肝硬化患者外周血和脾脏B细胞区的变化 虽然外围CD 27 + 肝硬化患者记忆B细胞库的耗尽 13 ,14 ,15 ,27 脾B细胞区的特征尚不清楚。在此，我们从肝硬化患者(乙肝病毒相关肝硬化(HBV-LC)和非乙型肝炎病毒相关肝硬化(非HBV-LC))和健康献血者(表)中采集脾脏和外周血样本。 1 )一项全面的脾脏B细胞研究。非肝硬化慢性乙型肝炎(CHB)患者也被纳入外周B细胞研究，以研究HBV感染对无肝硬化条件的B细胞的影响。用多色流式细胞仪对脾脏和外周B细胞池进行观察(图1)。 1A 和表 2 包括CD 45和一组B细胞相关标记，如CD 19、CD 21、CD 27、CD 10、CD 38、IGD、IgM、IgA、IgG、IgG 1、IgG 2和IgG 3。流式细胞仪的数据通过用umap软件对流式细胞仪进行分析，将高维参数降为二维图。 28 。在UMAP聚类的基础上，共识别出8个子集(图1)。 1B )。考虑脾B细胞与外周B细胞的相似性，并考虑其他B细胞亚群的分类 29 ,30 ,31 ,32 ，这些B细胞亚群被命名为Trans&GC B细胞(过渡性或生发中心B细胞，CD 38)。 嗨 CD 10 + )，PBS(浆细胞，CD 38) 嗨 CD 10 − )，MZB(边缘区或边缘区样B细胞，CD 27) + IGD + IGM + )、天真B细胞(IGD) + IGM + CD 27 − 和IgA/G1/G2/G3记忆B细胞(IgA) + ，IgG 1 + ，IgG 2 + 或IgG 3 + ，以及IGD − IGM − CD 27 +/− )。Trans&GC B细胞和PB亚群因其CD 10和CD 38的表达而与其他亚群不同，而幼稚、MZB和IGD的表达不同。 − 记忆B细胞由于其IGD和CD 27的表达模式而不同于其他亚群。 1C )。应用这一策略，对脾脏和外周B细胞亚群的频率进行了分析，并与健康对照组进行了比较。我们发现外周和脾脏CD 19 + B细胞比例在各组间相似(图1)。 S1a )。重要的是，肝硬化患者的外周血和脾脏中Trans&GC和NA B细胞明显增加，MZB和IgG 1、IgG 2和IgG 3记忆B细胞显著减少(图一)。 1D-f )。根据我们之前的研究 26 肝硬化患者脾脏浆细胞增多。IGA记忆B细胞在外周血中明显减少，但脾脏中的B细胞在很大程度上保持在与正常人相当的水平(图1)。 1E，f )。值得注意的是，虽然CHB患者的B细胞亚群与健康对照组相似，但他们的Trans&GC B细胞确实与肝硬化患者相似(图1)。 1E )，表明肝损伤患者有共同的B细胞特征。
图1：肝硬化患者脾脏和外周B细胞区的变化。 a 流式细胞术对PBMCs和脾脏总B细胞的门控策略。 b 全脾B细胞门控性标记的表达模式 a 在Flowjo软件中使用UMAP。该地块来自一位具有代表性的健康献血者的数据。如UMAP热图所示，有8个子集处于门控状态。 c 以CD 38和CD 10表达和/或CD 27和IGD表达为基础，为每个子集叠加有独特颜色的8个B细胞亚群。 d 健康献血员(HC)、HBV-LC、非HBV-LC、CHB受试者(左)及HC、HBV-LC和非HBV-LC患者脾脏B细胞的代表子集门控(UMAP)。 e HC外周血单个核细胞B细胞亚群的频率( n =12)，HBV-LC( n =11)，非HBV-LC( n =6)，及 n =9)科目。 f HC脾脏B细胞亚群的频率( n =19)，HBV-LC( n =26)和非HBV-LC( n =10)科目。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001, as determined by Mann–Whitney U -测试。 g HBV-LC患者脾MZB频率与红细胞(RBCs)、血红蛋白(HGB)、胆碱酯酶(ChE)、肌酸激酶(CK)等临床指标的相关性分析(英文) n =26)。采用Spearman秩相关检验，R平方( R 2 )与 P 值显示。
脾MZB细胞的减少是LC受扰B细胞室的一个显著特征。肝硬化患者脾脏中MZB细胞的频率与其疾病严重程度指标(如Child-Pugh评分、白细胞计数和血小板计数)无关(图二)。 S1B，C )。然而，MZB细胞在脾脏中的频率与一些临床指标有关，包括胆碱酯酶(ChE)、肌酸激酶(CK)、血红蛋白和红细胞计数(图)。 1D )。这些数据表明，肝硬化不仅在周围，而且在脾脏严重扰乱B细胞室。
