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能量代谢对乳腺癌细胞力学性能的影响

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发表时间:2020-10-26 16:24作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

肿瘤的发生会引起肌动蛋白皮质重构,从而使癌细胞变软。细胞变形能力在很大程度上是由肌球蛋白驱动的皮质张力和细胞皮层肌动蛋白纤维结构所决定的。然而,目前还不清楚每一项贡献的权重,以及这些贡献在癌症发展过程中的变化。此外,人们很少关注能量代谢对这一现象的影响及其在癌症中的重新规划。在此,我们根据幂律流变学进行了精确的二维机械表型分析,揭示了肌球蛋白Ⅱ、肌动蛋白纤维结构和能量代谢对健康(MCF-10A)、非侵袭性癌(MCF-7)和转移性(MDA-MB-231)人乳腺上皮细胞变形能力的贡献。与认为肌动蛋白皮层是一种对细胞提供机械抗性的被动结构相反,我们发现只有当肌动蛋白皮层被代谢过程激活时,这才是正确的。结果显示,增强细胞刚性的活动过程的性质有显著差异,即健康细胞使用ATP驱动的肌动蛋白聚合,而转移细胞则使用肌球蛋白II活性。非侵袭性癌细胞表现出异常行为,因为它们的僵硬程度不受营养和ATP缺乏的影响,这表明能量代谢重新编程被用于维持肌动蛋白皮层的活跃过程。

导言

现在人们普遍认识到,细胞可以被描述为机械系统,其特性受生物化学信号的控制。1,2。肌动蛋白皮质是细胞力学的主要决定因素。3。这是一个由半柔性肌动蛋白丝(丝状肌动蛋白,或F-肌动蛋白)组成的大致各向同性聚合物网络,由特殊的肌动蛋白结合蛋白交联而成,含有运动蛋白,在网络内产生压力。4,5。肿瘤发生导致细胞肌动蛋白皮质结构和组成发生剧烈变化。3,6,7...主要的结果是癌细胞变软了。7,8,9,10,11,这似乎为不受控制的分裂、渗透和迁移提供了关键优势。8,12。要理解机械开关在癌症中的生物学意义,就需要从三个层面破译细胞骨架皮层的变化:成分、组织和活动。不幸的是,我们对这些机制的了解仍然很贫乏。原因之一是由于肌动蛋白皮质的位置和厚度较小,很难用光学显微镜观察,100 nm3,5。在这个复杂的谜题中,大多数先前的工作都指向顶端肌动蛋白网络结构和肌球蛋白II马达产生的皮质张力,它们通过相互牵引肌动蛋白丝来产生收缩应力。3,5,13。在文献中,每一种效应的权重往往是两极化的。几项基于荧光显微镜和原子力显微镜的研究表明,肌动蛋白网络在癌细胞中的密度一般较小,组织较少,提示肌动蛋白皮质的改变是癌细胞变形性的主要原因。10,14,15。另一方面,有报道指出细胞刚度主要受皮层张力的控制,因此肌球蛋白Ⅱ运动的活性起着至关重要的作用。4,5,16,17,18...令人惊讶的是,很少有人注意到,Actomyosin皮层是由活动过程维持的,其特征时间从秒到几十秒,需要ATP形式的能量。3,4,5,19。癌症细胞需要比正常细胞更高水平的能量,以刺激其不受控制的细胞生长和分裂。反常的能量代谢是癌症的一个重要特征,诺贝尔奖得主奥托·沃伯格在20世纪20年代发现了这一现象。20,21,22.

为了确定细胞在癌症中所经历的肌动蛋白皮质的关键变化,需要精确的方法来量化单个细胞的整体力学特性。细胞是非常复杂的材料。引人注目的是,它们的力学性能服从一种简单的行为:复刚度取决于幂律的频率,即,\SIM(Iω\右),在哪里(i=\xrt{-1}\), β是一般范围在0(弹性固体)和1(粘性液体)之间的幂律指数。23,24,25。在不同的条件下,各种不同的细胞类型,以及各种方法,都观察到了功率定律的流变响应。此外,权力规律的行为在几十年的频率,即0.01到1千赫之间.这种机械反应的起源仍然令人费解。一个看似合理的解释来自软玻璃流变学理论,该理论将细胞骨架描述为一个无序的、亚稳态的元素网络,这些元素被微弱的吸引力连接在一起,并因此被困在具有广泛深度的能量井中。幂律指数β是与物质的有效温度(系统中的搅拌能量)有关的,它决定了元素在能量井之间跳跃的概率,并反映了系统的动力学。26.

