中性粒细胞诱导的铁吞促进胶质母细胞瘤进展过程中的肿瘤坏死

肿瘤坏死在许多癌症中普遍存在并预示着不良的预后。虽然它被认为是由慢性缺血引起的，但其潜在的性质和机制仍不清楚。在此，我们发现胶质母细胞瘤(GBM)中的坏死与中性粒细胞引起的嗜铁细胞增多有关.在PDZ结合基序驱动的GBM小鼠模型中，中性粒细胞与坏死的时间和空间重合.中性粒细胞耗竭抑制坏死。从小鼠脑肿瘤中分离出的中性粒细胞可杀死共培养的肿瘤细胞。从机制上讲，中性粒细胞通过将含有髓过氧化物酶的颗粒转移到肿瘤细胞中，从而诱导肿瘤细胞内铁依赖性过氧化脂质的积累。抑制或耗尽髓过氧化物酶可抑制中性粒细胞诱导的肿瘤细胞的细胞毒性。瘤内谷胱甘肽过氧化物酶4过表达或酰基辅酶A合成酶长链家族成员4缺失，可减少肿瘤的坏死和侵袭性。此外，对人GBMs的分析表明，中性粒细胞和嗜铁细胞增多与坏死有关，并可预测生存不良。因此，我们的研究确认铁下垂是GBMs中坏死的潜在性质，并揭示了铁下垂的促肿瘤作用。我们共同提出，某些肿瘤损伤发生在肿瘤进展早期(即缺血)，将中性粒细胞招募到组织损伤部位，从而形成一个正反馈环，最大程度地放大GBM坏死的发展。

肿瘤坏死是一个组织病理学术语，通常用来描述癌症中的组织死亡。它是浸润性乳腺癌等多种晚期癌症的共同特征和不良预后指标。1、非小细胞肺癌2恶性间皮瘤3、透明细胞肾癌4、恶性胃肠道间质瘤5，骨的尤因肉瘤6子宫内膜癌7，胶质母细胞瘤(GBMs)8。摘要GBM是成人最致命、最常见的原发性脑恶性肿瘤，其坏死是一种诊断标志，与肿瘤侵袭性和不良预后呈正相关。8,9,10。与其他实体肿瘤一样，GBMs的特点是组织缺氧，其原因可能是肿瘤扩张过快，血管供应不足。11。人们认为，缺氧是坏死的起始诱因，通过阻止氧化磷酸化而引起细胞死亡，并突然耗尽细胞内ATP。虽然ATP耗竭可能破坏细胞内的一系列稳态过程，导致细胞失控死亡，但肿瘤坏死的性质仍不明确，其发展的分子机制尚不清楚。

组织学上被描述为坏死的受损组织是免疫原性的。它们释放损伤相关的分子模式(DAMP)，如高迁移率族蛋白B1(HMGB 1)。阻尼通常作为趋化剂，将中性粒细胞(人类血液中最丰富的免疫细胞)吸收到坏死部位。12。虽然传统上认为中性粒细胞是一个同质且寿命较短的群体，但现在人们认识到中性粒细胞表现出具有动态功能可塑性的异质免疫表型。除了与组织损伤有关之外，众所周知，中性粒细胞存在于各种癌症中，如所谓的肿瘤相关中性粒细胞(TANS)。它们与多种晚期癌症有很强的相关性，引起了人们对研究中性粒细胞作为临床生物标志物和治疗靶点的长期兴趣。然而，中性粒细胞在癌症中的作用仍然存在争议。13,14,15。一方面，最近的研究表明，中性粒细胞通过释放因子促进细胞外基质的重塑，刺激血管生成，调节其他炎症细胞，从而促进肿瘤的进展。中性粒细胞释放的因子也能直接促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。另一方面，中性粒细胞也可以通过其细胞毒性发挥抗肿瘤作用。不同背景下中性粒细胞引发的细胞毒性研究表明，中性粒细胞源性活性氧(Ros)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)或过氧化氢参与中性粒细胞介导的肿瘤细胞杀伤。16,17。然而，杀死细胞的机制，细胞死亡的类型，以及对肿瘤进展的影响仍然是未知的。

铁下垂是一种由脂质过氧化物的致命积累介导的铁依赖性调节细胞死亡。18。谷胱甘肽依赖的脂质过氧化物还原系统的破坏导致脂质基活性氧的积累。这可以通过中断系统xc的功能来触发。−胱氨酸/谷氨酸反转运体或谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx 4)19。由于癌细胞铁含量高，对铁下垂诱导的敏感性提高，因此铁下垂在癌症治疗中具有广阔的应用前景。20。与此相一致的是，肿瘤抑制因子(如p53或bap 1)在癌细胞中的表达可通过诱导促生作用而抑制肿瘤的发生。21,22。然而，p5 3的表达也能抑制某些癌细胞的铁下垂。23,24提示铁下垂在癌症中的作用可能是复杂的，值得进一步研究。

在本研究中，我们研究中性粒细胞在GBM肿瘤坏死中的作用，采用原位异种移植的GBM小鼠模型，忠实地再现GBM患者所观察到的坏死程度。该模型显示坏死与中性粒细胞的时间和空间相关性。我们证明，中性粒细胞的减少减少了GBM坏死，从GBM荷瘤小鼠中分离出的TANS，以及活化的成熟中性粒细胞(G-CSF)激活的成熟中性粒细胞(G-CSF)，在体外共同培养时会导致肿瘤细胞死亡。从机械上讲，这种中性粒细胞介导的肿瘤细胞杀伤是通过铁吞作用实现的，依赖于细胞间将中性粒细胞特异性颗粒转移到肿瘤细胞中。颗粒中含有髓过氧化物酶(MPO)，其活性是肿瘤细胞杀伤所必需的。通过调控Gpx 4和酰基-CoA合成酶长链家族成员4(ACSL 4)等肿瘤细胞中关键的铁吞调节因子(ACSL 4)，抑制肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤的侵袭性。最后，我们提供证据表明中性粒细胞和嗜铁细胞增多也与GBM患者的肿瘤坏死和生存不良有关。

超活化TAZ促进GBM间充质(MES)转化和肿瘤坏死

PDZ结合基序(TAZ)的转录辅激活因子(TAZ)是河马通路中的一种致癌转录调节因子.结果表明，TAZ驱动的转录程序与gbm mes分化和侵袭性进展有关。25。检查塔兹在GBM的MES亚型中表达增加，我们通过cBioPortal分析TCGAGBM数据集。Www.cbioportal.org)。MES亚型肿瘤越多越高。塔兹表达水平高于神经前型(PN)或经典型(CL)(图1)。1A)。为了研究TAZ激活是如何驱动侵袭性gbm进程的，我们通过稳定地表达一个具有活性的taz突变体(Taz)，设计了一种TAZ驱动的异种gbm小鼠模型。4SA)26在一个常用的LN 229人GBM细胞株中(附图)。1A)，其中含有P98L错义突变的p53(肿瘤细胞株百科全书)。TAZ植入小鼠4SA-表达肿瘤细胞(下称LN 229)Taz(4SA))的存活率明显低于植入载体介导的肿瘤细胞(以下为LN 229)。矢量)(图1.1B)。LN 229Taz(4SA)肿瘤长得比LN 229快得多矢量肿瘤(附图)1B)。这些结果与以前的观察结果一致。27提示前者较后者具有更强的侵袭性。对MES标记物(纤维连接蛋白、CD 44和CTGF)进行印迹显示LN 229Taz(4SA)肿瘤在更高水平上表达这些蛋白质，表明在体内发生了MES的转化(如图所示)。1C)。组织学研究发现LN 229Taz(4SA)肿瘤的异质性比LN 229强得多。矢量肿瘤和大面积坏死，而LN 229矢量肿瘤不会发展为可检测的坏死(如图所示)。1D-f)。值得注意的是，即使在LN 229中，这种差异也存在。Taz(4SA)和LN 229矢量肿瘤的大小相同(补充图)。1C)，表明肿瘤的大小并不决定肿瘤坏死的存在与否。由于异质性和广泛性坏死是GBMs的共同特征，这种组织学表现提示TAZ的过度激活促进了肿瘤的进展。

TAZ作为一种转录辅激活因子，通过与转录因子tead相互作用调节基因转录。28。测试LN 229的攻击性Taz(4SA)肿瘤依赖于这种转录活性，我们使用了另一个TAZ突变体，TAZ。(4SA-S51A)无法绑定到tead的28。LN 229细胞表达TAZ的肿瘤研究(4SA-S51A)(下称LN 229)Taz(4SA-S51A))更类似于LN 229矢量比LN 229Taz(4SA)肿瘤，虽然有些LN 229Taz(4SA-S51A)肿瘤可发展为小坏死(如图所示)。1D，f)。值得注意的是，TAZ(4SA-S51A)和TAZ(4SA)在类似的水平上表达(附图)。1A)。这一结果表明TAZ与TAAD的相互作用对TAZ的恶性转化是必要的。为了研究TAZ过度激活是否仅限于LN 229细胞，我们与另外两种常用的人GBM细胞系U87MG和LN 18使用了相同的策略。而U87MG不含p53突变，LN 18含有C238S错义突变的p53(肿瘤细胞百科全书)。与LN 229细胞相似，TAZ在这些细胞中的过度激活也导致了含有广泛坏死的侵袭性GBMs(如图所示)。1D和补充图。1D-g)。这些结果提示TAZ-tead介导的转录程序驱动GBM MES的分化和进展，伴随着广泛的肿瘤坏死。

GBM坏死广泛浸润于肿瘤相关的中性粒细胞(TANS)。

虽然LN 229的坏死区Taz(4SA)肿瘤通常有较低的细胞密度，仔细检查发现这些区域含有某些细胞核较典型的肿瘤细胞小且密度大的细胞(见图)。2A、箭头和箭头)。这些细胞可能是死亡的肿瘤细胞或浸润的免疫细胞。这些细胞大多含有多叶核，这是中性粒细胞的特征(图)。2A、箭头)。为了证实它们的同一性，我们使用小鼠中性粒细胞标记物Ly6G对肿瘤切片进行免疫组织化学检测。29。LN 229坏死区可见Ly6G阳性细胞。Taz(4SA)肿瘤但在LN 229中很少发现矢量或LN 229Taz(4SA-S51A)肿瘤(如图所示)。2B)。然后用流式细胞仪定量地验证了这一观察结果。中性粒细胞是来源于髓系的终末分化白细胞。因此，我们首先使用髓系细胞标记CD11b和CD 45来检测CD11b。+CD 45+髓系细胞。与非荷瘤小鼠相比，所有肿瘤均有更多的髓样细胞浸润。2C，d)。在LN 229细胞中，髓系细胞的浸润更为明显。Taz(4SA)肿瘤比LN 229矢量或LN 229Taz(4SA-S51A)。接下来，我们使用小鼠中性粒细胞标记物Ly6G进一步验证这些肿瘤是否浸润CD11b。+CD 45+髓系细胞确实是中性粒细胞。与其他两种肿瘤不同，Ly6G高LN 229细胞似乎是浸润性髓系细胞的主要群体。Taz(4SA)肿瘤(如图所示)。2E，f)。这些结果表明，LN 229细胞的中性粒细胞浸润量明显增加。Taz(4SA)肿瘤。

