细胞的幂律流变学分析 细胞用直径为10m的刚性球形探针压入柔顺的微悬臂的自由端(见图)。 1A-D )。力为悬臂弹簧常数(≈0.2N/m)乘以激光束偏转法测得的悬臂梁挠度。微悬臂梁的最大力约为2.5-3 nn，导致压痕深度范围为 ∼ 100 nm至1~2m，然后将微悬臂收缩至初始位置。对力与位移的关系进行处理，得到力与压痕深度的关系。大的胶体探针和较高的作用力是为了模糊细胞三维的空间异质性，从而获得细胞整体力学性能的全局信息。图形 1E 当加载速率为1m/s时，将力作为MCF-10A中压痕深度和时间的函数表示，弹性试样的时间维数是无意义的，这意味着压痕面包含了获得弹性模量所需的所有信息。粘弹性行为表现为力与压痕深度曲线上的滞回曲线(图1)。 1F )。在这种情况下，力不仅仅是压痕深度的函数，它还取决于加载历史，因此也取决于时间。通常，一个表观弹性模量是通过拟合接近阶段赫兹模型，从而忽略了收缩阶段，因此样品粘弹性(图一)。 1F )。最近，Efremov和Raman开发了基于丁氏模型的数值程序，允许将任意线性粘弹性本构方程与赫兹模型结合起来，将探针与样品的相互作用描述为压痕深度和时间的函数。 31 ,32 。我们在这里使用这种方法，假设粘弹性来自于细胞的软玻璃行为。从而给出了电池的弹性松弛模量。 (E_0)左({{t}{t}\右)^\β\) ，在哪里 E 0 是任意参考时间下的表观弹性模量。 t 0 在这里定义为1 s.图 1F 结果表明，该模型的数值拟合既适用于接近阶段，也适用于收缩阶段。我们注意到，在这里所考察的所有条件下，探针和被测细胞之间的粘附力是可以忽略的，这是用赫兹模型来描述接触力学所必需的。
图1：原子力显微镜观察活细胞的力学特性。 A 用于测量附着在柔性微悬臂的自由端的微球与细胞之间的力的实验装置的原理图。采用激光束偏转法测量悬臂梁的挠度。 B 扫描电子显微镜图像的微悬臂用于本工作。悬臂由硅制成，长450米，宽50米，厚2米。名义弹簧常数为0.2N/m。 C 扫描电镜图像为直径10m的硼硅酸盐玻璃球，用于缩进细胞。 D 荧光显微镜图像的固定MCF-10A细胞，显示肌动蛋白丝(绿色)和细胞核(蓝色)。 E 在正常条件下，MCF-10A细胞的压痕深度和时间与力的三维曲线。 F 中显示的三维曲线的力与压痕深度平面 E 。接近相和收缩相之间的滞后反映了导致能量损失的细胞的粘弹性行为。赫兹模型只能适用于接近阶段。基于丁氏模型和幂律流变学的数值方法拟合了整个曲线.
图形 2A 结果表明，当加载速率分别为0.1、0.33、1、3.3和10m/s时，MCF-10A单元所获得的力和压痕深度随时间的变化而变化，并与PLR-汀模型进行了数值拟合。实验与模型的很好的一致性表明，电池的力学性能可以用两个PLR参数来描述。 E 0 和 β 。为了验证该方法的一致性，我们比较了MCF-10A单元在不同加载速率下获得的PLR参数。 2B )。数据显示，幂律行为与加载速率的相关性较弱，表明该方法提供了能较好地描述电池在三条以上的相互作用时间范围内的力学性能的幂律流变参数。我们注意到，在以往的工作中，PLR参数是由将力曲线的接近相位与赫兹模型拟合得到的弹性模量的加载率依赖关系得到的。 31 。图形 2C 给出了TING模型得到的PLR参数(在加载速率上的平均值)与基于Hertz模型的PLR参数的比较。数据的检验表明，采用后一种方法得到的PLR参数分布较宽。重要的是，幂律指数被低估了。与丁的模型相比，基于赫兹模型的PLR参数的获取方法在理论上是不支持的，因此它只提供了对实数的粗略逼近。在此基础上，用plr参数表征了晶胞的力学性能。 E 0 和 β 由丁的模型得到的平均五种加载率在这里使用。
