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不可逆电穿孔加同种异体Vγ9Vδ2 T细胞增强局部晚期胰腺癌患者的抗肿瘤作用

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发表时间:2020-10-26 15:39作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

由于免疫抑制微环境(ISM)的存在,免疫治疗对局部晚期胰腺癌(LAPC)的疗效有限。不可逆电穿孔(IRE)不仅能诱导免疫原性细胞死亡,而且能减轻免疫抑制。本研究旨在探讨异基因γδT细胞联合IRE对LAPC患者的抗肿瘤作用。共有62名符合资格标准的患者被纳入本试验,然后随机分为两组(A:n=30和B:n=32)。所有患者均接受IRE治疗,A组患者至少连续接受两个周期的γδT细胞灌注治疗。A组生存率优于B组(中位OS:14.5个月对11个月;中位PFS:11个月对8.5个月)。此外,接受多疗程γδT细胞输注治疗的A组患者OS(17个月)比单一疗程(13.5个月)长。异基因γδT细胞输注是一种很有前途的抗肿瘤治疗策略,可延长患者的生存期。

ClinicalTrials.gov ID:NCT 03180437

导言

胰腺癌(PDAC)是一种预后不良的疾病,在全世界范围内对癌症相关死亡率的影响越来越大。1根据美国癌症联合委员会(AJCC)的标准,~40%的PDAC患者(Ⅲ期)被诊断为局部晚期胰腺癌(LAPC),其定义为主要血管结构的侵犯,导致无法切除但无转移的疾病。2,3

对于LAPC患者,以吉西他滨为基础的放疗方案为标准治疗方案,中位OS为9-11个月。3FOLFIRINOX化疗延长生存期,但化疗毒性和不良事件发生率高,限制了治疗的推广。2目前,免疫检查点抑制剂(ICI)已经在许多实体恶性肿瘤中显示了临床反应,但胰腺癌的结果一直令人失望。4据报道,免疫抑制间质限制了ICIS治疗PDAC的疗效。5此外,PDAC还含有大量免疫抑制细胞,包括调节性T细胞(Tregs)。6免疫抑制微环境(ISM)也能抑制肿瘤浸润淋巴细胞的活性。7,8因此,有必要对LAPC患者进行新的、有效的治疗。

局部烧蚀治疗(如放射治疗)在LAPC治疗中发挥了重要作用。9射频消融术已被描述为少数无法切除的疾病,但该技术仅限于邻近器官和血管的热损伤。9,10

不可逆电穿孔(IRE)是一种新的、非热的、微创的技术,已被FDA和CFDA批准用于LAPC。11,12IRE可引起肿瘤细胞短时高压电脉冲的死亡。3,13近年来,多项研究证实,在不损伤血管和神经的情况下,IRE是治疗LAPC的一种很有前途的技术。14,15,16据报道,IRE促进吉西他滨进入PDAC肿瘤。17IRE还可能通过改变肿瘤微环境(TME)的结构和组成,或启动肿瘤特异性免疫来引起全身肿瘤的控制。2,18因此,IRE可作为一种潜在的免疫调节治疗手段,并可引起消融后免疫细胞或参数的大量增加。此外,赵等人。报道:IRE能增强免疫治疗的抗肿瘤效果。5Scheffer等人证明LAPC能瞬间减轻免疫抑制,为抗肿瘤T细胞的激活创造一个窗口。4,19

近年来,免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的应用越来越广泛。20,21在TME中,T细胞是肿瘤治疗的重要组成部分,ICIS或过继性细胞灌注治疗已导致肿瘤治疗的突破。22T细胞的临床应用主要集中在αβT细胞(CD4)上。+、CD8+T细胞)、γδT细胞也是肿瘤免疫的重要参与者。23γδT细胞占CD3总数的0.5~16%+外周血中的细胞。人γδT细胞可以以一种主要的组织相容性复合物(MHC)无关的方式被激活,从而使其具有更广泛的抗肿瘤细胞毒性。20Vγ9Vδ2 T细胞是免疫效应细胞的重要组成部分,有助于多种肿瘤的免疫监测,24,25,26,27结果表明,Vγ9Vδ2-T细胞可作为LAPC治疗的候选细胞。但到目前为止,只有一例关于胆管癌患者γδT细胞的报道,28结果表明,同种异体γδT细胞治疗能积极增强免疫功能,降低肿瘤活性,改善生活质量,延长生存期。在此基础上,我们设计了本临床试验,旨在阐明异基因Vγ9Vδ2 T细胞与异基因V 9Vδ2 T细胞联合应用对LAPC患者的治疗效果。

