了G 418抗性克隆.

抗体和试剂

酮己糖激酶抑制剂PyPy(420640)是从米利波(伯灵顿，MA)购买的。培养基为FBS、D-果糖(F 3510)、D-葡萄糖(G 7021)和抗旗标抗体(F 7425，1：5000稀释度)。抗khk(sc-377411，1：500)，鼻涕虫(sc-166476，1：1000)，N-钙粘蛋白(sc-7939，1：1000)，vimentin(sc-7558，1：1000)，Zeb-1(sc-25388，1：1000)，β-tubulin(sc-9104，1：5000)，gst-tag(sc-138，1：1000)，prps 1/2(sc100288，1：1000)，醛缩酶B(sc393278，1：1000)和l-B(sc-6216，1：1000)的抗体是从圣克鲁斯生物技术公司购买的。CA)；抗Importin-β(ab2811，1：1000)、α-SMA(ab7817，1：1000)、捻度(ab50581，1：1000)和蜗牛(ab53519，1：1000)的抗体(英国剑桥)；抗YWHAH(9640，1：1000)、Myc-Tag(2278，1：1000)、绿色荧光蛋白(2555，1：1000)和SQSTM 1/p62(5114 T，1：1000)的抗体；来自ECM生物科学(凡尔赛，KY)的抗丝氨酸/苏氨酸(PP 2551，1：1000)和磷酪氨酸(PP 2221，1：1000)的抗体；来自Signalway抗体LRRC 59(NBP 1-93953，1：1000)和12-脂氧合酶(NBP 1-90338，1：1000)的抗体来自Novus Biologals(Littleton，CO)；抗KHK-A(21708-2，1：1000)和KHK-C(21709-2，1：1000)的同型特异性抗体来自Signalway抗体LLC(Pearland，TX，美国)；抗His(6)标记的抗体(PM 032，1：1000)来自MBL(名古屋，日本)。HRP-结合兔抗山羊抗体(81~1620，1：5000)，抗E钙粘素(131700，1：1000)和SQSTM 1/p62磷酸-Ser28(PA5-35409，1：1000)抗体来自Thermo Fisher Science(Waltham，MA)；HRP-结合山羊抗兔(G 21234，1：5000)和HRP-结合山羊抗小鼠(G21040，1：5000)来自Invitrogen(CA)；抗-GLOD 4(GTX104484，1：1000)来自特克斯(圣安东尼奥)。兔抗HIF-1α抗体(1：1000)抗人HIF-1α单链肽。34。利用噬菌体展示技术，通过商业设施(Bioneer，大田，韩国)，获得了一种抗S25磷酸化YWHAH单克隆抗体。合成肽RYDDMASAMKAVTE和RYDDMA(P)SAMKAVTE是从GL Biochem(中国上海)购买的，与牛血清白蛋白结合作为抗原。

质粒、siRNAs的制备及转染

人类的DNAKHK-A(NM_000221)，人类KHK-C(NM_006488)，人类LRC 59(NM_018509)YWHAH(又称14-3-3η；NM_(003405))采用rt-PCR技术，将其插入pcDNA-Myc、pcDNA-标志、pcDNA-gfp、pcDNA-His(6)、CMV荧光素酶/IRES或pGEX质粒中。用PCR突变法检测KHK-A和YWHAH的突变.激酶缺陷型KHK-A(KHK-A-dATP)是通过删除A.A构建的.255-260E-cadherin质粒是从Addgene(#47502；剑桥，MA)购买的.瞬时转染质粒或siRNA时，分别用脂质体3000(用于质粒)或脂质体RNAiMAX(用于siRNA)转染融合率为70%的细胞。转染后的细胞在实验前稳定48h。补充表中概述了siRNAs的核苷酸序列。1.

