不可逆电穿孔加同种异体Vγ9Vδ2 T细胞增强局部晚期胰腺癌患者的抗肿瘤作用

由于免疫抑制微环境(ISM)的存在，免疫治疗对局部晚期胰腺癌(LAPC)的疗效有限。不可逆电穿孔(IRE)不仅能诱导免疫原性细胞死亡，而且能减轻免疫抑制。本研究旨在探讨异基因γδT细胞联合IRE对LAPC患者的抗肿瘤作用。共有62名符合资格标准的患者被纳入本试验，然后随机分为两组(A：n=30和B：n=32)。所有患者均接受IRE治疗，A组患者至少连续接受两个周期的γδT细胞灌注治疗。A组生存率优于B组(中位OS：14.5个月对11个月；中位PFS：11个月对8.5个月)。此外，接受多疗程γδT细胞输注治疗的A组患者OS(17个月)比单一疗程(13.5个月)长。异基因γδT细胞输注是一种很有前途的抗肿瘤治疗策略，可延长患者的生存期。

ClinicalTrials.gov ID：NCT 03180437

胰腺癌(PDAC)是一种预后不良的疾病，在全世界范围内对癌症相关死亡率的影响越来越大。1根据美国癌症联合委员会(AJCC)的标准，~40%的PDAC患者(Ⅲ期)被诊断为局部晚期胰腺癌(LAPC)，其定义为主要血管结构的侵犯，导致无法切除但无转移的疾病。2,3

对于LAPC患者，以吉西他滨为基础的放疗方案为标准治疗方案，中位OS为9-11个月。3FOLFIRINOX化疗延长生存期，但化疗毒性和不良事件发生率高，限制了治疗的推广。2目前，免疫检查点抑制剂(ICI)已经在许多实体恶性肿瘤中显示了临床反应，但胰腺癌的结果一直令人失望。4据报道，免疫抑制间质限制了ICIS治疗PDAC的疗效。5此外，PDAC还含有大量免疫抑制细胞，包括调节性T细胞(Tregs)。6免疫抑制微环境(ISM)也能抑制肿瘤浸润淋巴细胞的活性。7,8因此，有必要对LAPC患者进行新的、有效的治疗。

局部烧蚀治疗(如放射治疗)在LAPC治疗中发挥了重要作用。9射频消融术已被描述为少数无法切除的疾病，但该技术仅限于邻近器官和血管的热损伤。9,10

不可逆电穿孔(IRE)是一种新的、非热的、微创的技术，已被FDA和CFDA批准用于LAPC。11,12IRE可引起肿瘤细胞短时高压电脉冲的死亡。3,13近年来，多项研究证实，在不损伤血管和神经的情况下，IRE是治疗LAPC的一种很有前途的技术。14,15,16据报道，IRE促进吉西他滨进入PDAC肿瘤。17IRE还可能通过改变肿瘤微环境(TME)的结构和组成，或启动肿瘤特异性免疫来引起全身肿瘤的控制。2,18因此，IRE可作为一种潜在的免疫调节治疗手段，并可引起消融后免疫细胞或参数的大量增加。此外，赵等人。报道：IRE能增强免疫治疗的抗肿瘤效果。5Scheffer等人证明LAPC能瞬间减轻免疫抑制，为抗肿瘤T细胞的激活创造一个窗口。4,19

近年来，免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的应用越来越广泛。20,21在TME中，T细胞是肿瘤治疗的重要组成部分，ICIS或过继性细胞灌注治疗已导致肿瘤治疗的突破。22T细胞的临床应用主要集中在αβT细胞(CD4)上。+、CD8+T细胞)、γδT细胞也是肿瘤免疫的重要参与者。23γδT细胞占CD3总数的0.5~16%+外周血中的细胞。人γδT细胞可以以一种主要的组织相容性复合物(MHC)无关的方式被激活，从而使其具有更广泛的抗肿瘤细胞毒性。20Vγ9Vδ2 T细胞是免疫效应细胞的重要组成部分，有助于多种肿瘤的免疫监测，24,25,26,27结果表明，Vγ9Vδ2-T细胞可作为LAPC治疗的候选细胞。但到目前为止，只有一例关于胆管癌患者γδT细胞的报道，28结果表明，同种异体γδT细胞治疗能积极增强免疫功能，降低肿瘤活性，改善生活质量，延长生存期。在此基础上，我们设计了本临床试验，旨在阐明异基因Vγ9Vδ2 T细胞与异基因V 9Vδ2 T细胞联合应用对LAPC患者的治疗效果。