最广泛的测量细胞力学性能的技术是原子力显微镜(AFM)。在该技术中,测量了柔性微悬臂梁在探针压痕过程中的挠度,并将纳米或微米尺寸的探针固定在微悬臂梁的末端。产生的力量((挠度)VS压痕曲线用解析力学接触模型拟合得到单元的弹性模量。10,27,28,29,30。不幸的是,这种方法避免了单元的幂律行为,使力在很大程度上依赖于加载历史。最近,一种将接触力学和幂律行为结合起来的模型被开发出来,为更准确地描述细胞的力学表型打开了大门。31.

本工作旨在阐明肌动蛋白皮质组织、皮质张力和细胞代谢如何增强细胞的刚度,以及这些贡献在肿瘤和转移中是如何被改变的。为此,我们采用计算方法,对不同恶性程度的人乳腺上皮细胞进行幂律流变参数的测定,从传统的afm力与压痕曲线上求出幂律参数。31。我们了解到肌动蛋白皮质对细胞力学性质的不同贡献,通过选择性地破坏肌动蛋白丝状体和细胞松弛素D,抑制肌球蛋白II的活性,并使细胞处于能量饥饿的状态。

结果和讨论

细胞的幂律流变学分析

细胞用直径为10m的刚性球形探针压入柔顺的微悬臂的自由端(见图)。1A-D)。力为悬臂弹簧常数(≈0.2N/m)乘以激光束偏转法测得的悬臂梁挠度。微悬臂梁的最大力约为2.5-3 nn,导致压痕深度范围为100 nm至1~2m,然后将微悬臂收缩至初始位置。对力与位移的关系进行处理,得到力与压痕深度的关系。大的胶体探针和较高的作用力是为了模糊细胞三维的空间异质性,从而获得细胞整体力学性能的全局信息。图形1E当加载速率为1m/s时,将力作为MCF-10A中压痕深度和时间的函数表示,弹性试样的时间维数是无意义的,这意味着压痕面包含了获得弹性模量所需的所有信息。粘弹性行为表现为力与压痕深度曲线上的滞回曲线(图1)。1F)。在这种情况下,力不仅仅是压痕深度的函数,它还取决于加载历史,因此也取决于时间。通常,一个表观弹性模量是通过拟合接近阶段赫兹模型,从而忽略了收缩阶段,因此样品粘弹性(图一)。1F)。最近,Efremov和Raman开发了基于丁氏模型的数值程序,允许将任意线性粘弹性本构方程与赫兹模型结合起来,将探针与样品的相互作用描述为压痕深度和时间的函数。31,32。我们在这里使用这种方法,假设粘弹性来自于细胞的软玻璃行为。从而给出了电池的弹性松弛模量。(E_0)左({{t}{t}\右)^\β\),在哪里E0是任意参考时间下的表观弹性模量。t0在这里定义为1 s.图1F结果表明,该模型的数值拟合既适用于接近阶段,也适用于收缩阶段。我们注意到,在这里所考察的所有条件下,探针和被测细胞之间的粘附力是可以忽略的,这是用赫兹模型来描述接触力学所必需的。

图1:原子力显微镜观察活细胞的力学特性。
figure1

A用于测量附着在柔性微悬臂的自由端的微球与细胞之间的力的实验装置的原理图。采用激光束偏转法测量悬臂梁的挠度。B扫描电子显微镜图像的微悬臂用于本工作。悬臂由硅制成,长450米,宽50米,厚2米。名义弹簧常数为0.2N/m。C扫描电镜图像为直径10m的硼硅酸盐玻璃球,用于缩进细胞。D荧光显微镜图像的固定MCF-10A细胞,显示肌动蛋白丝(绿色)和细胞核(蓝色)。E在正常条件下,MCF-10A细胞的压痕深度和时间与力的三维曲线。F中显示的三维曲线的力与压痕深度平面E。接近相和收缩相之间的滞后反映了导致能量损失的细胞的粘弹性行为。赫兹模型只能适用于接近阶段。基于丁氏模型和幂律流变学的数值方法拟合了整个曲线.