图2：用于测量电池幂律流变参数的方法的流程图. A 力和压痕深度作为压痕时间的函数，加载速率为0.1，0.33，1，3.3和10m/s(厚线)。适合丁的模型也显示(破折号线)。 B 幂律流变参数的盒形图， E 0 和 β 将力曲线拟合到加载速率分别为0.1、0.33、1、3.3和10m/s的丁氏模型，并给出了Hertz模型得到的弹性模量(中间图)。赫兹弹性模量盒中的线表示平均值与幂律的拟合。符号表示实验数据，方框为(25%，75%)分位数，误差栏为标准差。 n =17(0.1米/秒)， n =48(0.33平方米/秒)， n =67(1毫米/秒)， n =71(3.3米/秒)， n =64(10毫米/秒)。 C 通过拟合赫兹弹性模量的加载速率关系得到的锁相环参数与在各力曲线上采用丁氏法并对加载速率进行平均得到的PLR参数进行了比较。符号表示实验数据，方框为(25%，75%)分位数，误差栏为标准差。 n =66个MCF-10A细胞。
肿瘤发生和侵袭的力学特征 图形 3A 给出了非致瘤性MCF-10A、致瘤性非转移性MCF-7和转移性MDA-MB-231细胞的PLR参数.结果表明，致瘤细胞比健康的细胞柔软。事实上, E 0 良、恶性、浸润性表型分别为1.14±0.65、0.26±0.16、0.46±0.24kPa。有趣的是，侵袭性癌细胞比非侵袭性癌细胞更坚硬.这些结果使人怀疑细胞的变形能力是否可以作为转移潜能的生物标志物。 33 ,34 ,35 。变形性和侵袭性之间的相关性是简单的证明，因为转移细胞需要通过狭窄的间隙变形，因为它们侵入周围的组织并转移到遥远的部位。 8 ,36 。然而，转移性癌细胞的高迁移能力也要求将化学能有效地转化为机械功。在这一机制中，分子运动肌球蛋白II在其底物肌动蛋白丝上的活性是基本的。 35 ,37 ,38 ,39 。迁移需要一个强大的Atomyosin网络，这为MDA-MB-231细胞相对于MCF-7细胞的更高刚度提供了一个合理的解释。在分析细胞骨架药物和ATP耗竭对细胞机械反应的影响时，这一假说在下文得到了加强。这三种细胞系在幂律指数上也表现出重要的差异， β MCF-10A细胞为0.186±0.049，MCF-7细胞为0.234±0.060，MDA-MB-231细胞为0.147±0.061。非侵袭性癌细胞比正常人表现出更多的流体样行为。有趣的是，转移细胞的幂律指数是最低的，这表明转移细胞的弹性行为可以方便增强的迁移和通过狭窄的孔隙。
图3：正常情况下所研究的乳腺细胞系的幂律流变学参数。 A 参考时间为1s的表观弹性模量的盒形图， E 0 幂律指数， β 。符号表示实验数据，方框为(25%，75%)分位数，误差栏为标准差。这个 E 0 值符合对数正态分布，而 β 数值符合正态分布。 n =66个MCF-10A细胞， n =67个MCF-7细胞， n =61个MDA-MB-231细胞。 B 颜色强度图的概率密度的实部和虚部的刚度( E ‘， E “)每个细胞系。概率密度等值线(厚线)代表最大概率密度的一半。破折线是常数的等值线。 β .
图形 3B 显示了实数的二维概率密度( E ‘)和想象( E “)部分刚度， (e_0{{}{cos}}\左[{\frac{2}\β}\右]\) 和 (e_0{{}{sin}}\左[{\frac{2}\β}\右]\) 分别。数据表明，在这两个正交参数的基础上，三种细胞系表现出三种明显的机械表型。我们指出，这种最优单元分类依赖于用于测量单元的幂律机械响应的方法的鲁棒性和精度。
细胞骨架药物和ATP耗竭对细胞流变学的影响 细胞肌动蛋白皮层的力学性质由三个关键组分决定：肌动蛋白网络组织、肌动蛋白/肌球蛋白Ⅱ相互作用、肌动蛋白聚合/解聚和运动活性等能持续过程。这些成分分别是通过肌动蛋白干扰物细胞松弛素D，肌球蛋白II抑制剂，博比司他汀和ATP耗竭来靶向的。细胞松弛素D是一种能抑制肌动蛋白聚合和破坏肌动蛋白微丝的真菌毒素。 40 ,41 。布比司他阻断肌动蛋白分离的国家元首中的肌球蛋白II，但它不干扰肌球蛋白与肌动蛋白的结合，也不干扰ATP诱导的肌球蛋白解离。 42 ,43 。因此，白藜芦醇只会抑制向产生武力的国家的过渡。ATP耗竭既能防止细胞内的运动，又能防止聚合反应的发生。在肌动蛋白皮质水平，肌球蛋白Ⅱ和肌动蛋白聚合所产生的力均受到抑制。 44 ,45 。图形 4 综述了细胞骨架药物和ATP耗竭对细胞力学性能的影响。图形 4A 分别显示 E 0 和 β 以下称为刚度模量和流动性参数。图形 4B 给出了刚度的实部和虚部的二维概率密度.