Ar18b和BORC介导的溶酶体贩运促进辐射后癌细胞的侵袭

侵袭性增强是转移和预后不良的一个关键因素，在包括放射治疗在内的癌症治疗后的癌细胞中已经被观察到。在这里，我们证明辐射存活癌细胞的侵袭性与溶酶体外吞作用的改变有关，这是由于Ar18b的激活增强而引起的，Ar18b是一种调节溶酶体贩运的小GTPase。通过调节BORC-亚基，增强了Arl8b与其效应因子Skip的结合。Ar18b或BORC亚基的敲除可降低溶酶体外吞和辐射存活细胞的侵袭力。值得注意的是，高表达的ARL8BBORC亚基基因与乳腺癌患者预后不良密切相关。SP1是一种ATM调控的转录因子，辐射后可增加BORC亚基基因的表达.体内实验表明，Ar18b的消融降低了IR诱导的侵袭性肿瘤生长和远处转移。这些发现提示BORC-Arl8b介导的溶酶体贩运是通过抑制侵袭性肿瘤生长和转移而改善放射治疗的靶点。

癌细胞侵袭性与转移潜能有关。1，导致癌症患者预后不良。2。以前的研究表明，在癌症治疗(如化疗)后，癌细胞的侵袭性会增强。3，靶向治疗4、放射治疗5,6,7。这些治疗后，侵袭力的增加可能会导致抗药性和复发。8,9。然而，这些治疗后癌细胞获得侵袭性的潜在分子机制尚未完全阐明。因此，找出治疗后存活癌细胞侵袭性增强的关键分子机制，为提高治疗效果提供了一个新的靶点。

肿瘤的侵袭与分泌蛋白酶的形成和基质降解有关，从而导致微环境的重塑。10,11,12,13。我们先前的研究表明，乳腺癌细胞通过分泌纤维连接蛋白来重建其细胞外基质(ECM)，以帮助他们在电离辐射(IR)治疗后存活。14。此外，通过三维培养的富层粘连蛋白细胞外基质(Lrecm)导管原位癌模型，我们发现在IR治疗后存活的原位癌细胞以浸润性表型出现，并呈现上调的α5β1-整合素表达和纤维连接蛋白和基质金属蛋白酶9分泌。5。IR可以通过溶酶体相关蛋白(如组织蛋白和基质金属蛋白酶)改变肿瘤的微环境，这些蛋白是由癌细胞分泌的。8,15.

我们和其他人已经证明，囊泡的贩运，包括内吞，再循环，以及蛋白质和细胞器的外吞作用，在肿瘤的侵袭中起着至关重要的作用。16,17,18,19。与此相一致，最近的研究强调了溶酶体在肿瘤生物学中的重要作用。20。除了溶酶体作为降解细胞器的众所周知的功能外，它们还参与许多其他的细胞过程，包括细胞粘附、肿瘤侵袭和转移。20。这些过程在一定程度上受到溶酶体向微管负端或微管+端贩运的调控。21。溶酶体与质膜对接并融合，然后释放其内容物。22，包括蛋白质水解酶，如组织蛋白酶或基质金属蛋白酶，进入细胞外空间，导致ECM重塑和癌细胞侵袭。23。最近的一项研究通过观察细胞浸润性突起的形成，提供了溶酶体外吞与细胞侵袭之间密切关系的直接证据。[医]线虫锚细胞24.

Arf样小gtpase ar18b被认为是溶酶体定位的关键调节因子。25。与ARL家族的其他成员一样，Arl8b在不活跃的(GDP结合的)胞质构象和活性的(GTP结合的)膜结合构象之间循环。Arl8b的活性形式主要定位于溶酶体，在溶酶体中调节溶酶体向细胞边缘的贩运。25。在溶酶体的转运过程中，arl8b的活性形式介导效应蛋白siifa和激酶相互作用蛋白(skip，也称为plekhm 2)的膜再生，这反过来又促进下游事件，将溶酶体与动蛋白1连接起来。25,26。溶酶体相关细胞器复合体1(第1组)相关复合物(BORC)的生物发生是激活Ar18b/Skip促进溶酶体转运的必要条件。27。BORC由几个亚基组成，包括BLOS 1、BLOS 2、Myrlysin(LOH12CR1)和其他，它们介导Arl8b/Skip向kinesin的招募，随后复合物促进溶酶体向细胞边缘的转运。27,28。因此，溶酶体从微管组织中心向细胞边缘的顺行贩运受到borc/arl8b/kip复合体的调控，该复合体被招募到kinesin家族成员。21.

红外辐射通过激活调节特定基因表达的转录因子而诱导一系列细胞过程。29。转录因子是由dna损伤传感器蛋白(如atm)、atm和Rad3相关蛋白(Atr)和dna依赖蛋白激酶(Dna Pk)在IR诱导的dna损伤后激活的。29。Sp1是一种转录因子，据报道是以atm依赖的方式激活的。30,31。而Sp1的激活可以调节与癌症进展相关的基因的表达。32,33，Sp1在溶酶体活化中的作用尚未见报道。

在此，我们发现Ar18b依赖的溶酶体外吞作用在增强IR后细胞的侵袭力中起着关键作用。通过用溶酶体抑制剂阻断溶酶体，可以抑制IR诱导的侵袭性.IR刺激可使溶酶体分布于细胞周围，并伴有溶酶体外吞增加。IR-存活(IR-S)细胞溶酶体组分Ar18b增加。Ar18b基因敲除可降低IR依赖的溶酶体外吞和侵袭。此外，我们还发现，在IR处理后，由BORC介导的Arl8b与跳跃的结合增强。此外，Sp1的激活增强了IR后BORC-亚基的转录。最后，Ar18b沉默抑制小鼠移植瘤模型中IR-S细胞的生长和远处转移。我们的发现提出了一种新的机制，通过这种机制可以增强放疗后癌细胞的侵袭力，并为提高肿瘤治疗水平提供一种治疗策略。