中性粒细胞在空间上与坏死有关，尤其是在细胞肿瘤和坏死区的界面(如图所示)。2A，b)，我们试图检查中性粒细胞与坏死之间是否存在时间相关性。首先，我们用CD11b和CD 45检测LN 229中的髓系细胞。Taz(4SA)肿瘤在肿瘤进展的不同阶段。流式细胞仪检测CD 45+肿瘤植入后第20天，肿瘤细胞(即浸润的小鼠免疫细胞)可根据CD11b和CD 45信号强度分为三大类，我们称之为CD11b。高CD 45高、CD11b医学博士CD 45医学博士，和CD11b低层CD 45低层细胞(附图)2A)。在这个阶段，肿瘤浸润的免疫细胞在三个细胞中所占的比例几乎相等。随着肿瘤的发展，CD11b高CD 45高细胞逐渐成为优势种群(附图)。2A，b)。以前的研究报道，炎症脑内的小胶质细胞可以根据较低的小胶质细胞CD 45的表达来区别于外周浸润的巨噬细胞。30。然而，中性粒细胞CD 45相对于脑小胶质细胞和巨噬细胞的表达尚不清楚。为了检测哪些细胞群含有中性粒细胞，我们使用了小鼠中性粒细胞标记物Ly6G。CD11b高CD 45高人口主要由Ly6G组成+细胞，而其他两个种群实质上缺乏Ly6G+细胞(附图)2A)。Ly6G的这种特殊富集+细胞在肿瘤发展过程中不会发生变化(附图)。2C)。因为Ly6G+-富集CD11b高CD 45高在肿瘤发生过程中，细胞数量和坏死共同增加，结果表明中性粒细胞与坏死呈时间相关性。

为了在早期进一步研究中性粒细胞与坏死的相关性，我们采用免疫组织化学方法。肿瘤细胞植入后第10天苏木精和伊红(H&E)染色可见脑肿瘤。然而，没有发现肿瘤坏死(图一)。2G)。这些肿瘤和LN 229一样均匀。矢量肿瘤(无花果)2Gv.V.1D)。这些肿瘤中很少见中性粒细胞。肿瘤细胞植入后第16天，肿瘤内有少量坏死灶浸润中性粒细胞(图1)。2G)。值得注意的是，H&E染色。2G和Ly6G免疫组织化学(补充图)。二维空间)在这一天，16个肿瘤组织出现轻微损伤的区域出现中性粒细胞聚集。这些结果提示中性粒细胞浸润可能发生在发生新坏死的区域。这些结果表明，GBM坏死在空间和时间上与中性粒细胞浸润密切相关。

中性粒细胞在体内促进GBM坏死并在体内诱导肿瘤细胞死亡

众所周知，受损的组织可以释放阻尼，能够吸收中性粒细胞。因此，在我们的模型中看到GBM坏死与中性粒细胞浸润之间的时空相关性是不足为奇的。然而，浸润的中性粒细胞是否能促进或促进肿瘤坏死的发生仍未解决。为了验证这一点，我们使用了一项先前建立的协议，通过抗Ly6G抗体来消耗中性粒细胞。31并观察其对GBM坏死的影响。值得注意的是，抗Ly6G抗体本身并不影响肿瘤细胞体外增殖(附图)。3A)。我们腹腔注射单克隆抗Ly6G抗体或非特异性IgG进入LN 229。Taz(4SA)按照指示的方案进行荷瘤小鼠(附图)。3B)。治疗过程从肿瘤细胞植入后第14天开始，一直持续到每只动物达到其终点(~14天)，直至坏死前阶段至末期。为了评价中性粒细胞耗竭的有效性，我们首先通过外周血涂片检查循环中性粒细胞.与IgG处理的小鼠相比，Ly6G处理的小鼠在整个治疗过程中循环中性粒细胞明显减少(补充图)。3C)。在初次治疗后(例如第一次抗体注射后的第1-6天)，耗竭似乎最有效，之后(例如，第一次抗体注射后的第11至13天)就变得不那么有效了。这种消耗动力学与以前使用同样的耗尽策略的研究是一致的。32。然后我们检查了脑组织中与肿瘤相关的中性粒细胞。肿瘤植入后第20天(第一次抗体注射后第6天)出现完全衰竭。值得注意的是，虽然中性粒细胞耗竭的有效性逐渐丧失，但部分耗竭仍在继续(补充图1)。三维空间(例如，第一次注射抗体后的第10和12天)。在末期，肿瘤相关的中性粒细胞在很大程度上具有耐耗性(补充图).三维空间)。由于中性粒细胞耗竭在早期阶段更为有效，我们研究了肿瘤早期(即肿瘤植入后20、22和24天)和到达终点(即肿瘤植入后26~33天)对肿瘤坏死的影响。对这些小鼠肿瘤的分析表明，Ly6G处理的小鼠所显示的肿瘤的坏死核心明显小于IgG处理的小鼠(见图)。3A，b和补充图。3E)。坏死程度早期(62%)明显高于晚期(50%)。肿瘤内内皮细胞(CD 31)+当中性粒细胞耗尽时，细胞的数量就减少了(补充图)。3F)。这一观察结果与TANS促进肿瘤血管生成的观点是一致的。33,34。总之，这些结果提示中性粒细胞参与促进肿瘤坏死的发展。

为了直接研究肿瘤相关中性粒细胞(Tans)是否能诱导肿瘤细胞死亡，我们从ln 229脑中分离出tans。Taz(4SA)荷瘤小鼠与LN 229共培养Taz(4SA)细胞体外。在急性(15h)细胞存活实验中，通过发光法测定细胞活力。荧光素酶表达-LN 229Taz(4SA)肿瘤细胞与TANS按1：1~1：20比例共培养，加入荧光素底物和发光读数。随着中性粒细胞与肿瘤细胞的比例增加，存活的肿瘤细胞越来越少(附图)。第三代)，表明TANS对肿瘤细胞具有细胞毒性。为了检查这种杀伤细胞的能力是否特定于TANS，我们从非荷瘤小鼠的骨髓和脾脏中分离出幼稚的中性粒细胞。肿瘤中性粒细胞比率Taz(4SA)肿瘤似乎远远高于1：1，尤其是在坏死区和细胞肿瘤区的交界处(如图所示)。2A)，采用1：20的比例进行体外测定。在急性细胞存活试验中，TANS，而不是肿瘤-原始中性粒细胞，诱导了肿瘤细胞的共同培养死亡。3C)。为了更直接地评估细胞活力，我们使用了两种额外的方法：流式细胞术分析(使用Sytox细胞-不透水核酸荧光染料；附图)。3H)和菌落形成试验。3D，e)。这些实验证实了TANS具有特异性的肿瘤细胞杀伤能力。不同类型的中性粒细胞在杀伤能力上的差异与以前的报道一致，其中肿瘤相关的中性粒细胞可以发挥肿瘤细胞的细胞毒性，而从非荷瘤动物中分离出来的中性粒细胞对肿瘤细胞的杀伤作用是不存在的。35,36。TANS的特异性细胞毒性，而非荷瘤小鼠的中性粒细胞，提示含有坏死的肿瘤微环境可能进一步诱导中性粒细胞的成熟或激活，从而获得这种细胞毒性。

为了研究成熟是否能增加中性粒细胞的细胞毒性，我们建立了中性粒细胞分化模型。报道了粒细胞集落刺激因子(G-CSF)诱导小鼠骨髓细胞32D克隆3(32Dcl3)分化为中性粒细胞。分化的32Dcl3细胞在功能上与成熟的中性粒细胞相似，因此已被用于研究中性粒细胞的功能。37。我们检查了这些体外分化的中性粒细胞是否也具有细胞毒性。用Ly6G流式细胞仪检测分化的32Dcl3细胞的成熟期29(补充图。3i，j)我们用上述的急性存活试验检测了这些分化中性粒细胞的杀伤能力。与TANS一样，分化的32Dcl3细胞具有比率依赖性的肿瘤细胞杀伤能力(附图)。3K)。有趣的是，只有分化的32Dcl3细胞，而不是亲代细胞，才能诱导LN 229。Taz(4SA)肿瘤细胞死亡(图1.3C)。Sytox染色实验进一步证实了这一点(补充图)。3H)和集落形成试验。3D，e)。提示G-CSF诱导分化可能具有细胞毒性.在上述实验中，采用小鼠中性粒细胞和人肿瘤细胞。为了检查细胞杀伤是否是由于物种差异所致，我们使用了人类中性粒细胞。人早幼粒细胞白血病细胞系(HL-60)是研究髓系细胞分化的模型，经维甲酸和G-CSF联合作用，可分化为成熟的中性粒细胞。38。一种中性粒细胞和嗜酸性粒细胞特异性活化抗原CD66b的流式细胞术证实了这一点。39(补充图。3L，m)。我们发现分化的HL-60中性粒细胞(而不是亲代细胞)对LN 229表现出细胞毒性。Taz(4SA)所有细胞存活试验中的肿瘤细胞。3C-E和补充图。3H)。总之，上述结果支持中性粒细胞的细胞毒性与分化程度较高的中性粒细胞相关联。