登记病人

2017年6月至2018年6月，共有来自12个国家的176名PDAC患者通过筛查程序登记，其中70名(39.8%)确诊为LAPC(补充表)。1)。在筛查过程中，有5名患者因肝功能受损而被排除在外(n=2)，严重冠心病(n=1，对造影剂过敏(n及化疗或放射治疗≤6周(n=1)。共有三名病人因适宜切除而被切除(n=2)并撤回同意(n=1)全身治疗后。最后，将62例(35.2%)LAPC患者随机分为A组(n=30)和B(n=32)(图3。1A)。两组患者的临床特点基本平衡(表)。1)。大多数参与者接受了新辅助化疗，包括吉西他滨和纳布紫杉醇(n=7，6-16循环)，FOLFIRINOX(n=37、2-15周期)和其他(n=5，4-6周期)。A组患者的临床特征也得到平衡(表)1).

安全

先前的研究证实，免疫细胞输注不会导致严重的急性呼吸窘迫，28因此，AES应该来源于IRE。在试验期间，主要的AEs和与愤怒相关的AES的比例列在图中.2和补充表3按等级。两组的AES发生率相似(分别为63.3%和62.5%)。P>0.05)。62例患者中，31例(50%)发生了14例，其中A组16例(53.3%)，B组15例(46.9%)。24例患者有1例AE，6例有2例，1例有3例。大多数轻微的不良反应涉及胃肠道症状，如恶心、呕吐、食欲不振和腹泻。其他一级/Ⅱ级急症是腹痛需要止痛药，脓肿需要抗生素，门静脉血栓形成需要抗凝血。严重的急症(Ⅲ级和Ⅳ级)包括胆道梗阻、胆管炎、胰腺炎或胰瘘，需要抗生素治疗，十二指肠出血导致严重吐血，需要内镜检查、手术结扎和输血，胃瘫需要鼻空肠管喂养。试验中未发现与愤怒有关的Ⅴ级急症。

碳水化合物抗原19-9(CA19-9)

治疗前CA19-9的平均值均大于正常范围.重要的是，尽管B组有一定疗效，但A组CA19-9水平明显降低(图一)。3A).

循环肿瘤细胞

与IRE组比较，A组7.5mL血液中CTCs数量明显减少(10.77±3.61 vs 13.41±5.12)。3B)。用流式细胞术在附图中显示A组CTCs的典型变化。4.

免疫参数

我们评估了CD4的免疫细胞。+、CD8+用免疫荧光标记法和流式细胞术检测NK细胞。A组治疗后淋巴细胞数明显增加(图1)。4A-C)。此外，联合治疗后，A组Th1细胞因子值明显升高(图1)。4D-f).

表面受体

众所周知，NKG2D受体在γδT细胞的识别和杀伤中起着重要的作用。29本研究检测和分析了NKG2D的水平。有趣的是，联合治疗后，A组NKG2D受体水平明显升高(图1)。5A)。程序性细胞死亡1(PD-1)是一种重要的免疫抑制分子，它通过与程序性死亡配体1的结合，启动T细胞的程序性死亡，从而使肿瘤细胞获得免疫逃逸。30,31令人惊讶的是，联合治疗后，γδT细胞中的Pd-1水平明显降低(如图所示)。5B)。同时，CD 44(T细胞活化的表面标记分子)的表达也显著上调。5C).

绩效状况评分

以PS评分评定生活质量。与单用IRE相比，联合治疗后PS评分显著降低(P<0.01)。P < 0.05) (Fig. 6A).

肿瘤最大横径(TMTD)

患者的TMTDs列于图中。6B。与单用IRE比较，A组TMTDs值显著降低(P<0.01)。P < 0.05).

生存

B组诊断中位OS为19个月，IRE中位数为11个月，A组诊断和联合治疗的中位OS分别为22.5个月和14.5个月。显然，A组患者的中位OS比B组好(见图)。7A，补充图。5A)。此外，与单纯接受γδT细胞输注的患者相比，接受多疗程γδT细胞治疗的患者的OS中位数更长(17个月比13.5个月；P < 0.05) (Fig. 7b).

B组诊断中位PFS为15.5个月，IRE组为8.5个月，A组诊断和联合治疗的PFS中位数分别为18.5个月和11个月。因此，A组患者的PFS中位数优于B组(图1)。7C，补充图。5B)。然而，接受多个疗程的γδT细胞输注的患者与接受单一疗程的患者之间的中位PFS差异无显着性(图1)。7D)。一例有代表性的CT图像显示在补充图中。6.

