脑脊液中循环的肿瘤DNA使髓母细胞瘤的特征和监测成为可能

髓母细胞瘤的分子特征是最常见的儿科脑瘤，是正确处理和治疗这种异质性疾病的关键。然而，组织标本不足、肿瘤异质性的存在或播散性疾病可能对其诊断和监测构成挑战。本文报告了脑脊液循环肿瘤DNA(CtDNA)对肿瘤基因组变化的影响，促进了肿瘤的亚分组和危险分层，为肿瘤的诊断和预后提供了有价值的信息。CSFctDNA也具有肿瘤内基因组异质性的特点，可以识别小的亚克隆.CtDNA在脑脊液中丰富，但在血浆中几乎不存在，纵向分析ctDNA可用于研究微小残留疾病、基因组进化和肿瘤复发时的特征。最终，脑脊液ctDNA分析有助于髓母细胞瘤患者的临床管理，有助于制定针对性的治疗策略，在减少过度治疗的同时提高治疗效果，防止长期继发效应。

髓母细胞瘤是儿童时期最常见的恶性肿瘤。中枢神经系统胚胎性肿瘤(CNS)是一种复杂的、发展中的异质性疾病，预后范围广，在某些情况下是一种极具侵袭性的恶性肿瘤。MB可分为四个分子共识亚组：wnt、shh、第3组和第4组。1,2,3,4,5并制定了一项共识风险分类方案，将4组患者分为91%(有利)、81%(标准)、42%(高风险)和28%(极高风险)的5年无进展生存率。4,6.

MB的治疗包括肿瘤切除、化疗以及大多数患者的颅脊髓放射治疗。脑肿瘤手术切除是目前首选的治疗方法，手术标本被用于诊断和肿瘤特征。然而，缺乏足够的样本、组织伪影或非肿瘤组织的过度存在会造成不确定因素，从而准确地描述和分类肿瘤。

除了患者间的肿瘤异质性，瘤内异质性已被描述为MB，单次活检代表这种复杂性的有效性可能是有限的。据报道，在体细胞突变和拷贝数改变(Cnas)水平上存在空间异质性，这一事实说明了单次活检的局限性。7.

此外，MB肿瘤随着时间的推移而进化，强调需要纵向样本来描述疾病进展过程中不同时间点的肿瘤特征。尽管目前正在努力，但约有30%的病人复发，局部或通过转移到鳞翅目，这是儿童死亡的主要原因。8,9。对原发肿瘤和复发肿瘤的比较表明，在复发环境中可以出现特定的分子改变。10,11。此外，继发性放射治疗引起的肿瘤也可能在某些患者中出现。12,13,14。为了评估转移性播散，我们进行了脑脊液细胞学检查、脑MRI和脊髓MRI检查，并根据常M分期系统对患者进行分类。15。不幸的是，细胞学显示有限的敏感性，有时不能提供准确的信息。

总之，这表明需要改进甲基溴的分子特征和监测。需要一种相对无创的方法来描述原发和复发的肿瘤并监测疾病的进展，以帮助MB患者的临床管理。在这方面，液体活检，特别是无细胞循环肿瘤dna(Ctdna)为研究开辟了一条途径。16。肿瘤细胞释放出在体液中循环的dna片段，ctdna的分析可以提供有关肿瘤分子特征和临床演变的信息。17。我们的小组和其他人以前报道过成人脑恶性肿瘤中ctdna的检测。18,19,20,21,22,23。脑脊液中ctDNA的分析较血浆中ctDNA更能反映脑肿瘤基因组的变化，可作为一种分子诊断工具，并可用于病人监测过程中的动态变化。18,21,22,23,24,25.