肝硬化患者脾B细胞区的持续激活 脾Tfh细胞持续活化可能促进肝硬化患者B细胞成熟 26 因此，我们分析了LC患者B细胞亚群上的活化相关标记(CD 95、FcRL 4、CD 86和CD 71)和迁移相关标记(CD11c、CXCR 3和CCR 6)。 2 ，第2和第3小组)。在这两个面板中，Trans&GC B细胞、PBS细胞、天真B细胞和MZB细胞根据其表型进行门控，而IGD细胞则按表型进行门控。 − CD 38内的记忆B细胞 +/− CD 10 − 成熟B细胞分化为CD 27+ 经典记忆B细胞(此处命名为cMBCs)和CD 27 − 非典型记忆B细胞(此处命名为aMBCs) 33 (无花果。 1C 和 2A )。通过对阳性人群进行门控或测定平均荧光强度(MFI)，分析B细胞亚群上活化相关和迁移相关标记的表达。 2B，c )。总之，无论B细胞是从外周还是脾脏中分离出来的，LC患者的B细胞亚群在不同程度上表达的CD 95、FcR 4、CD 86、CD 71、CD11c、CXCR 3和CCR 6水平均高于HC患者(图1)。 S2A-D 还有无花果。 2D-g )。尤其是CD 95，一种在凋亡细胞和活化细胞上高表达的死亡受体，在LC患者几乎所有的脾B细胞亚群上都有明显的上调(图一)。 二维空间 )。同样，在LC患者脾MZB细胞上，抑制性受体FcRL 4也明显增加。 二维空间 )。FcRL 4是已知的共同微生物抗原的受体。 34 。FcRL 4的增加 + MZB细胞可反映LC患者脾脏中细菌抗原的积累或细菌移位。有趣的是，CD 86和CD 71在LC患者的脾Trans和GC B细胞上均有明显增加，而在周围则有不同的表达(图一)。 2E 还有无花果。 S2B )。AS CD 71也是前胃癌B细胞的标记物。 35 提示肝硬化时脾GC活性增强。此外，外周血B细胞对CHB患者CD 71的上调(图1)。 S2B )与我们以前的发现是一致的 36 。CD11c，aMBCs的一种标记物，在各种慢性炎症条件下识别出一个扩展的B细胞亚群。 37 ，在非HBV-LC患者的脾cMBCs、MZB细胞和aMBCs中也有增加(如图所示)。 2F )。此外，来自LC患者的脾cMBCs和aMBCs的CXCR 3水平高于HC患者(图1)。 2F )。最后，与HC患者相比，LC患者多个脾B细胞亚群CCR 6表达增加(图1)。 2G )。这些结果表明肝硬化患者，尤其是脾B细胞亚群中B细胞区的持续激活。
图2：表型分析显示LC患者脾脏B细胞区持续激活。 a Trans&GC B细胞、PBS、cMBCs、aMBCs、MZB细胞和天真B细胞在Flowjo伪彩色图上进行门控，以进行随后的表型分析。 b 代表CD 95，FcRL 4，CD 86和CD 71表达谱的脾B细胞亚群来自一个健康供体和一个HBV-LC供体。根据每个标记的荧光负1(FMO)对照对阳性群体进行门控，并指出其百分比。 c , d 占CD 95的百分比 + 、FcRL 4 + 、CD 86 + 和CD 71 + 来自HC脾脏的Trans&GC B细胞、天真B细胞、MZB细胞、cMBCs和aMBCs的群体 n =12)，HBV-LC( n =16)和非HBV-LC( n =11)所示的主题。 e 代表CD11c、CXCR 3和CCR 6的脾B细胞亚群在正常供体和HBV-LC供体脾脏中的表达谱。 f CD11c百分比 + 和CXCR 3 + B细胞亚群的人群 c , d . g CCR 6在HC脾脏B细胞亚群上的平均荧光强度(MFI) n =9)，HBV-LC(12)和非HBV-LC( n =11)科目。数据显示为平均值和SEM。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001, as determined by Mann–Whitney U -测试。