溶酶体参与IR-S癌细胞的侵袭

IR后癌细胞存活的侵袭性增强5。近来，溶酶体被认为与癌细胞的侵袭性有关。20。为探讨溶酶体是否参与了IR-S细胞的增强侵袭作用，我们用溶酶体抑制剂巴非来霉素A1(BafA1；4 NM)或氯喹(CQ；30μM)作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-231和Hs578T进行了12 h的侵袭实验。抑制剂抑制IR诱导的两种细胞系的侵袭力增加(图一)。1A，b)但在侵袭试验中不影响细胞活力(附图)。1A，b)。为证实抑制剂对溶酶体形态的影响，采用溶酶体标记物LysoTracker Red DND-99和溶酶体相关膜蛋白1(LAMP 1)(补充图1)对溶酶体进行染色。1C)。在这些抑制剂处理的细胞中发现有异常的溶酶体结构，而在对照细胞中则没有。与对照细胞的溶酶体相比，baf A1或cq处理后细胞内的溶酶体膜边缘不清，呈膨胀状，提示溶酶体功能障碍。34,35。这些数据表明溶酶体在增强IR-S乳腺癌细胞的侵袭中起着重要作用。

溶酶体胞外增生症和定位与癌细胞侵袭有关。23,24。为探讨溶酶体外吞在IR-S细胞中的作用，我们用右旋糖酐-488(补充图)评价了溶酶体外吞作用。2A)，主要积累在溶酶体中。36,37。用葡聚糖-488孵育细胞3h，用无葡聚糖培养基代替培养液(见“方法”和附图)。2B)。我们测定了培养液中分泌的葡聚糖-488的荧光，发现IR-S、MDA-MB-231细胞的荧光强度明显高于未处理细胞(图1)。1C)。我们证实右旋糖酐-488摄取在右旋糖酐治疗后3h内不受IR的影响(附图)。2C)。在此实验中，IR对细胞活力没有影响(补充图)。二维空间)。溶酶体通过胞吐作用与质膜融合22。因此，我们通过检测细胞表面的LAMP 1来测量细胞外吞量。38。IR处理可显著增加MDA-MB-231细胞表面LAMP 1的暴露量。1D，e)，与葡聚糖-488释放数据一致(如图所示)。1C)。这些数据表明，在IR-S，MDA-MB-231细胞中溶酶体外吞作用增强.

顺行溶酶体贩运是溶酶体外生所必需的。21。为了进一步阐明溶酶体外吞作用在IR-S细胞中的作用机制，我们用免疫荧光技术分析了溶酶体的胞浆分布。在IR处理的细胞中LAMP 1染色更多的是弥漫性和周围性(图)。1F)。相反，未处理细胞的溶酶体有更多的核周分布(图)。1F)。IR治疗不影响LAMP 1的表达。1g)。然后，我们量化了溶酶体的分布，与以前用来测量线粒体分布的方法相同。17(无花果)氢结果发现，在IR-S细胞中溶酶体的分布明显向细胞边缘方向移动(如图所示)。1I，j)。另一方面，IR治疗对溶酶体的大小和数量没有明显影响(补充图)。2E).

与基础亚型乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和Hs578T)相一致，A型乳腺癌细胞株MCF-7的侵袭性增强，伴随着周围溶酶体分布的增加(见图)。1K-n和补充图。2F)。这些结果表明，溶酶体向细胞边缘的顺行贩运至少部分地促进了溶酶体的胞体外吐作用。

Ar18b增强溶酶体外吞和侵袭性

顺行溶酶体贩运受Ar18b活化调控。26。为了确定Ar18b是否参与了IR-S细胞溶酶体外吞作用的增强，我们首先测定了溶酶体组分中Ar18b的含量。IR-S、MDA-MB-231细胞的溶酶体组分Ar18b较未处理细胞增加(图1)。2A)，但Arl8b的总量没有受到影响(图1)。2B)。然后我们构建了一个多西环素诱导的Arl8b过表达系统(图1)。2C进一步验证Arl8b在溶酶体外吞和侵袭中的作用。Arl8b-m金星定位于溶酶体(图1)。二维空间)，如预期25。Ar18b在溶酶体上的过度表达增加了Ar18b在溶酶体上的积累，就像在IR-S细胞中的情况一样，导致溶酶体向细胞边缘的分布(如图所示)。2e-g)。Ar18b高表达细胞的溶酶体数目与对照细胞无显着性差异(附图)。3A)。Ar18b过表达增加了化疗侵袭(图1)。2H)，如IR-S细胞所见，但不影响细胞活力(附图)。3B)。如前所述，分泌蛋白酶在肿瘤侵袭中起着重要作用。我们确定必需的蛋白酶定位在Ar18b阳性的溶酶体中(如图所示)。2I)。这些蛋白酶，包括MMP-3、MT1-MMP(MMP-14)、组织蛋白酶B和组织蛋白酶D，在肿瘤侵袭、体内肿瘤生长和远处转移中发挥着重要作用。39,40,41.