经单因素和多变量Cox回归分析，肿瘤大小与生存质量差相关(HR：13.5，95%CI：2.6，70.6)；P=0.002)。IRE前接受化疗的患者生存率较好(HR：5.1，95%CI：1.4，17.9；P=0.012)。局部进展早的患者生存率明显差(HR：0.2，95%CI：0.1，0.5；P=0.001)(表2).

对于LAPC患者生存能力差的问题，寻找延长生存的新策略是至关重要的。越来越多的证据证实，对LAPC的IRE是安全有效的。14,16,32,33在我们的研究中，62名LAPC患者接受了IRE治疗。我们研究的主要结果是LAPC患者从诊断开始的OS中位数为19个月，这与Martin等人先前报道的结果是一致的。9Ruarus等人显示LAPC患者的OS自诊断起17个月，部分患者在发病前未接受任何诱导化疗。3此外，虽然IRE治疗与某些并发症有关，但大多数可以通过保守治疗来治疗。近年来，国内外对IRE联合化疗治疗PDAC的研究已初见端倪，显示出适宜的生存期。然而，化疗的毒性严重影响患者的生活质量。因此，LAPC患者需要进行新的治疗。

近年来，随着嵌合抗原受体T细胞和ICIS的发展，30,34免疫治疗已成为恶性肿瘤最有力的治疗手段之一。由于免疫抑制性肿瘤相关基质的存在，免疫治疗对PDAC的疗效有限。7,35IRE不仅杀死肿瘤细胞，而且促进吉西他滨进入PDAC肿瘤，17向基质展示规则。赵等人报道表明，IRE逆转了对免疫检查点阻断的抗性，增强了免疫治疗的抗肿瘤效果。5Scheffer等人显示Tregs短暂减少，活化pd-1同时增加。+T细胞，与IRE后肿瘤相关免疫抑制的短暂减少相一致.19此外，一团肿瘤特异性抗原在IRE后原位释放。36Narayanan等人提示用Toll样受体-7(TLR 7)激动剂刺激天然免疫系统，同时阻断抗PD-1检查点的适应性免疫系统，可增强IRE引起的全身抗肿瘤免疫反应。4在此基础上，我们建立了一种新的治疗方案，首先是局部IRE，然后系统地注入γδT细胞。

在TME中，T细胞是一个关键的组成部分，IHI或过继细胞的治疗已经导致癌症治疗的突破。37,38γδT细胞与αβT细胞具有许多共同的特性，如细胞毒性效应功能和促炎性细胞因子的产生，但γδT细胞与αβT细胞的主要区别之一是它们对MHC分子的相对依赖性。与αβT细胞不同的是，哺乳动物中γδT细胞的数量较少，使得了解其在肿瘤中的作用的进展缓慢。39幸运的是，癌症相关的γδT细胞生物学在过去几年中取得了重大进展，例如揭示了它们对肿瘤和其他免疫细胞的强大影响，突出了它们作为抗肿瘤和亲肿瘤介质的多方面作用，等等。22以往的研究表明，Vγ9Vδ2-T细胞对多种肿瘤的免疫监测有一定的促进作用。24,25,26,27事实证明，同种异体Vγ9Vδ2 T细胞输注给本研究带来了更多的益处。

鉴于上述结果，我们将异基因Vγ9Vδ2 T细胞与异基因V 9Vδ2 T细胞联合应用于LAPC患者，观察其疗效。与单纯IRE相比，异基因Vγ9Vδ2 T细胞能明显增强机体免疫功能，抑制肿瘤生长，延长患者的生存期。结果表明，同种异体Vγ9Vδ2 T细胞输注后，外周血T细胞和NK细胞数量明显增加，输注时间越长，免疫细胞数量越多。这一结论与Alnaggar等人以前的报告一致。28除增加淋巴细胞外，IL-2、IFN-γ、TNF-β水平也有提高，提示抗肿瘤作用较强。20众所周知，NKG2D在肿瘤的识别和杀伤中起着重要的作用，ERE+γδT细胞可以显著上调NKG2D的表达。同样，γδT细胞的Pd-1在IRE+γδT细胞治疗后明显下调.这些结果值得注意的是，IRE与同种异体Vγ9Vδ2 T细胞的结合不仅增强了γδT细胞的杀伤作用，而且抑制了Pd-1的表达。同时，CD 44水平显著升高。综上所述，我们的数据表明，IRE和γδT细胞的结合可以增强抗肿瘤作用。此外，与单独治疗相比，联合治疗后CA19-9和CTCs水平也明显下降。重要的是，这是首次报道Vγ9Vδ2 T细胞输注可减少外周血CTCs的数量。以前的报道已经证实NK细胞导致CTCs的减少。30,40一般来说，PDAC患者的生活质量很差，良好的生活质量预测肿瘤的发展将受到控制。因此，本研究的另一个目的是检查LAPC患者的PS评分。在前几次报告中，IRE治疗对PDAC患者的生活质量有了改善。41令人鼓舞的是，在接受了IRE和Vγ9Vδ2 T细胞联合治疗后，患者获得了较好的PS评分。本试验通过观察治疗前后上述指标的变化，评价了异基因γδT细胞联合IRE治疗的临床疗效。然而，在未动态评估治疗后免疫学参数的情况下，研究设计可能存在一定的局限性。