脑积水在患有后颅窝肿瘤的患儿中非常常见，如MB。在这些病例中，在肿瘤手术治疗之前，需要脑脊液引流来减轻颅内压(ICP)。26,27。此外，还定期收集脑脊液样本进行细胞学分析。然而，尽管获得了csf，但ctdna的研究尚未在儿科环境中进行，只有少数研究侧重于儿童弥漫性中线胶质瘤，通过液滴-数字聚合酶链反应(DdPCR)或靶向Sanger测序分析ctdna中h3突变。28,29。在目前的研究中，我们在脑脊液中检测ctDNA，但在MB患者的血浆中几乎检测不到ctDNA。脑脊液ctDNA分析反映了肿瘤的基因组变化，使MB患者的亚组分类和风险分层成为可能。此外，对后续脑脊液样本的研究确定了微小残留疾病，并揭示了复发时基因组的演变情况。总之，脑脊液ctDNA分析是一种相对无创和可靠的工具，可以帮助诊断，预后和监测儿童MB。

MB患者的分类及危险分层

为了评价脑脊液ctDNA分析是否可以作为诊断和监测MB患者的工具，从13例患者中采集了肿瘤、血液和脑脊液样本(图1)。1A).

所有患者入院时均经MRI检查发现脑积水，并需要脑脊液引流、暂时性外室引流(EVD)，以减少颅内压(ICP)。为了避免脑脊液分流术的发生，13例患者中有12例在EVD植入前进行了内镜下第三脑室穿刺造口术。在此过程中，获得脑脊液样本并用于护理标准、临床测量(细胞学)和研究目的。在接下来的几天里，患者接受了后颅窝肿瘤的手术切除，并获得了更多的脑脊液样本。在进行化疗之前，3名患者需要植入Ommaya贮液器(附在头皮下的贮液器上的心室内导管)，以便定期采集脑脊液样本。对其余10名患者，通过腰椎穿刺获得随访样本.

对匹配的肿瘤/正常DNA进行全外显子测序(WES)，鉴定常见的MB生殖细胞和体细胞驱动突变、焦点拷贝数变异(CNVS)、臂水平和全染色体增益/丢失(图1)。1B和补充表1)。计算了编码区体细胞突变的频率，每Mb的突变中位数为0.36[范围：0.08-1.21]，类似于以前的研究2,30.

患者分为先前定义的MB亚组和亚型。4,5，并根据分子亚组和风险修饰剂的存在(放大)，进行了预测的风险分层(5年期pfs)。MYC和MYCN、诊断转移、13号染色体丢失、大细胞间变性(LCA)组织学4(无花果)1C).

13 MB儿科患者在入院时的临床病理特征、分子特征、MB亚型分类和危险分层(首次诊断时12例，复发诊断1例(MB8))如图所示。1D.

CtDNA在脑脊液中比在血浆中更丰富。

我们试图评估ctDNA是否能在13 MB患者的脑脊液中检测到，并与血浆ctDNA和脑脊液细胞学标准进行比较。为了便于ctDNA的检测，根据变异等位基因频率(VAF)和影响从匹配的肿瘤/正常样本的WES中筛选出体细胞突变。检测肿瘤/正常DNA的突变情况，分析术前脑脊液和血浆游离DNA(CfDNA)的变化。

所有病例的细胞学分析均未检测到脑脊液中的细胞。手术前脑脊液标本ctDNA检出率为76.9%(10/13)。相反，ctDNA不能在血浆中检测到，只有1例患者的VAF非常低(2.2%)(图一)。2A)。总之，这些结果表明脑脊液是比血浆更好的ctDNA来源在MB患者，并强调了ctDNA分析比细胞学更高的敏感性。

观察13例患者脑脊液ctDNA水平的变化。与其他患者相比，三名患者的VAF水平很高(超过25%)，并被确定为异常值(图1)。2B)。为了探讨这些差异，我们将ctDNA(vaf%)和cfdna(ng/ml)与肿瘤体积(Cm)进行比较。3)但未观察到相关性(附图)。1)。有趣的是，3例脑脊液ctDNA含量丰富的患者在27.5个月和5.3个月时均有很高的复发风险和病情进展(MB6和MB8)。1D)。这些结果表明，较高的CSF ctDNA水平可能是更侵袭性肿瘤的一个指标。