提示Ar18b与溶酶体的结合增加可刺激溶酶体向周围细胞的贩运，通过蛋白酶的分泌促进癌细胞的侵袭性。

在IR-S肿瘤细胞中Ar18b-Skip结合增强

为了研究Arl8b在增强IR-S细胞侵袭中的作用，我们重点研究了Arl8b的活性。Arl8b在gdp结合(非活性)和gtp结合(活动)之间切换；后者与效应蛋白跳跃(介导向前向溶酶体运动)相互作用。26。因此，我们用下拉试验确定了活性Arl8b及其与Skip的相互作用是否增加了IR-S细胞中的活性Arl8b。GTP结合野生型Arl8b(Arl8b-WT)和组成活性GTP结合突变体Arl8b(Arl8b-Q75L)，而非显性负GDP结合突变体Arl8b(Arl8b-T34N)，与Skip共定位。3A)。用GST标记的Arl8b蛋白进行的下拉试验表明，Arl8b-WT和Arl8b-Q75L与STIP相互作用，而Arl8b-T34N仅与效应物有少量的相互作用(见图)。3B)。有趣的是，Arl8b-WT和Skip在IR-S细胞中的结合增加，提示Arl8b在IR-S细胞中的活性增加(图1)。3C)。为证实内源性Arl8b在侵袭性癌细胞中的激活作用，我们将V5-Skip和Arl8b-HA转染到MDA-MB-231细胞中。为了平衡Skip和Arl8b的表达水平，还加入了Arl8b-HA，因为细胞活力在其他方面有很大的改变。Arl8b-HA的表达低于内源蛋白的表达，Westernblotting可将这些条带区分开来。结果表明，IR处理后，内源性Arl8b与V5-Skip的结合增强。三维空间)。我们的数据表明Arl8b在溶酶体上积累的激活在高侵袭性的IR存活细胞中增加。

Arl8b是增强IR-S细胞侵袭能力所必需的。

为了进一步验证Arl8b在增强IR-S细胞侵袭中的作用，我们构建了乳腺癌细胞株，其中Arl8b被shRNAs打倒(如图所示)。4A和补充图。4A-d)。MDA-MB-231细胞中Ar18b的沉默能有效抑制溶酶体在IR-S细胞中的外周分布。4B-d和补充图。4E)。与溶酶体分布的这种差异相一致，右旋糖酐-488和细胞膜LAMP 1检测结果表明，Ar18b-基因敲除细胞的溶酶体外吞作用明显减少(如图1所示)。4E-g)。Arl8b的敲除不影响右旋糖酐-488的摄取(补充图1)。4F)。此外，Ar18b的基因敲除可抑制IR-S人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、Hs578T、MCF-7和小鼠乳腺肿瘤细胞株4T1的侵袭性增强。4H-K)。值得注意的是，Ar18b是增强溶酶体外吞和侵袭IR-S细胞所必需的，而非未经处理的细胞。在这些试验中，Arl8b的敲除不影响细胞的活力(补充图)。4G-k)。为了确定Ar18b是否影响肿瘤细胞的长期存活，我们进行了克隆形成细胞存活试验。Ar18b基因敲除不影响放射敏感性，如集落形成法(附图)。4L).

蛋白酶的释放，包括MMP和组织蛋白酶家族，是ECM降解和肿瘤侵袭的重要过程。13。为探讨蛋白酶对基质降解的中介作用，将细胞培养在添加荧光素结合的DQ-胶原的lrECM上，IR-S对照细胞ECM降解增加，Arl8b基因敲除抑制了ECM的降解(图1 8b)。4L，m)。这些结果共同支持了Ar18b在溶酶体贩运到IR-S细胞边缘的关键作用，进而导致ECM降解和癌细胞侵袭的假说。

ARL8BBORC亚基基因是预测预后的指标。

接下来，我们试图找出Arl8b在高侵袭性癌细胞中的调节因子。我们把重点放在了BORC，这是Arl8b招募溶酶体所必需的。27。为了确定BORC的哪些亚基与Arl8b在肿瘤的进展和侵袭过程中相互配合，我们分析了可在癌症基因组图谱(TCGA)上获得的乳腺癌数据集。我们发现这么高ARL8B表达与病人的存活率差有关(图一)。5A)。高表达水平的病人ARL8B (ARL8B-高级别患者)，根据BLOC1S1(BLOS 1)，BLOC1S2(BLOS 2)BORC 5(Myrlysin)，但没有其他brc亚单位基因，进一步将生存率显著低下的患者与其他患者分离开来，特别是在ARL8B/BLOC1S2-高组(图1.5A和补充图。5A)。这个ARL8B/BLOC1S2-高组也被发现与淋巴结转移率增加有关(图一)。5B)。然后用微阵列技术定量测定3D培养的MDA-MB-231细胞在IR作用下基因表达的相对变化。在BORC亚基基因中，BLOC1S2和BORC 5IR治疗后表达量增加1.5倍以上(如图所示)。5C)。这些结果表明Arl8b的表达和/或激活确实影响癌细胞的恶性进程，IR-S细胞的情况就是如此。

基于这些结果，我们重点研究了BLOS 2和Myrlysin在IR-S细胞中的作用。BLOS 2或Myrlysin的基因敲除可抑制IR-S细胞Ar18b与STIP结合的增加(图1)。5D和补充图。5B)。与先前的研究一致27，BLOS 2的敲除降低了Myrlysin的蛋白水平，反之亦然(附图)。5C)。用转染Arl8b-HA的MDA-MB-231细胞检测Arl8b在肿瘤细胞中的分布。BLOS 2或Myrlysin沉默可部分抑制Arl8b-HA和LAMP 1阳性溶酶体与IR治疗的关系(图1)。5E)。BLOS 2或Myrlysin沉默可抑制IR-S、MDA-MB-231细胞内溶酶体的增加和侵袭活性的增加。5F-I和补充图。5D)，但细胞活力未受影响(附图)。5E)。这些结果表明，BORC亚基是活性Arl8b介导的高侵袭性癌细胞增强侵袭的必需亚基。