慢病毒载体稳定细胞系的建立

小鼠慢病毒载体KHK-a-基因制药(中国上海)产生了沉默的shRNA。将寡核苷酸退火后插入shRNA表达载体pGLVU 6/Puro。ShRNA序列(补充表)2)被设计成针对老鼠的编码区域。KHK-a(NM_001349066)。含病毒上清液取自HEK293T细胞，800×离心。g和过滤。滤液与含PEG-8000的浓缩液在4°C下隔夜孵育，在1600×离心条件下离心。g60 min后，病毒颗粒在pBS中重新悬浮，应用于MTV-TM/011细胞。用1μg/mL普罗霉素筛选转染细胞。为获得稳定的肿瘤移植细胞株，将MTV-TM/011细胞集落组合在一起。补充表中概述了shRNAs的核苷酸序列。2.

乳腺癌异种移植

所有动物实验都是在首尔国立大学动物保护和使用委员会(批准号：)批准的协议提案下进行的。170721-1-5；190712-2-1；190819-1)。用G 418筛选出携带CMV荧光素酶-IRES-gfp质粒或CMV荧光素酶-IRES-KHK-A质粒的MTV-TM-011细胞株；用sh-gfp质粒筛选CMV荧光素酶-IRES-gfp质粒。KHK-a(或sh-对照)，或cmv荧光素酶-IRES-khk-C质粒与sh-KHK-a用G 418和普罗霉素筛选CMV荧光素酶-IRES-GFP质粒，用G 418和Zeocin筛选His-YWHAH_ST25A或His-YWHAH_S25A质粒。将这些细胞植入雌性小鼠(8周龄，Balb/CSLC-nu/nu)右下乳腺脂肪垫中。制表水或15%果糖(或葡萄糖)的水是提供的Libitum。用异氟醚麻醉小鼠，腹腔注射维沃格洛荧光素溶液(40 mg/mL)(Promega，Madison，WI)100μL，获得肿瘤的活体图像。10 min后，用XenogenIVIS 100采集图像，用LivingImage2.50.1软件(Xenogen，Alameda，CA)进行分析。植入后2周，每周三次监测原发肿瘤生长情况。当平均原发肿瘤体积达到500-600 mm时3切除原发肿瘤，监测肿瘤转移3周。收集主要脏器(肺、肝、心、脾、脑、肾、后腿、胃肠道)，以确定肿瘤转移情况。

细胞侵袭试验

为评估细胞浸润情况，采用8μm孔径的Matrigel包膜隔开Transwell室。细胞接种于无血清培养基上，密度为2×10。4(H 1299，A 549和MDA-MB-231)，3×104(U87、U 251、DU 145、DLD-1、HCT 116、786 O、RCC 4、SIHA和HeLa)，4×104(Mcf-7和U2OS)，6×104(MIAPaca 2、PanC1和MTV-TM-011)，或7×104(PC3和HepG 2)细胞/好，在下腔内放置含FBS的培养基。细胞孵育18h后，用4%多聚甲醛固定，苏木精和伊红染色。滤镜上部的细胞用棉签去除，向下侵入的细胞在BX53-P偏光显微镜下被观察和拍摄(奥林巴斯，日本东京)。利用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD)对入侵细胞进行计数。

重组蛋白的制备

重组GST-KHK-A，GST-YWHAH和游离GST蛋白在大肠杆菌BL 21细胞，用谷胱甘肽亲和珠(GE Healthcare；芝加哥，IL)在4°C作用1h，用10 mm还原谷胱甘肽(Sigma-Aldrich)洗脱。在HEK293T细胞中表达标志-LRC 59和His(6)-KHK-A蛋白，分别用EZview红旗(Sigma-Aldrich)和镍-NTA(Chiagen，Hilden，德国)亲和珠在4°C下洗脱4h，分别用500 ng/μL的标志肽和250 mm咪唑洗脱。用SDS-PAGE和考马斯亮蓝R-250染色法检测蛋白质的含量和纯度.