脑脊液ctDNA的WES反映肿瘤基因组的改变

在完成这项研究时，10/13名患者没有观察到疾病进展，在病人监测期间未检测到ctDNA(补充表)。2)。相反，对其余三位患者(MB5，MB6和MB8)的癌症进展情况进行了观察，这三位患者被认为有很高的复发风险(如图5所示)。1C)。对肿瘤/正常DNA和脑脊液cfDNA在诊断和随访或复发过程中与另一例预测的高危患者(MB 13)进行了彻底的分析。

为了确定脑脊液中ctDNA的WES是否能可靠地识别和反映肿瘤的基因组改变，我们进行了肿瘤的WES和cfDNA的检测。我们发现，在VAF>5%的原发肿瘤标本中，也能在匹配的CSFctDNA中检测到98.9%(88/89)的突变。重要的是，肿瘤VAFs与从ctDNA中获得的VAFs有显著的相关性(R)。2=0.57，0.96，0.53和0.87)3A-d)。提示脑脊液ctDNA可再现原发肿瘤的瘤内异质性。因此，脑脊液ctDNA的分析可以提供有关MB肿瘤亚克隆基因组结构的信息。

阿-dCSFctDNA VAF与肿瘤VAF的相关性(VAF>5%)。线性回归与拟合优度R2在每个数字中显示。N，代表VAF>5%的原发肿瘤样本中检测到的突变数。e基于肿瘤和脑脊液ctDNA WES分析的临床病理特征和分子改变。MB-分组分类和风险分层(基于Schwalbe等人，2017年5年期PFS)。基于17.7Mb(MB5，MB6，MB13)，50.4Mb(MB8-肿瘤)和51.6Mb(MB8-CSF)WES面板，每Mb(Mut/Mb)编码区的体细胞突变频率。CNV：删除(日志)2值<−1，蓝色)，放大(日志)2值>1，红色)。在细胞遗传学分析中，臂水平或染色体损失率的阈值由13 MB队列中事件的平均和百分位数决定，如图所示。1黑色大于75%(>65.5%)，灰色大于平均值(>44.5%)。符号和缩略词的定义与图中所示相符。1如下所示。病理：大细胞间变性(LCA)、经典(C)、脱皮/结节(D/N)。转移状态：阳性(+)，阴性(−)。残留(R)疾病状况：>1.5厘米2(+)，<1.5厘米2(−)。

全尺寸图像

对CNVS、臂水平或整个染色体的增益/丢失的分析显示了类似的情况.脑脊液标本中CNV的总体情况与匹配肿瘤中的CNV相似(MB6，MB8和MB 13)。尽管MB5-CSF中cfDNA的数量有限，但在肿瘤中检测到的关键mBCNV也可以在脑脊液中检测到(如图所示)。3E).

Ctdna促进mb亚型和危险分层

为了确定ctDNA序列所确定的分子改变是否能提供诊断和预后信息，将患者分为MB亚组和风险分层组(图1)。3E)。MB常见的分子改变，包括Ptch 1和TP 53突变；MYCN和GLI 2扩增；SUFU检测到缺失和17P丢失，有利于亚组分类。4例患者均为MB SHH亚型，其中残留疾病、转移性播散、LCA组织学或MYCN放大是极高风险的风险修正指标。4。重要的是，这些结果表明，脑脊液ctDNA分析可以作为一种诊断工具，以分类和危险分层的病人。

脑脊液ctDNA监测发现微小残留疾病

接下来，我们将探讨CSFctDNA的WES是否能帮助监测MB患者的基因组肿瘤演变，并提供有关治疗或疾病进展的反应的信息。随访采集脑脊液和血浆标本，以确定脑脊液ctDNA水平在病程中是否随时间而波动。

患者MB6行手术切除，诊断为经典MB。术后影像学诊断为残留性疾病。在一线治疗完成后，观察复发情况，随后对患者进行二线化疗和放射治疗。尽管肿瘤大小初步缩小，连续7个月的MRI显示软脑膜结节是稳定的(没有观察到大小的变化)(图)。4A)。在对ctDNA进行跟踪分析时，也发现了肿瘤和第一脑脊液中存在的突变。在随访的CSF中发现的VAFs显示，由于手术切除引起的肿瘤负担减少，VAFs明显减少(如图所示)。4A-C和补充图。2)。我们无法在后续的CSF ctDNA中检测到额外的突变；然而，我们发现了3/5的突变，VAF<1.5%，这是以前在肿瘤和CSF 1中检测到的(图一)。4B)。其中，止损收益SRCAP (SRCAP：p.R 2444*)，用ddPCR进行验证(图1)。4C和补充图。2)。此外，在肿瘤和CSF 1中都发现了染色体17p臂的缺失。3E)。在治疗结束时获得的脑脊液样本中仍观察到少量的ctDNA，这一事实表明，通过对CSFctDNA的分析，可以检测到残留在患者体内的小结节。4B，c).

