SARS-CoV-2膜糖蛋白M拮抗Mavs介导的先天抗病毒反应

一种新的SARS相关冠状病毒(SARS-CoV-2)已成为一种严重的致病菌，其发病率高，死亡率高。然而，SARS-CoV-2逃避宿主免疫的机制尚不清楚.在此，我们发现SARS-CoV-2膜糖蛋白M是天然免疫应答的负调节因子.我们发现M蛋白在天然免疫反应通路中与中央适配蛋白Mavs相互作用。这种相互作用损害了小牛的聚集及其下游TRAF 3、TBK 1和IRF 3的吸收，导致固有抗病毒反应的减弱。我们的发现揭示了SARS-CoV-2逃避天然免疫反应的机制，提示SARS-CoV-2的M蛋白是SARS-CoV-2干预发展的潜在靶点。

天然免疫反应是宿主抵御病毒感染的第一道防线，由细胞模式识别受体(PRRs)对病原体相关分子模式的识别启动。这引发了一系列的信号事件，导致I型干扰素(IFNs)、促炎细胞因子和其他抗病毒效应基因的诱导。^1,2,3,4这些下游效应蛋白介导固有的抗病毒反应，促进适应性免疫，抑制病毒复制，消除体内病毒。^5,6

在PRRs中，维甲酸诱导基因-I(RLRs)样受体(RLRs)，包括RLR-Ⅰ和黑色素瘤分化相关基因5(MDA 5)，已被证明是哺乳动物细胞内病毒RNA传感器。^6,7,8尽管Rig-I和MDA 5对检测不同类型的病毒RNA具有一定的特异性，但它们利用一种叫做Mavs的通用适配蛋白(又称VISA、IPS-1或Cardyf)来触发下游信号转导。^9,10,11,12在与病毒RNA结合后，rlRs通过各自的卡域被招募到线粒体所在的小牛体内，¹导致类朊蛋白聚合物的聚集和形成。¹³聚集的MAVS作为下游信号元件(TRAF 2/3/5/6、TBK 1和IKK)的中心平台，激活转录因子IRF 3和NF-κB，诱导下游抗病毒效应基因的产生。^14,15,16,17

SARS-CoV-2是冠状病毒家族的成员，是一种典型的单链阳性RNA病毒，编码28种蛋白质，包括4种结构蛋白(穗、膜、包膜和核衣壳)、16种非结构蛋白(NSP1-NSP 16)和8种辅助蛋白(ORF3a、ORF3b、ORF 6、ORF7a、ORF7b、ORF 8、ORF9b和ORF 14)。^18,19,20最近，SARS-CoV-2已经引起了全球大流行和世界范围的社会和经济混乱.严重的SARS-CoV-2感染患者通常在1周后出现呼吸困难，然后迅速表现为急性呼吸窘迫综合征并导致死亡。^{21,22,23,24,25}在严重新冠肺炎患者中发现了干扰素的调节异常。^26,27然而，对于SARS-CoV-2如何避开免疫系统，人们知之甚少.

SARS-CoV-2膜蛋白M是一种具有三个N端跨膜结构域的222个氨基酸糖基化结构蛋白，是病毒颗粒组装所必需的.¹⁸在本研究中，我们发现SARS-CoV-2M蛋白是Mavs介导的先天抗病毒免疫应答的抑制剂。我们的结果表明M是针对Mavs的，并削弱了Mavs的聚集和下游信号元件的合成。我们的发现揭示了SARS-CoV-2逃避天然免疫反应的机制.