中性粒细胞介导的肿瘤细胞杀伤是通过铁吞作用实现的。

为了了解中性粒细胞引起的肿瘤细胞死亡的本质，我们使用了一组小分子抑制剂，专门抑制某些类型的受调控细胞死亡。这些抑制剂包括：z-vad-fmk(凋亡)、坏死抑素-1(死亡下垂)、GSK-872(死亡下垂)、坏死磺胺(Nsa)、铁抑素-1(嗜铁下垂)和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC；ROS诱导的细胞死亡)。这些化合物不影响LN 229的活性。Taz(4SA)肿瘤细胞单独培养时(附图)。4A)。有趣的是，只有铁抑素-1和NAC似乎可以通过分化的32Dcl3中性粒细胞来拯救肿瘤细胞。4A)。值得注意的是，虽然坏死抑素-1可以部分挽救中性粒细胞介导的杀伤，但其他两种死亡抑制因子GSK-872和NSA没有显示出这样的效果(图一)。4A)。鉴于坏死抑素-1已被报道为非特异性地抑制铁下垂，作为一种非靶点效应。40，死亡可能与我们观察到的细胞死亡无关。因此，本研究提示嗜铁细胞增多可能是中性粒细胞诱导肿瘤细胞死亡的潜在机制。我们进一步证实，铁他汀-1也抑制TANS或分化的HL-60中性粒细胞引起的肿瘤细胞死亡(如图所示)。4B和补充图。4B)。Liproxstatin-1是另一种铁吞抑制剂，很可能是一种自由基诱捕抗氧化剂。40,41。我们发现Liproxstatin-1同样可以帮助肿瘤细胞免于上述两种中性粒细胞的杀伤(补充图)。4B，c)。为了研究这种细胞死亡是否是铁依赖性的，我们尝试用铁螯合剂去铁胺(DFO)来拯救中性粒细胞的死亡。事实上，DFO废除了中性粒细胞引起的肿瘤细胞死亡。4B和补充图。4B)。此外，我们采用Sytox染色方法进一步证实中性粒细胞诱导的肿瘤细胞死亡可被铁抑素-1、Liproxstatin-1或DFO(补充图1)所抑制。4D)。虽然导致嗜铁细胞最终死亡的确切机制仍有待确定，但众所周知，嗜铁作用的特征是细胞内脂质过氧化物的过度积累。我们考虑了TANS或分化中性粒细胞是否会引起肿瘤细胞的脂质过氧化，因此我们将中性粒细胞与肿瘤细胞共培养，同时使用一种通用的ROS指标DCFDA和一种脂类ROS特异性指标BODIPY。与TANS共培养的肿瘤细胞与分化后的32Dcl3细胞相比，DCFDA和BODIPY信号更强(图1)。4C，d和补充图。4E，f)，在共培养的肿瘤细胞中显示出较高的脂质过氧化水平。当在共培养中加入铁抑素-1、Liproxstatin-1或DFO时，BODIPY指示的脂质过氧化物积累被取消(补充图1)。4G，h)。有报道称嗜热细胞含有较小且浓缩的线粒体。18，以及LN 229Taz(4SA)与细胞毒性分化的32Dcl3和HL-60细胞共培养的细胞表现出这种线粒体病理改变(图1)。4E)，与嗜热细胞死亡一致。有趣的是，这些肿瘤细胞中的线粒体也出现了形态扭曲，嵴较少且肿胀(如图所示)。4E).

接下来，为了破译铁下垂和脂质过氧化物的积累是否与体内肿瘤坏死有关，我们进行了荧光探针的原位加载，以检测细胞内的脂质活性氧(Liperfluo)。42，关于LN 229的非固定脑片Taz(4SA)荷瘤小鼠。肿瘤区域表现出比周围正常脑实质更强的流氟信号(图)。4F，以蓝色星号标示的区域)。在肿瘤区，LiperFluo信号出现变化。DAPI染色使我们能够区分坏死(DAPI-稀疏)和细胞(DAPI-致密)肿瘤区域(图)。4G，左)。可见坏死区比细胞肿瘤区有更强的LiperFluo信号(图1)。4G，红色对白色星号)。有趣的是，坏死带似乎表现出最强的LiperFluo信号(如图所示)。4G、白色箭头)。因此，中性粒细胞丰富(如图所示)。2A我们想知道是中性粒细胞还是肿瘤细胞促成了LiperFluo信号。CD 45作为小鼠白细胞标记标记LN 229细胞的研究Taz(4SA)肿瘤，我们区分免疫细胞和肿瘤细胞(补充图)。4I)。肿瘤细胞(CD 45)−)显示比CD 45更强的LiperFluo信号+免疫细胞4H和补充图。4J)。这些结果表明，坏死区肿瘤细胞内脂质过氧化物含量高于其他肿瘤细胞或非肿瘤细胞。Ptgs 2(a.k.a.)当细胞发生铁下垂时，COX 2会增加，因此它通常被用作铁下垂的指标。19,43。与我们的预期一致，坏死性肿瘤细胞Ptgs 2的表达增加(如图所示)。4I)。然后，我们通过从LN 229获得的全脑切片的电子显微镜对这些坏死肿瘤细胞的线粒体形态进行了表征。Taz(4SA)荷瘤小鼠。我们发现，与我们对肿瘤中性粒细胞共培养的体外观察相似，这些坏死的肿瘤细胞与健康的肿瘤细胞相比，含有较少且看似肿胀的嵴的线粒体(图1)。4J)。这些观察表明，肿瘤细胞在体外与中性粒细胞共同培养时，会受到氧化应激和积累的脂质过氧化物的影响。以上结果表明，坏死性肿瘤细胞在遇到中性粒细胞时会发生嗜酸性细胞死亡。

中性粒细胞间转移髓过氧化物酶介导中性粒细胞诱导的肿瘤细胞毒性

为了进一步研究中性粒细胞与肿瘤的相互作用，我们使用亲脂膜荧光染料pkh 26标记中性粒细胞，并在Ln 229中表达gfp。Taz(4SA)肿瘤细胞要区分两种细胞类型。我们注意到肿瘤细胞含有PKH 26。+补充图5A)。检查这些PKH 26+点点与中性粒细胞诱导的肿瘤细胞死亡有关，与多种PKH 26标记细胞共培养时，我们对肿瘤细胞中的点点进行了定量研究。与肿瘤相关或体外分化的小鼠和人中性粒细胞共同培养的肿瘤细胞相比，pkh 26较少。+观察到肿瘤细胞与原始中性粒细胞或未分化的髓样细胞(包括骨髓和脾脏的中性粒细胞)以及亲代HL-60和32Dcl3细胞共培养时的点点。5A-C和补充图。c.)。由于肿瘤-幼稚和未分化中性粒细胞未能诱导肿瘤细胞死亡(图一)。3C-E)，我们推测PKH 26的加入+肿瘤细胞的点状可能与中性粒细胞的杀伤能力有关。为了验证这一观点，我们分离出含有更多PKH 26的肿瘤细胞。+斑点(PKH 26)高)从含有较少或不含PKH 26的+斑点(PKH 26)低/-)流式细胞术(附图)。5D)并比较它们的生存。我们发现PKH 26高如集落形成实验所示，肿瘤细胞的存活率降低(如图所示)。5D，e)和Sytox染色试验(附图)。5E)。PKH 26活性降低高肿瘤细胞可以被铁抑素-1，Liproxstatin-1或DFO(补充图1)拯救.5E).

细胞内PKH 26的相关性+点状参入和肿瘤细胞死亡导致我们推测中性粒细胞间向肿瘤细胞转移可能导致肿瘤细胞内的嗜铁细胞增多。MPO是一种过氧化物酶，主要在中性粒细胞中表达，将过氧化氢转化为反应更多的活性氧，即盐酸。我们发现PKH 26+当细胞被MPO抗体染色时，肿瘤细胞中的点状物大部分与MPO共同定位。5A和补充图。5B)。类似于PKH 26+皮塔岛+在与细胞毒性中性粒细胞共培养的肿瘤细胞(如TANS，分化的HL-60和32Dcl3细胞)中也有较多的点状。5A，c和补充图。c.)。为了了解这种中性粒细胞来源的MPO转移到肿瘤细胞中是否需要直接的细胞接触，我们采用了两种方法。首先，在中性粒细胞培养的条件培养液(CM)中培养肿瘤细胞。第二，肿瘤细胞和中性粒细胞与中间的细胞不透水膜共培养，肿瘤细胞在井底，中性粒细胞在膜上方。在这两种情况下，几乎没有MPO+与直接与中性粒细胞共培养的细胞相比，肿瘤细胞中观察到点状物(附图)。5F，g)。这些结果共同提示肿瘤细胞与中性粒细胞之间的直接细胞接触或接近是细胞间MPO转移所必需的。

我们通过免疫组织化学进一步研究了MPO斑在体内是否也存在。在LN 229里Taz(4SA)肿瘤切片中，MPO表达的细胞主要是坏死区的中性粒细胞。5F，绿色轮廓)。这些细胞又圆又小。MPO-染色信号在这些细胞中无法清晰地与细胞核分离，这可能是由于细胞质相对浓缩(图一)。5F，在被放大的绿色轮廓区域中的箭头)。有趣的是，一些坏死周肿瘤细胞似乎含有MPO点状物(如图所示)。5F、品红-轮廓)。这些细胞有较大的细胞核和不规则的形状。MPO-染色信号在这些细胞中是点状的，并且可以清晰地与细胞核分离(如图所示)。5F，箭头在放大的洋红轮廓区)。为了进一步证实这一观察，我们进行了MPO和N-cadherin的双重染色，这是在GBM细胞中高表达的。N-钙粘素还允许我们检查组织中的单个细胞。MPO+在肿瘤细胞中可以看到点状物(如图所示)。5G、黄色箭头)。值得注意的是，一种浸润的小鼠中性粒细胞含有更多但更小的MPO。+点点也出现在这里(图中所示)。5G、白色箭头)。类似于上面的观察(图)。5F)，这种推测的中性粒细胞MPO-染色信号似乎与合并图像中的核重叠。这种细胞与周围的人肿瘤细胞的特征性，明亮和浓缩的DAPI染色中心，常见于小鼠细胞，而不是人肿瘤细胞株。总之，这些结果表明肿瘤细胞在体外和体内都能从中性粒细胞中获得MPO。然后我们测试了MPO酶活性是否是中性粒细胞诱导的肿瘤细胞死亡所必需的.4-氨基苯甲酸酰肼(4-abah)和pf 06282999是两种能特异性抑制MPO过氧化物酶活性的小分子抑制剂。44,45。在中性粒细胞与肿瘤细胞共培养中加入4-Abah可消除肿瘤细胞的死亡。5H)。同样，PF06282999也能抑制中性粒细胞引起的肿瘤细胞死亡。5H)。提示MPO酶活性与中性粒细胞的细胞毒性有关。为了进一步研究这个概念，MPO从分化的HL-60和32Dcl3细胞被两种不同的短发夹RNA(shRNAs；补充图)击倒。5H，i)。当通过Sytox染色活力检测时，这些MPO缺乏的细胞诱导肿瘤细胞死亡的能力明显低于对照组(见图)。5I)，与药物抑制的结果一致(如图所示)。5H)。综上所述，上述结果支持了嗜中性粒细胞间向肿瘤细胞转移的观点，而导致肿瘤细胞内嗜中性粒细胞增多的是嗜中性粒细胞的含量，如本文所示的MPO。