病人MB 13也有类似的情况。该病人接受肿瘤切除，并被诊断为LCA MB。术后MRI检查残留病变<1.5cm2然而，有趣的是，ctDNA仍被检测到VAF 7.6%BMP 5*P.R 321*术后13天(如图所示)。4D，g)。治疗已经开始，在术后两个半月的随访影像中没有发现残留疾病的证据。第一批脑脊液的突变景观和CNV谱与肿瘤高度相似。对随访的脑脊液样本进行分析，发现3/15突变，VAF<1%(图1)。4E，f)。其中，BMP 5*P.R 321*和MIB 1：p.M468I用ddPCR进行验证(图1)。4G和补充图。2)。这些结果表明，虽然MRI没有发现恶性肿瘤，但在检测到ctDNA后，仍存在一种残留的疾病。MB6和MB 13两例均证明CSF ctDNA可促进MB患者微小残留疾病的诊断。

脑脊液ctDNA分析显示基因组进化

与先前概述的病例相比，MB5和MB8患者在复发后因疾病而死亡。

患者MB8接受了手术，并被诊断为硬结/结节(D/N)MB。术后影像诊断残余病<1.5cm2并开始治疗。诊断后3年，MRI检查发现患者复发并向脑脊液播散。第二次手术后组织学表现由D/N MB变为LCA MB。化疗和放射治疗已经开始，但在5个月内，病人死亡(图)。5A).

肿瘤和脑脊液样本在复发时的测序分析揭示了常见的改变，包括四个预测的驱动因素：Ptch 1*P.L1024Pfs，TP 53*第N239Tfs页，CDKN2B*P.G124D和KMT2A*第W1199S页(图1)。5B)。突变Ptch 1和CDKN2B在肿瘤/正常DNA、脑脊液和血浆cfDNA中使用ddPCR进行验证(附图)。2)。重要的是，Ptch 1致癌突变被描述为smo抑制剂vismodegig和sonidegib的可操作基因突变(在反复或难治性MB的临床试验中显示了令人鼓舞的结果)。31,32,33,34。突出CNV的景观也很重要。5C)(如果.的存在MYCN放大提供有关MB对SMO抑制剂的抗性的信息35。除了ctdna中检测到的肿瘤特异性突变外，还发现csf私有突变，例如驱动突变。KMT2A：：P.W1199S，经ddPCR验证。这些CSF特异性突变要么显示肿瘤内异质性，在肿瘤活检中被漏掉，分析或表明病灶间的异质性来自MRI发现的弥漫性软脑膜结节(图一)。5A-C和补充图。2).

同样，病人MB5接受手术切除，并被诊断为LCA MB。术后影像诊断残余病<1.5cm2。治疗已经开始，在随访期间，在颈髓处发现了一种髓周软脑膜植入物。诊断后30个月，病人复发。肿瘤切除和化疗后，观察到肿瘤的急性进展，患者在复发9个月后死亡(如图所示)。5D).

