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五肽-3对前列腺癌补体激活的调节作用

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发表时间:2020-10-28 16:20作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

戊蛋白3(PTX 3)是天然免疫系统的重要组成部分,是补体级联的重要调节因子。补体系统在前列腺癌发病机制中的作用一直被低估。本研究的目的是探讨PTX 3作为补体激活的调节因子在肿瘤发生发展中的作用。我们进行了一个单一的中心队列研究;从2017年1月到2018年12月,从620名接受前列腺活检的患者中获取了血清和前列腺组织样本。一组良性前列腺增生症(BPH)患者在12-36个月内进行第二次活检,证实有前列腺癌(A组,n=40)或确诊为BPH(B组,N=40)。用共聚焦显微镜观察A、B两组组织PTX 3蛋白表达及补体激活情况。我们证实,与B组相比,A组第一次活检组织中PTX 3的表达增加。C_1q沉积在A组中广泛存在,与PTX_3沉积显著相关,B组C1q/PTX_3沉积呈阴性,而且在A组患者中,C_3a和C_5a受体表达明显增加。有趣的是,C1q/PTX 3沉积与终末补体复合物C5b-9的激活无关,而且我们发现肿瘤组织中补体抑制剂CD 59显著增加。我们的数据表明PTX 3可能通过补体级联早期组分的增加而在这种肿瘤的发生发展中发挥重要的致病作用,同时抑制与CD 59上调相关的终末补体通路的激活。这种改变可能导致PTX 3介导的促进细胞增殖、血管生成和对凋亡的不敏感可能导致癌细胞的侵袭和迁移。

背景

前列腺癌是男性癌症相关死亡的第二大原因。1。激素环境一直被认为在这种肿瘤的发病机制中起着关键的作用。2尽管在过去的十年中,人们对慢性炎症在这种环境中的作用越来越感兴趣。事实上,越来越多的证据表明慢性前列腺慢性炎症与前列腺癌的发病率显著相关。2,但这一联系的精细分子机制仍然很不清楚。戊四氮-3(Ptx 3)作为五肽超家族中的大多数蛋白质,都是为了应对炎症的触发而产生的。3。有趣的是,ptx 3可以促进有丝分裂信号通路的失调,并促进细胞增殖、血管生成、对凋亡不敏感、癌细胞侵袭和迁移以及肿瘤从免疫监视中逃逸。4,5,6,7。我们先前已经证明,ptx 3前列腺表达和ptx 3血清水平的增加可能预示着前列腺癌的后续发展。7.

众所周知,ptx 3在补体级联激活的调控中起着关键的作用。3,5,6从细胞增殖和血管生成的角度来看,这些文献提供了补体激活与癌症之间潜在关系的几个证据。8,9,10,11.

在这个场景中,补体蛋白C3a和C5a表现出了特别的兴趣。事实上,有几份报告记录了两种过敏毒素的增殖能力。6,12,13通过激活与肿瘤进展相关的不同信号转导途径。C3a(C3aR)和C5a受体(C5aR)是G蛋白偶联受体。14,15激活丝裂原活化蛋白激酶家族的不同成员,包括细胞外信号调节激酶和p38。16,17,18。此外,C3a和C5a增加了磷脂酰肌醇3-激酶Akt和哺乳动物雷帕霉素靶标的激活。19,20,三种与肿瘤密切相关的信号转导蛋白21,22。O‘Barr等人证明C3a/C3aR通过蛋白激酶C和NF-κB激活促进未分化人神经母细胞瘤细胞的增殖。23。值得注意的是,补体蛋白可以直接或间接地在肿瘤血管生成的发病机制中发挥作用。事实上,这两种过敏毒素和C1q都被证明直接影响内皮细胞的增殖和迁移。24。另一方面,相同的补体级联成分可以在浸润的组织巨噬细胞中诱导出亲血管生成的表型。25.