IR通过atm-sp1轴增加brc基因的表达

正如导言中提到的，IR可以通过激活转录因子来调节基因的表达。29。因此，为了确定IR增加BORC表达的机制，我们将注意力转向IR激活的转录因子。据报道，有几种转录因子在IR处理后被激活，如sp1。42、p5343，以及NF-κB5。我们使用ENCODE(Www.encodeproject.org)和Jaspar(jaspar.genereg.net)转录因子目标数据库，以确定可能与启动子区域结合的转录因子。BLOC1S2和BORC 5。在将预测的转录因子与已报道的IR激活转录因子进行比较后，我们将Sp1作为潜在的靶点。我们发现Sp 1被siRNAs击倒(见图)。6A)不仅抑制了mRNA的表达BLOC1S2和BORC 5而且IR诱导的表达BLOC1S2和BORC 5(无花果)6B)。在蛋白质水平上，我们证实Ser-101的Sp1磷酸化在IR处理后增加，部分依赖于ATM(如图所示)。6C)。Atm是一种DNA损伤传感器。44在IR诱导的dna损伤后激活多个转录因子。29。最后，确认sp1增加了dna的转录。BLOC1S2和BORC 5、染色质免疫共沉淀(芯片)-qPCR。经IR处理后，Sp1与BLOC1S2和BORC 5增加(如图所示)。6d)。这些结果表明，Sp1的激活调节了IR处理后BORC亚基BLOS 2和Myrlysin的表达增加。

aSP1在转染siRNAs进行Sp1基因敲除的MDA-MB-231细胞中的表达。18S rRNA作为内部对照。b表达BLOC1S2和BORC 5转染siRNAs进行Sp1基因敲除的MDA-MB-231细胞的mRNA。18S rRNA作为内部对照。cMDA-MB-231细胞经4Gy IR处理后磷Sp1(p-Sp1)的Westernblot分析。d4 Gy IR处理后MDA-MB-231细胞的芯片-qPCR检测。用抗Sp1或非免疫IgG进行免疫沉淀。所有列图都表示了三个独立实验的SEM均值。*P < 0.05; **P < 0.01.

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Arl8b对IR-S细胞转移的促进作用

最近的溶酶体蛋白酶研究表明肿瘤侵袭与肿瘤生长和转移有关，包括对MMP-3的研究。39,45、MT1-MMP40,46、组织蛋白酶B47,48，以及组织蛋白酶D49。由于Arl8b对高侵袭性肿瘤细胞有明显的影响，在小鼠模型中，我们试图验证Arl8b是否是侵袭性肿瘤生长和转移所必需的。4 Gy IR，4T1-Luc稳定表达红移细胞，观察Ar18b在存活细胞中的作用卢西奥拉斜体荧光素酶照射后，选择IR-S群体，体外培养2d后，皮下注射到裸鼠体内(图1)。7A)。与以前的工作一致50，与未照射细胞相比，IR-S细胞的肿瘤生长明显增强(图1)。7b，c)。然而，shRNA介导的Arl8b在4T1-Luc细胞中的敲除(补充图)。4D和6)有效抑制IR所致小鼠侵袭性肿瘤生长的增加(图一)。7b，c)。用免疫组织化学方法检测各组肿瘤细胞增殖标志物Ki-67的表达。7D)。在IR-S细胞中，增殖细胞(Ki-67-阳性细胞)的比例较高.7E)。先前的一项临床研究报告，高水平的Ki-67与淋巴结转移的高发率呈正相关。51。通过活体显像和肺组织苏木精和伊红(H&E)染色证实Ar18b参与了IR-S肿瘤细胞的远端转移。Ar18b基因敲除能有效抑制IR诱导的小鼠IR-S细胞的肺转移(图1)。7F-h)。这些结果提示，IR-S细胞具有较强的肿瘤生长和转移潜能，被Ar18b基因敲除所抑制。综上所述，并与体外获得的数据一致，这些体内结果表明，Ar18b是溶酶体外吞作用的调节因子，对于高侵袭性肿瘤细胞的生长和转移是必不可少的。

最近的研究已经证明了可能的分子机制来解释肿瘤细胞侵袭性的增加。5,6,7。在本研究中，我们发现在IR-S细胞中，溶酶体外吞增加，这可能影响蛋白酶的释放，导致ECM降解增加。我们的发现也阐明了IR-S细胞溶酶体外吞增加的分子机制，这种机制受Ar18b和BORC的调控。

活性形式的Arl8b结合它的效应器，跳跃，以招募运动素马达，介导溶酶体的运输到细胞的边缘。Ar18b的激活似乎是细胞对细胞外刺激的一种反应，并调节多种细胞功能。Ar18b促进肝细胞生长因子、表皮生长因子或酸性细胞外pH的顺行溶酶体转运，在前列腺癌三维模型中，这与侵袭性生长和蛋白水解ECM的降解有关。52。细菌感染还可激活ar18b并诱导溶酶体介导的hela细胞和原代巨噬细胞的质膜修复。53。此外，佛波酯对Ar18b的激活促进了巨噬细胞溶酶体的小管形成。54。在本研究中，我们发现在高侵袭性肿瘤细胞中，Ar18b的活性增强，并且这一过程受到BORC的调控。其他人和我们的数据表明，Ar18b调节的溶酶体外吞作用对于刺激依赖性侵袭性是必不可少的，而不是基础侵袭性。

如图所示，Ar18b过表达后，部分细胞出现溶酶体增大。二维空间。溶酶体的大小可能与溶酶体的活性有关，但其贡献尚不清楚。55。有几种蛋白质影响溶酶体的大小。例如，TPC的过表达56或者MT1-MMP的沉默57当Diaskedin被击倒时，细胞中的溶酶体被发现变大58或转录因子EB的过度表达59溶酶体变小。这些蛋白质如何影响溶酶体大小的机制还没有完全实现。因此，溶酶体大小与这些蛋白质(包括Ar18b)之间的关系值得进一步研究。