Gpx 4在肿瘤细胞中的过度表达或ACSL 4缺失抑制肿瘤坏死和侵袭性

为了评估下垂是否导致肿瘤坏死，我们评估了铁下垂阻滞对坏死的影响。Gpx 4是一种必需的磷脂过氧化物酶，负责减少脂质过氧化物，从而保护细胞免受铁下垂。43。我们发现，在靠近坏死区的肿瘤细胞中，Gpx 4的数量少于LN 229的细胞肿瘤区。Taz(4SA)肿瘤(如图所示)。6A)。提示Gpx 4的缺失可能使肿瘤细胞易发生铁下垂。为了研究Gpx 4补充剂是否能挽救肿瘤细胞，我们在LN 229中进行了重组Gpx 4(RGPX 4)的体外表达。Taz(4SA)细胞(附图)6A)。值得注意的是，rGPx 4(箭头)包含一个线粒体靶向序列。46并且似乎大于内源性Gpx 4(星号)，后者很可能没有这个序列。体外表达的rGPX 4似乎在胞浆中扩散，而不限于线粒体(附图)。6B)。LN 229Taz(4SA)在体外共培养实验中，表达rGPX 4的细胞对中性粒细胞介导的杀伤的敏感性低于对照组(补充图)。6C)。RGPX 4-表达LN 229小鼠Taz(4SA)肿瘤寿命明显长于对照组(24%)。6B)。两组肿瘤大小相似的组织学检查显示，rGPX 4阳性肿瘤的坏死明显小于对照组(47%)。6C和补充图。6d)。因此，上述结果支持了抑制下垂可以减少肿瘤坏死和侵袭性的观点。有趣的是，rGPX 4的表达稍微减缓了肿瘤的生长，尽管两者之间的差异在统计学上是微不足道的(补充图)。6E)。这表明肿瘤生长减少并不能完全解释长期存活的原因。

为了进一步研究这些概念，我们采用了另一种方法来抑制铁下垂。Acsl 4是合成含有多不饱和脂肪酸的磷脂的必需酶，磷脂是脂质过氧化和随后的铁吞作用的主要底物。47,48。为了抑制铁下垂，我们沉默了ACSL 4在LN 229中Taz(4SA)两种不同shRNAs的细胞(附图)。6f，g)。TANS或体外分化中性粒细胞对肿瘤细胞的杀伤作用ACSL 4表达更有效地沉默(补充图)。六小时，第41号。然而，当ACSL 4部分耗尽时，对细胞杀伤的抑制作用不明显(附图)。六小时，第42号。移植ACSL 4-缺失LN 229小鼠相似大小肿瘤的组织学评价Taz(4SA)细胞显示ACSL 4缺失肿瘤的坏死明显小于对照组(分别为68%和58%)。6d和补充图。6I)。荷瘤小鼠ACSL 4无论用哪种方法，shRNA的寿命都明显长于对照组(分别为45%和31%，分别为sh#41和sh#42)。6E)。值得注意的是，当肿瘤生长受到抑制时ACSL 4表达更有效地沉默(补充图)。6J，第41号。然而，当ACSL 4部分耗尽时，对肿瘤的生长几乎没有抑制作用(附图)。6J，第42号。上述两种方法的结果都支持铁下垂参与了肿瘤坏死的形成，并共同提示铁下垂增强了肿瘤的侵袭性。

为了了解铁下垂介导的细胞死亡的促肿瘤作用机制，我们推测即将死亡的肿瘤细胞可能会分泌某些促进肿瘤进展的因素。为了验证这一点，我们通过使用全肿瘤裂解物的人细胞因子抗体阵列，对这些因素进行了公正的筛选。在LN 229中，五个因素似乎更为丰富。Taz(4SA)(伴有坏死)矢量(无坏死)肿瘤。6f)。然后，我们进行了比较研究，以检查这些因素是否与人GBMs坏死相关。为此，我们使用公开提供的GBM数据集(常春藤成母细胞瘤Atlas项目)对基因表达进行了分析。49...该数据集包括26份来自肿瘤坏死区(PNZ)的样本和111份来自细胞肿瘤区(CT)的样本。在这一分析中，我们发现这五个基因中有四个与人GBMs的细胞肿瘤区相比，在坏死区的表达增加了(如图所示)。6g)。在这两个不同的地理特征中差异表达的基因的独创性途径分析(IPA)表明，这四个基因在坏死区的激活程度更高(图1)。6g)。因为IL8在TCGA数据集中无法获得数据，我们进一步检查了TCGA数据集中的其他三个基因。它们在间充质亚型的GBMs中的表达高于经典或前神经亚型的GBMs(如图所示)。六小时)，并与较差的生存相关(图一)。6I)。值得注意的是，IL8和IL6都与促进GBM的进展有关50。此外，我们还研究了上述两种遗传操作抑制铁下垂对GBM微环境的影响。看来CD 31的数目+内皮细胞与GFAP+星形胶质细胞未受影响(附图)。6k，l)。有趣的是，通过小鼠小胶质细胞标记物TMEM 119的检测，我们发现在肿瘤中表达rGPX 4或rGPX 4的肿瘤内小胶质细胞较少。ACSL 4ShRNAs相反，脑实质小胶质细胞无差异(补充图)。6k，l)。总之，这些结果表明，分泌促肿瘤因子和/或由萎缩的肿瘤细胞募集小胶质细胞，可使促生细胞功能发挥促肿瘤作用，并有助于人类GBMs的肿瘤侵袭性和不良预后。

嗜铁细胞增生与间充质转换有关，与人GBMs肿瘤侵袭性呈正相关。

为了探索下垂是否与人的GBM坏死有关，我们生成了一组铁下垂调节基因的列表(补充图)。7A)。据报道，这些基因与铁下垂有关，可分为促下垂基因和抑铁基因。19,20。基因集富集分析(GSEA)51在TCGA中，GBM数据集发现，促下垂基因在间充质(MES)GBM中比在前神经(PN)亚型中表达更高(如图所示)。7A)。因为MES-GBM与较短的生存期有关，更容易发生坏死。52,53,54这一结果表明萎缩症与坏死以及不良预后之间存在联系。传统的肿瘤亚型不能反映肿瘤内异质性。55为了更直接地检验萎缩和坏死之间的关系，我们分析了上述常春藤GBM数据集。GSEA发现，促下垂基因在PNZ中的表达较高，而促下垂抑制基因在两种肿瘤区域均无富集(图一)。7b)。这些结果表明，铁下垂是在PNZ发生的。比较MES-GBMs和GBMs的PNZ中最丰富的嗜铁作用基因，发现有很大的重叠(图1)。7C)，表示MES子类型与PNZ之间的链接。为了进一步研究人类GBMs中的铁下垂，我们使用Ptgs 2作为标记物。类似于我们对荷瘤小鼠的观察(图一)。4I免疫组织化学染色显示PNZ肿瘤细胞Ptgs 2表达增强(图1)。7D)，表明这一地区出现了铁下垂。在进一步研究铁下垂与肿瘤侵袭性的关系时，我们发现两个最丰富的铁吞基因-赖氨酸氧化酶(LOX)和前列腺6跨膜上皮抗原3(STEAP 3)，以及其他五个高度富集的铁下垂基因，都与GBM患者的生存质量较差有关(图一)。7E)。值得注意的是，尽管Gpx 4与所有TCGA GBM病例相比，未显示对患者生存的影响，低表达Gpx 4在没有IDH 1突变(图1.7F)。这个结果表明Gpx 4表达确实会对肿瘤的侵袭性产生负面影响，这种关系可能取决于肿瘤的代谢状态。总的来说，这些结果进一步证实了下垂与侵袭性肿瘤有关。

TANS与肿瘤坏死程度呈正相关，预测GBM患者生存不良

为了探讨中性粒细胞是否与人GBM坏死有关，我们对常春藤GBM数据集的PNZ和CT样本中差异表达的基因进行了独创性路径分析(IPA)。结果表明，与CT相比，PNZ中中性粒细胞的募集、运动、积聚和脱颗粒过程均增强。8A)，表明中性粒细胞在PNZ中更活跃。此外，与铁下垂有关的细胞功能，如活性氧生成、脂质代谢和多不饱和脂肪酸(PUFAs)的合成，在PNZ(补充图)中也得到了增强。8A)。这一结果与上述分析相一致，表明下垂与人GBM坏死有关。此外，PNZ还与晚期恶性实体肿瘤相关的细胞过程增强有关(补充图)。8A)。为了进一步阐明GBM坏死与中性粒细胞之间的联系，我们利用术前、T1加权对比后磁共振成像(MRI)从一组GBM患者中收集了肿瘤和肿瘤坏死的体积分析(图一)。8A)。肿瘤大小与肿瘤坏死相关(附图)。8B)。为了检查肿瘤坏死的发展是否与循环中性粒细胞直接相关，我们通过电子病历检索从患者的全血计数(CBC)中获得了术前中性粒细胞计数。循环中性粒细胞的数量(以白细胞总数的百分比计算)与肿瘤和坏死核大小均呈正相关(补充图)。8C，d中性粒细胞计数与肿瘤坏死比的相关性更强(图1)。8B)。这些结果提示中性粒细胞的产生和动员与肿瘤坏死程度有关。值得注意的是，这项研究不能排除感染或药物(如围手术期类固醇)对循环中性粒细胞计数的可能影响。为了检查中性粒细胞在GBMs中的浸润，我们检查了45例死亡患者的骨髓嗜中性粒细胞浸润，这些患者的病理报告显示其坏死“明显”或“广泛”。在H&E染色切片中的中性粒细胞可以通过其特征性多叶核来识别(如图所示)。8C、箭头)。通过这种方法，我们计算了三个不同的感兴趣区域(包括肿瘤浸润区、坏死区和界面区)中每个高功率场中性粒细胞的绝对数量(40x目标)。具有中性粒细胞特征的细胞几乎完全存在于坏死区(如图所示)。8D)。为了更准确地鉴定中性粒细胞，我们用嗜中性粒细胞特异性活化抗原CD66b对从这一队列中获得的肿瘤切片进行了免疫组织化学检测。39。免疫组织化学染色证实H&E染色中的细胞确实是中性粒细胞，并显示CD66b阳性细胞定位于肿瘤坏死区(如图所示)。8E)。为了检查坏死和中性粒细胞是否与生存不良有关，我们根据坏死与肿瘤体积比和肿瘤中性粒细胞计数将患者分为两组。结果表明，肿瘤坏死率和中性粒细胞浸润率均与生存质量相关(图1)。8F，g)。最重要的是，这些研究支持了这样的观点，即与我们的临床前模型一致，中性粒细胞浸润和嗜铁增多与肿瘤坏死密切相关，并可预测GBM患者的不良生存。

坏死常见于晚期实体肿瘤，尤其是GBMs。然而，肿瘤坏死的本质和机制尚不清楚。在本研究中，我们证明铁下垂参与了GBMs坏死的发生。这种受调控的细胞死亡可由中性粒细胞触发，中性粒细胞在肿瘤发生过程中可能被某些早期组织损伤所吸收。机械地，我们发现活化的成熟中性粒细胞通过将其特有的颗粒转移到肿瘤细胞中，从而诱导肿瘤细胞的脂质过氧化。颗粒中含有髓过氧化物酶，这是负责增加肿瘤细胞脂类ROS，从而导致下垂细胞死亡。