Sars-cov-2蛋白M拮抗病毒RNA引发的先天抗病毒免疫应答

研究表明，RLRs介导了对RNA病毒(包括SARS-CoV)的天然免疫应答.^28,29,30为了鉴定SARS-CoV-2蛋白可能抑制RLR介导的下游抗病毒基因的诱导，我们构建了17个SARS-CoV-2蛋白表达克隆，筛选出抑制仙台病毒(一种RNA病毒)诱导HEK 293细胞干扰素β启动子激活的候选基因(见图)。1A)。筛选出SARS-CoV-2ORF3a、M、N、ORF9b和NSP 1蛋白为候选蛋白。在报告实验中，M蛋白的异位表达剂量依赖性地抑制了SeV诱导的HEK293T细胞β启动子、ISRE和NF-κB的激活。1B)。为了进一步证实M的作用，我们通过慢病毒转导建立了稳定的HEK 293细胞体外表达M(HEK293-M)。QPCR分析表明，M的异位表达抑制了细胞的转录。IFNB 1, ISG 56, CXCL 10和肿瘤坏死因子SeV感染诱导的基因(图1。1C)或转染合成的RNA类似物聚(I：C)(如图所示)。1D)在HEK293-M细胞中。同样，M的过表达也明显抑制了sars-cov-2诱导的转录。IFNB 1稳定表达ACE 2的HEK 293细胞(HEK293-ACE 2)感染后6、24h的下游抗病毒基因(图2)。1E)。为了进一步研究M对I型IFN诱导的抑制作用是否是由于间接影响病毒复制，我们用qPCR方法评价了M在SARS-CoV-2复制中的作用。如图所示。1F感染后1、6h，M几乎不影响SARS-CoV-2的复制，说明M抑制抗病毒基因的转录而不影响病毒的复制。感染后24小时，在高表达M细胞中观察到病毒基因组复制增强，这种增强可能是由于M介导的抑制细胞抗病毒反应所致，因为RLR介导的抗病毒天然免疫反应在感染早期对抑制病毒复制是必不可少的。^2,10,11,12我们随后进行了ELISA实验，发现HEK293-M细胞感染或多(I：C)转染后，IFN-β和TNF-α的分泌也受到影响。1g)。此外，M还能抑制SeV或poly(I：C)诱导的TBK 1、IKKα/β、IRF 3和p65的磷酸化。氢)。共聚焦显微镜观察显示，与对照组相比，在体外表达M的细胞中，IRF 3的Sev触发的核易位被破坏(如图1所示)。1I)。相反，M对IFN-β诱导的转录无明显影响。ISG 56和CXCL 10基因(图1.1J)。由于上述实验对293个稳定表达M的细胞进行了实验，我们进一步评估了M对细胞活力的影响。细胞增殖试验证实M对细胞活力无影响。1K)。综上所述，这些结果表明M作为RNA病毒的抑制剂-触发天然免疫反应.

M抑制Mavs介导的下游抗病毒基因的诱导

接下来我们研究M介导的抑制先天抗病毒反应的机制。报告分析表明，M抑制IFN-β启动子和ISRE的激活，其介导的启动子和启动子的激活是通过过表达平台I卡、MDA 5和MAVS介导的，而对其下游组分TBK 1则无抑制作用(图1)。2A)。M对HEK 293细胞的NF-κB活化也有抑制作用，但对p65下游细胞无抑制作用。2A)。QPCR分析表明，M的异位表达抑制了IRF 3调控的转录。IFNB 1和ISG 56基因的过度表达导致的钻机-I卡，MDA 5和小牛，而不是TBK 1(图1)。2B)。在类似的实验中，M还抑制NF-κB控制的转录。肿瘤坏死因子和CXCL 10基因的过度表达导致的钻机-I卡，MDA 5和小牛，而不是p65(图6)。2C)。这些结果提示M在Mavs水平上抑制固有的抗病毒信号。

M蛋白负调控Mavs介导的信号传导。aM蛋白对不同成分介导的干扰素β启动子、ISRE和NF-κB激活的影响。将IFNβ启动子、ISRE或NF-κB报告子、M质粒和指示表达质粒转染HEK 293细胞20 h后进行荧光素酶检测。b, cM蛋白对多种成分介导的抗病毒基因转录的影响。用M转染HEK 293细胞，并将所述表达质粒转染15 h后，进行qPCR分析。图显示平均±SD，n=3.ns不显着，*p < 0.05, **p < 0.01 (Student’s unpaired t测试)