肝硬化患者脾脏GC反应增强及原发性卵泡减少 如上所述，LC患者的Trans和GC B细胞显著增加，MZB细胞和IGD丢失。 − 脾脏中的记忆细胞。为了进一步研究这些变化，我们进行了免疫组织化学染色，用抗CD 20、抗IGD、抗Ki-67和抗CD1c进行了脾切片，用于B细胞滤泡、脾边缘区、生发中心和mzb细胞的鉴定。 30 ,38 ,39 。我们发现肝硬化患者的脾脏一般表现为GC样次级卵泡增大(图一)。 3A )。很明显，IGD 嗨 幼稚B细胞(CD1c) − )聚集在脾脏的地幔带，在卵泡中心周围形成一个明显的环形层(见图)。 3A，b )。进一步用Ki-67染色显示LC患者的假GC区增殖增强(图二)。 3A )。而初级卵泡的CD1c与之相当。 + 细胞富集(主要是MZB细胞)在HC组和LC组中，LC患者的次级卵泡增大，边缘区相对较薄(图1)。 3A，b )。此外，LC患者的原发性B细胞滤泡数量明显减少，伴随着次级卵泡计数的增加(见图)。 3C，d )。有趣的是，LC患者的原发性卵泡大于HC患者(图1)。 3E )，可能反映出一种更活跃的状态。这些二级结构的增加与增加的Trans&GC B细胞相一致，而伴有MZB细胞丢失的LC脾细胞缺乏一级结构。
图3：免疫化学染色显示LC患者GC反应增强，MZB富集的原发性卵泡减少。 福尔马林固定石蜡包埋健康供体脾切片( n =6)和LC患者( n 6)采用苏木精-伊红(HE)和免疫组织化学染色。 a HE和CD 20、IGD、CD1c和Ki-67在3例HC和3例LC患者的连续/或相邻脾脏切片中的表达。 b 用CD 20、IGD、CD1c染色放大HC和LC的代表初级卵泡和次级卵泡。 c , d HC原代和次级B细胞滤泡的平均计数( n =6)和LC( n =6)学科。 e HC组和LC组原发性卵泡的平均直径。注意，在两个HC和一个LC受试者的切片中找不到次级卵泡。* P < 0.05, and **P < 0.01, as determined by Mann–Whitney U -测试。
大容量RNA-seq显示LC患者脾B细胞代谢缺陷 为了进一步探讨肝硬化对LC患者B细胞亚群的整体影响，我们对HBV-LC和HC患者的脾B细胞、MZB细胞和cMBCs进行了大量的RNA-seq检测。我们通过主成分分析分析了B细胞亚群的转录组。 4A )。结果表明，样本是按B细胞亚群聚类的，而不是按被试群聚类的。MZB细胞和cMBCs的转录序列比较相似，但与单纯B细胞的转录结构不同。在正常人B细胞中检测到41条上调基因和65条下调基因，MZB细胞中检测到30条上调基因和87条下调基因，LC患者cMBCs中检测到36条上调基因和297条下调基因。 4B ).
图4：正常人脾B细胞亚群与LC患者脾B细胞亚群的转录比较。 a PCA图显示了正常人B细胞、MZB细胞和来自HC和HBV-LC患者的cMBCs的转录.每一点代表一个样本。 b 火山图显示HC和HBV-LC受试者在幼稚B细胞、MZB细胞和cMBCs中差异表达的基因(DEGS)。每个点代表一个基因，有log2(折叠)<−1或>1的基因 P Wald试验测得的值<0.05分别为下调基因和上调基因。显示下调或上调基因的数量。 c GSEA图谱显示，HBV-LC患者的mTORC 1信号通路、氧化磷酸化通路中的丰富基因序列明显下调，在正常人B细胞、MZB细胞和cMBCs中均有明显下调。这个 X 绿色曲线的轴是根据信号到噪声值排列的基因的等级，以及 Y 轴是富集分数(ES)。黑棒表示基因在某些通路上的等级。峰右侧的基因表示对ES贡献最大的前沿子集基因。 d 热图显示参与mTORC 1信号和氧化磷酸化通路的基因(按信号到噪声排列的前50位，见“材料和方法”部分)，这些基因在乙肝病毒-LC患者的正常B、MZB和cMBCs中被下调。
用基因集富集分析(GSEA)检测LC患者B细胞亚群的功能改变。根据MSigDB中的标志基因集，我们证实LC患者的三个B细胞亚群中的mTORC 1信号和氧化磷酸化通路均有明显的下调(图一)。 4C )。RNA-seq数据还揭示了LC患者脾B细胞、MZB和cMBCs的糖酵解缺陷(图一)。 S3A )。事实上，mTORC 1信号、氧化磷酸化和糖酵解途径中多个基因的表达水平下降(图一)。 4D 还有无花果。 S3B )。这些结果强烈提示LC患者脾B细胞存在广泛的代谢缺陷。此外，在LC患者的cMBCs和MZB细胞中，参与细胞凋亡负调控和细胞增殖正调控的基因也被下调。 S3C )。因此，我们推测，在肝硬化中，脾脏B细胞在代谢、抗凋亡途径、增殖和/或分化方面表现出严重的功能障碍。