传统的模型认为肿瘤坏死是在血液供应不足以支持肿瘤生长的情况下发生的，而肿瘤坏死的形成似乎更为复杂。11。本研究从载体或TAZ(4SA)介导的GBM细胞中提取肿瘤，为研究GBM坏死中的细胞死亡过程提供了独特的模型。LN 229Taz(4SA)肿瘤最早在植入后第16天就会发生坏死(如图所示)。2G)。此时，肿瘤的大小仍然相对较小。相比之下，LN 229矢量肿瘤即使在体积比LN 229大得多的情况下也不会发生坏死。Taz(4SA)肿瘤(如图所示)。2G对附图。1C)。这表明肿瘤大小并不决定坏死的发展，这与临床观察的小GBMs也能发生坏死是一致的。11。虽然LN 229中确切的引起坏死的因素Taz(4SA)肿瘤仍有待确定，可见坏死的病灶被中性粒细胞浸润(如图所示)。2G)。这些中性粒细胞可能在坏死发展的早期阶段(即新坏死)中促进坏死的形成.由于中性粒细胞的耗竭不能完全消除坏死的形成(如图所示)。3A)，我们的结果不能排除其他因素，如缺血，对坏死诱导的贡献。据报道，我们使用的抗Ly6G抗体可以特异性识别中性粒细胞，但不能识别单核/巨噬细胞。31，我们不能排除一种可能的非目标效应，对驻留的免疫细胞，如小胶质细胞。因此，小胶质细胞在坏死中是否起作用是一个悬而未决的问题。然而，这些结果确实支持中性粒细胞在促进坏死的发展中发挥了显著的作用。中性粒细胞如何被招募到这些焦点仍有待解决。TAZ激活本身不可能导致中性粒细胞浸润到LN 229。Taz(4SA)肿瘤，因为在植入后第10天，这些肿瘤中没有发现中性粒细胞积聚(如图所示)。2G)。低氧诱导的肿瘤细胞炎症诱导PTEN缺乏性子宫癌小鼠模型中的中性粒细胞生成56。此外，在非肿瘤组织炎症中，已知受损/死亡细胞被动释放阻尼，例如hmb 1，它优先于其他免疫细胞吸收中性粒细胞。57。因此，这是合理的，最初的缺氧细胞死亡或炎症可能是负责中性粒细胞的招募。对Ly6G的观察+-富集CD11b高CD 45高随着肿瘤的发展，细胞数量逐渐超过其他髓系细胞(附图)。2A，b)提示，随着坏死的进展和扩大，受损/死亡的肿瘤细胞可能会吸收更多的中性粒细胞浸润到坏死的细胞中。也就是说，坏死和中性粒细胞浸润可能形成一个正反馈回路，以最大限度地放大肿瘤内坏死的形成(如图所示)。8H)。值得注意的是，本研究中的小鼠模型是免疫缺陷的，因此中性粒细胞诱导的肿瘤细胞嗜铁作用是否也在免疫功能系统中在肿瘤坏死中发挥类似的作用值得进一步研究。

为什么坏死通常发生在GBMs尚不清楚。鉴于嗜热细胞死亡是肿瘤坏死的原因，这种共性可能是由于固有的解除管制的信号与独特的肿瘤微环境相结合造成的。结果发现，MES亚型的GBMs比其他亚型有更多的坏死。52,53,54。Taz是驱动与gbm mes分化相关的基因表达程序的三种转录调节因子之一。25,58。有趣的是，激活TAZ或其类似物是相关蛋白(Yap)，能够促进典型的嗜铁下垂刺激下的嗜热细胞死亡。59,60。因此，TAZ激活可使GBM细胞对铁下垂敏感。此外，RAS-RAF-ERK信号是GBMs中最常见的激活途径之一。61。这种信号也与铁吞敏感性有关，尽管这种作用似乎是细胞型特异性的。43,62,63,64。因此，研究RAS-RAF-ERK信号激活是否也有助于GBMs的下垂是很有意义的。虽然这种解除管制的信号通路可以使GBM细胞对铁下垂敏感，但细胞内的ROS失衡是触发细胞死亡的必要条件。我们发现中性粒细胞可以引起肿瘤细胞萎缩，提示这些免疫细胞可能是触发因素。此外，坏死性GBMs中谷氨酸水平升高。65细胞外谷氨酸的积累可能引起坏死。66。值得注意的是，胞外谷氨酸的升高可通过抑制系统xc摄取胱氨酸来诱导铁吞作用。-18。因此，GBM微环境中谷氨酸含量的增加也可能引发肿瘤细胞的凋亡。

虽然中性粒细胞的抗肿瘤细胞毒性已经研究了几十年，但是在这种情况下肿瘤细胞是如何死亡的还不清楚。本研究揭示肿瘤细胞在中性粒细胞浸润到肿瘤间质时会发生嗜中性粒细胞死亡。中性粒细胞的嗜铁作用诱导似乎需要一定的激活信号，很可能是由肿瘤微环境提供的。体外研究表明，G-CSF能激活中性粒细胞诱导的肿瘤细胞毒性.因为GBM细胞能合成G-CSF67这种细胞因子可能参与激活肿瘤微环境中的中性粒细胞。此外，我们还观察了G-CSF分化的32Dcl3(小鼠细胞)和HL-60(人细胞)对肿瘤细胞的体外杀伤能力，而从非荷瘤小鼠骨髓中分离出的中性粒细胞则未见这种杀伤能力。这种差异可能是由于他们的成熟阶段(即分化)的差异。虽然中性粒细胞通常被认为是同质群体，具有明确的分子特征和保守的功能，但越来越多的证据表明，中性粒细胞是以多功能免疫表型和动态功能可塑性的异质群体存在的，主要被认为是上下文和环境依赖性的。68,69。最近的一项利用细胞流式细胞术(Cytof)的研究表明，骨髓中的粒细胞至少可以分为三个不同的亚群(已承诺的增殖性中性粒细胞前体、未成熟的中性粒细胞和成熟的中性粒细胞)，每种细胞都具有不同的增殖能力、分子特征、发育轨迹和效应功能。70。相比之下，具有杀伤能力的G-CSF分化的32Dcl3和HL-60细胞作为终末分化的中性粒细胞存在，并与具有强杀菌性的成熟中性粒细胞的分子和功能特性密切相似。37,71,72。Sagiv等人报道说成熟的中性粒细胞虽然有杀死肿瘤细胞的能力，但未成熟的中性粒细胞却没有。36。此外，并非所有成熟的中性粒细胞都具有杀伤力。只有高密度的成熟中性粒细胞才能杀伤肿瘤细胞，而低密度或不成熟的中性粒细胞(形态类似于低密度的中性粒细胞)则不能杀死肿瘤细胞。36。根据这些先前的研究，从正常生理条件下从骨髓中分离出来的中性粒细胞(即从非肿瘤动物中分离出来的)缺乏杀伤能力，因为骨髓是中性粒细胞的成熟阶段。在中性粒细胞与肿瘤细胞的相互作用中，我们发现中性粒细胞特异性颗粒被转移到肿瘤细胞中.这些颗粒含有髓过氧化物酶，这是中性粒细胞诱导铁吞所必需的。这一观察与早期发现从mpo缺乏的患者中分离出的中性粒细胞丧失细胞毒性是一致的。16。虽然还需要进一步的研究来描述含MPO的颗粒是如何转移到肿瘤细胞中的，但我们对这一现象的观察表明，中性粒细胞可能增加肿瘤细胞内某些细胞内的脂质过氧化。

坏死通常随着肿瘤的进展而发展。肿瘤坏死程度与GBM患者生存呈负相关8。目前尚不清楚坏死是肿瘤进展的一种表象，还是其侵袭性的原因。通过将GBM肿瘤坏死定义为渐近细胞死亡，我们能够实验验证这些概念。通过操纵必要的调控基因来抑制铁下垂，例如Gpx 4和ACSL 4，抑制了GBM的侵袭性，延长了荷瘤小鼠的存活时间。6B，e)。值得注意的是，本研究使用了一个包含线粒体靶向序列的Gpx 4亚型(RGPX 4)。提示细胞内Gpx 4亚型在预防铁垂病中起着重要作用。73。我们观察到rGPX 4似乎存在于胞浆中，而不局限于线粒体(附图)。6B)。非特异性定位可能是由于rGPX 4大量的线粒体蛋白转运蛋白，或者是由于rGPX 4氨基酸末端的标志-HA标记掩盖了线粒体靶向序列(见方法)。在这种情况下，标志-HA标记似乎没有中断rGPX 4函数。这与观察到gpx 4的功能不受其N端标签的影响是一致的。74。然而，rGPX 4的过度表达可能是本研究的一个局限。虽然目前尚不清楚坏死如何降低临床前和临床GBMs的整体存活率，但我们怀疑，嗜铁瘤细胞分泌促肿瘤因子和/或其他免疫细胞(如小胶质细胞)的募集和激活，可能导致某些非自治的肿瘤效应，从而诱发神经炎症(或更确切地说，“坏死性炎症”)和脑细胞因子风暴，最终导致不可逆转的脑水肿、背痛、多器官功能障碍和死亡，正如我们的GBM小鼠模型所观察到的那样。因此，当晚期肿瘤出现坏死时，通过抑制肿瘤坏死引起的后遗症，靶向性嗜酸性细胞死亡可能有利于GBM患者。