结果

登记病人

2017年6月至2018年6月,共有来自12个国家的176名PDAC患者通过筛查程序登记,其中70名(39.8%)确诊为LAPC(补充表)。1)。在筛查过程中,有5名患者因肝功能受损而被排除在外(n=2),严重冠心病(n=1,对造影剂过敏(n及化疗或放射治疗≤6周(n=1)。共有三名病人因适宜切除而被切除(n=2)并撤回同意(n=1)全身治疗后。最后,将62例(35.2%)LAPC患者随机分为A组(n=30)和B(n=32)(图3。1A)。两组患者的临床特点基本平衡(表)。1)。大多数参与者接受了新辅助化疗,包括吉西他滨和纳布紫杉醇(n=7,6-16循环),FOLFIRINOX(n=37、2-15周期)和其他(n=5,4-6周期)。A组患者的临床特征也得到平衡(表)1).

图1

临床试验概况和治疗计划。a临床试验概况。共对来自12个国家的176例PDAC患者进行了登记筛查,其中70例(39.8%)接受了LAPC检查。在筛选过程中,5名参与者因肝功能受损而被排除在外(n=2),严重冠心病(n=1,对造影剂过敏(n及化疗或放射治疗≤6周(n=1)。经全身治疗后,三名参与者被排除在外,原因是分期下降至切除(n=2)并撤回同意(n=1)。总的来说,LAPC患者接受了资格标准的筛选,62名(35.2%)最终被纳入研究,并随机分为A组(n=30)或B组(n=32)。b临床治疗计划。A组患者接受IRE+异基因γδT细胞治疗1~3个疗程,1个γδT细胞治疗疗程包括2个周期,共6个γδT细胞输注28天,第1周期12、13、14天,第2周期26、27、28天。B组的病人刚刚接受了治疗。n=62)

表1基线时患者的人口和疾病特征

安全

先前的研究证实,免疫细胞输注不会导致严重的急性呼吸窘迫,28因此,AES应该来源于IRE。在试验期间,主要的AEs和与愤怒相关的AES的比例列在图中.2和补充表3按等级。两组的AES发生率相似(分别为63.3%和62.5%)。P>0.05)。62例患者中,31例(50%)发生了14例,其中A组16例(53.3%),B组15例(46.9%)。24例患者有1例AE,6例有2例,1例有3例。大多数轻微的不良反应涉及胃肠道症状,如恶心、呕吐、食欲不振和腹泻。其他一级/Ⅱ级急症是腹痛需要止痛药,脓肿需要抗生素,门静脉血栓形成需要抗凝血。严重的急症(Ⅲ级和Ⅳ级)包括胆道梗阻、胆管炎、胰腺炎或胰瘘,需要抗生素治疗,十二指肠出血导致严重吐血,需要内镜检查、手术结扎和输血,胃瘫需要鼻空肠管喂养。试验中未发现与愤怒有关的Ⅴ级急症。

图2

安全人群中所有引起的不良事件。a各研究组间无明显差异(P>0.05).b按等级分列的与治疗相关的不良事件患者的比例。两组间无显着性差异。n=62。P>0.05。卡方检验

碳水化合物抗原19-9(CA19-9)

治疗前CA19-9的平均值均大于正常范围.重要的是,尽管B组有一定疗效,但A组CA19-9水平明显降低(图一)。3A).

图3

肿瘤标志物在治疗前和治疗后90d的评价。a用化学发光免疫法测定CA19-9的含量。n=62。数据显示为单独的数据点与框和胡须图(底部:25%;顶部:75%;线:中位数;胡须:分钟到最大)。组内比较:*P < 0.001; comparison between groups: ###P < 0.001. Mann–Whitney test or Wilcoxon test. bCD 45的数目科克+CD 326+细胞(CTCs)是用FACSCanto获得的。TM数据显示为单独的数据点与框和胡须图(底部:25%;顶部:75%;线:中位数;胡须:最小到最大)。组内比较:*P < 0.001; comparison between groups: #P < 0.05. Two-tailed Student’s t试验(n=62)

循环肿瘤细胞

与IRE组比较,A组7.5mL血液中CTCs数量明显减少(10.77±3.61 vs 13.41±5.12)。3B)。用流式细胞术在附图中显示A组CTCs的典型变化。4.