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共免疫共沉淀实验表明M与Mavs有特异性的联系，但在哺乳动物的过表达系统中不与rig-I、MDA 5或TBK 1相关(如图1所示)。3A，B)。进一步的实验表明，在HEK 293细胞中，SeV感染前后M蛋白与内源性Mavs有一定的相关性。3C)。体外GST下拉试验表明，M蛋白与Mavs直接相互作用，呈剂量依赖关系(图一)。三维空间)。结构域定位实验表明，Mavs跨膜结构域与M的结合是必需的，其中Mavs(360~540)与M蛋白的相互作用最强，而Mavs(180~540)和Mavs(100~540)与M蛋白的相互作用较弱，提示Mavs的中间片段(aa 100~360)抑制了其与M蛋白(Fig)的相互作用。3E)。所有的M截短，包括TM1/2(只包含两个N端跨膜结构域)和ΔTM1/2(缺少两个N端跨膜结构域)，与MAVS相互作用(如图所示)。3E)，表明M蛋白可以通过不同的片段与小牛相互作用。报告分析表明，M蛋白的两个N端跨膜结构域对β启动子激活的抑制作用是必需的。3F)以及小牛介导的下游转录IFNB 1和CXCL 10基因(图1.第三代)。一个可能的解释是，虽然M的多个基序可以介导它与VISA的关联，但只有TM1/2结构域抑制了VISA的激活。综上所述，这些结果提示M通过靶向Mavs抑制固有的抗病毒反应，其TM1/2结构域是这种抑制功能的关键。

M与小牛的相互作用a, bM蛋白在哺乳动物过度表达系统中与Mavs相互作用。将所述质粒转染HEK293T细胞20h，用所述抗体进行共沉淀和免疫印迹分析。cM蛋白与内源小牛的关系。标记表达M-的HEK 293细胞感染SeV(MOI=1)。免疫沉淀和免疫印迹分析。dM蛋白直接与小牛结合。将纯化的重组GST-M与谷胱甘肽琼脂糖微球结合，与重组His-Mavs共同孵育3h，用标记抗体免疫印迹法分析GST-M与GST-M的结合蛋白。eM-Mavs关联的域映射。将所指示的M和Mavs截短突变体转染HEK 293细胞20h后，用所指示的抗体进行免疫印迹分析。fM截短对SeV诱导的干扰素β启动子激活的影响。将IFN-β启动子荧光素酶质粒转染HEK 293细胞20 h，用MOI=1感染HEK 293细胞，待荧光素酶检测后12 h不感染HEK 293细胞。gM截短对Mavs介导的下游抗病毒基因转录的影响。用所述质粒转染HEK 293细胞15h后进行qPCR分析。图为平均±SD；n=3；ns不显着；*p < 0.05, **p < 0.01 (Student’s unpaired t测试)

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M损害小牛的聚集及其下游成分的招募

此前有报道称小牛的朊蛋白样聚集是激活病毒感染后先天抗病毒反应的关键。¹³我们研究了M是否会影响Mavs聚集体的形成。如图所示。4A经琼脂糖凝胶电泳(SDD-AGE)分析，M蛋白及其TM1/2截短而非ΔTM1/2截短对转染Mavs的聚集有抑制作用。以前，据报道SNX 8是小牛病毒感染后聚集所必需的。³¹如图所示。4BM蛋白破坏了小牛的自联想及其与SNX 8的联系。这些结果提示M蛋白通过抑制Mavs的聚集作用而破坏固有的抗病毒反应。

M蛋白抑制小牛的聚集及其下游成分的聚集。aM和TM1/2的过表达抑制Mavs的聚(I：C)引发的聚集。从转染指示质粒的HEK 293细胞中提取线粒体粗提物20 h，再用多聚(I：C)转染8h，用SDD-AGE和SDS-PAGE对提取液和全细胞裂解物进行分离，用所指示的抗体进行免疫印迹分析。bM蛋白对Mavs-SNX8相互作用的影响⊡将所述质粒转染HEK293T细胞20h后共沉淀，用所指示的抗体进行免疫印迹分析。cM蛋白干扰TRAF 3、TBK 1和IRF 3的合成。将所述质粒转染HEK293T细胞20h后共沉淀，用所指示的抗体进行免疫印迹分析。dM蛋白在体外能抑制MAVS与TRAF 3、TBK 1和IRF 3的相互作用。纯化的重组GST-MAVS与谷胱甘肽琼脂糖微球结合，并与转染FLAG-TRAF 3、FLAG-TBK 1、FLAG-IRF 3和/或M-HA的HEK 293细胞裂解液共同孵育。用所指示的抗体免疫印迹法分析珠结合蛋白。