有趣的是，我们注意到在IR处理后的一些细胞中，核周围溶酶体失去了围绕着中心体的极化(图)。4B)。溶酶体的分布可分为位于细胞核周围“云”的微管组织中心周围的不动池和细胞外围高度动态的池。60。包括晚期内小体、溶酶体和跨高尔基网络小泡在内的核周云中所含的货物向细胞边缘移动，以达到它们的目的地。60。Jongsma等人表明核周云囊泡的停止和释放是由内质网的E3连接酶RNF 26和几种泛素化物控制的。61。IR后核周云溶酶体的总释放可能与这些蛋白质的变化有关，这可能在今后的研究中进行。

溶酶体在肿瘤生物学中起着至关重要的作用。20。多种溶酶体相关因子和途径已成为提高放射敏感性的靶点。62。近年来，溶酶体介导的降解过程自噬作为放射增敏的靶标引起了广泛的关注。63。一项研究表明，半胱氨酸组织蛋白酶储存在溶酶体腔中，在腔内会产生辐射抗性。64。Korolchuk等人报道了Ar18b的活化依赖于营养，提示Ar18b因饥饿而失活，导致溶酶体在中心体堆积，增加了自噬体与溶酶体的融合。65。在我们的研究中，Arl8b的基因敲除并没有导致IR治疗后细胞集落形成的显著差异，提示溶酶体位置可能影响的自噬能力并不总是影响放射敏感性。相反，我们的结果强调了溶酶体贩运在IR-S癌细胞侵袭中的作用.我们还发现，Ar18b沉默在体外抑制了IR-S乳腺癌细胞的侵袭能力，抑制了肿瘤的体内转移。对TCGA数据的分析也支持了我们的观点，即在高侵袭性肿瘤细胞中发现的BORC-Arl8b通路的上调与乳腺癌患者淋巴结转移增加和预后不良有关(另见下文)。

在此，我们发现在IR-S癌细胞中，Ar18b介导的溶酶体外吞和侵袭需要BORC-亚基。最近，有报道称“Ragator复合物”对brc-arl8b通路产生了负调节作用。66,67。在营养物质或生长因子的存在下，Ragator复合物被激活并与BORC分离，从而激活BORC和Ar18b介导的溶酶体顺行转运。66,67。虽然我们的数据表明BORC-亚基的增加参与了Ar18b的激活，但Ragator复合物与BORC的解离是否也是由IR引起的，在其他地方也应加以研究。此外，Ragator复合物的激活还参与了几种蛋白的调控，包括雷帕霉素复合物1(MTORC 1)和轴突蛋白的机制靶点，它们参与了dna损伤反应。68,69,70。因此，Ragator复合物在IR后的DNA损伤反应，以及BORC-Arl8b通路内可能存在的串扰，将在未来进一步研究。

溶酶体在细胞边缘的分布是与肿瘤侵袭性和侵袭性相关的一种重要表型。21。与此相一致，我们发现Ar18b-BORC-亚基调控的溶酶体的周边分布与乳腺癌细胞的侵袭性增强有关。的高表达ARL8B和BLOC1S2后者是一个BORC亚单位，与乳腺癌患者的低生存率和淋巴结转移增加有关，这两种基因都可能是乳腺癌侵袭性增加的原因。这些结果表明，无论IR治疗与否，Ar18b-BLOS 2调控的溶酶体定位可能与乳腺癌的侵袭性有关。最近，Morgan等人。发现高转移癌细胞优先易受溶酶体抑制。71。溶酶体抑制剂对高转移性膀胱癌细胞的细胞毒性高于低转移性膀胱癌细胞。71。除了我们的数据，这些研究表明，溶酶体可以作为治疗高转移癌的靶点。

总之，我们的研究为BORC-Arl8b介导的溶酶体贩运如何增加IR-S细胞的侵袭性提供了重要的见解，从而为制定一种改进癌症治疗的新策略提供了基础。

细胞培养与辐照

所有的细胞系都是从美国类型的培养集(ATCC，Manassas，美国)购买的，并按照他们的指示进行扩展。在含10%胎牛血清(FBS，HyClone，Logan，USA)的DMEM(Sigma-Aldrich，St Louis，USA)中培养MDA-MB-231、Hs578T、MCF-7和HEK293T细胞，在含10%FBS的RPMI-1640(Sigma-Aldrich)培养基中培养4T1小鼠乳腺肿瘤细胞。产生稳定表达红移的4t1-luc细胞卢西奥拉斜体荧光素酶72用携带红色流感病毒的慢病毒感染4T1细胞，用10μg/ml杀虫素S(美国马萨诸塞州热费雪科学)筛选。用CellRad X射线发生器对电池进行130 kV X射线辐照(美国北布兰福德精密X射线).

Matrigel侵袭试验

采用生物涂层基质侵袭室(Corning，Corning，USA)或24孔米氏细胞培养(24μm PET膜，美国伯灵顿默克·米利孔)，在37°C下用400μg/ml康宁生长因子还原基质基膜基质(Corning)进行细胞化学侵袭试验，IR处理24h后细胞被胰蛋白酶化，并加载到不含FBS的DMEM侵袭室上井。下井用含10%FBS的培养基填充。Mdma-mb-231、hs578T、mcf-7和4t1细胞分别在5%CO 37℃下孵育5h、3h、8h和5h。2。细胞用4%多聚甲醛(PFA)固定，1%结晶紫染色。