细胞松弛素D使细胞的力学性能发生了最剧烈的变化，使细胞的变形性和流动性都有了显著的提高。在正常细胞和转移细胞中，刚度模量下降了4倍左右，在非侵袭性癌细胞中下降了大约一半。在二维刚度复空间中，未处理细胞和细胞松弛素D处理细胞的概率密度可明显分离。肌动蛋白皮质的紊乱使细胞的刚度依赖于其他细胞的机械成分。最近的工作指出细胞质的重要性，细胞质的最大部分，在细胞的机械抵抗变形。 46 ,47 。细胞质流变学在很大程度上取决于变形的时空尺度。在我们的实验条件下，细胞质反应接近粘性流体。 46 ,47 。这与我们在细胞松弛素D处理实验中观察到的流动性的大幅度增加是一致的。
图4：所研究的乳腺细胞系的幂律流变学参数：在正常情况下，用白藜芦丁处理，用细胞松弛素D处理，以及在ATP耗竭条件下。 A 参考时间为1s的表观弹性模量的盒形图， E 0 幂律指数， β 。符号表示实验值，方框表示(25%，75%)分位数，误差条表示标准偏差。 n (mcf-10A)=66(正常)，25(Bb)，33(cyto-D)，37(ATP-del)； n (mcf-7)=67(正常)，32(Bb)，26(cyto-D)，46(ATP-del)； n (MDA-MB-231)=61(正常)，32(BLOB)，21(Cyto-D)，37(ATP-DIP). B 颜色强度图的概率密度的实部和虚部的刚度( E ‘， E “)对于每个细胞系和不同的条件。概率密度等值线(厚线)代表最大概率密度的一半。虚线是常数的等值线。 β .
我们现在关注ATP耗竭和肌球蛋白II运动抑制对正常和转移细胞的影响。ATP耗竭使正常细胞和转移细胞的刚度模量下降，与细胞松弛素D引起的刚度模量下降非常相似，但流动性也有所增加，但在刚度复杂空间中，正常细胞在ATP耗尽和细胞松弛素D处理下的概率密度在真实方向上集中在一个相似的位置，并在假想方向分离。在转移细胞的情况下，由于ATP缺乏的细胞PLR参数的变异性，这两种分布都表现出很大的重叠。布比司他汀对MCF-10A和MDA-MB-231细胞有不同的机械反应.健康细胞几乎对博比司他汀的治疗免疫。刚度模量保持不变，流动性略有提高。相反，转移细胞的刚度模量下降幅度与ATP耗竭条件下相似，尽管流动性增加较小。肌球蛋白II在生成使mda-mbb-231细胞具有阿米巴样迁移能力的力量方面起着重要作用。 37 ,38 。的确，伯比司他汀抑制了转移细胞的迁移。我们的数据指出肌球蛋白Ⅱ的活性也控制转移细胞的僵硬度。 35 。皮质张力是由肌球蛋白II调节的，它是通过相互牵张肌动蛋白纤维来调节的。
ATP耗竭对非侵袭性癌细胞MCF-7细胞的影响与其他细胞系观察到的行为不同。在能量饥饿条件下，刚度模量基本保持不变。流动性增加，但低于细胞松弛素D处理。博来司他与侵袭性MDA-MB-231细胞的作用相似，刚度模量降低，流动性增加，但这些变化不明显。
活动过程对细胞弹性的贡献 为了更好地理解这些结果，我们提出了一个简单的现象学模型，该模型描述了细胞的机械反应，它是由平行排列的机械元件组成的，代表肌球蛋白Ⅱ活性、根尖肌动蛋白网络和其他细胞成分(主要是细胞质)的贡献。每个机械元件都表现出PLR响应，它被表示为“弹簧”，而不是用来描述粘弹性材料的弹簧和仪表盘的传统组合。 48 (无花果) 5A )。重要的是，该模型区分了支持能量饥饿的肌动蛋白皮质成分和需要消耗能量的肌动蛋白皮质成分。虽然肌动蛋白聚合是atp的主要消费者之一，但在没有atp的情况下，细胞在稳定肌动蛋白细胞骨架方面起着非常保守的作用。 45 ,49 。这与细胞的静止状态是一致的，在这种状态下，肌动蛋白皮层采用最小但稳定的构象。共聚焦荧光显微镜显示肌动蛋白纤维大部分保存在ATP耗竭条件下(附图)。 1 )。该模型的示意图如图所示。 5B 。在我们的模型中，我们假设肌动蛋白网络、肌球蛋白Ⅱ和能量驱动的actomyosin的贡献分别是由细胞松弛素D、博比司他汀和ATP耗竭所致。在此模型的基础上，我们表示了这些部件对刚度的弹性分量的相对贡献。 左(e_0{{_0){{max}\\β}\\左({\frac{p}{2}\β}\\右) (无花果) 5C ).
