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肝硬化患者脾B细胞室代谢缺陷

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发表时间:2020-10-26 09:11作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

肝硬化与疫苗反应缺陷和感染增加有关。肝硬化患者的B细胞间隔失调已被注意到,但并不是很好的特征,特别是在脾脏。在此,我们对肝硬化患者脾脏和外周血中B细胞的扰动进行了全面的研究。我们发现肝硬化明显地耗尽了开关和非开关的脾记忆B细胞,组织学进一步证实了这一点。大量的RNA-seq显示明显的代谢缺陷是脾B细胞功能受损的潜在机制。与正常对照组相比,肝硬化患者脾记忆B细胞在功能上表现出较强的代谢缺陷和抑制增殖。因此,肝硬化广泛干扰脾脏和外周B细胞区,这可能是肝硬化期间体液免疫缺陷的原因之一。

导言

人体肝脏在维持免疫平衡方面起着重要作用。1。在肝硬化(Lc)期间,肝脏的免疫功能受到很大损害。2。肝硬化相关免疫功能障碍(CAID)是许多病理事件的基础,导致肝硬化患者的严重并发症和死亡。3。例如,在晚期肝硬化患者中,免疫缺陷通常会增加微生物感染的易感性,经常导致病人死亡。4。另外,代偿性肝硬化患者可患急性上慢性肝衰竭(Aclf),这是由各种触发事件引发的。5。ACLF的发生与CAID有关,在CAID中,免疫失衡困惑地引起了高发炎和免疫麻痹,在触发阶段导致炎症失调,在再生阶段导致免疫防御失败。5,6。此外,肝硬化患者对疫苗反应不佳,使他们成为最易感染可预防传染病的人群,如流感。7和病毒性肝炎8,9.

体液免疫通过产生抗体在保护宿主免受微生物感染方面起着至关重要的作用。10。在免疫应答过程中,天真B细胞在次级淋巴结(SLO)中遇到抗原和滤泡T辅助细胞(Tfh),触发其增殖和分化为CD 27。+记忆B细胞和抗体分泌细胞11。在稳态条件下,人类记忆B细胞、血浆细胞和抗体池以平衡的方式相互调节。12。然而,肝硬化触发了这些调节机制的不平衡。循环CD 27耗竭+肝硬化患者记忆B细胞池和同时高球蛋白血症的报道13,14,15。有趣的是,这些现象也在各种免疫缺陷和自身免疫条件下被观察到。16,17,18,19,20,21暗示这种不平衡可能存在的共同联系。

肝硬化常导致脾体积增大,严重的脾肿大通过脾切除术治疗。22。脾脏是体内最大的单细胞,含有大量的免疫细胞,尤其是大量的B细胞。23。虽然脾脏在血液传播感染的免疫防御中起着关键的作用。24脾脏在肝硬变时破坏免疫细胞或预防有害感染中的作用仍有争议。25。目前尚不清楚CAID是如何影响脾脏免疫细胞的。最近,我们发现肝硬化患者脾Tfh细胞群的扩大与生发中心(GC)反应增强和高伽马球蛋白血症有关。26说明研究肝硬化脾脏局部免疫的重要性。在此,我们对肝硬化患者脾B细胞区进行了全面的描述,探讨了记忆性B细胞缺失和功能损害的潜在机制,并探讨了这些现象对B细胞储备的影响及其潜在的临床意义。