体外结合试验

纯化的his-khk-A和旗标-lrrc 59或gst-yWHAH的混合物在一个结合缓冲液(25 mm HEPES/pH 7.5,150 mm kCl，12.5 mm MgCl)中孵育。20.5 mm DTT、0.1%NP-40和10%甘油)在4°C作用1h，加入或不加1mm果糖，在4°C下与镍-NTA亲和珠进一步孵育1h，经结合缓冲液洗涤后，在变性SDS样品缓冲液中洗脱结合蛋白，进行Westernblotting。

体外激酶测定

重组His-KHK-A(10 Ng)或His-KHK-C(10 Ng)和GST-YWHAH(5 0 Ng)在含50 mm Tris-HCl/pH 7.5,100 mm KCl，50 mm MgCl的激酶缓冲液的30μL中2，1mm邻苯二甲酸钠,DTT 1mm，甘油10%，ATP 2mm。反应在37℃下孵育1h，在SDS缓冲液中加热结束。蛋白质磷酸化采用Westernblotting方法。

定量RT-PCR

用TRIZOL(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取总RNA，在42°C下反向转录60 min，加入M-MLV逆转录酶(Enzynology，Daejeon，Korea)、RNase抑制剂、dNTP和随机引物。在qPCR主成分(Enzynome)中进行实时PCR，cfx连接实时Cycler(Bio-RAD，Hercules，CA)监测染料-DNA复合物的荧光发射.目标基因的mRNA值按GAPDH的表达进行归一化。所有反应均为三重反应。在补充表中总结了实时定量PCR中使用的引物。3.

染色质免疫沉淀

细胞以1%甲醛固定，37°C固定10 min，用含蛋白酶抑制剂的PBS冷洗。细胞经0.5%NP-40裂解后，用1%SDS提取细胞核，经超声处理，将基因组DNA切成300-500 bp片段。在4°C下，用抗旗标、抗鼻塞、抗钉螺或抗YWHAH抗体沉淀可溶性染色质复合物，在4℃下用蛋白A/G珠(Santa Cruz生物技术)沉淀免疫复合物2 h，用低盐、高盐、LiCl和TE溶液依次洗涤。结合染色质复合物在芯片直接洗脱缓冲液中洗脱15 min，在65°C下孵育一夜，进行反向交联。用苯酚-氯仿提取DNA，乙醇沉淀.将沉淀后的DNA在蒸馏水中溶解，用qPCR(95°C/55°C/72°C，每相20s)进行分析。PCR引物的核苷酸序列(5‘~3’)为GCGCTGCTGATTGCTGTG和GGCTGGAGTCTGAACTGAC。Cdh 1启动子。芯片-qPCR结果表示为输入信号的百分比(%输入).所有反应均为三重反应。

细胞质和核成分的分馏

细胞离心量为1000×g在含10 mm Tris/HCl(pH7.4)、10 mm KCl、1mm EDTA、1.5mm MgCl的裂解缓冲液中均匀化5 min。2，0.2%NP-40，0.5mm DTT，1mm正丁酸钠，400μMPMSF。用1000×离心法将细胞裂解液分离成小球(核组分)和上清液(胞浆组分)。g持续5分钟。核萃取缓冲液(20 mm Tris/HCl，pH 7.4,420 mm NaCl，1毫米EDTA，1.5毫米MgCl)2在球团中加入20%甘油、0.5mm DTT、1mm正丁酸钠和400μMpMSF，在冰上间歇旋转30 min。核组分和胞质组分的纺丝速度为20,000×g保存10 min，存放在−70°C。

免疫印迹和免疫沉淀

在SDS/PAGE上分离蛋白质，并将其转移到固定化-P膜(Milli孔隙，Bedford，MA)上.用5%脱脂乳阻断膜，用一次抗体在4℃孵育隔夜，用辣根过氧化物酶(HRP)结合抗体孵育1h，用ECL+试剂盒(AmericshimBiosciations，Piscataway，NJ)观察。未修剪的斑点出现在补充图中。14。为分析蛋白质的相互作用，将细胞裂解液与抗KHK、抗YWHAH或IgG在4℃下隔夜孵育，用蛋白A/G珠将免疫复合物拉下。另外，细胞裂解液与EZview红抗Myc或抗标志亲和凝胶或镍-NTA亲和珠在4℃下孵育4h，将结合蛋白在变性SDS样品缓冲液中洗脱并载入SDS-PAGE。所有的西方印迹实验都进行了三次或更多次。