考虑到补体激活在前列腺癌发生中的作用,本研究旨在阐明PTX 3与补体级联激活在此竞赛中的潜在关系。特别是,我们研究了PTX 3表达增加是否与补体级联激活有关,以及后者是否与从慢性前列腺炎症到前列腺癌的进展有关。

材料和方法

学习人口

本次观察性单一中心队列研究的对象是连续620名患者,他们从2017年1月1日至2018年12月31日在意大利福贾大学医院“Policlinic Riuniti”泌尿外科接受了第一次前列腺活检(PBX)。研究中的患者在局麻后接受了18核心活检计划,如前所述。26。组织学诊断包括良性前列腺增生(BPH)385例和前列腺癌(235例)。每例患者在活检时取血清标本,保存于−80°C。127例组织学诊断为良性前列腺增生患者,12~36个月内接受临床诊断。其中40例在第二次活检中被诊断为前列腺癌(A组)。根据年龄、血清PSA值、前列腺体积、指直肠探查和第二次活检时间等临床变量,采用倾向评分多维匹配技术对第一次阴性后至少一年以上的第二次阴性活检患者(B组,n=40)进行诊断。

所有与会者均书面同意参加。研究项目的议定书已得到地方道德委员会的批准(2014年9月3日第152/CE/2014号决定;福贾大学“Ospedali Riuniti”医院道德委员会),并符合区域道德委员会关于人类实验的准则和1995年“赫尔辛基宣言”的规定。

前列腺组织学分析

两位资深泌尿病理学家采用现代前列腺上皮内瘤变(PIN)、不典型小腺泡增生(ASAP)和前列腺癌(PCA)诊断标准进行分析。此外,对良性前列腺组织和PCa组织活检标本按炎症四点分级(0-无炎症细胞,1-分散炎性细胞浸润,2-非汇合淋巴结节和3大炎症区,浸润汇合)和侵袭性(炎症细胞与腺上皮之间没有接触;1-炎症细胞浸润与腺上皮接触;2-清楚但有限,不到25%的材料,腺上皮破裂,3-腺上皮破裂超过25%),如伊尼等人所描述的。27.

间接免疫荧光与共聚焦激光扫描显微镜

采用双标记免疫荧光法检测PTX-3、C1q、MBL、C3aR、C5aR1、C5b-9和CD 59的表达及其共同定位。为此,我们使用了以下主要抗体:鼠单克隆IgG2a抗ptx-3抗体(克隆mnb 4,abcamm,剑桥英国)。28,29小鼠单克隆IgG 1/k抗甘露糖结合凝集素(抗MBL)(克隆EPSISR 5;AbCAM);兔抗甘露糖结合凝集素(抗MBL)(克隆EPSISR 5;AbCAM);兔多克隆IgG抗C3aR(ABCAM);单克隆IgG2a抗C5R1/CD 88(克隆P12/1;AbCAM);小鼠单克隆IgG2a抗C5b-9(克隆11;ABCAM);兔抗CD 59多克隆IgG(Sigma-Merck KGaA,Darmstadt,Darmstadt)。

取石蜡后,组织切片在4°C下用1:100稀释1:100的混合抗体在PBS pH7.4中孵育一夜。免疫复合物用alexa-Fluor 488山羊抗鼠抗体、546山羊抗鼠IgG和546山羊抗兔IgG(均来自Alexa、Thermo Fisher、Waltham、MA)检测。用封闭液和无关抗体孵育,获得阴性对照。

在pbs(3×5‘)洗涤后,切片和阴性对照分别与山羊抗鼠IgG 488和山羊抗鼠IgG 546或山羊抗兔IgG 546在室温下孵育1h。所有次级抗体的稀释度为1:250。

核染色用PBS pH7.4(3×5‘)洗涤后,在PBS pH=7,4(Invitrogen-分子探针,Thermo Fisher,Waltham,MA)中用1:5000的to-pro稀释液孵育。幻灯片安装在凝胶山(西格玛)和密封。

用激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5(Leica,Intertzlar,德国)),分别配备氩氪(488 Nm)、绿氖(543 Nm)和氦氖(633 Nm)激光器,用共聚焦显微镜对荧光进行了评价。荧光定量如前面所述。7.