免疫荧光

为定量细胞内溶酶体的分布，在37°C的培养基中直接加入37℃的PFA 10 min，将IR处理后24h的MDA-MB-231细胞固定在2%PFA的浓度范围内。细胞经甲醇固定，在−20°C下渗透5 min，用5%牛血清白蛋白(BSA)浸泡1h。用1：400稀释液，5%BSA/PBS在4°C下孵育细胞。洗涤后，将细胞与阿列克荧光偶联抗体在室温下孵育1h。在室温下，用4‘，6-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI)在PBS中染色5 min。用真共焦扫描显微镜系统获得了免疫荧光图像(Leica微系统，德国韦茨勒)。

免疫印迹

如前面所述，执行了该过程。6。简单地说，细胞在放射免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液(1%nonidet P-40[NP-40]缓冲液，150 mm NaCl，50 mm Tris-HCl[pH 7.4]，5 mm乙二胺四乙酸[EDTA]，1%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]，1mm NaNa[SDS])中溶解。3Vo4，1毫米NaF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒[默克米利波]。细胞裂解物以等量加入NuPAGE双-Tris蛋白凝胶(ThermoFisher Science)或SDS-PAGE凝胶进行分离。将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在室温下用奥德赛封闭缓冲液(Li-cor生物科学，林肯，美国)阻断，然后在4℃下用初级抗体检测1小时。用吐温-20(TBST；25 mm[pH 7.4]，120 mm NaCl，3mm KCl，0.1%吐温-20)三次浸泡10 min后，在室温下与IRDye 800 CW或IRDye 680 LT，Li-cor二次抗体孵育1 h，用奥德赛成像仪(Li-cor Bioscies)检测膜上的信号。

抗体

本研究中使用的抗体在补充表中作了说明。1.

葡聚糖-488胞吞试验

1×104IR处理24h后，将MDA-MB-231细胞接种到96孔培养板中.细胞在10,000 mW(右旋糖酐-488，热费舍尔科学)作用3h后，用PBS洗涤3次后，每孔加入100μ1的培养基。培养8h后，收集培养基，转移到新的96孔培养板上。用微板阅读器测定了葡聚糖-488在条件培养基中的荧光强度(CLARIOstar，BMG LabTech，Ortenberg，德国)。数据来自三个独立的实验，一式三份，并对对照组进行归一化处理。

流式细胞术

细胞被胰蛋白酶化，再悬浮于流式细胞仪缓冲液(PBS中2%FBS)中，与抗LAMP 1抗体(细胞信号技术，Danvers，美国)孵育，在4°C的流式细胞仪缓冲液中识别LAMP 1的腔/胞外结构域[29-382]，作用30 min。用流式细胞仪缓冲液洗涤2次后，在4℃下用Alexa荧光结合次级抗体染色30 min。作为同工型对照，细胞单独用次级抗体染色。洗涤后，用FACSAria III流式细胞仪(BD生物科学，富兰克林湖，美国)对每个样本的10,000个细胞进行了分析。数据收集和分析采用BD FACSDiva软件(BD生物科学)。将LAMP 1的平均荧光强度从三个独立的实验中采集，并对对照组进行归一化处理。

细胞表面蛋白染色

为定量细胞表面LAMP 1的含量，细胞在24孔板中培养，用1%PFA固定，不经渗透。细胞与原代抗LAMP 1抗体(细胞信号传导技术)在4℃下孵育一夜。用PBS洗涤细胞后，用二级抗体(IRDY800CW，Li-Cor生物科学)染色。荧光强度测定采用奥德赛CLX图像扫描系统(Li-cor生物科学)，并以细胞计数试剂盒8(CCK-8；日本熊本市Dojindo)获得的各组细胞活力为标准。数据来自三个独立的实验，一式三份，并对对照组进行归一化处理。

溶酶体分布的定量

为定量溶酶体的分布，获得LAMP 1/α-微管蛋白/γ-微管蛋白染色细胞的多通道荧光图像。每个细胞分为5个区域，从中心体(由γ-微管蛋白染色确定)到细胞膜(由α-微管蛋白染色确定)。用软件测量LAMP 1的荧光强度，计算各区域LAMP 1强度与整个细胞LAMP 1强度的比值。为了用元形态软件(分子器件，美国圣何塞)对溶酶体分布进行半自动测量，如前面所述，开发了一个原始的期刊宏。17.

溶酶体数目和大小的定量

用变性软件分析LAMP 1标记的小泡，计算细胞内溶酶体的数量和大小。

溶酶体的分馏

为了丰富细胞的溶酶体分数，按照制造商的指示，使用了一种用于组织和培养细胞的溶酶体富集试剂盒(Thermo Fisher Science)。细胞经胰蛋白酶消化后再悬浮于试剂A中，微丸涡状体作用5s，在冰上孵育2 min。用等体积的试剂B对悬浮液进行超声处理，将混合物轻轻倒置几次，在500×离心条件下离心。g4°C作用10 min。上清液组分收集成新管。制备了梯度(17-30%)，并将15%的上清液和培养基的混合物加载到17%的梯度层上，然后在145,000×分的条件下进行超速离心。g在4℃下培养2h，取溶酶体组分，用免疫印迹法进行分析。

富含层粘连蛋白的ECM和dq-Ⅳ型胶原的三维培养

基质基底膜基质(Corning；富含层粘连蛋白的ECM)添加25μg/ml荧光素结合的DQ-Ⅳ型胶原，形成三维基质培养物。Hs578T细胞(2.5×10)4将转染的蓝色荧光蛋白(BFP)与3D基质的130个μ1混合，接种于4室35/10 mm CELLview细胞培养盘中(Greiner Bio-One，Kemsmünster，奥地利)。四百微升三维培养基(添加1%氟脲嘧啶，2 5 0μg/ml胰岛素，10μg/ml转铁蛋白，2.6 ng/ml亚硒酸钠，10-10 M雌二醇，1.4×10)–6三维基质顶部加入m氢化可的松和5μg/ml催乳素。接种2d后，用真共聚焦扫描显微镜系统(LeicaMicrosystems)获取培养细胞的图像。用变形软件测量DQ-Ⅳ型胶原断裂面积。计算DQ-Ⅳ型胶原裂解面积的百分比：(切割DQ-Ⅳ型胶原面积−细胞面积)/细胞面积。在三个独立实验中，每组20多个细胞被分析。