尤其是在本研究中，IRE+Vγ9Vδ2 T细胞的存活情况优于单独的IRE细胞。在本研究中，仅接受IRE的患者中位OS值为11个月，与先前的结果相似。3,16有趣的是，在接受IRE+Vγ9Vδ2 T细胞的患者中位OS增加到14.5个月，说明Vγ9Vδ2 T细胞输注延长了生存期。另外，与未接受Vγ9Vδ2 T细胞的患者相比，接受Vγ9Vδ2 T细胞的患者存活时间较长，且OS与输注过程呈正相关。回归分析结果显示肿瘤大小、接受化疗和局部进展时间是OS的显著预测因素。

我们的研究证实，在接受Vγ9Vδ2 T细胞后，患者出现了增强的抗肿瘤作用。多项研究探讨了γδT细胞体内抗肿瘤作用的机制。Rossi等人发现PD-1阻断促进γδT细胞介导的滤泡性淋巴瘤。42Benyamine等人表明BTN3A是γδ2 T细胞免疫治疗的预后指标和靶点，为BTN3A 2 0.1mAb增强Vγ9Vδ2 T细胞抗肿瘤功能提供了可能。43Chauvi等人以同种异体Vγ9Vδ2 T细胞灌注肿瘤为基础，为神经胶质母细胞瘤的复发提供了新的免疫治疗方案。44Capietto等人显示了一种新的策略来提高Herceptin在her-2中的功效。+Trastuzumab和Herceptin联合应用对乳腺癌γδT细胞有刺激作用。45以上研究表明，γδT与其他干预方法相结合可提高肿瘤的抗肿瘤效果。

综上所述，本临床试验提示，IRE联合γδT细胞增强抗肿瘤作用，延长生存期，为LAPC患者提供了一种新的治疗策略。

试设计

采用随机数表法将患者分为A组(IRE+Vγ9Vδ2 T细胞)和B组(仅IRE组)。联合治疗方案如图所示。1B。更广泛地说，除IRE外，A组患者还接受了一至三个疗程的γδ2 T细胞灌注；一个疗程为28天，包含两个输注周期。收集健康献血员100 ml静脉血进行γδT细胞扩增.

参加者

入选标准包括：预期寿命大于12周，年龄大于18岁，符合AJCC标准的LAPC，不能接受化疗或拒绝接受化疗，并有足够的肝肾功能。最重要的排除标准是化疗后可切除，对造影剂过敏，严重冠心病，有3级高血压史，骨髓抑制，自身免疫性疾病，不能通过气管麻醉，肝功能受损(如凝血病、腹水、门脉高压等)，PS评分>2，乙肝或HIV感染。

愤怒

IRE是使用IRE消融系统进行的(NanoKnfe；血管动力学，昆士伯里，纽约)。文中详细介绍了在IRE发生之前、期间或之后的详细方法。补充数据以及我们之前的研究。46

Vγ9Vδ2 T细胞

Vγ9vδ2 T细胞扩展和激活显示在补充数据(补充表格)2, 3；补充图。1–3).30

跟踪

术后3个月行CT增强扫描，然后每3个月进行一次增强扫描。两位放射科医生独立解释CT结果。

终点

主要终点为总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)。次要终点是安全性评估，即AES、免疫参数、CTCS、CA19-9、PS评分、表面受体和TMTD。方法列出了次级端点的详细描述。补充数据.

统计分析

对所有随机分配的患者进行安全性和有效性评估。用Kaplan-Meier分析法估算和绘制生存曲线。采用分层对数秩评定PFS和OS的治疗差异。单因素分析用于确定预后因素。第一次使用SPSSv22.0(IBM，Armonk，NY，美国)分析定量数据的正态性。对于正态分布，双尾学生的t测试是用的。对于非正态分布，采用Mann-Whitney检验或Wilcoxon检验.P < 0.05 was considered statistically significant.