统计分析

用SPSS25.0软件(SPSSInc,Evanston,IL)进行统计分析。用Kolmogorov-Smirnov检验变量分布的正态性。采用学生t检验和Mann-WhitneyU检验,比较了不同组间因正态分布或非参数分布而产生的变量差异。用Sperman非参数检验研究了PTX 3与C1q矿床的相关性。一个p≤0.0 5值被认为具有统计学意义。除另有说明外,结果用平均值±标准差表示。

结果

我们第一次评估PTX 3在第一组患者进行第二次PBX后12-36个月内的第一次活检中的表达,以证实在这个新的更大的队列中我们先前的发现。如前所述7,PTX 3在A组中的表达明显高于对照组(见图4)。1A-D)然后在B组患者(图1)。1(e-H)这一观察是通过定量的特异性荧光而得到加强的(如图所示)。1I,J)。我们还证实PTX 3蛋白的表达广泛地与PSA共同定位。1(a-H)

图1
figure1

Ptx 3蛋白表达及与PSA共定位在前列腺癌患者(A组)和未发生前列腺癌患者(B组)的第一次PBX中的表达和定位。PTX 3(绿色;AE)和PSA(红色;BF用双标免疫荧光法和共聚焦显微镜观察第一次PBX中蛋白的表达情况。用to-pro-3染色细胞核(蓝色;CG)。合并图像(DH)显示这两种蛋白信号(黄色)的共同定位。平均荧光强度(MFI)定量证实A组PTX 3表达明显高于B组(I, J)。杆长=50公厘。

然后,我们研究了补体级联的激活,在第一次活检的两个研究组。由于PTX 3可以通过经典途径激活补体系统,我们评估了C1q的沉积。有趣的是,C1q沉积广泛存在于A组患者的组织标本中(图1)。2A-D),而B组完全缺席(图1)。2E-H),根据PTX 3的表达水平。另一方面,补体级联激活的凝集素通路中的一种识别分子MBL在两组中均不存在(数据未显示)。C1q特异性免疫荧光的定量显示了两个研究组之间的统计学差异(图1)。2I,J)。有趣的是,双重免疫荧光在A组组织标本中清楚地显示了C1q/PTX 3的共同定位。2(a-D)有趣的是,我们在A组前列腺癌患者中发现PTX 3和C1q沉积之间存在相关性(图1)。2j)。

图2
figure2

补体因子C1q沉积及与PTX 3共定位于初发前列腺癌患者(A组)(B组)。PTX 3蛋白表达(绿色;AE)和C1q沉积(红色;BF)用双标免疫荧光法和共聚焦显微镜对第一批PBX进行评价,详细介绍了材料和方法。用to-pro-3染色细胞核(蓝色;CG)。合并图像(DH)显示这两种蛋白信号(黄色)的共同定位。平均荧光强度(MFI)定量证实A组C1q沉积明显高于B组(I)。杆长=50;(JA组PTX 3与C1q沉积有显著相关性。

为了进一步研究补体级联,我们接下来评估了补体终末复合物C5b-9的组织沉积。令人惊讶的是,C1q的表达增加并不与终末补体复合物的沉积增加相对应。事实上,C5b-9特异性免疫荧光在A组和B组的第一次活检的前列腺组织中完全缺失(如图所示)。3(a-i)

图3

晚期补体复合物C5b-9与PTX 3在晚期前列腺癌患者(A组)中的沉积及共定位(B组)。PTX 3蛋白表达(绿色;AE)和C5b-9沉积(红色;BF)用双标免疫荧光法和共聚焦显微镜对第一批PBX进行评价,详细介绍了材料和方法。用to-pro-3染色细胞核(蓝色;CG)。合并图像(DH)不要显示这两种蛋白信号的任何共同定位。平均荧光强度(MFI)定量证实两组均无C5b-9沉积(I)。杆长=50公厘。

为了探讨补体级联激活的可能抑制作用,我们检测了补体级联抑制剂CD 59的表达。13可以防止c5b-9组装。10,30。有趣的是,CD 59在几个肿瘤中的表达增加。31虽然没有关于CD 59在肿瘤或炎症前列腺组织中表达水平的信息。值得注意的是,与B组相比,A组PBX中CD 59蛋白的表达明显增加,主要分布在细胞内。4(a-H)CD 59特异性免疫荧光定量显示,两组间差异有统计学意义(图一)。4i)。