结果

肝硬化患者外周血和脾脏B细胞区的变化

虽然外围CD 27+肝硬化患者记忆B细胞库的耗尽13,14,15,27脾B细胞区的特征尚不清楚。在此,我们从肝硬化患者(乙肝病毒相关肝硬化(HBV-LC)和非乙型肝炎病毒相关肝硬化(非HBV-LC))和健康献血者(表)中采集脾脏和外周血样本。1)一项全面的脾脏B细胞研究。非肝硬化慢性乙型肝炎(CHB)患者也被纳入外周B细胞研究,以研究HBV感染对无肝硬化条件的B细胞的影响。用多色流式细胞仪对脾脏和外周B细胞池进行观察(图1)。1A和表2包括CD 45和一组B细胞相关标记,如CD 19、CD 21、CD 27、CD 10、CD 38、IGD、IgM、IgA、IgG、IgG 1、IgG 2和IgG 3。流式细胞仪的数据通过用umap软件对流式细胞仪进行分析,将高维参数降为二维图。28。在UMAP聚类的基础上,共识别出8个子集(图1)。1B)。考虑脾B细胞与外周B细胞的相似性,并考虑其他B细胞亚群的分类29,30,31,32,这些B细胞亚群被命名为Trans&GC B细胞(过渡性或生发中心B细胞,CD 38)。CD 10+),PBS(浆细胞,CD 38)CD 10),MZB(边缘区或边缘区样B细胞,CD 27)+IGD+IGM+)、天真B细胞(IGD)+IGM+CD 27和IgA/G1/G2/G3记忆B细胞(IgA)+,IgG 1+,IgG 2+或IgG 3+,以及IGDIGMCD 27+/−)。Trans&GC B细胞和PB亚群因其CD 10和CD 38的表达而与其他亚群不同,而幼稚、MZB和IGD的表达不同。记忆B细胞由于其IGD和CD 27的表达模式而不同于其他亚群。1C)。应用这一策略,对脾脏和外周B细胞亚群的频率进行了分析,并与健康对照组进行了比较。我们发现外周和脾脏CD 19+B细胞比例在各组间相似(图1)。S1a)。重要的是,肝硬化患者的外周血和脾脏中Trans&GC和NA B细胞明显增加,MZB和IgG 1、IgG 2和IgG 3记忆B细胞显著减少(图一)。1D-f)。根据我们之前的研究26肝硬化患者脾脏浆细胞增多。IGA记忆B细胞在外周血中明显减少,但脾脏中的B细胞在很大程度上保持在与正常人相当的水平(图1)。1E,f)。值得注意的是,虽然CHB患者的B细胞亚群与健康对照组相似,但他们的Trans&GC B细胞确实与肝硬化患者相似(图1)。1E),表明肝损伤患者有共同的B细胞特征。

表1.登记对象的基本人口资料。
图1:肝硬化患者脾脏和外周B细胞区的变化。

a流式细胞术对PBMCs和脾脏总B细胞的门控策略。b全脾B细胞门控性标记的表达模式a在Flowjo软件中使用UMAP。该地块来自一位具有代表性的健康献血者的数据。如UMAP热图所示,有8个子集处于门控状态。c以CD 38和CD 10表达和/或CD 27和IGD表达为基础,为每个子集叠加有独特颜色的8个B细胞亚群。d健康献血员(HC)、HBV-LC、非HBV-LC、CHB受试者(左)及HC、HBV-LC和非HBV-LC患者脾脏B细胞的代表子集门控(UMAP)。eHC外周血单个核细胞B细胞亚群的频率(n=12),HBV-LC(n=11),非HBV-LC(n=6),及n=9)科目。fHC脾脏B细胞亚群的频率(n=19),HBV-LC(n=26)和非HBV-LC(n=10)科目。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001, as determined by Mann–Whitney U-测试。gHBV-LC患者脾MZB频率与红细胞(RBCs)、血红蛋白(HGB)、胆碱酯酶(ChE)、肌酸激酶(CK)等临床指标的相关性分析(英文)n=26)。采用Spearman秩相关检验,R平方(R2)与P值显示。

表2流式细胞术抗体面板。

脾MZB细胞的减少是LC受扰B细胞室的一个显著特征。肝硬化患者脾脏中MZB细胞的频率与其疾病严重程度指标(如Child-Pugh评分、白细胞计数和血小板计数)无关(图二)。S1B,C)。然而,MZB细胞在脾脏中的频率与一些临床指标有关,包括胆碱酯酶(ChE)、肌酸激酶(CK)、血红蛋白和红细胞计数(图)。1D)。这些数据表明,肝硬化不仅在周围,而且在脾脏严重扰乱B细胞室。