肝硬化患者B细胞室的功能损害 我们进一步证实了LC患者脾B细胞代谢缺陷。葡萄糖对B细胞的激活是可有可无的，氧化磷酸化也是由其他营养物质推动的。 40 。我们发现CMBC上葡萄糖转运体GLUT 1的水平和CD 98(SLC3A2)的表达，这是一条与增殖细胞相关的异二聚体氨基酸转运体的重链。 41 ，MZB细胞和AMBC亚群在LC患者中明显减少(图1)。 5A )。此外，三种B细胞亚群CD 36(脂肪酸转运蛋白)在LC患者和HC患者中的表达也是相似的(图一)。 S4 )。然而，我们确实观察到在LC患者中，天真B细胞、MZB细胞和cMBCs的脂肪酸摄取明显减少(图1)。 5A )。线粒体动力学在免疫细胞的能量产生中起着重要作用。 42 。我们还测量了脾脏B细胞线粒体的质量，以评估代谢活性。 43 使用MitoTracker Green 44 并观察到LC患者的cMBCs、MZB细胞和aMBCs明显低于HC患者(图1)。 5A )。此外，我们还用海马分析了B细胞耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)，分别测定了糖酵解过程中线粒体能量的产生和乳酸的产生，发现肝硬化患者培养的B细胞在未经治疗和刺激的情况下，在耗氧量和糖酵解功能方面都存在严重缺陷(图1)。 5B )。尤其是肝硬化患者的B细胞经CpG刺激后，其最大呼吸电位明显降低(图1)。 5B )。24小时培养还显示肝硬化患者脾B细胞摄取2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG，一种用于监测活细胞葡萄糖摄取的荧光葡萄糖类似物)低于正常人(如图所示)。 5C )。这些数据表明，肝硬化很可能对利用氨基酸和脂肪酸进行各种脾脏B细胞亚群的氧化磷酸化造成严重损害。
图5：LC患者B细胞代谢不良，功能受损。 a 结果表明，HC脾脏B细胞亚群表达GLUT 1、CD 98、BodyProbe和MitoTracker Green(MT Green)等代谢标记物。 n =4)和HBV-LC( n =4)学科。 b 测定了体外培养的富脾B细胞的耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。 n =3)和HBV-LC( n =3)受试者使用海马分析仪。这些细胞不是未经处理就是用CpG刺激。同时加入寡霉素、羰基氰化物-4-(三氟甲基氧化)苯肼(FCCP，线粒体解偶联剂)、抗霉素A、鱼藤酮(A/R)和2-脱氧葡萄糖(2-DG)。 c HBV-LC和正常人脾B细胞对2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG)的摄取 n =6；HBV-LC， n =5)或IgM(HC， n =4；HBV-LC， n =4)24小时。 d HC脾B细胞Pakt(Thr 308)和pS6(S 235/236)水平 n =3)和HBV-LC( n (4)未受刺激者或用CpG(1μM)、CpG(1μM)+雷帕霉素(RAPA)或CpG(1μM)加CD40L(5 0 ng/mL)刺激者。 e HC脾B细胞产生细胞因子(TNF和IL-6) n =4)和HBV-LC( n (4)在未刺激或刺激的条件下，加入CpG(1μM)或R 848(1μg/mL)培养18h。 f HC对脾B细胞增殖的影响 n =4)和HBV-LC( n 4)用CpG体外培养4d。用CFSE标记富集的脾B细胞，用CFSE标记富集的脾B细胞。 低层 检测细胞增殖情况。没有刺激。数据显示为平均值和SD。* P < 0.05, and **P < 0.01, as determined by Mann–Whitney U -测试。
我们接下来研究肝硬化患者的B细胞是否在刺激后的mTORC 1相关信号转导、细胞因子产生和细胞增殖中表现出功能障碍。事实上，我们观察到在CpG或CpG/CD40L刺激的HBV-LC脾B细胞中，Pakt和pS6水平明显降低(见图)。 5D )，确认mTORC 1激活存在缺陷。我们还发现HBV-LC患者脾B细胞亚群的细胞因子生成明显低于HC患者(图1)。 5E )。此外，HBV-LC患者脾B细胞培养4天后，其体外增殖能力明显低于正常对照组(图1)。 5F )。因此，我们的数据显示来自LC患者的B细胞是过度活跃和功能受损的，并且表现出较弱的增殖能力，这与他们的能量代谢缺陷有关。