图5：解除肌动蛋白网络、肌球蛋白Ⅱ驱动的收缩能力和ATP水解对细胞刚度的影响. A 用于表示PLR响应的机械元件“跳泉”的草图。它的行为就像一个弹簧 β =0，并且当 β =1。 B 不同弹跳器的原理图，它们平行地为细胞提供刚度。该模型区分了支持能量饥饿的肌动蛋白皮质成分(被动肌动蛋白)和那些需要能量消耗的成分(活性肌动蛋白和肌球蛋白II)。在实验条件下，我们假设细胞质呈流体状行为(见正文)。 C 细胞质、肌动蛋白网络、肌球蛋白Ⅱ和ATP水解对乳腺细胞整体弹性的相对贡献。
该模型表明，在正常和转移细胞中，肌动蛋白皮质贡献了75%-80%的弹性。在非侵袭性癌细胞中，这一贡献在很大程度上减少到40%左右.这种差异行为与这些细胞异常柔软一致，表明它们具有极小的肌动蛋白皮质结构。在正常细胞中，大部分的肌动蛋白皮质弹性是基于ATP驱动的过程(≈95%)，主要是肌动蛋白聚合过程。肌球蛋白Ⅱ活性对细胞弹性的贡献微乎其微。同样，在转移细胞中，ATP水解维持了大部分的肌动蛋白皮质弹性(≈85%)。然而，大部分“活跃”的肌动蛋白皮质弹性来自肌球蛋白Ⅱ活性(≈90%)。从MCF-10和MDA-MB-231细胞的实验结果可以得出相关结论.相反，肌动蛋白皮层作为一个被动的结构，提供对细胞的机械阻力，只有当肌动蛋白皮层被ATP驱动的过程激活时，这种机械阻力才能实现。此外，正常细胞和转移细胞在消耗能量的过程中也有所不同。Mcf-10A细胞刚度主要由肌动蛋白聚合维持，而在MDA-MB-231细胞中，其刚度主要依赖于肌球蛋白Ⅱ的活性。
在这种观点下，非侵袭性癌细胞对弹性表现出异常的代谢效应.肌动蛋白皮质弹性对ATP和营养素缺乏不敏感，但当肌球蛋白Ⅱ活性受到抑制时，肌动蛋白皮质弹性下降约75%。这一惊人的结果表明，MCF-7细胞可以在饥饿条件下维持运动活动.由于MCF-7细胞表现出经济行为球蛋白皮质，能量成本较低.我们假设MCF-7细胞可以使用其他途径来维持某些活跃的过程.癌细胞新陈代谢的一个共同特点是能够从经常缺乏营养的环境中获得必要的营养，并利用这些营养来维持生存能力和建立新的生物量。 21 ,22 。即使在我们的条件下，没有可用的细胞外营养，一些癌细胞可以承受长时间的自我分解过程中的自噬。
结语 在此，我们证明AFM能够根据细胞的幂律流变学参数精确地提供细胞的二维力学表型。数据显示，在这里检查的三种细胞系，即代表正常组织的乳腺上皮细胞株、非侵袭性癌和转移性癌，表现出三种可区分的机械表型。精确的机械表型与细胞骨架药物和ATP耗竭疗法相结合，可以勾勒出根尖肌动蛋白网络、肌球蛋白Ⅱ驱动的收缩张力和ATP活性对细胞变形能力的贡献。从这里使用的方法可以得出相关的结论。这些结论超出了众所周知的格言“癌细胞比正常人更柔软”。相反，我们发现，只有当肌动蛋白皮层被代谢过程激活时，肌动蛋白皮层才是对细胞提供机械抵抗的被动结构。结果表明，增强细胞刚度的活动过程的性质有明显的差异。健康细胞使用ATP驱动的肌动蛋白聚合，而转移细胞则使用肌球蛋白II活性.非侵入性癌细胞表现出异常行为，因为它们的僵硬度几乎不受营养和ATP缺乏的影响，这表明能量代谢重新编程被用于维持肌动蛋白皮层的活跃过程。综上所述，能量代谢与细胞刚度密切相关。细胞骨架的重塑和能量代谢的重新编程是相关的癌症标志。我们的工作为揭示这两个癌症特征之间的联系以及进行药物分析提供了一个方法。