图形2A结果表明,当加载速率分别为0.1、0.33、1、3.3和10m/s时,MCF-10A单元所获得的力和压痕深度随时间的变化而变化,并与PLR-汀模型进行了数值拟合。实验与模型的很好的一致性表明,电池的力学性能可以用两个PLR参数来描述。E0β。为了验证该方法的一致性,我们比较了MCF-10A单元在不同加载速率下获得的PLR参数。2B)。数据显示,幂律行为与加载速率的相关性较弱,表明该方法提供了能较好地描述电池在三条以上的相互作用时间范围内的力学性能的幂律流变参数。我们注意到,在以往的工作中,PLR参数是由将力曲线的接近相位与赫兹模型拟合得到的弹性模量的加载率依赖关系得到的。31。图形2C给出了TING模型得到的PLR参数(在加载速率上的平均值)与基于Hertz模型的PLR参数的比较。数据的检验表明,采用后一种方法得到的PLR参数分布较宽。重要的是,幂律指数被低估了。与丁的模型相比,基于赫兹模型的PLR参数的获取方法在理论上是不支持的,因此它只提供了对实数的粗略逼近。在此基础上,用plr参数表征了晶胞的力学性能。E0β由丁的模型得到的平均五种加载率在这里使用。

图2:用于测量电池幂律流变参数的方法的流程图.
figure2

A力和压痕深度作为压痕时间的函数,加载速率为0.1,0.33,1,3.3和10m/s(厚线)。适合丁的模型也显示(破折号线)。B幂律流变参数的盒形图,E0β将力曲线拟合到加载速率分别为0.1、0.33、1、3.3和10m/s的丁氏模型,并给出了Hertz模型得到的弹性模量(中间图)。赫兹弹性模量盒中的线表示平均值与幂律的拟合。符号表示实验数据,方框为(25%,75%)分位数,误差栏为标准差。n=17(0.1米/秒),n=48(0.33平方米/秒),n=67(1毫米/秒),n=71(3.3米/秒),n=64(10毫米/秒)。C通过拟合赫兹弹性模量的加载速率关系得到的锁相环参数与在各力曲线上采用丁氏法并对加载速率进行平均得到的PLR参数进行了比较。符号表示实验数据,方框为(25%,75%)分位数,误差栏为标准差。n=66个MCF-10A细胞。

肿瘤发生和侵袭的力学特征

图形3A给出了非致瘤性MCF-10A、致瘤性非转移性MCF-7和转移性MDA-MB-231细胞的PLR参数.结果表明,致瘤细胞比健康的细胞柔软。事实上,E0良、恶性、浸润性表型分别为1.14±0.65、0.26±0.16、0.46±0.24kPa。有趣的是,侵袭性癌细胞比非侵袭性癌细胞更坚硬.这些结果使人怀疑细胞的变形能力是否可以作为转移潜能的生物标志物。33,34,35。变形性和侵袭性之间的相关性是简单的证明,因为转移细胞需要通过狭窄的间隙变形,因为它们侵入周围的组织并转移到遥远的部位。8,36。然而,转移性癌细胞的高迁移能力也要求将化学能有效地转化为机械功。在这一机制中,分子运动肌球蛋白II在其底物肌动蛋白丝上的活性是基本的。35,37,38,39。迁移需要一个强大的Atomyosin网络,这为MDA-MB-231细胞相对于MCF-7细胞的更高刚度提供了一个合理的解释。在分析细胞骨架药物和ATP耗竭对细胞机械反应的影响时,这一假说在下文得到了加强。这三种细胞系在幂律指数上也表现出重要的差异,βMCF-10A细胞为0.186±0.049,MCF-7细胞为0.234±0.060,MDA-MB-231细胞为0.147±0.061。非侵袭性癌细胞比正常人表现出更多的流体样行为。有趣的是,转移细胞的幂律指数是最低的,这表明转移细胞的弹性行为可以方便增强的迁移和通过狭窄的孔隙。