尽管cfdna的数量有限，但cfdna中也检测到cfdna中的突变和大多数相关的基因组改变，包括MYCN和GLI 2放大，和部分损失17P(图1。5E，f还有无花果。3E)。令人惊讶的是，在复发时对CSF ctDNA的分析显示了一个基因组转化，与原发肿瘤和第一个复发肿瘤没有相同的分子图谱(图一)。5E和补充图。2)。CtDNA水平下降，复发时未检测到HCN1*p.Q 828*突变在原发肿瘤中检测到。相反，复发后病情进展过程中脑脊液变化的ctDNA水平在81天内稳定或增加，直到病人死亡(地址1*P 718 L VAF：41.6%-52%和ACTA 2*P.Y190S VAF：13.2-15%)(补充图。2)。这些结果表明存在两个独立的肿瘤，一个在诊断时，另一个在复发时。对韦斯检测到的种系变异进行分析后发现，病人携带的是TP 53P.R282W突变，表明他患有Li-Fraumeni综合征。重要的是，我们的数据强调，脑脊液ctDNA分析可用于监测基因组肿瘤的演变。在这种特殊情况下，CSFctDNA能够识别出两种完全不同的肿瘤在诊断和复发时的极端情况。

MB的诊断、预后信息以及治疗靶点的确定取决于肿瘤的分子特征。迄今为止，为了鉴定MB，需要肿瘤标本。这提供了局限性，因为脑瘤外科手术有时可能不可行，即使它们是可行的，肿瘤碎片也可能提供有限的关于肿瘤分子特征的信息，包括肿瘤内异质性的信息。此外，纵向活检很少挑战肿瘤基因组进化的研究以及复发背景下继发性肿瘤的特征。在本研究中，我们发现CSFctDNA的分析允许MB的分子特征，并为这些儿科病人的临床治疗提供了便利。

CSFctDNA中所发现的基因组改变对肿瘤中存在的基因组进行了重新描述，因此对ctDNA的分析是识别MB基因组特征的一种较小的侵袭性选择。关键分子改变包括但不限于TP 53和Ptch 1突变；MYCN和GLI 2放大；SUFU脑脊液ctDNA中检测到缺失和17p缺失，为MB分子诊断和危险分层提供了充分的信息。因此，CSFctDNA可以将肿瘤分类到正确的亚型和风险亚型，并提供有关预后的重要信息。

因为大多数MB患者都有脑积水26,27手术前需要脑脊液引流。然后脑脊液以无创的方式可用，甚至在手术前就可以对ctDNA进行分析，以提供有关肿瘤的信息。从我们的队列来看，所有13名患者都需要在手术前几天接受脑脊液引流。因此，脑脊液中ctDNA的特征可以为外科医生和肿瘤学家提供重要的信息，以评估风险/利益平衡，并指导外科手术、化疗和放射治疗策略。在手术前了解病人的诊断和预后可以帮助鉴别那些预后良好的病人，这些病人将从保守的肿瘤切除和温和的化疗和放疗剂量中受益。此外，它还可以确定残留疾病是风险修正剂和缩短PFS的指标的一组患者，强调肿瘤全切除的重要性。4.

如其他中枢神经系统恶性肿瘤所示18,19,21,24我们观察到脑脊液是ctDNA比血浆更好的来源。有趣的是，我们观察到在手术切除前很高的复发风险患者脑脊液ctDNA的水平，并观察到其中两人的疾病进展。未来有更多队列的研究将需要调查脑脊液ctDNA的丰度是否可以作为一个有价值的预后指标。

重要的是，CSFctDNA再现了肿瘤的亚克隆基因组。肿瘤中同一基因突变的VAFs与CSF之间存在显著的相关性。这表明，对CSFctDNA的研究可以描述MB的瘤内异质性，有助于识别小的侵袭性克隆，从而促进复发或对治疗的抗药性。

在通过脑脊液ctDNA监测患者时，我们能够识别微小残留的疾病并评估肿瘤的演变。小脑参与感觉神经运动和认知功能，mb幸存者可能会遭受治疗引起的长期后遗症以及继发性肿瘤的出现。36,37,38。这些患者将受益于连续CSFctDNA样本的研究，以评估肿瘤的进展和对治疗的反应，以便调整治疗强度和持续时间，以适应特定时间点肿瘤的特定状态。此外，CSF ctDNA可以补充影像学技术，早期发现复发，指导治疗策略。复发是MB死亡的主要原因。活检很少在复发时进行，缺乏肿瘤特征的数据可能会对有效的二线治疗策略的选择提出挑战。此外，比较原发肿瘤和复发肿瘤的研究表明，复发肿瘤可能会出现其他突变，继发性肿瘤可能与原发肿瘤完全不同。11,12,13,14。在本研究中，我们已经证明CSFctDNA的WES可以描述复发时的疾病，包括检测CSF-私有突变，揭示肿瘤内/病变间的异质性。在一位患有Li-Fraumeni综合征的患者中，CSFctDNA能够在复发时识别出一个完全独立的肿瘤的出现。在缺乏脑脊液ctDNA分析的情况下，由于这个病人不适合复发肿瘤的活检，肿瘤性质的变化将是未知的，因此病人可能没有得到准确的处理。复发时对CSF ctDNA的分析将有助于确定肿瘤进展过程中治疗靶点存在的变化，从而使治疗策略能够适应肿瘤在每个时间点的分子特征。