免疫参数

我们评估了CD4的免疫细胞。+、CD8+用免疫荧光标记法和流式细胞术检测NK细胞。A组治疗后淋巴细胞数明显增加(图1)。4A-C)。此外,联合治疗后,A组Th1细胞因子值明显升高(图1)。4D-f).

图4

治疗前和治疗后90d检测免疫指标。ac用6色TBNK试剂进行流式细胞术检测血液中淋巴细胞。df流式细胞术用细胞计量学珠阵列人Th1/Th2细胞因子试剂盒Ⅱ检测血液中的细胞因子。数据显示为单独的数据点与框和胡须图(底部:25%;顶部:75%;线:中位数;胡须:分钟到最大)。组内比较:*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; comparison between groups: #P < 0.05; ##P < 0.01; ###P < 0.001. Two-tailed Student’s t试验(n=62)

表面受体

众所周知,NKG2D受体在γδT细胞的识别和杀伤中起着重要的作用。29本研究检测和分析了NKG2D的水平。有趣的是,联合治疗后,A组NKG2D受体水平明显升高(图1)。5A)。程序性细胞死亡1(PD-1)是一种重要的免疫抑制分子,它通过与程序性死亡配体1的结合,启动T细胞的程序性死亡,从而使肿瘤细胞获得免疫逃逸。30,31令人惊讶的是,联合治疗后,γδT细胞中的Pd-1水平明显降低(如图所示)。5B)。同时,CD 44(T细胞活化的表面标记分子)的表达也显著上调。5C).

图5

NKG2D、Pd-1和CD 44在治疗前和治疗后90d的表达。用小鼠抗人NKG2D、pd-1和CD 44单克隆抗体对γδT细胞表面受体NKG2D、pd-1和CD 44进行染色,并用流式细胞仪对其进行分析。TM二、MFI是指荧光强度。数据显示为具有散点图的单个数据点(行:均值与SD)。组内比较:**P < 0.01; ***P < 0.001; comparison between groups: #P < 0.05; ##P < 0.01. Two-尾学生t试验(n=62)

绩效状况评分

以PS评分评定生活质量。与单用IRE相比,联合治疗后PS评分显著降低(P<0.01)。P < 0.05) (Fig. 6A).

图6

PS评分和TMTD的变化。a治疗前和治疗后3个月,根据医务人员的观察,计算PS评分。b治疗前和治疗后3个月用肿瘤成像系统对TMTD进行评价。数据显示为具有散点图的单个数据点(行:均值与SD)。组内比较:*P < 0.05; ***P < 0.001; comparison between groups: ###P < 0.001. Mann–Whitney test or Wilcoxon test (n=62)

肿瘤最大横径(TMTD)

患者的TMTDs列于图中。6B。与单用IRE比较,A组TMTDs值显著降低(P<0.01)。P < 0.05).

生存

B组诊断中位OS为19个月,IRE中位数为11个月,A组诊断和联合治疗的中位OS分别为22.5个月和14.5个月。显然,A组患者的中位OS比B组好(见图)。7A,补充图。5A)。此外,与单纯接受γδT细胞输注的患者相比,接受多疗程γδT细胞治疗的患者的OS中位数更长(17个月比13.5个月;P < 0.05) (Fig. 7b).

图7

Kaplan-Meier生存曲线。a图显示自治疗时起,在总人口中的OS(n=62)。bA组接受单次γδT细胞输注或多疗程γδT细胞输注的患者,自治疗时起出现OS。n=30)。c图显示自治疗时起,在总人口中的PFS(n=62)。d图显示A组接受单次γδT细胞输注或多疗程γδT细胞输注的患者从治疗时起即出现PFS(P<0.01)。n=30)

B组诊断中位PFS为15.5个月,IRE组为8.5个月,A组诊断和联合治疗的PFS中位数分别为18.5个月和11个月。因此,A组患者的PFS中位数优于B组(图1)。7C,补充图。5B)。然而,接受多个疗程的γδT细胞输注的患者与接受单一疗程的患者之间的中位PFS差异无显着性(图1)。7D)。一例有代表性的CT图像显示在补充图中。6.

经单因素和多变量Cox回归分析,肿瘤大小与生存质量差相关(HR:13.5,95%CI:2.6,70.6);P=0.002)。IRE前接受化疗的患者生存率较好(HR:5.1,95%CI:1.4,17.9;P=0.012)。局部进展早的患者生存率明显差(HR:0.2,95%CI:0.1,0.5;P=0.001)(表2).