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Mavs在聚集过程中起着中心平台的作用，可以招募TRAF 3、TBK 1和IRF 3等下游信号元件，进而诱导下游抗病毒基因的产生。¹⁶共免疫共沉淀实验表明，M蛋白破坏了TRAF 3、TBK 1和IRF 3的合成，但对Mavs与Rig-I或MDA5的相互作用无明显影响(图5)。4C)。体外GST下拉试验显示M蛋白抑制MAVS与TRAF 3、TBK 1和IRF 3的结合。4D)。这些结果提示M蛋白能抑制TRAF 3、TBK 1和IRF 3在MAVS复合物中的表达，从而抑制MAVS的固有抗病毒反应。

在与宿主共同进化的过程中，病毒进化出了多种逃避宿主免疫防御的机制。^32,33,34SARS-CoV-2是如何避开宿主免疫防御的尚不清楚。在本研究中，我们发现SARS-CoV-2M蛋白是抑制宿主抗病毒天然免疫的一个因素，它直接针对RLR介导的Ⅰ型IFN诱导的中枢适配器Mavs。

几条证据表明M直接针对小牛抑制天然免疫反应。M蛋白对SARS-CoV-2-、SeV-和PolyI：C诱导的下游抗病毒基因转录具有特异性抑制作用.M蛋白抑制了RIP I、MDA 5和Mavs介导的信号转导，但其下游组分TBK 1或p65不受抑制。免疫共沉淀和体外拉伸试验表明M蛋白与Mavs直接相互作用.进一步的研究表明，M蛋白损伤了病毒RNA诱导的Mavs聚集及其下游组分(如TRAF 3、TBK 1和IRF 3)的合成。这些结果提示M蛋白通过抑制Mavs的激活来避免固有的抗病毒反应。

以前，SARS-CoV和MERS-CoV已经发展出多种机制来逃避先天免疫反应.例如，SARS-CoV M、N、9b和NSP 1以及MERS-CoV M、ORF4a和ORF4b已被证明针对天然免疫反应通路中的不同信号成分。^28,29,35,36最近的研究发现SARS-CoV-2M，N，ORF3a，ORF 6，NSP 1，NSP 3，NSP 12，NSP 13，NSP 14和NSP 15可能是抑制干扰素β诱导的候选分子。^37,38特别是SARS-CoV M蛋白通过抑制TRAF 3/坦克/TBK 1复合物而抑制天然免疫应答。^28,35而MERS-CoV M蛋白则破坏了TBK 1介导的IRF 3磷酸化。³⁹考虑到这些结果和我们的研究结果，SARS-CoV病毒家族可能利用其M蛋白作为规避宿主天然免疫系统的一般策略。我们目前的发现有助于了解SARS-CoV-2与宿主之间复杂的相互作用，并为SARS-CoV-2干预措施的制定提供了一个潜在的目标。

试剂、抗体、病毒和细胞

从上述厂家购买了以下试剂：脂质体2000(Invitrogen)；普罗霉素(Thermo)；双特异性荧光素酶分析试剂盒(Promega)；SYBR(Bio-RAD)；聚丁烯(Milli孔隙)；MTT(MedChemExpress)；人IFN-β和肿瘤坏死因子-α(4A生物技术)ELISA试剂盒；抗国旗和β-actin(Sigma)、His和HA(Origene)、MYC(9B11)和IKkβ(8943 S)(细胞信号技术)的小鼠抗体；兔抗HA、荧光粉-IKKα(Ser 176)/β(Ser 177)(细胞信号传导技术)、荧光粉TBK 1(Ab109272)和TBK 1(Ab40676)(ABCAM)的单克隆抗体和兔抗Mavs(B乙基)的多克隆抗体。HEK 293、HeLa和HEK293T细胞购自ATCC。通过慢病毒转导获得稳定表达ACE 2(HEK293-ACE 2)的HEK 293细胞。SEV(坎特尔株)得到了如前所述。⁴⁰SARS-CoV-2(IVCAS 6.7512)是从2019年12月在武汉采集的一例病毒性肺炎患者的BALF中分离得到的。⁴¹分离的病毒颗粒在Vero E6细胞中增殖。⁴²HEK293-ACE 2细胞感染SARS-CoV-2后，在武汉的生物安全水平4(BSL-4)实验室进行检测。