免疫荧光分析

将KHK-A和KHK-C cDNA融合到GFP的C端，在488 nm处用卡尔蔡司LSM 510共聚焦显微镜观察。用3.7%甲醛固定10 min，0.1%TritonX-100固定30 min，检测LRC 59和YWHAH的亚细胞定位。细胞在含0.05%吐温-20和3%BSA的PBS中孵育1h，在4°C下用一次抗体进一步孵育。将细胞与Alexa Fluor 594结合二次抗体孵育1h，用Alexa Fluor 633 phalloidin(Invitrogen)孵育30 min，DAPI(Sigma-Aldrich)染色30 min，装于法拉多水贴壁培养基(DAKO，Glostrup，丹麦)中，共聚焦显微镜观察。

免疫组织化学

将小鼠原发肿瘤和肺组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成4μm切片.在60°C干燥烤箱中孵育1 h，脱石蜡，再水化，在121℃柠檬酸缓冲液(DAKO)中孵育10 min，提取抗原。阻止非特定信号。玻片用3%H孵育。2O2在BSA溶液中用2%马血清孵育15 min，用抗KHK(1：100，Santa Cruz)、抗LRC 59(1：100，Novus生物制剂)或抗E钙粘素(1：200，Thermo Fisher Science)在4℃孵育一夜。切片用二次抗体生物素化1h，免疫复合物用威他他汀ABC试剂盒(载体实验室)和民建联检测试剂盒(DAKO)显示。最后用苏木精染色15 min，在每张幻灯片的4个高功率场下拍照。

蛋白质互作体的质量分析

用空载体His-KHK-A或His-KHK-C转染Mcf-7和MDA-MB-231细胞，用5 mm果糖孵育8h，细胞裂解液与镍-NTA微球在4℃下孵育4h，用250 mm咪唑洗脱结合蛋白。用BCA试剂盒(ThermoFisher Science，Rockford，IL.)测定滑槽的蛋白质浓度。用30K阿米孔超离心过滤机(英国米利孔)进行助滤样品制备后，在纳米级易-nLC 1000系统(丹麦欧登塞，Proxeon生物系统)上分离多肽，该系统配有填料柱(100μm颗粒，75μm×50 cm)。流速为300 nL/min，流速为300 nL/min，流速为300 nL/min，流速为90 min，梯度范围为5%~30%乙腈与0.1%甲酸。用四极轨道差质谱(Q-Exactive，ThermoFisher Science，San Jose，CA)对电离肽进行了分析.在dda模式下测量了ms1光谱，分辨率为70,000。M/z扫描范围为300-1800。对于MS2光谱，多肽被高能碰撞离解(HCD)碎裂，归一化碰撞能为30，分辨率为17,500。使用Maxquant(ver.1.5.5.1)对用于无标签量化的原始MS数据文件进行处理，以与uniprotKB Fasta数据库匹配(74 540个条目，2014年6月版本)。MS/MS峰的搜索参数如下：肽长至少为6个氨基酸，固定的甲胺基修饰，可变的蛋氨酸氧化和可变的N端乙酰化。主搜索和首次搜索的容忍度分别为6 ppm和20 ppm。在所有蛋白质和肽的搜索中，错误发现率为1%。

质量分析以识别翻译后的修改

LC-MS/MS分析细胞内YWHAH蛋白，转染过表达或敲除KHK-A的MDA-MB-231细胞，再用5mm果糖处理24h，标记亲和珠纯化，SDS-PAGE。对YWHAH在体外磷酸化的LC-MS/MS分析，用SDS-PAGE法分离了GST-KHK-A与GST-KHK-A反应的重组GST-YWHAH。用胰蛋白酶消化凝胶切片中的蛋白质，并将其负载到简单的n-LC(Thermo Fisher，San Jose，CA).样品在C18纳米孔柱(150 mm×0.1mm，3μm孔径；Agilent)上分离。流动相A为0.1%甲酸，3%乙腈为去离子水，B为乙腈中0.1%甲酸。色谱梯度在40 min内从5%B增加到55%B，5 2%B到75%B在4 min，95%B在4 min，3%B在6 min。流速保持在1500 nL/min。利用配备纳米电喷雾源的LTQ轨道RAP XL质谱仪(ThermoFisher)对质谱进行了分析。质谱采用全质量扫描数据相关采集(350-1200)。M/z其次是10次MS/MS扫描。对于MS1全扫描，轨道分辨力为30,000，AGC为2×10。5。对于LTQ中的MS/MS，AGC为1×10。4。用78道尔顿在消化肽上的附加质量来鉴定磷酸化。利用蛋白质组发现者(V1.2.0.208用SEQUEST算法)鉴定修饰氨基酸。MS/MS光谱和检测到的碎片离子表现在补充图中。15和16.