治疗后OS的单变量和多变量COX回归分析

讨论

对于LAPC患者生存能力差的问题,寻找延长生存的新策略是至关重要的。越来越多的证据证实,对LAPC的IRE是安全有效的。14,16,32,33在我们的研究中,62名LAPC患者接受了IRE治疗。我们研究的主要结果是LAPC患者从诊断开始的OS中位数为19个月,这与Martin等人先前报道的结果是一致的。9Ruarus等人显示LAPC患者的OS自诊断起17个月,部分患者在发病前未接受任何诱导化疗。3此外,虽然IRE治疗与某些并发症有关,但大多数可以通过保守治疗来治疗。近年来,国内外对IRE联合化疗治疗PDAC的研究已初见端倪,显示出适宜的生存期。然而,化疗的毒性严重影响患者的生活质量。因此,LAPC患者需要进行新的治疗。

近年来,随着嵌合抗原受体T细胞和ICIS的发展,30,34免疫治疗已成为恶性肿瘤最有力的治疗手段之一。由于免疫抑制性肿瘤相关基质的存在,免疫治疗对PDAC的疗效有限。7,35IRE不仅杀死肿瘤细胞,而且促进吉西他滨进入PDAC肿瘤,17向基质展示规则。赵等人报道表明,IRE逆转了对免疫检查点阻断的抗性,增强了免疫治疗的抗肿瘤效果。5Scheffer等人显示Tregs短暂减少,活化pd-1同时增加。+T细胞,与IRE后肿瘤相关免疫抑制的短暂减少相一致.19此外,一团肿瘤特异性抗原在IRE后原位释放。36Narayanan等人提示用Toll样受体-7(TLR 7)激动剂刺激天然免疫系统,同时阻断抗PD-1检查点的适应性免疫系统,可增强IRE引起的全身抗肿瘤免疫反应。4在此基础上,我们建立了一种新的治疗方案,首先是局部IRE,然后系统地注入γδT细胞。

在TME中,T细胞是一个关键的组成部分,IHI或过继细胞的治疗已经导致癌症治疗的突破。37,38γδT细胞与αβT细胞具有许多共同的特性,如细胞毒性效应功能和促炎性细胞因子的产生,但γδT细胞与αβT细胞的主要区别之一是它们对MHC分子的相对依赖性。与αβT细胞不同的是,哺乳动物中γδT细胞的数量较少,使得了解其在肿瘤中的作用的进展缓慢。39幸运的是,癌症相关的γδT细胞生物学在过去几年中取得了重大进展,例如揭示了它们对肿瘤和其他免疫细胞的强大影响,突出了它们作为抗肿瘤和亲肿瘤介质的多方面作用,等等。22以往的研究表明,Vγ9Vδ2-T细胞对多种肿瘤的免疫监测有一定的促进作用。24,25,26,27事实证明,同种异体Vγ9Vδ2 T细胞输注给本研究带来了更多的益处。

鉴于上述结果,我们将异基因Vγ9Vδ2 T细胞与异基因V 9Vδ2 T细胞联合应用于LAPC患者,观察其疗效。与单纯IRE相比,异基因Vγ9Vδ2 T细胞能明显增强机体免疫功能,抑制肿瘤生长,延长患者的生存期。结果表明,同种异体Vγ9Vδ2 T细胞输注后,外周血T细胞和NK细胞数量明显增加,输注时间越长,免疫细胞数量越多。这一结论与Alnaggar等人以前的报告一致。28除增加淋巴细胞外,IL-2、IFN-γ、TNF-β水平也有提高,提示抗肿瘤作用较强。20众所周知,NKG2D在肿瘤的识别和杀伤中起着重要的作用,ERE+γδT细胞可以显著上调NKG2D的表达。同样,γδT细胞的Pd-1在IRE+γδT细胞治疗后明显下调.这些结果值得注意的是,IRE与同种异体Vγ9Vδ2 T细胞的结合不仅增强了γδT细胞的杀伤作用,而且抑制了Pd-1的表达。同时,CD 44水平显著升高。综上所述,我们的数据表明,IRE和γδT细胞的结合可以增强抗肿瘤作用。此外,与单独治疗相比,联合治疗后CA19-9和CTCs水平也明显下降。重要的是,这是首次报道Vγ9Vδ2 T细胞输注可减少外周血CTCs的数量。以前的报道已经证实NK细胞导致CTCs的减少。30,40一般来说,PDAC患者的生活质量很差,良好的生活质量预测肿瘤的发展将受到控制。因此,本研究的另一个目的是检查LAPC患者的PS评分。在前几次报告中,IRE治疗对PDAC患者的生活质量有了改善。41令人鼓舞的是,在接受了IRE和Vγ9Vδ2 T细胞联合治疗后,患者获得了较好的PS评分。本试验通过观察治疗前后上述指标的变化,评价了异基因γδT细胞联合IRE治疗的临床疗效。然而,在未动态评估治疗后免疫学参数的情况下,研究设计可能存在一定的局限性。