图4
figure4

CD 59蛋白表达及与PTX 3共定位在前列腺癌患者(A组)和未发生前列腺癌患者(B组)的第一次PBX中的表达。PTX 3蛋白表达;AE)和CD 59(红色;BF)用双标免疫荧光法和共聚焦显微镜对第一批PBX进行评价,详细介绍了材料和方法。用to-pro-3染色细胞核(蓝色;CG)。合并图像(DH)显示这两种蛋白信号(黄色)的共同定位。平均荧光强度(MFI)定量证实A组CD 59表达明显高于B组(I)。杆长=50公厘。

由于过敏性毒素被认为是可能的可溶性介质,因此可同时调节癌细胞增殖和肿瘤血管生成。11我们研究了C3a和C5a受体的蛋白表达。两种跨膜蛋白在A组第一次PBX中的表达均明显高于B组(图1)。5上面板A-H和图。5底部面板A-H)。此外,在这种情况下,定量的具体荧光,证实了差异是有统计学意义的(图一)。5上面的面板和图。5我的下面板)。值得注意的是,CD 59、C3aR和C5aR1在前列腺组织中的表达与PTX 3的表达一致。4d,5D上面板和5D底板)。

图5
figure5

C_3a和C_5a受体蛋白表达及与PTX_3共定位于初发前列腺癌患者(A组)和未发生前列腺癌患者(B组)。上面板:PTX 3蛋白表达(绿色;AE)和C3a受体(红色;BF)用双标免疫荧光法和共聚焦显微镜对第一批PBX进行评价,详细介绍了材料和方法。用to-pro-3染色细胞核(蓝色;CG)。合并图像(DH)显示这两种蛋白信号(黄色)的共同定位。平均荧光强度(MFI)定量证实A组C3a受体表达明显高于B组(I组)。杆长=50公厘。底部面板:蛋白表达PTX 3(绿色;AE)和C5aR1(红色;BF)用双标免疫荧光法和共聚焦显微镜对第一次PBX进行评价。用to-pro-3染色细胞核(蓝色;CG)。合并图像(DH)显示这两种蛋白信号(黄色)的共同定位。平均荧光强度(MFI)定量证实A组C5a受体表达明显高于B组(I)。杆长=50公厘。

最后,A、B组第二次活检证实C1q、CD 59、C3aR和C5aR1的表达均为阴性。6表明PBX中观察到的变化先于前列腺癌的出现,并在肿瘤性疾病发生后保持不变。

图6
figure6

C1q、C5b-9沉积、CD 59、C3a、C5a受体的表达及其与PTX 3在前列腺癌患者(A组)和非前列腺癌患者(B组)第二次活检中的共定位。PTX 3(A, E, I, M, Q),C1q(B),C5b-9(F),CD 59(J),C3a(N)和C5a受体(R)用双标免疫荧光法和共聚焦显微镜对蛋白质进行了研究,并在材料和方法上作了详细介绍。用to-pro-3反染细胞核(蓝色;C, G, K, O, S)。合并图像(黄色;D, H, L, P, T)演示C1q(D),CD 59(L),C3a(P)和C5aR1(T)使用ptx 3,而对于c5b-9则没有明显的共同定位(H)。杆长=50公厘。

讨论

本研究结果提示,Ptx 3在炎症前列腺组织中的表达与C1q表达有定量、暂时性和空间相关性,提示补体系统经典通路的激活并不导致C5b-9的激活;最后,PTX 3相关的C1q沉积与CD 59、C3aR和C5aR1的表达增强密切相关。

前列腺癌仍然是导致男性癌症相关死亡的最常见原因之一。32。因此,及时诊断是其管理的首要需要。Psa是我们手中唯一一种用于前列腺癌筛查的无创工具,尽管这一生物标志物的局限性是众所周知的,特别是缺乏准确性和高的假阳性率。33。我们已经展示了PTX 3作为组织和血清生物标志物的潜在作用,它可以可靠地预测前列腺癌的发展。7。PTX 3作为前列腺癌特异性标志物的发展可能存在两个潜在的限制:它在其他肿瘤中的潜在表达及其与炎症状态的关系。后者可能很容易通过上下文测量CRP血清水平来克服,就像我们在本研究中所做的那样。前者可能更有意义,尽管PTX 3在肿瘤发生和发展中的作用仍有争议。34.