在这一概念的证明研究中，我们证明ctDNA的分析允许MB的特征，并提供一个早期和准确的分子诊断，包括亚型和风险分层。它还允许病人进行监测，提供关于最小残留疾病、肿瘤演变和复发时疾病特征的信息。为了将我们的研究结果转化为患有MB的儿科病人的临床实践，有必要进行更多的队列研究。这最终可以导致量身定做的治疗策略，减少不必要的治疗，从而导致长期的次要效应，并选择最佳的、调整的、个性化的治疗方法。脑脊液样本通常作为护理标准的一部分获得，随着临床实践中基于CSF的测试的实施，可以从每个患者那里获得有价值的信息，从而使精确药物更接近MB患者(图一)。6).

患者队列、临床数据和样本

共有13名儿科患者被诊断为髓母细胞瘤。所有患者都是在沃尔·德·希布伦大学医院(西班牙巴塞罗那)诊断和治疗的。一份书面同意，表明在临床实践中作为护理标准的样本可以用于研究，是根据赫尔辛基宣言从父母/法律代理人那里获得的。这项研究得到了Vall d‘Hebron大学医院IRB的批准。

样本采集与DNA提取

用QIAamp DNA微型试剂盒和QIAamp DNA FFPE组织试剂盒分别从新鲜冷冻切片和石蜡包埋切片中提取肿瘤DNA。用QIAAmDNA微型血液试剂盒从外周血细胞中提取生殖细胞DNA。外周血采自含K2EDTA的导管(真空保持器)，取血浆1600×。g离心10 min。血浆和脑脊液均在3000×离心条件下离心。g培养5 min，取上清液。用QIAamp循环核酸试剂盒(QIAamp循环核酸试剂盒)从血浆和脑脊液中提取cfDNA。用Qubit荧光计测定基因组和cfDNA。

基因组变异的DNA测序与分析

12例患者采用2.5μg配对肿瘤和生殖细胞基因组进行全外显子DNA测序。用SureSelectHumanAll Exon V5(Agilent Technologies)进行文库的制备和富集，用Illumina配对读测序平台HiSeq 2500进行测序(读长2×100，覆盖范围>75×对照，>100×肿瘤；50.4 Mb)。对于一个病人(MB 13)，WES是使用SureSelectXTHS人类聚焦Exome 17.7Mb进行的，解释如下。

鉴于13例患者cfDNA数量有限，4例患者的脑脊液cfDNA进行了DNA测序(6-200 ng)。对1例患者(MB8)，采用SureSelectHumanAll Exon V5(Agilent Technologies)对复发时获得的脑脊液cfDNA(51.6 mb)进行检测。其余3例，在肿瘤活检手术前及进展或随访期间采集脑脊液纵向标本。采用SureSelectXT HS人聚焦Exome 17.7Mb(自定义构建面板，Agilent技术)分析配对肿瘤和生殖细胞株(200 Ng)和后续脑脊液样本(6-200 ng)，利用Illumina平台NextSeq进行文库富集和测序，读取长度为150 bp。