GBM患者组织学中性粒细胞定量研究

通过自然语言搜索Cerner，死者名单(n=132)世卫组织2009年至2015年在宾州好时医疗中心进行的肿瘤切除4级诊断为多形性胶质母细胞瘤。在进一步分析之前，病人的死亡是由档案上的电子病历和/或现有的公共记录确认的。在这些病人中，只有那些在病理报告中指定为“显著”或“广泛”坏死的病人，才包括在本项研究中(n=45)。病理切片和石蜡包埋块的GBM肿瘤上证实死亡的病人收集了中性粒细胞定量。为捕捉肿瘤内异质性，采用奥林巴斯CX 41显微镜PLCN 40x物镜，获取H&E染色肿瘤片上最大感兴趣区(肿瘤浸润区、界面区和坏死区)的多个明亮视野图像。肿瘤浸润区是指活的肿瘤细胞浸润正常脑实质的区域。坏死区被定义为没有活细胞。界面区是指肿瘤浸润区与邻近坏死区之间插入的区域。在每一张幻灯片上，最大的感兴趣区域被用于图像采集。在高功率(40倍)下，从其他各个领域拍摄图像，以评估每个感兴趣的区域。中性粒细胞计数由一名受过训练的研究人员在病理学家的直接监督下在所有获得的图像上进行。对于研究人员和病理学家之间中性粒细胞计数不一致的图像，用高级病理学家以盲目的方式获得的计数进行分析。利用抗人CD66b(下文进一步描述的方法)的显色免疫检测，对3名随机选择的患者进行了中性粒细胞计数的验证。用于生存分析。8g)，这一组的所有患者都包括在内(n=45)。从病理诊断之日起至死亡日期计算存活时间。将患者分为两组，从诊断的H&E染色切片中分离出坏死区的中性粒细胞计数/高功率场(如图1所示)。8C，e)。中性粒细胞增高组由绝对中性粒细胞计数/视野高于中位数(包括中位数)的患者组成；n而中性粒细胞低水平组由绝对中性粒细胞计数/视野低于中位数的病人组成(n=22)。只有现有的数据是通过审查电子病历(EMR)获得的，因此本研究没有进一步的数据收集或受试者招募。组织标本和从这一减少的队列收集的数据在图中使用。8C-e。研究程序和数据收集得到宾州机构审查委员会(IRB)的批准，并被认为是非人类主题研究。

增强后T1 MRI对GBM坏死的X线容积分析

研究对象来自宾夕法尼亚州好时神经肿瘤诊所2018年12月至2019年3月间的一组患者(包括从外部设施诊断和转诊的患者以及在此确诊的患者)，只有经组织学证实为4级恶性胶质瘤的患者才被纳入这项研究(n=75)。回顾性分析75例经病理证实的GBMs患者术前、术后轴位T1加权脂肪饱和(T1 FS)MRI图像，层厚5mm。在注射0.1mmol/kg钆后，采用1.5T或3.0T磁铁(SiemensHealthcare)，通过标准的多对比序列(包括饱和脂肪饱和TSE序列)获得MRI图像。用Philips PACS(IntelliSpacePACSEnterprise4.4)对全肿瘤和中央坏死区域进行人工追踪和测量，由一名经过训练的研究人员在一名致盲神经放射学家的监督下进行。中央坏死定义为增强肿瘤内无强化区，增强后T1加权像内边缘不规则。术前外周血中性粒细胞计数从回顾性电子病历中获得.用于生存分析。8F)，包括所有已去世的病人(n=37)。从病理诊断之日起至死亡日期计算存活时间。将患者分为两组，分别采用中位X线片所确定的坏死与肿瘤体积比值。这个N/T高比例组由坏死与肿瘤患者组成。N/T)体积比高于中位数(n=18)；N/T比率低组由病人组成N/T比率低于或包括中位数(n=19)。仅通过电子病历(EMR)和影像学研究(MRI)获得现有的数据，因此本研究没有进一步的数据收集或受试者招募。这项研究程序和数据收集得到了宾夕法尼亚州好时医疗中心的机构审查委员会(IRB)的批准。根据宾州的IRB，人类的主题研究如图所示。8B和补充图。8B-d在这份手稿中免除了知情同意的要求。

小鼠和原位异种移植瘤模型

采用6~8周龄雌性无胸腺裸鼠(Nu(NCR)-Foxn1nu株编码：490，Charles River)建立GBM异种移植小鼠模型。在肿瘤发生实验中，首次将表达萤火虫荧光素酶的逆转录病毒载体导入人GBM细胞。然后用逆转录病毒或慢病毒载体转导这些细胞，表达所指示的shRNAs或互补DNA(CDNAs)。每只老鼠3×105细胞在(+1，+2，-3)处注入右半球。用生物发光法监测脑肿瘤生长。简单地说，用异氟醚麻醉小鼠。将1.875 mg荧光素溶解在125μ1的磷酸盐缓冲液中，15 mg/ml腹腔注射于小鼠体内。10分钟后，将小鼠置于活体成像系统(IVIS)成像室(Xenogen，Alameda，CA)，以灵敏度最高的摄像机拍摄1 min。用LivingImage软件(Xengen)对脑区发射的光子进行定量。荧光素酶活性以每秒发射的光子来测量。在肿瘤标本制备和组织学方面，用4%中性缓冲福尔马林固定肿瘤组织，石蜡包埋，交宾夕法尼亚州立医学院比较医学组织学核心，切成5μ厚的部分，用苏木精和伊红(H&E)染色。用ImageJ手动追踪和测量肿瘤面积和中央坏死面积，量化坏死与肿瘤的比率。所有动物都被安置在一个12小时光/暗循环的房间里，可以自由获得标准的啮齿类食物，在环境温度下保持在18到23摄氏度之间，湿度在40%-60%之间。本研究中所描述的所有实验都是在宾夕法尼亚州立大学动物保护和使用委员会的批准下并按照其指导方针进行的。

坏死与肿瘤比率的定量研究

采用石蜡包埋、H&E染色对上述异种移植小鼠模型中GBM坏死肿瘤比率进行了定量研究。H&E染色将坏死(N)定义为肿瘤内的脱细胞区(呈淡粉红色)，而细胞肿瘤(CT)区域被定义为超细胞区。使用ImageJ中的徒手工具手动跟踪和测量感兴趣区域。由于坏死区在肿瘤内部不均匀分布，同一肿瘤不同部位的坏死与肿瘤比率可能存在显著差异。为了提高定量的准确性，采用3~4步切片(每隔50μ)对同一肿瘤的坏死与肿瘤面积比进行比较，并以这些比值的平均值来表示每个肿瘤(每只荷瘤动物)。

细胞

人GBM细胞株：LN 229(CRL-2611)，U87MG(HTB-14)，LN 18(CRL-2610)，小鼠骨髓母细胞株32D克隆3(CR-11346)，人早幼粒细胞白血病细胞系HL-60(CCL-240)。人胶质母细胞瘤细胞在Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(DMEM；10-013-CV，Corning)中加入10%胎牛血清(fbs；gibco，10437028)和1%抗生素-抗真菌液(30-004-CI，Corning)，37℃加5%CO。2。32D克隆3细胞在Roswell Park纪念研究所(RPMI)1640(10-040-CV，Corning)中培养，加入10%FBS和1%抗生素-抗真菌液，加5ng/ml小鼠白细胞介素-3(IL-3)培养液(CB 40040，热Fisher)。用RPMI 1640加20%FBS和1%抗生素-抗真菌液培养hl-60细胞。将32D克隆3细胞分化为中性粒细胞的方案是从先前描述的协议中改编而来的。37。简略，2×105细胞/毫升在55厘米内播种2上述培养液含100 ng/ml重组人粒细胞集落刺激因子(RHG-CSF；214-CS，R&D)，培养14d。将HL-60细胞分化为中性粒细胞的方案是从先前描述的协议中改编而来的。71,75,76。在RPMI 1640中加入10%FBS、1%抗生素-抗真菌液、1μM ALL-反式-维甲酸(Arta；R 2625，Sigma)和30 ng RHG-CSF，作用21天。32d无性系3和HL-60细胞均加入1-2ml新鲜全培养基，每3天加入上述分化因子，调节细胞密度，使细胞密度保持在2×10之间。5和1×106细胞/ml；检测细胞活力和形态学变化。流式细胞术检测HL-60细胞32D克隆3和CD66b(详见抗体部分)Ly6G的表达。这些细胞系均未列入ICLAC和NCBI生物样品维护的错误识别细胞系数据库中。本研究未对这些细胞系进行鉴定。所有细胞系均确认为支原体实验前是阴性的。除非另有说明，细胞生长到50%汇合。在复合处理实验中，细胞(单细胞培养和共培养)在不含RHG-CSF或Arta的中性粒细胞完全生长培养基中播种。

中性粒细胞分离(脑、骨髓和脾脏)

根据该机构动物保护委员会批准的协议，用二氧化碳和颈椎脱位对小鼠进行安乐死。为分离肿瘤相关中性粒细胞，取小鼠颅内肿瘤，用无菌Dulbecco‘s磷酸盐缓冲液冲洗三次(DPBS；21-030-CVR，Corning).肿瘤组织(100~200 mg)被完全切割。用含Hanks平衡盐溶液(HBSS；21-022-CV，Corning)的15毫升锥形管与0.1mg/ml IV型胶原酶(C 5138，Sigma)和0.1mg/ml透明质酸酶(H 6254，Sigma)在37℃下孵育15 min。加入2%的FBS/HBSS混合液，停止消化。细胞在1000 rpm(110×g；St-40离心机，热Fisher)下离心5 min，用2%FBS/HBSS混合液洗涤两次，完全去除消化酶，然后用无菌的40μm尼龙网滤器(22-363-547)过滤。从非荷瘤小鼠骨髓和脾脏中分离中性粒细胞是根据先前描述的方案进行的。77,78。骨髓提取用400×离心法从小鼠的一个股骨和一个胫骨中分离出细胞。g骨骺切开术后4°C时间7 min。脾中性粒细胞分离，取小鼠全脾各取1份。用胰岛素注射器击打40μm尼龙网状网细胞过滤器，在培养皿上用胰岛素注射器压榨脾细胞，使细胞解离。用红血球溶解缓冲液(11814389001，Sigma)溶解肿瘤、骨髓和脾单细胞悬液中的红细胞，用2%FBS洗涤3次，用台盼蓝负载，用自动细胞计数器计数，再用2%FBS在DPBS中进行免疫磁选择或流式细胞术。用细胞核酸荧光染料Sytox-Green(热Fisher)进行流式细胞术检测细胞活力。活力百分比绘制为Sytox-Green。-用常规培养得到的LN 229亲本细胞作为阴性对照，从单个细胞中分离出细胞。

免疫磁选择与免疫图谱通孔流式细胞术

用小鼠中性粒细胞分离试剂盒(130-097-658，Miltenyi Biotec)，对肿瘤、脾脏和骨髓中的小鼠中性粒细胞进行免疫磁选。简单地说，在上述细胞解离后，单悬活细胞首先被纯化的大鼠抗小鼠CD 16/32 FC受体阻滞(553141，BD生物科学)阻断，然后进行抗体标记。免疫磁选择用生物素偶联抗小鼠Ly6G标记分离细胞，用抗生物素微球和MS柱(130~042~201，Miltenyi Biotec)进行阳性磁选择。经流式细胞术鉴定，中性粒细胞总数的纯度一般大于90%。用细胞核酸荧光染料Sytox-Green(热Fisher)流式细胞仪检测免疫分离中性粒细胞的活力。活力百分比绘制为Sytox-Green。-用常规培养得到的LN 229亲本细胞作为阴性对照，从单个细胞中分离出细胞。对于流式细胞术，活单细胞悬液浓度为1×10。6从新鲜肿瘤组织中提取的细胞/ml，先用抗小鼠CD 16/32 Fc受体阻滞，然后在室温下表面标记抗CD 45(克隆30-F11)、抗CD11b(克隆M1/70)和抗Ly6G(克隆1A8)抗体20 min。抗体使用的详细信息见下面的抗体部分。然后，细胞被洗三次，再悬浮在1毫升的DPBS中，并在宾州州立医学院的流式细胞术核心的LSRFortessa(BD生物科学)细胞分析仪上运行。