图3:正常情况下所研究的乳腺细胞系的幂律流变学参数。

A参考时间为1s的表观弹性模量的盒形图,E0幂律指数,β。符号表示实验数据,方框为(25%,75%)分位数,误差栏为标准差。这个E0值符合对数正态分布,而β数值符合正态分布。n=66个MCF-10A细胞,n=67个MCF-7细胞,n=61个MDA-MB-231细胞。B颜色强度图的概率密度的实部和虚部的刚度(E‘,E“)每个细胞系。概率密度等值线(厚线)代表最大概率密度的一半。破折线是常数的等值线。β.

图形3B显示了实数的二维概率密度(E‘)和想象(E“)部分刚度,(e_0{{}{cos}}\左[{\frac{2}\β}\右]\)(e_0{{}{sin}}\左[{\frac{2}\β}\右]\)分别。数据表明,在这两个正交参数的基础上,三种细胞系表现出三种明显的机械表型。我们指出,这种最优单元分类依赖于用于测量单元的幂律机械响应的方法的鲁棒性和精度。

细胞骨架药物和ATP耗竭对细胞流变学的影响

细胞肌动蛋白皮层的力学性质由三个关键组分决定:肌动蛋白网络组织、肌动蛋白/肌球蛋白Ⅱ相互作用、肌动蛋白聚合/解聚和运动活性等能持续过程。这些成分分别是通过肌动蛋白干扰物细胞松弛素D,肌球蛋白II抑制剂,博比司他汀和ATP耗竭来靶向的。细胞松弛素D是一种能抑制肌动蛋白聚合和破坏肌动蛋白微丝的真菌毒素。40,41。布比司他阻断肌动蛋白分离的国家元首中的肌球蛋白II,但它不干扰肌球蛋白与肌动蛋白的结合,也不干扰ATP诱导的肌球蛋白解离。42,43。因此,白藜芦醇只会抑制向产生武力的国家的过渡。ATP耗竭既能防止细胞内的运动,又能防止聚合反应的发生。在肌动蛋白皮质水平,肌球蛋白Ⅱ和肌动蛋白聚合所产生的力均受到抑制。44,45。图形4综述了细胞骨架药物和ATP耗竭对细胞力学性能的影响。图形4A分别显示E0β以下称为刚度模量和流动性参数。图形4B给出了刚度的实部和虚部的二维概率密度.细胞松弛素D使细胞的力学性能发生了最剧烈的变化,使细胞的变形性和流动性都有了显著的提高。在正常细胞和转移细胞中,刚度模量下降了4倍左右,在非侵袭性癌细胞中下降了大约一半。在二维刚度复空间中,未处理细胞和细胞松弛素D处理细胞的概率密度可明显分离。肌动蛋白皮质的紊乱使细胞的刚度依赖于其他细胞的机械成分。最近的工作指出细胞质的重要性,细胞质的最大部分,在细胞的机械抵抗变形。46,47。细胞质流变学在很大程度上取决于变形的时空尺度。在我们的实验条件下,细胞质反应接近粘性流体。46,47。这与我们在细胞松弛素D处理实验中观察到的流动性的大幅度增加是一致的。

图4:所研究的乳腺细胞系的幂律流变学参数:在正常情况下,用白藜芦丁处理,用细胞松弛素D处理,以及在ATP耗竭条件下。

A参考时间为1s的表观弹性模量的盒形图,E0幂律指数,β。符号表示实验值,方框表示(25%,75%)分位数,误差条表示标准偏差。n(mcf-10A)=66(正常),25(Bb),33(cyto-D),37(ATP-del);n(mcf-7)=67(正常),32(Bb),26(cyto-D),46(ATP-del);n(MDA-MB-231)=61(正常),32(BLOB),21(Cyto-D),37(ATP-DIP).B颜色强度图的概率密度的实部和虚部的刚度(E‘,E“)对于每个细胞系和不同的条件。概率密度等值线(厚线)代表最大概率密度的一半。虚线是常数的等值线。β.