质粒构建与转染

对于Arl8b-m维纳斯的表达，人类ARL8B将cdna亚克隆到mvenus n1载体中，然后亚克隆到基于piggybac转座子的多西环素诱导载体ppb-trg-mcs-ch-rtta 3-ip中。17。多活性载玻片转座酶(HyPbase)载体与Arl8b-m维纳斯质粒的共转染17采用ViaFect™转染试剂(美国麦迪逊Promega)转染MDA-MB-231细胞，转染2d后用1μg/ml普罗霉素培养细胞。12.5ng/ml多西环素诱导Ar18b-m维纳斯表达，引起过度表达。

对于长期敲除，针对补充表中描述的序列的shRNA载体。2构建：将寡核苷酸克隆到pen_TTmiRc 2载体(Addgene，Watertown，USA)中。73，然后以mTagBfp 2 cDNA为表达标记，亚克隆入基于piggybac转座子的载体ppb-ch-mcs-ip。17。用hyPbase质粒共转染细胞，用普罗霉素进行筛选。

对于GST-Arl8b和Xpress-SKIP表达式，ARL8B和PLEKHM 2利用SuperScript IV逆转录酶(Thermo Fisher Science)，从MDA-MB-231细胞合成的第一链cDNA中，通过PCR获得(STIP)cDNA。用PCR方法设计并扩增了Arl8b-Q75L(一个缺乏GTP水解活性的突变体)和Arl8b-T34N(一个阻断鸟嘌呤核苷酸交换因子的显性阴性突变体)。这个ARL8BCdna(野生型、q75L和t34n)被插入到pCEHG载体中，并带有gst标记，如前所述。17。这个PLEKHM 2将cDNA克隆到pcDNA3.1/His C载体(Addgene)中。瞬时转染HEK293T细胞。

为检测内源性Arl8b在MDA-MB-231细胞中的结合作用，将V5-Skip转染到Arl8b-HA转染的MDA-MB-231细胞中。为了在极低水平上稳定表达V5-跳跃，对ppb PGK IP载体进行了修饰，将其转移到多克隆位点(MCS)中，在内部核糖体进入位点(IRES)后产生新的MCS，形成ppb-PAC-IRES-MCS载体。将编码V5-STIP、猪病毒-1 2A(P2A)和Arl8b-HA的cDNA序列插入到ppb-PAC-IRES-MCS的MCS中.如上述所述，所得到的载体被稳定转染。

GST下拉试验与免疫沉淀

在GST下拉实验中，将含有GST-Ar18b(野生型或突变体)和Xpress-SKIP的质粒转染到HEK293T细胞中。细胞用np-40缓冲液(1%np-40,150 mm NaCl，20 mm Tris-HCl[pH 7.4]，5 mm edta，1 mm Na)溶解。3Vo4、1mM NaF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(默克米利波)处理后24h。溶菌物(200μg)与10μ1的谷胱甘肽Sepharose 4B微球(Ge Healthcare，Chicago，USA)在4°C下温和搅拌2h。用NP-40裂解缓冲液广泛洗涤3次后，加入LDS样品缓冲液(热Fisher科学)和2-巯基乙醇，在70℃下孵育10 min。蛋白质经NuPAGE分离，Westernblotting分析。

免疫沉淀(IP)用抗V5标记抗体微球(Fujifilm，日本东京)在4℃温和搅拌培养3h。用NP-40裂解缓冲液广泛洗涤3次后，加入LDS样品缓冲液(热Fisher科学)和2-巯基乙醇，在70℃下孵育10 min。用NuPAGE分离蛋白质，免疫印迹法进行分析。用兔抗体(细胞信号技术)对IP中的V5进行免疫印迹，以避免检测用于IP的小鼠抗体珠。用小鼠V5抗体(ThermoFisher Science)对总裂解液进行免疫印迹。

SiRNA与转染

用北海道系统科学方法合成siRNA双链。用脂质体RNAiMAX(ThermoFisher Science)转染siRNA双倍体。SiRNA序列列在补充表中。2.

细胞活力测定

用CCK-8法测定细胞侵袭试验和细胞外吞试验中的细胞活力。将CCK-8溶液加入96孔板中，37℃培养1h，用Multiskan™Go微板分光光度计测定细胞活力。

集落形成试验

将MDA-MB-231细胞接种于不同密度的6孔板中：0 Gy处理100和200细胞/盘，2 Gy处理400和800细胞/盘，5 Gy处理4000和8000细胞/盘。培养第14天，用4%PFA固定10 min，用1%结晶紫染色。收集4个独立实验的数据，并将其归一化为对照组的菌落数。

TCGA

Rna-seq与乳腺癌患者的临床资料(n从癌症基因组图谱中获得。病人按ARL8B表达率最高的15%患者ARL8B表达式被归类为“ARL8B-高“组”，其他患者被归类为“ARL8B-低“组”。这个ARL8B-高组进一步分层，每一个BORC-亚单位基因的相对表达水平，和ARL8B-高/高/高组占总病人的3%。采用Kaplan-Meier法估算生存曲线，用logrank检验进行生存率比较。同样的分类用于检验与局部淋巴结转移的相关性。每例患者的淋巴结转移评分按阳性(H&E染色)淋巴结占被检淋巴结总数的比例计算。采用Brunner-Munzel检验，检验其与分布和方差无关的统计显着性.