为了处理测序数据，用BWA-MEM对FASTQ文件与人类参考基因组(hg 19/GRCh37hs37d5)进行比对，去除PCR重复序列。对齐信息在补充数据中显示1。体细胞突变调用是使用Sidrón进行的。39并使用变异效应预测器(VEP)进行注释。40。用BCFTOOLS提取生殖细胞突变，用普通SNP筛选dbSNP。使用程序exome2cnv检测拷贝数变体(Cvs)。41。对正常样本进行相互比较，以找出只有该区域自身的可变性才能改变的任何区域。对每条染色体的丢失/增益百分比进行了总结。

过滤是根据以下标准执行的。对于SNVS，我们将重点放在影响蛋白编码序列的突变上，需要一个覆盖深度的≥20来比较肿瘤和ctDNAVAF；如果在同一病例的任何样本中VAF>5%，则认为它是一个突变，并对其在其他样本中的存在进行了研究。为了确定一个样本是否包含在同一病例的另一个样本中检测到的突变，建立了一个大于或等于1%的VAF作为阈值。对于种系突变，我们分析了编码区域的定位质量≥50。为了只选择杂合子变异体，我们将重点放在0.35≤vAF≥0.75，并删除GNOAD数据库对照队列中大于或等于0.001的变异，以确保在最终的突变集中不存在多态性。对于CNV，只考虑含有≥10探针的区域。对数比大于或等于0.5的区域被视为增益，低于或等于−0.5的区域被视为缺失。为了进行更严格的分析，我们使用−1≤LOG2RATIO≥1作为阈值来报告MBCNV。

MB-子群的分类

为了识别与MB相关的突变、cnv和细胞遗传学特征，我们将重点放在以下几个方面4,5。突变：BCOR、CTDNEP 1、CTNB1、DDX3X、GFI 1、GFI 1行为、GFI1B行为、KBTBD 4、KDM6A、KMT2C、KMT2D、PRDM 6行为、SMARCA 4、SMO、SUFU、TERT、TERT促进者，TP 53，TP 53(细菌系，GL)，ZMYM 3。CNV：GLI 2安培MYC安培MYCN安培OTX2安培PTEN戴尔SUFU戴尔。细胞遗传学：1Q+，2+，4−，5+，6−，7+，8−，8+，9p+，9q−，10−，10q−，11−，13−，13+，14+，14Q−，15−，16−，16Q−，17p−，17p+，18+，21−。I17q被排除在外，因为无法从数据中进行计算。计算每个类别的事件数，当更改属于不同的子组时，选择事件最多的组(补充表)1).

对于已鉴定出的生殖细胞突变，那些被报道为致病性和与克林瓦尔遗传性癌症易感综合征有关的突变。42附加说明(补充数据)2)。从种系突变中获得的MB-亚组信息是根据先前的研究得出的。43.

每毫巴体细胞突变的频率由肿瘤和脑脊液体细胞编码突变(VAF>5%)除以WES面板大小(补充数据)计算。1, 3–7)。并将所得值与甲基溴体细胞突变的频率进行比较。2,30.

对log2值>0.5和<−0.5，染色体丢失率>15%的，计算臂水平染色体损失率。对于染色体的总增益/丢失，两种武器都需要受到影响。为了确定一个阈值，我们绘制了13个肿瘤样本的染色体增益/丢失的比例。n=46)以确定四分位数的分布。样本服从正态分布(KS正态性检验)，列数最小：18%；25%百分位数：29.5%；中位数44.5%；75%百分位数：65.5%，最大值：100%。对于MB分类亚组，我们包括臂水平或整个染色体的得失在75%以内[覆盖65.5%-100%，黑色)，高于中位数[44.5%-65.5%，灰色)。

DdPCR分析

我们采用滴-数字聚合酶链反应(DdPCR)，一种灵敏度高、精密度高的稳健方法，测定脑脊液中ctDNA的含量。从配对肿瘤/正常DNA的NGS分析中，根据突变的影响、VAFs的影响以及它们是否与MB的发病机制或癌症基因组解释鉴定为驱动突变来选择突变。44。针对每一个突变设计了标准Taqman snp基因分型方法，并根据生产厂家的相关协议和文献，采用qx 200液滴数字PCR系统(bio-rad)，对肿瘤/正常基因组DNA 10 ng，脑脊液和血浆cfdna 1-10 ng进行了ddPCR。45.