我们现在关注ATP耗竭和肌球蛋白II运动抑制对正常和转移细胞的影响。ATP耗竭使正常细胞和转移细胞的刚度模量下降,与细胞松弛素D引起的刚度模量下降非常相似,但流动性也有所增加,但在刚度复杂空间中,正常细胞在ATP耗尽和细胞松弛素D处理下的概率密度在真实方向上集中在一个相似的位置,并在假想方向分离。在转移细胞的情况下,由于ATP缺乏的细胞PLR参数的变异性,这两种分布都表现出很大的重叠。布比司他汀对MCF-10A和MDA-MB-231细胞有不同的机械反应.健康细胞几乎对博比司他汀的治疗免疫。刚度模量保持不变,流动性略有提高。相反,转移细胞的刚度模量下降幅度与ATP耗竭条件下相似,尽管流动性增加较小。肌球蛋白II在生成使mda-mbb-231细胞具有阿米巴样迁移能力的力量方面起着重要作用。37,38。的确,伯比司他汀抑制了转移细胞的迁移。我们的数据指出肌球蛋白Ⅱ的活性也控制转移细胞的僵硬度。35。皮质张力是由肌球蛋白II调节的,它是通过相互牵张肌动蛋白纤维来调节的。

ATP耗竭对非侵袭性癌细胞MCF-7细胞的影响与其他细胞系观察到的行为不同。在能量饥饿条件下,刚度模量基本保持不变。流动性增加,但低于细胞松弛素D处理。博来司他与侵袭性MDA-MB-231细胞的作用相似,刚度模量降低,流动性增加,但这些变化不明显。

活动过程对细胞弹性的贡献

为了更好地理解这些结果,我们提出了一个简单的现象学模型,该模型描述了细胞的机械反应,它是由平行排列的机械元件组成的,代表肌球蛋白Ⅱ活性、根尖肌动蛋白网络和其他细胞成分(主要是细胞质)的贡献。每个机械元件都表现出PLR响应,它被表示为“弹簧”,而不是用来描述粘弹性材料的弹簧和仪表盘的传统组合。48(无花果)5A)。重要的是,该模型区分了支持能量饥饿的肌动蛋白皮质成分和需要消耗能量的肌动蛋白皮质成分。虽然肌动蛋白聚合是atp的主要消费者之一,但在没有atp的情况下,细胞在稳定肌动蛋白细胞骨架方面起着非常保守的作用。45,49。这与细胞的静止状态是一致的,在这种状态下,肌动蛋白皮层采用最小但稳定的构象。共聚焦荧光显微镜显示肌动蛋白纤维大部分保存在ATP耗竭条件下(附图)。1)。该模型的示意图如图所示。5B。在我们的模型中,我们假设肌动蛋白网络、肌球蛋白Ⅱ和能量驱动的actomyosin的贡献分别是由细胞松弛素D、博比司他汀和ATP耗竭所致。在此模型的基础上,我们表示了这些部件对刚度的弹性分量的相对贡献。左(e_0{{_0){{max}\\β}\\左({\frac{p}{2}\β}\\右)(无花果)5C).

图5:解除肌动蛋白网络、肌球蛋白Ⅱ驱动的收缩能力和ATP水解对细胞刚度的影响.
figure5

A用于表示PLR响应的机械元件“跳泉”的草图。它的行为就像一个弹簧β=0,并且当β=1。B不同弹跳器的原理图,它们平行地为细胞提供刚度。该模型区分了支持能量饥饿的肌动蛋白皮质成分(被动肌动蛋白)和那些需要能量消耗的成分(活性肌动蛋白和肌球蛋白II)。在实验条件下,我们假设细胞质呈流体状行为(见正文)。C细胞质、肌动蛋白网络、肌球蛋白Ⅱ和ATP水解对乳腺细胞整体弹性的相对贡献。