微阵列分析

将MDA-MB-231细胞培养在玉米基质基底膜基质(Corning)上进行三维富含层粘连蛋白的ECM(LrECM)培养。经2Gy×4d的IR处理后，用核酸自旋RNA试剂盒(MachereyNagel，Düren，德国)分离细胞总RNA。采用高灵敏度3D基因人寡核苷酸芯片25k v2.10(东丽工业，日本东京).

定量实时PCR

用三试剂(Sigma-Aldrich)从MDA-MB-231细胞中提取总RNA.用SuperScript IV逆转录酶(Thermo Fisher Science)从总RNA中合成了第一链cDNA.使用FastStart必需的DNA绿色主混合物(Hoffmann-La Roche，Ltd.，巴塞尔，巴塞尔)对LightCycler 96系统(Hoffmann-La Roche，Ltd.)进行定量实时PCR。用于扩增目标基因的引物在补充表中作了说明。2.

芯片qPCR

1%甲醛固定10 min，1.25M甘氨酸作用5 min，PBS洗涤3次。用刮除法收集细胞，将干燥的颗粒冷冻在液氮中。在0.2%NP-40缓冲液(0.2%NP-40，10 mm NaCl，10 mm Tris-HCl)中再悬浮15 min。上清液被丢弃，干燥的小球被重新悬浮在SDS裂解缓冲液(1%SDS，10 mm EDTA[pH 8]，50 mm Tris-HCl[pH 8.1]，1 mm Na)中。3Vo4，1毫米NaF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒；默克米利波)。在冰上孵育15 min后，用生物声纳仪(UCD-300，Cosmo Bio，日本东京)将染色质剪切至200~500 bp，超声处理(300 W，10次，30 s左右)。免疫沉淀用染色质用5μg的芯片级抗Sp1抗体(细胞信号技术)孵育，4℃搅拌过夜。将含有1/10的染色质样品保存在4°C处进行输入控制。用2.2 5μg的皮尔斯™蛋白A/G磁珠(热费舍尔科学)在4°C下搅拌4h，分离出染色质和抗体复合物。将珠子分别用1ml的缓冲液(0.1%SDS、1%Triton、2mm EDTA、20 mm Tris[pH 8.0]、15 mm NaCl)、高盐免疫复合物缓冲液(0.1%SDS、1%Triton、2 mm EDTA、20 mm Tris[pH 8.0]、500 mm)、LiCl免疫复合物缓冲液(0.25 M LiCl、1%NP-40、1%去氧胆酸、2mm EDTA，20 mm Tris[pH 8.0]和TE(10 mm Tris，1mm EDTA)两次。用2 0 0μ1洗脱缓冲液(1%十二烷基硫酸钠，0.1M NaHCO)洗脱染色质抗体复合物3)和8μl的5 M NaCl。将洗脱样品在65°C下孵育一夜，可逆转交联反应，用磁台收集上清液。样品在37℃下用RNase A处理30 min，然后蛋白酶K在55℃下处理1.5h，最后用酚-氯仿萃取和乙醇沉淀纯化样品。按上述方法进行定量的实时PCR。用于扩增目标基因的引物在补充表中作了说明。2.

体内研究

为获得稳定敲除Arl8b的4T1-Luc细胞，将携带Arl8b小鼠1 shRNA序列的质粒转染4T1-Luc细胞。为筛选IR-S肿瘤细胞，分别用0或4Gy的IR处理，在肿瘤注射前孵育2d。4T1-Luc细胞(1×10)66周龄雌性BALB/c-nu/nu小鼠右侧大腿皮下注射，每只小鼠分别从日本札幌(日本札幌)购买。用卡尺测量肿瘤的长度和宽度，计算肿瘤体积：v=4/3π×长×宽×(长+宽)/2×1/8。生物发光成像用异氟醚麻醉，腹腔注射D-荧光素如(日本大阪，Wako)。用生物发光法检测肿瘤生长和转移(IVIS光谱CT；Perkin Elmer，美国Perkin Elmer)。组织学方面，将组织固定在10%福尔马林溶液(Sigma-Aldrich)中，在室温下过夜，在70%乙醇中孵育，然后被石蜡包埋。将石蜡切片切成4m切片，装在显微镜下，按标准程序进行H&E染色。

免疫组化：肿瘤切片与抗原解掩液(美国Burlingame载体实验室)在95°C水浴中孵育30 min进行抗原提取。3%H对内源过氧化物酶活性的猝灭2O2。每片在2%的封闭缓冲液(瑞士巴塞尔罗氏)中孵育1h，然后与抗Ki-67抗体(细胞信号技术)孵育一夜。采用超灵敏IHC检测系统(BioGenex，San Ramon，USA)对信号进行放大。切片用辣根过氧化物酶(HRP)结合次级抗体染色。洗过两次后，用苏木精(MutoPure化学，日本东京)对玻片进行染色。

所有动物实验都是根据北海道大学动物保护和使用委员会批准的协议进行的。

统计与重现性

体外实验至少重复三次。用于小样本的实验(n < 6), statistical significance was analyzed by two-tailed t-测试。图是均值的均值±标准差(SEMS)。对于大样本量的实验(溶酶体分析)，采用D‘Agostino-Pearson综合法对数据集的正态性进行了检验。P>0.05用于定义正态分布。对于正态分布的数据集，用t-确认相同方差后，由F-测试或t-韦尔奇校正是否有显着性差异。对于非正态分布的数据，用Mann-Whitney检验确定统计显着性.图1.统计意义5B采用Brunner-Munzel检验，该检验不受分布和方差的影响。显著差异如下：*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; and ns, not significant. The exact P-数值列于补充表3。这些实验不是随机的，而是以基本相同的方式进行的。在实验和结果评估过程中，研究人员并没有被蒙蔽，但没有先入为主的概念.