我们先前的结果得到了其他研究的证实,强调了ptx 3在癌变中的作用,表明这种长时间的戊蛋白可能是炎症和肿瘤之间的关键联系。3,7,9,35,36。在此背景下,补体系统与PTX 3的密切关系可能是一种有趣的致病机制,尽管缺乏前列腺癌中补体级联激活的实验数据。

PTX 3与C1q结合,并能诱导补体级联激活。37。在我们的设置中,我们展示了与C1q的明确的共同本地化,而不是MBL。这些证据提示补体系统通过经典途径局部激活。有趣的是,在我们的环境中,我们没有观察到可能导致肿瘤细胞随后溶解的终末补体复合体的形成。

C1q在肿瘤中的沉积与血管生成有关,而不是补充活化。10。此外,PTX 3通过吸收因子H或抑制血管生成,在其他肿瘤环境中也会导致炎症反应、癌变和血管生成减少37,38在这种情况下,绑定到C1q可以减少补体激活。5.

在我们的数据中,我们观察到C1q的表达增加与在第二次活检中被诊断为前列腺癌的患者的终末补体复合物C5b-9的沉积增加有关。与大多数肿瘤一样,转化后的细胞可能通过激活多种机制来逃避补体依赖的裂解.尤其是CD 59或保护素的产生,它是C5b-9组装的主要抑制剂之一。这种蛋白在正常情况下普遍表达在低水平,在许多肿瘤中显著增加。39。事实上,我们观察到CD 59在第一次和第二次活检中都有明显的上调。与现有文献相比,这是我们发现的主要创新之一。事实上,有充分的文献证明癌细胞倾向于上调各种补体受体和膜结合补体抑制剂,包括CD 59,但也包括CD 46和CD 55。10,31有趣的是,据我们所知,我们的研究是第一次证明在肿瘤性疾病发生前组织中CD 59的上调。因此,我们的观察支持了以下假设:凝血级联的激活和终末补体复合物C5b-9的抑制可能在肿瘤细胞逃避免疫监视中发挥关键作用,并可能是临床上明显的肿瘤疾病发展的第一步。在这种情况下调节CD 59表达的因素仍有待澄清,尽管炎症环境可能也代表了这一事件的答案,因为Bjorge等人。报道了两种重要的促炎细胞因子白细胞介素-1和肿瘤坏死因子α诱导人结肠腺癌细胞CD 59的表达。39这也是为了澄清经典途径(C1q)介导的补体激活在这些患者是否也有其他因素可以抑制C3,C4和C5的沉积。然而,我们的结果指出,在随后发生前列腺癌的患者中,前列腺组织的特征是C1q的表达增加,补体系统的激活降低,而CD 59则最终抑制了C1q的表达。

然而,补体级联的启动,即使不完全,仍能释放出许多可能在癌症发病机制中起重要作用的介质。特别是在补体系统激活的过程中,C3和C5的酶解产生了两个活性的可溶性组分C3a和C5a。40。这两种分子已被证明能诱导一系列有利于肿瘤的效应。事实上,这两种过敏毒素通过与两种特定的细胞表面受体C3aR和C5aR1相互作用,可以促进肿瘤细胞的存活、增殖和运动。31。另一方面,c5a可激活髓样源性抑制细胞,诱导产生高度免疫抑制的活性氧(Ros)和反应性氮(Rns),从而抑制抗肿瘤T细胞反应。41。此外,Nabizadeh等人。最近报道,C3aR通过抑制中性粒细胞和CD4参与黑色素瘤的癌变。+T细胞反应;他们观察到缺乏C3a受体的小鼠黑色素瘤的发展明显延迟,这种作用与浸润性中性粒细胞和CD4显著增加有关。+T细胞42。此外,补体型过敏性毒素还能转化分化多个常驻细胞。43,44,45。在我们的实验环境中,C3a和C5a受体在前列腺癌患者的前列腺组织中都有明显的上调,这支持了这样的假设:补体级联激活后可在原位获得的两种可溶调节剂可能对常驻细胞发挥直接作用,以促进肿瘤的发生。

考虑到它的临床性质,我们研究的主要局限在于我们只能证明PTX 3的表达和补体激活之间的联系,而不是因果关系。然而,我们的研究设计是一个关键的力量,因为它允许我们提供完全新的信息,补充系统激活和抑制的时间在肿瘤的发展。


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