果糖和1-磷酸果糖的质量分析

将mcf-7和mda-mbb-231细胞与不含5mm果糖的mdma-7细胞孵育4h，在低渗溶液中以0.6%np-40在冰上缓慢匀浆，1000×离心。g而球团则被保存为核子分数。上清液离心10,000×g并以细胞质分数的形式收集。用冰冷萃取溶剂(乙腈：甲醇：水=4：4：2，v/v/v)对细胞质和核组分进行1 min的离心，在液氮中快速冷冻1 min，然后以10,000×分离心。g15分钟。样品经SpeedVac真空离心蒸发。用50μL盐酸甲氧基胺(20 mg/mL)在30℃下衍生90 min，再用70μl N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺在60°C下衍生30 min。将衍生样品应用于LECLEC-PEGASUS(TOF)MS(LECO公司，英国爱丁堡)，并配以Agilent 6890 GC(Agilent Technologies)，配置一个30米长的0.25mm RTX-5 Sil MS柱。色谱条件为恒流1mL/min，温度由50℃提高到330°C，流速为20°C/min。电子电离和离子源温度分别为−70 eV和250°C。为了测定果糖-1-磷酸，细胞被收集在500μL的冰冷乙醇中，用400μL的氯仿作有力的涡旋，与150μL的水混合，然后在10,000×10,000的条件下离心。g15分钟。对含有极性代谢物的上相进行了衍生化，并应用于GC-MS分析。果糖-1-磷酸被量化使用标准化学品(MF 03840)提供的碳合成有限公司(伯克希尔，英国)。

KHK-A-YWHAH反应动力学参数

10 ng重组gst-khk-A和不同量的gst-yWHAH与不同浓度的果糖共同孵育于含1mm原代戊酸钠、2mM atp和10μci(γ-)的激酶缓冲液的51μL中。32P]-ATP反应在37℃下孵育10 min，加入10%冰冷三氯乙酸结束反应。沉淀后的蛋白质在15,000×g，用冰凉的丙酮洗三次。用闪烁计数器测量了球团中的放射性。这个Km在1/C.P.M.的地块中计算出YWHAH的KHK-A值。对1/[YWHAH]根据莱恩韦弗-伯克方程。这个Ki用GraphPad Prism 5.0软件对KHK-A介导的YWHAH磷酸化过程中果糖的竞争抑制模型进行拟合。数据代表了三个独立实验的手段。测量集成电路50果糖对KHK-A-YWHAH反应、10 ng GST-KHK-A和1μg GST-YWHAH与不同浓度果糖在37℃反应缓冲液51μL中孵育10 min。集成电路50用GraphPad Prism 5.0软件从KHK-A酶活性与对数[果糖]的关系图中计算。数据代表了三个独立实验的手段。

确定KdKHK-A和KHK-C制果糖

重组His-KHK-A或His-KHK-C(10 Ng)及不同浓度的D-[14C(U)]-果糖(ARC 0116 A，美国放射性标记化学品，圣路易斯，MO)混合在30μL 25 mm HEPES或50 mm磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，含85 mm KCl、17 mm NaCl、1 mm MgCl。2，以及0.2毫米CaCl2。混合物在37℃下孵育10 min，加入10%冰冷三氯乙酸结束反应。沉淀后的蛋白质在15,000×g，用冰凉的丙酮洗三次。用闪烁计数器测量了颗粒中蛋白质结合果糖的放射性。Kd用GraphPad棱镜5.0软件对果糖进行了拟合。