尤其是在本研究中,IRE+Vγ9Vδ2 T细胞的存活情况优于单独的IRE细胞。在本研究中,仅接受IRE的患者中位OS值为11个月,与先前的结果相似。3,16有趣的是,在接受IRE+Vγ9Vδ2 T细胞的患者中位OS增加到14.5个月,说明Vγ9Vδ2 T细胞输注延长了生存期。另外,与未接受Vγ9Vδ2 T细胞的患者相比,接受Vγ9Vδ2 T细胞的患者存活时间较长,且OS与输注过程呈正相关。回归分析结果显示肿瘤大小、接受化疗和局部进展时间是OS的显著预测因素。

我们的研究证实,在接受Vγ9Vδ2 T细胞后,患者出现了增强的抗肿瘤作用。多项研究探讨了γδT细胞体内抗肿瘤作用的机制。Rossi等人发现PD-1阻断促进γδT细胞介导的滤泡性淋巴瘤。42Benyamine等人表明BTN3A是γδ2 T细胞免疫治疗的预后指标和靶点,为BTN3A 2 0.1mAb增强Vγ9Vδ2 T细胞抗肿瘤功能提供了可能。43Chauvi等人以同种异体Vγ9Vδ2 T细胞灌注肿瘤为基础,为神经胶质母细胞瘤的复发提供了新的免疫治疗方案。44Capietto等人显示了一种新的策略来提高Herceptin在her-2中的功效。+Trastuzumab和Herceptin联合应用对乳腺癌γδT细胞有刺激作用。45以上研究表明,γδT与其他干预方法相结合可提高肿瘤的抗肿瘤效果。

综上所述,本临床试验提示,IRE联合γδT细胞增强抗肿瘤作用,延长生存期,为LAPC患者提供了一种新的治疗策略。

材料和方法

试设计

采用随机数表法将患者分为A组(IRE+Vγ9Vδ2 T细胞)和B组(仅IRE组)。联合治疗方案如图所示。1B。更广泛地说,除IRE外,A组患者还接受了一至三个疗程的γδ2 T细胞灌注;一个疗程为28天,包含两个输注周期。收集健康献血员100 ml静脉血进行γδT细胞扩增.

参加者

入选标准包括:预期寿命大于12周,年龄大于18岁,符合AJCC标准的LAPC,不能接受化疗或拒绝接受化疗,并有足够的肝肾功能。最重要的排除标准是化疗后可切除,对造影剂过敏,严重冠心病,有3级高血压史,骨髓抑制,自身免疫性疾病,不能通过气管麻醉,肝功能受损(如凝血病、腹水、门脉高压等),PS评分>2,乙肝或HIV感染。

愤怒

IRE是使用IRE消融系统进行的(NanoKnfe;血管动力学,昆士伯里,纽约)。文中详细介绍了在IRE发生之前、期间或之后的详细方法。补充数据以及我们之前的研究。46

Vγ9Vδ2 T细胞

Vγ9vδ2 T细胞扩展和激活显示在补充数据(补充表格)2, 3;补充图。13).30

跟踪

术后3个月行CT增强扫描,然后每3个月进行一次增强扫描。两位放射科医生独立解释CT结果。

终点

主要终点为总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)。次要终点是安全性评估,即AES、免疫参数、CTCS、CA19-9、PS评分、表面受体和TMTD。方法列出了次级端点的详细描述。补充数据.

统计分析

对所有随机分配的患者进行安全性和有效性评估。用Kaplan-Meier分析法估算和绘制生存曲线。采用分层对数秩评定PFS和OS的治疗差异。单因素分析用于确定预后因素。第一次使用SPSSv22.0(IBM,Armonk,NY,美国)分析定量数据的正态性。对于正态分布,双尾学生的t测试是用的。对于非正态分布,采用Mann-Whitney检验或Wilcoxon检验.P < 0.05 was considered statistically significant.


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