Ly6G介导的中性粒细胞耗竭

稳定表达TAZ的LN 229异种移植瘤4SA如上文所述。植入后2周行生物发光显像(BLI)，以确定肿瘤生长的部位。然后根据BLI读数随机分为两组，一组接受单克隆Ly6G抗体，另一组接受同类型对照。为了在坏死形成前开始消耗中性粒细胞，小鼠腹腔注射50克英维沃加大鼠抗小鼠Ly6G，克隆1A8(BE0075-1，BioXcell)或英维沃另加大鼠IgG2a亚型对照，克隆2A3(BE0089，BioXcell)，每3天接种100 lDPBS，从植入后2周开始。从植入后3周开始，从植入后4周开始，每2天注射一次消耗抗体或同工型对照。通过外周血涂片和全肿瘤组织流式细胞术监测中性粒细胞耗竭的效果。

利用发光法测定细胞活力

稳定表达TAZ的人GBM细胞(LN 229)4SA在96孔平底板中单独接种3000个细胞，或与中性粒细胞以1：20比例重复培养，37°C孵育15h，在共培养结束时，用荧光素酶分析系统(E 1500，Promega)测定细胞活力。简单地说，细胞用DPBS清洗一次，溶解，并在通过多模式平板阅读器(BmgLabTech)进行发光测量之前，给予溶解在培养基中的D-萤火虫荧光素钾盐(D-萤火虫荧光素钾盐)。用肿瘤细胞单细胞培养的发光法建立基线读数。所有读数在重复井之间平均。将共培养井的空白减影发光归一化为肿瘤细胞单细胞培养，计算存活率。在所有的复合治疗实验中，以相同浓度的同一化合物处理的肿瘤细胞单细胞培养作为正常对照(100%成活率)。

集落形成试验

嗜中性粒细胞共培养后进行集落形成实验，以评估肿瘤的克隆性生存。27。LN 229细胞稳定表达TAZ4SAGFP用DPBS清洗一次，胰蛋白酶化后，与小鼠(32D克隆3)或人(HL-60)中性粒细胞(HL-60)共培养48 h后，在宾夕法尼亚州立医学院流式细胞术核心的FACSAria SORP高效细胞分选器(BD生物科学)中进行荧光活化细胞分选(FACS)，结果表明：GFP与小鼠(32D克隆3)或人(HL-60)中性粒细胞共培养48 h，在全中性粒细胞生长培养基中以1：-5比5的比例培养。分类后，400 GFP+肿瘤细胞接种于6孔板的每口完整培养基中，培养10~12d。然后用PBS洗盘子，用结晶紫染色(6101，ENG科学公司)以观察菌落。用ImageJ对集落图像进行扫描和量化。其次，为了评估含有细胞内中性粒含量的肿瘤细胞的活力，在与gfp共培养前，用亲脂性pkh 26红荧光细胞连接染料(pkh26g1-1kT，Sigma)标记小鼠中性粒细胞(32d克隆3)。+塔兹4SA-如上文所述，表达肿瘤细胞。在上述共培养和细胞分选后，将400个绿色荧光和红色荧光双阳性的肿瘤细胞与相同共培养条件下的绿色肿瘤细胞进行共培养，然后进行上述集落形成培养。

细胞活力测定通孔核酸荧光染料

MCherry-表达LN 229Taz(4SA)肿瘤细胞接种于12孔平底板中，密度为50,000个肿瘤细胞/孔，或与未标记的中性粒细胞以1：5比例重复培养，37°C孵育，2天共培养后，细胞被负载活细胞-不渗透核酸染色，Sytox-Green(S 34680，热Fisher)或Sytox-Blue(S 34857，热Fisher)，作为死亡细胞的指标，通过流式细胞仪测定细胞活力。简单地说，在共培养结束时，细胞被收获，用浓度为1×10的冷DPBS洗涤三次。6细胞/毫升，用赛托克斯-绿色或蓝色标记的稀释度为1至1000。标记细胞混合物在室温下孵育20 min，用蓝488 nm激光(Sytox-Green)或紫罗兰405 nm激光(Sytox-Blue)进行流式细胞分析。成活率是以樱桃的百分比来表示的。高LN 229中Sytox-Blue信号在每种条件下的细胞门控Taz(4SA)肿瘤细胞单独培养(100%)。PKH细胞活力比较高-和库尔德工人党低/--LN 229Taz(4SA)ZsGreen表达LN 229细胞Taz(4SA)细胞单独接种或与嗜中性粒细胞共培养，前标记为亲脂PKH 26红荧光细胞链接染料，如上文所述。共培养后，细胞被负载活细胞抗渗核酸染色，Sytox-Blue，如前所述，以检查细胞的活力。所有流式细胞术分析采用LSRFortessa(BD生物科学)细胞分析仪在宾夕法尼亚州立医学院流式细胞术核心进行，并使用Flowjo软件V10(BD生物科学)进行分析。

免疫沉淀和免疫印迹

对于标记介导的免疫共沉淀，3×106将标记蛋白标记的细胞在10 cm平板中接种10 cm，用RIPA缓冲液(50 mm Tris，pH7.5,150 mm NaCl，4mm EDTA，1 mm EGTA，1%Triton X-100，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，10%甘油，1x磷酸酶抑制剂(Roche)和1x蛋白酶抑制剂(Roche))溶解。细胞裂解液在4°C下用反标志M2亲和凝胶(Sigma)孵育2h，用RIPA缓冲液洗涤3次，用3xFLAG肽(Sigma#F 4799)洗脱，溶解于TBS(10 mm Tris HCl，150 mm NaCl，pH 7.4)中。免疫印迹如下27。细胞在SDS裂解缓冲液(10 mm Tris pH7.5，1%SDS，50 mm NaF，1 mm Na)中溶解。3Vo4)进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，在4-12%双-三-三-十二烷基硫酸钠凝胶(Invitrogen)上，转移到固定化-P膜(微孔)上.隔膜(5%脱脂乳/TBST(0.1%吐温，10 mm Tris，pH7.6,100 mm NaCl)在室温下孵育1h，与5%牛血清白蛋白(BSA)/TBST稀释的初级抗体在4°C过夜，3次洗涤后，与山羊抗兔HRP-结合抗体或山羊抗HRP-结合抗体(7074S和7076S，细胞信号传递技术；1：5000)在室温下孵育2h，用ECL(1856136，皮尔斯)进行化学发光。

免疫荧光染色及显色免疫检测

免疫荧光染色如下27。对组织学标本，石蜡包埋5-μm切片在连续的二甲苯和乙醇(100%、95%、70%和50%)中分离和再水化，然后在10 mm柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)中进行热诱导(95°C)表位检索。室温下用5%BSA/PBS阻断1h后，在4℃下用2.5%BSA/0.05%TritonX-100/PBS稀释原抗体，隔夜孵育。第二天，用0.1%TritonX-100/PBS冲洗3次，然后用2.5%BSA/0.05%TritonX-100/PBS稀释的二次抗体在室温下孵育60~90 min。再用0.1%TritonX-100/PBS洗涤3次，用4，6-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI)标记，用PBS冲洗，装在延长金防锈剂(P 10144，Invitrogen)中。用抗兔HRP-民建联细胞及组织染色试剂盒(CTS 005，R&D)对组织标本进行染色免疫检测。除另有规定外，所有初级抗体均在1至100浓度稀释，所有次级抗体在1至200浓度下稀释。

PKH 26/MPO点状定量及免疫细胞化学(ICC)

ZsGreen-表达LN 229Taz(4SA)肿瘤细胞(16,000/孔)分别单独或与上述亲脂PKH 26红荧光细胞连接染料标记的中性粒细胞在37°C下共培养48h。共培养后用DPBS洗涤一次，室温下用4%多聚甲醛固定20 min，在渗透缓冲液(PDT：0.3%去氧胆酸钠，0.3%TritonX-100，PBS)中孵育30 min。随后，在4℃下，用抗小鼠髓过氧化物酶(MPO)抗体(详见抗体部分)染色，用二次抗体孵育，用DAPI标记，并按上述方式安装。除另有规定外，所有初级抗体均在1至100浓度稀释，所有次级抗体在1至200浓度下稀释。染色细胞在0.5m时沿z-宾夕法尼亚州立医学院光镜中心Leica SP 8倒置共焦激光扫描显微镜的轴线。用405 nm半导体激光器和488、561和633 nm氩激光器进行了光学激发。图像以最大强度叠加，用ImageJ 1.50进行合并，荧光点点用图像中的分析粒子函数进行量化。用GFP通道勾画肿瘤细胞，仅对位于肿瘤细胞内的点状(PKH 26和MPO)进行定量。为了检验肿瘤细胞内MPO点状形成是否需要细胞与细胞的直接接触，Ln 229。Taz(4SA)肿瘤细胞被播种在24孔平底板中，如上文所述。取小鼠(32Dcl 3)或人(HL-60)中性粒细胞衍生条件培养液(CM)，分别于培养2天的32Dcl 3或HL-60单细胞培养，培养细胞数为对照组的9倍。CM收集后，从32dcl 3或hl-60单细胞培养得到的上清液首先在110×离心。g(St-40，热Fisher)去除细胞碎片4分钟，加入LN 229之前，先在新鲜培养基中稀释1：2。Taz(4SA)肿瘤细胞在结缔组织上预先播种。在我们的第二种方法中，zsGreen表达ln 229。Taz(4SA)在共培养前一天，将肿瘤细胞接种在眼镜蛇舌上。第二天，将分化的小鼠(32Dcl3)或人(HL-60)中性粒细胞(HL-60)接种于含有或不含细胞渗透的0.4 m孔径的聚对苯二甲酸聚对苯二甲酸乙二醇酯(EMD)悬浮细胞培养的24孔板中。细胞共培养两天后，如上述ICC程序所示，用抗人/鼠MPO染色。染色细胞用奥林巴斯CX 41显微镜PLCN40x成像，并通过ImageJ对其进行定量分析。