人乳腺癌组织芯片

人类乳腺癌组织微阵列，包含40个不同的乳腺癌标本，被购买在超级生物芯片实验室(首尔，韩国)。该公司还提供了临床记录，包括性别、年龄、TNM分期、组织学分级、存活和死亡原因。根据布卢姆-理查德系统的诺丁汉改良法确定组织学分级.临床资料见补充表。4。为了对免疫染色标本中的蛋白表达进行评分，两名检查人员在每一张幻灯片上观察了四个高功率场。用组织核心分析蛋白表达，反映细胞核染色强度(分级为0，非染色；1，弱；2，中度；3，强)和阳性细胞百分比。可能的分数范围从0到300。临床资料见补充表。4.

ROS测量

Mdf-7和mda-mbb-231细胞分别转染了myc-khk-A、myc-khk-c质粒或siRNA，分别与含或不含4 0 0nM嘧啶的mdf-7和mda-mb-231细胞共孵育20μM的H。2O2作为ROS生产的阳性对照。与果糖孵育后，细胞内加入DCF-DA(20μM).细胞在黑暗中孵育20分钟后，在PBS中清洗两次，并应用于TECAN无限大M 200 PRO(奥地利格罗迪格)。DCF荧光在488 nm处激发，524 nm处检测到。

分子动力学模拟

用全原子原子分子动力学(MD)模型模拟了YWHAH-11/ATP/KHK-A三元配合物体系。以PDB ID：2hw1和2c63为原料，通过修饰KHK-A/果糖/腺苷基-50-酰亚胺二磷酸和YWHAH，制备了作为受体配体对的KHK-A/ATP和YWHAH-11。29,35。使用十六进制软件包进行了分子对接(版本8.0.0)36通过球极傅里叶算法随机更新配体和受体分子的坐标，生成配体(YWHAH-11)-受体(KHK-A/ATP)构象系综。37。在对接过程中，配体和受体分子保持刚性。在产生的配体受体结构中，初始结构选择了能量分数最高的最有利结构。在周期边界条件下，用100 mm NaCl的TIP3P水分子溶解所选择的结构。在310 K和1 bar条件下，利用gromacs软件包进行npt集成md模拟，使溶剂体系平衡10 ns。38(5.1.2版)与CHARMM 36力场39。改进的Berendsen恒温器40和Parrinello-Rahman Barostat41用于维持温度和压力。在平衡后，从以前的平衡模拟得到的轨迹结束开始，通过将yWHAH-11的s25-OH的氧向atp-γpo的磷方向拉伸，进行了转向md模拟。3使用1000 kJ mol的弹簧常数超过1ns−1NM−2拉速为0.001 nm−1得到S25-OH向ATP-γPO的运动轨迹3通过位置约束算法将ATP固定为固定基准。使用这个轨迹从拉力模拟，配置有不同的d以间隔0.1nm作为伞式取样的起始结构，随后进行了10 ns的NPT-系综MD。最后采用加权直方图分析方法(WHAM)得到PMF剖面。42。我们为每个剖面进行了五组完全独立的伞式模拟，以检查其可重复性。在此基础上，利用200 Bootsps的贝叶斯自举分析方法，利用重采样技术对剖面的不确定性进行了估计。对YWHAH-11/ATP/KHK-C、PRPS1-11/ATP/KHK-A和YWHAH-11D21A/ATP/KHK-A进行了上述模拟计算。

基于TCGA数据集的KHK异构体分析

利用肿瘤基因组图谱(TCGA)的数据分析KHK-A和KHK-C在人类肿瘤中的表达.从宽频研究所FireBrowse门户下载的原始数据(RNAseqV2级，RSEM标准化的转录异构体数据)43。对象的UCSC异构体标识符。KHK在UCSC基因组浏览器中，基因的第3外显子位置(KHK-A为uc002ril.3；KHK-C为uc002rim.3)。