该模型表明,在正常和转移细胞中,肌动蛋白皮质贡献了75%-80%的弹性。在非侵袭性癌细胞中,这一贡献在很大程度上减少到40%左右.这种差异行为与这些细胞异常柔软一致,表明它们具有极小的肌动蛋白皮质结构。在正常细胞中,大部分的肌动蛋白皮质弹性是基于ATP驱动的过程(≈95%),主要是肌动蛋白聚合过程。肌球蛋白Ⅱ活性对细胞弹性的贡献微乎其微。同样,在转移细胞中,ATP水解维持了大部分的肌动蛋白皮质弹性(≈85%)。然而,大部分“活跃”的肌动蛋白皮质弹性来自肌球蛋白Ⅱ活性(≈90%)。从MCF-10和MDA-MB-231细胞的实验结果可以得出相关结论.相反,肌动蛋白皮层作为一个被动的结构,提供对细胞的机械阻力,只有当肌动蛋白皮层被ATP驱动的过程激活时,这种机械阻力才能实现。此外,正常细胞和转移细胞在消耗能量的过程中也有所不同。Mcf-10A细胞刚度主要由肌动蛋白聚合维持,而在MDA-MB-231细胞中,其刚度主要依赖于肌球蛋白Ⅱ的活性。

在这种观点下,非侵袭性癌细胞对弹性表现出异常的代谢效应.肌动蛋白皮质弹性对ATP和营养素缺乏不敏感,但当肌球蛋白Ⅱ活性受到抑制时,肌动蛋白皮质弹性下降约75%。这一惊人的结果表明,MCF-7细胞可以在饥饿条件下维持运动活动.由于MCF-7细胞表现出经济行为球蛋白皮质,能量成本较低.我们假设MCF-7细胞可以使用其他途径来维持某些活跃的过程.癌细胞新陈代谢的一个共同特点是能够从经常缺乏营养的环境中获得必要的营养,并利用这些营养来维持生存能力和建立新的生物量。21,22。即使在我们的条件下,没有可用的细胞外营养,一些癌细胞可以承受长时间的自我分解过程中的自噬。

结语

在此,我们证明AFM能够根据细胞的幂律流变学参数精确地提供细胞的二维力学表型。数据显示,在这里检查的三种细胞系,即代表正常组织的乳腺上皮细胞株、非侵袭性癌和转移性癌,表现出三种可区分的机械表型。精确的机械表型与细胞骨架药物和ATP耗竭疗法相结合,可以勾勒出根尖肌动蛋白网络、肌球蛋白Ⅱ驱动的收缩张力和ATP活性对细胞变形能力的贡献。从这里使用的方法可以得出相关的结论。这些结论超出了众所周知的格言“癌细胞比正常人更柔软”。相反,我们发现,只有当肌动蛋白皮层被代谢过程激活时,肌动蛋白皮层才是对细胞提供机械抵抗的被动结构。结果表明,增强细胞刚度的活动过程的性质有明显的差异。健康细胞使用ATP驱动的肌动蛋白聚合,而转移细胞则使用肌球蛋白II活性.非侵入性癌细胞表现出异常行为,因为它们的僵硬度几乎不受营养和ATP缺乏的影响,这表明能量代谢重新编程被用于维持肌动蛋白皮层的活跃过程。综上所述,能量代谢与细胞刚度密切相关。细胞骨架的重塑和能量代谢的重新编程是相关的癌症标志。我们的工作为揭示这两个癌症特征之间的联系以及进行药物分析提供了一个方法。

方法

细胞培养

Mcf-7、MDA-MB-231和MCF-10A细胞系是从美国类型培养集(美国ATCC)购买的。在Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(DMEM,吉布科,生命技术公司,洛克维尔,MD,美国)中添加10%FBS、500 U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。McF-10A细胞在添加5%马血清、20 ng/ml表皮生长因子、0.5g/ml氢化可的松、100 ng/ml霍乱毒素、10μg/ml胰岛素、500 U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM/F12培养基中培养。细胞在5%CO中维持在37°C。2在加湿的孵化器里。由于力学性能取决于细胞间的接触和细胞的运动状态,我们在细胞汇合或处于稳定状态后进行了原子力显微镜测量。50,51。这是通过在密度为2×10的条件下播种细胞来实现的。5细胞/毫升于35毫米细胞培养板(Corning CellBIND Surface)24-36h后(附图)。2).