免疫荧光IHC对内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的定量研究

免疫荧光染色在石蜡包埋5-μm脑肿瘤切片上进行了上述描述.内皮细胞分析用CD 31作为内皮标记物。图像采集在IHC后1~3天内，使用奥林巴斯CX 41显微镜PLCN20x目标覆盖整个切片。在显微镜软件上使用自动照相功能对图像进行拼接。然后将拼接后的全断面图像转换为灰度8位图像，用ImageJ中的分析粒子函数进行阈值化和量化。数据被绘制为CD 31的总数。+细胞面积归一化为每个野区(即肿瘤内与非肿瘤实质)。DAPI图像用于鉴别肿瘤内实质与非肿瘤实质。星形胶质细胞分析以GFAP作为星形胶质细胞的标记物。由于GFAP信号的瘤内异质性，为了避免选择偏差，在其它高功率场(40倍目标)中，从GFAP信号强度最高的区域(细胞肿瘤边缘)采集肿瘤内图像，对感兴趣区域进行间接评价。非肿瘤实质GFAP信号基本均匀，所有非肿瘤实质的图像均来自非肿瘤半球的皮层。小胶质细胞分析以TMEM 119为标记物。由于TMEM 119信号的瘤内异质性和避免选择偏差，在其他高功率场(40x目标)下，从TMEM 119信号强度最高的区域(每个肿瘤内坏死区)采集肿瘤内图像，以间接评价感兴趣区域。非肿瘤实质TMEM 119信号基本均匀，所有非肿瘤实质图像均来自非肿瘤半球的皮层。在利用ImageJ进行阈值化和粒子分析之前，首先将所有图像转换为灰度8位图像。相应的DAPI图像再次用于鉴别肿瘤内和非肿瘤实质，并对每幅图像中的野面积进行量化。数据被绘制为GFAP总数的数字。+或TMEM 119+单元对象归一化为每个图像字段区域。

原位LiperFluo染料负载

为了检测活肿瘤组织中脂质过氧化物的积累，按照制造商的指示(L 248-10，Dojindo分子技术公司)进行了原位Liperfluo染料加载。简单地说，如上文所述，安乐死后，大脑被切除，迅速安装在振动体上(Vibratome 1000，IMEB公司)，并迅速淹没在4°C氧合Krebs溶液中进行切片。将荷瘤脑组织切片成300μm切片，放置于30°C氧合克雷布斯溶液的容器中，直至LiperFluo染料加载。在Krebs溶液中浸入LiperFluo(悬浮在DMSO中，终浓度为10μM)，在37°C的24个多井板上使用自由浮动免疫标记法加载4 h，偶有轻微的震动。染色标记后，切片在DPBS中洗三次，室温下在黑暗中轻轻摇动，然后放置在镜片上。然后用2%多聚甲醛固定脑片，用DAPI标记进行核显影。

BODIPY-C11和CM-H2DCFDA检测细胞内脂质过氧化物和活性氧

用BODIPY 581/591 C11(D 3861，热Fisher科学)检测细胞内脂质过氧化物，CM-H2DCFDA(C 6827，分子探针，Invitrogen)检测细胞内ROS。为了鉴定细胞(即肿瘤与免疫细胞)细胞内脂质过氧化物和活性氧积累的类型，从新鲜脑肿瘤组织中制备的单细胞悬液首先用抗CD 45(克隆30-F11)标记，然后在含有5μM BODIPY 581/591 C11或2μM CM-H2DCFDA的1 ml HBSS中进行偶发振荡培养15 min。在表面标记和染料加载后，用DPBS洗涤3次，再悬浮于200μl新鲜HBSS中，然后立即使用宾州州立医学院流式细胞术核心设备的BD LSRFortessa(BD生物科学)仪进行分析。

透射电镜

将上述模型小鼠脑肿瘤组织解剖，用冷PBS冲洗一次，于4℃下立即用含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛(pH 7.3)的半强度Karnovsky固定液固定。体外共培养8×105稳定表达TAZ的LN 229肿瘤细胞4SA分别于37°C与体外分化的小鼠中性粒细胞(32D克隆3)或人中性粒细胞(HL-60)共培养1~10小时，于37°C下接种60×15 mm Permanox培养皿(Nalge Nunc International)，共培养12 h。细胞用温热的PBS洗两次，用Karnovsky固定剂固定在室温下1小时。固定后，将样品送至透射电镜核心进行加工。简单地说，样品在0.1M氯化钠缓冲液(pH7.4)中加入1%四氧化锇溶液固定1h，用分级乙醇系列脱水，然后加入丙酮并嵌入LX-112(Ladd Research，Williston，VT)。在JEOL JEM 1400透射电子显微镜(JEOL USA Inc.，Peabody，MA)上，用醋酸铀酰和柠檬酸铅对薄层(60 Nm)进行染色。

人细胞因子阵列

根据制造商的指示(b 133998，ABCAM)，使用基于ELISA的80靶标细胞因子阵列试剂盒(Ab133998)进行了人细胞因子的无偏筛选。简单地说，我们从LN 229中解剖出了整个肿瘤组织。矢量和LN 229Taz(4SA)荷瘤小鼠在到达终点后，通过组织匀浆器在裂解缓冲液(试剂盒中提供)中进行匀浆。所有样品的总溶出蛋白浓度首先用BCA法进行量化，并按照制造商的推荐进行稀释。对每个样品，每个阵列膜使用200微克总蛋白在1毫升阻断缓冲液(在试剂盒中提供)。

抗体、试剂、化合物

流式细胞术抗体：抗小鼠CD11b(101205，Biolegend，稀释1/100)，PE抗小鼠CD 45(103105，Biolegend，稀释1/100)，bv 421大鼠抗小鼠CD 45(563890，BD生物科学，稀释1/100)，抗小鼠CD 16/32 fc受体阻滞(CAT#553141，地段9060742，BD生物科学，0.25μg/10)。6)。

IHC、ICC和发色免疫检测抗体：超纯化大鼠Ly-6G(1a8,127620，biolegend)，兔抗小鼠/人髓过氧化物酶(ab9535，abcamm)，抗小鼠/人ptgs 2(克隆H-3，sc-376861，Santa Cruz)，抗小鼠/人COX 2(D5h5)xp(CAT#12282 S，lot#5，cell信号技术)，小鼠抗人CEACAM 8/CD66b(g10F5，Novus biologals)，兔抗谷胱甘肽过氧化物酶4，gpx 4(ab125066，Abcamm)，N-herin(13-A9，sc-59987，Cruz Cruz技术)，抗生物粘附素(ccad-cad 8/cd66b，g10f5，Novus biologals)，兔抗谷胱甘肽过氧化物酶4，gpx 4(ab125066，abCAM)，N-herin(13-A9，细胞信号技术)，兔抗人/鼠GFAP(D1F4Q，12389S，细胞信号技术)，兔抗小鼠TMEM 119(28-3，ab 209064，ABCAM)和小鼠抗HA.11(16B12，MMS-101 R，Biolegend)。对于IHC和ICC，所有的原始抗体在1/100稀释时使用，次级抗体在1/200稀释时使用)。

免疫印迹抗体小鼠抗人纤维连接蛋白(EP5)克隆；圣克鲁兹，sc-8422，稀释1/5000)，兔抗人CD 44(b 157107，Abcamm，稀释度1/10，)，兔抗人CTGF(86641，细胞信号技术，稀释1/5000)，小鼠抗β-actin(3700，细胞信号技术，稀释1/20，稀释)，Gpx 4(克隆E-12，sc-166570，圣克鲁兹，稀释1/1000)，TAZ(V 386,4883S，细胞信号技术，稀释1/1000)，抗人ACSL 4(F-4，sc-365230，圣克鲁斯生物技术，稀释1/1000)，抗小鼠/人MPO(ab9535，ABCAM，稀释1/1000)，抗人MPO(E1E7I，14569，细胞信号技术，稀释度1/1000)，抗人GAPDH(0411，sc-47724，圣克鲁斯生物技术，稀释1/5000)，山羊抗兔HRP结合抗体(7074S，细胞信号传导技术，稀释1/5000)，山羊抗鼠HRP结合抗体(7076S，细胞信号传导技术，稀释1/5000)。

抑制剂筛选用的化合物和最终浓度：Z-VAD-fmk(HY-16658，MedChem Express，25 M)，坏死抑素-1(11658，开曼化学品，30 M)，GSK‘872(530389，EMD，15 M)，奈克磺酰胺(20844，开曼化学品，1 M)，Ferrostatin-1(SML 0583，Sigma，2 M)，Liproxstatin-1(SML 1414，Sigma，0.2 M)，N-乙酰半胱氨酸(A 7250，Sigma，5mm)，甲磺酸去氧胺盐(D 9533，Sigma，0.1-0.2mm)，PF06282999(PZ-0375，Sigma2M)，4-氨基苯肼，4-Abah(103200050，Acros Organics，2M)。以上所有化合物，除N-乙酰半胱氨酸(仅溶于水)，在细胞处理前溶解于2-氧戊二酸二甲酯(DMSO；349631，Sigma)。

基因表达与沉默

宝贝-新的-塔兹(4SA)26由坤良关博士慷慨资助。宝贝-新的-塔兹(4SA-S51A)是利用快速诱变试剂盒(Stratagene)进行定点诱变产生的。MGC人Gpx 4序列验证的cdna(mhs 6278-202801819)是从dharmacon获得的，并被亚克隆到pBabe-puro载体上，在氨基酸末端带有标志-HA-标记，以生成pBabe-puro-标志-HA-Gpx 4。编码靶向shRNAs的慢病毒载体ACSL 4(#41：TRCN0000045541；#42：TRCN0000045542)ACSL 4LN 229击倒Taz(4SA)。编码靶向小鼠的shRNAs的慢病毒载体MPO(什-MPO#45：TRCN0000076745；Sh-MPO#46：TRCN0000076746)和人类MPO(什-MPO#03：TRCN0000046003；(Sh-MPO#04：使用TRCN0000046004)生成MPO在分化的小鼠(32Dcl3)或人(HL-60)中性粒细胞样细胞中被击倒。在培养基中稀释2 g/ml普罗霉素，筛选出所有表达shRNA的阳性克隆。培养阳性克隆，并在含有2μg/ml普罗霉素的分化培养基中进行扩增(如前所述)。筛选后每周对阳性无性系进行一次Westernblotting验证。所有的shRNA都来自宾州shRNA库的核心设施。

基因表达数据集分析

GBM基因表达数据集已从常春藤成釉细胞瘤Atlas项目下载(Https://glioblastoma.alleninstitute.org/)。对肿瘤坏死区(PNZ)与细胞肿瘤区(CT)差异表达的基因，直接通过网站进行比较。对于独创性路径分析，1.5倍和P < 0.05 were used as the cutoffs for differentially expressed genes. Indirect relationships were chosen. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) was performed using GSEA 4.0 software provided by the Broad Institute (Http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)。用于分析的基因集是通过调查已发表的研究而产生的，这些研究显示了与铁下垂有关的基因。19,20。根据这些基因的参考文献，将这些基因分为促下垂(正向作用)基因和抑制(负向作用)基因。