质粒构建

本文首先介绍了干扰素β启动子、isre和nf-κB荧光素酶报告质粒，以及含有ha标记的rig-i、mda 5、mavs、trf 3和tbk 1的哺乳动物表达质粒。^14,43用标准分子生物学技术构建了标志标记M、MYC-和HA标记M及其突变体。

转染和报告试验

荧光素酶检测用双特异性荧光素酶分析试剂盒(Promega)进行。细胞(1×10)⁵)在48孔板上播种，第二天用标准磷酸钙沉淀转染。在同一实验中，加入空白对照质粒，以保证每次转染的总DNA量相同。为使转染效率正常化，PRL-TK的μg为0.01g(雷尼拉将荧光素酶(荧光素酶)报告质粒加入每一次转染。³¹

实时PCR

提取总RNA进行qPCR分析，检测所指示基因的mRNA水平。所显示的数据是所指示的mRNAs的相对丰度与GAPDH的相对丰度。引物序列IFNB 1, ISG 56, CXCL 10, 肿瘤坏死因子，并对GAPDH进行了描述。^31,40SARS-CoV-2S引物CTTCCCTCAGTCAGCACCTC(前)和AACCAGTGTGGCCATTTGA(反向)以及SARS-CoV-2E引物TCGTTTCGGAAGAGACAGGT(正向)和CACGAGATAAAAGAAGG(反向)。

ELISA法

HEK293-M或对照细胞感染SeV或PolyI：C 8h，用ELISA法检测IFN-β和TNF-α。

免疫共沉淀和免疫印迹分析

免疫共沉淀和免疫印迹分析进行了如前所述。^34,44简而言之，对于免疫共沉淀，细胞(1×10)⁷)在NP-40裂解缓冲液(20 mM Tris-HCl[pH7.4]，150 mm NaCl，1mM EDTA，1%NOINIDT P-40，10μ/mL抑肽酶，10μg/mL白肽，1mm苯甲基磺酰氟)中溶解。直接分析蛋白表达，用SDS-PAGE负载缓冲液溶解细胞后超声处理。

GST下拉分析

将GST-M与谷胱甘肽琼脂糖微球结合，与纯化的His-Mavs或HEK293T细胞裂解液共同孵育，瞬时表达FLAG-TBK 1、FLAg-IRF 3或Flat-TRAF 3，与空质粒或HA-M质粒共同孵育3h，用裂解缓冲液(20 mm Tris-HCl[pH7.4]、150 mm NaCl、1mm EDTA、1%NP-40、10μg/mL抑肽酶、10μg/mL亮蛋白、1mm苯磺酰氟)洗涤3次。然后将其与SDS负载缓冲液混合，煮沸10 min。用SDS-PAGE分析输入/洗脱液，用Coomassie染色和/或免疫印迹法进行分析。

半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳(SDD-age)

进行了半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳(SDD-age)。¹⁴在1×样品缓冲液(0.5×TBE，10%甘油，2%十二烷基硫酸钠，0.0025%溴酚蓝)中，粗线粒体再悬浮于1.5%琼脂糖凝胶(Bio-Rad)上。在运行缓冲液(1×TBE和0.01%SDS)中电泳50 min，在4°C下电压为100 V时，将蛋白转移到固定膜(Milli孔隙)上进行免疫印迹分析。

MTT法

细胞接种于96孔培养板(2000细胞/200 L/孔)中，用5%CO2孵育器孵育。在相应的时间点，加入10 L MTT原液(5mg/mL)，将细胞置于5%CO2孵育器中孵育4h，去除培养液，将细胞形成的福尔马林晶体溶解在100 L DMSO中。在多阱平板阅读器上，在570 nm波长处读取吸光度。