药物和ATP耗竭疗法

全ATP耗竭需要抑制氧化代谢和糖酵解代谢。这是通过在无糖培养基中添加20 mm NaN来实现的。35毫米2-脱氧-D-葡萄糖。培养1h后进行AFM测定。在细胞培养基中加入细胞松弛素D,以5 g/ml的浓度抑制肌动蛋白聚合,10 min后进行AFM测定。为了抑制非肌肉肌球蛋白II,在AFM测定前,在细胞培养液(50M)中加入博比司他汀(50M)1h。用原子力显微镜测量时,未去除治疗。在所有处理中,剂量和孵育时间远远超过达到细胞饱和反应的阈值。52,53,54,55,但是保持他们的生存能力56,57,58.

原子力显微镜

AFM实验用JPK纳米向导进行®4安装在倒置光学显微镜上(Leica DMI 6000-CS,德国)。在测量前,用标称弹簧常数为0.2N/m(CP-COT-BSG,NanoMore GmbH,德国)的硅微悬臂自由端安装了直径为10m的硼硅酸盐玻璃球形探头进行了力-距离(斜率)曲线的测量,并利用该仪器的热噪声自动分析软件对光电探测器的弹簧常数和位移灵敏度进行了标定。以0.1、0.33、1、3.3和10m/s 5种不同的尖端速度,在同一位置测量细胞核顶部,用基于Efremov等人的Wolfram Mathematica(Wolfram Research)自定义算法进行幂律流变分析。28方法。首先求出了每个单元在不同加载速率下的幂律流变参数的平均值,并在五种加载速率下对所得值进行了平均值。微悬臂梁的最大力约为2.5-3 nn,导致压痕深度范围为100 nm到1-2m。基于丁氏模型获得细胞流变参数的算法可以包括有限厚度样品的底效应修正模型。27,28。然而,通过考虑有限厚度效应,我们既没有发现拟合的改进,也没有观察到最佳拟合参数的显著变化。因此,这一影响没有包括在数值配件中。

统计与重现性

功率流变学数据与正常条件下的MCF-10A细胞(4个独立实验)、ATP耗竭的MCF-10A细胞(3个独立实验)、细胞松弛素D(3个独立实验)、25 MCF-10A细胞(2个独立实验)、67个MCF-7细胞(5个独立实验)、46个MCF-7细胞ATP耗竭(4个独立实验)、26个MCF-7细胞经细胞松弛素D处理(4个独立实验)、32个MCF-7细胞(2个独立实验)相对应;61株MDA-MB-231细胞处于正常状态(4个独立实验),37个MDA-MB-231细胞处于ATP耗竭状态(3个独立实验),21个MDA-MB-231细胞经细胞松弛素D处理(2个独立实验),32个MDA-MB-231细胞被博比司他汀处理(2个独立实验)。实验于2018年6月至2020年2月进行。幂律流变参数在不同独立实验中呈现相似的统计分布.

免疫细胞化学与共聚焦显微镜

盖子玻璃用食人鱼溶液清洗,并在毫升Q水中涂上聚赖氨酸0.1%。干燥后暴露于紫外线下4h,培养24h,室温下用新鲜制备的4%多聚甲醛固定15 min,用PBS洗涤3次,每次5 min。然后用0.25%TritonX-100在PBS(PBST)中渗透10 min,3次后用PBS洗涤。染色前用1%牛血清白蛋白(BSA)阻断PBST 30 min。3次用PBS冲洗5 min后,加入phalloidin(Alexa Fluor 488 Phalloidin,6.6M,稀释1:20)15 min,冲洗,加入DAPI 0.5g/ml(细胞信号技术)。在PBS中再漂洗一次后,我们将样品装上延长的抗Fade试剂,允许室温下干燥24小时。我们在成像前用指甲漆封好了。共焦成像用共焦显微镜Nikon A1R HD 25在SMOC(Centro de Biología分子Severo Ochoa)上进行。

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