肝硬化患者脾B细胞区的持续激活

脾Tfh细胞持续活化可能促进肝硬化患者B细胞成熟26因此,我们分析了LC患者B细胞亚群上的活化相关标记(CD 95、FcRL 4、CD 86和CD 71)和迁移相关标记(CD11c、CXCR 3和CCR 6)。2,第2和第3小组)。在这两个面板中,Trans&GC B细胞、PBS细胞、天真B细胞和MZB细胞根据其表型进行门控,而IGD细胞则按表型进行门控。CD 38内的记忆B细胞+/−CD 10成熟B细胞分化为CD 27+经典记忆B细胞(此处命名为cMBCs)和CD 27非典型记忆B细胞(此处命名为aMBCs)33(无花果。1C2A)。通过对阳性人群进行门控或测定平均荧光强度(MFI),分析B细胞亚群上活化相关和迁移相关标记的表达。2B,c)。总之,无论B细胞是从外周还是脾脏中分离出来的,LC患者的B细胞亚群在不同程度上表达的CD 95、FcR 4、CD 86、CD 71、CD11c、CXCR 3和CCR 6水平均高于HC患者(图1)。S2A-D还有无花果。2D-g)。尤其是CD 95,一种在凋亡细胞和活化细胞上高表达的死亡受体,在LC患者几乎所有的脾B细胞亚群上都有明显的上调(图一)。二维空间)。同样,在LC患者脾MZB细胞上,抑制性受体FcRL 4也明显增加。二维空间)。FcRL 4是已知的共同微生物抗原的受体。34。FcRL 4的增加+MZB细胞可反映LC患者脾脏中细菌抗原的积累或细菌移位。有趣的是,CD 86和CD 71在LC患者的脾Trans和GC B细胞上均有明显增加,而在周围则有不同的表达(图一)。2E还有无花果。S2B)。AS CD 71也是前胃癌B细胞的标记物。35提示肝硬化时脾GC活性增强。此外,外周血B细胞对CHB患者CD 71的上调(图1)。S2B)与我们以前的发现是一致的36。CD11c,aMBCs的一种标记物,在各种慢性炎症条件下识别出一个扩展的B细胞亚群。37,在非HBV-LC患者的脾cMBCs、MZB细胞和aMBCs中也有增加(如图所示)。2F)。此外,来自LC患者的脾cMBCs和aMBCs的CXCR 3水平高于HC患者(图1)。2F)。最后,与HC患者相比,LC患者多个脾B细胞亚群CCR 6表达增加(图1)。2G)。这些结果表明肝硬化患者,尤其是脾B细胞亚群中B细胞区的持续激活。

图2:表型分析显示LC患者脾脏B细胞区持续激活。

aTrans&GC B细胞、PBS、cMBCs、aMBCs、MZB细胞和天真B细胞在Flowjo伪彩色图上进行门控,以进行随后的表型分析。b代表CD 95,FcRL 4,CD 86和CD 71表达谱的脾B细胞亚群来自一个健康供体和一个HBV-LC供体。根据每个标记的荧光负1(FMO)对照对阳性群体进行门控,并指出其百分比。c, d占CD 95的百分比+、FcRL 4+、CD 86+和CD 71+来自HC脾脏的Trans&GC B细胞、天真B细胞、MZB细胞、cMBCs和aMBCs的群体n=12),HBV-LC(n=16)和非HBV-LC(n=11)所示的主题。e代表CD11c、CXCR 3和CCR 6的脾B细胞亚群在正常供体和HBV-LC供体脾脏中的表达谱。fCD11c百分比+和CXCR 3+B细胞亚群的人群c, d. gCCR 6在HC脾脏B细胞亚群上的平均荧光强度(MFI)n=9),HBV-LC(12)和非HBV-LC(n=11)科目。数据显示为平均值和SEM。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001, as determined by Mann–Whitney U-测试。

肝硬化患者脾脏GC反应增强及原发性卵泡减少

如上所述,LC患者的Trans和GC B细胞显著增加,MZB细胞和IGD丢失。脾脏中的记忆细胞。为了进一步研究这些变化,我们进行了免疫组织化学染色,用抗CD 20、抗IGD、抗Ki-67和抗CD1c进行了脾切片,用于B细胞滤泡、脾边缘区、生发中心和mzb细胞的鉴定。30,38,39。我们发现肝硬化患者的脾脏一般表现为GC样次级卵泡增大(图一)。3A)。很明显,IGD幼稚B细胞(CD1c))聚集在脾脏的地幔带,在卵泡中心周围形成一个明显的环形层(见图)。3A,b)。进一步用Ki-67染色显示LC患者的假GC区增殖增强(图二)。3A)。而初级卵泡的CD1c与之相当。+细胞富集(主要是MZB细胞)在HC组和LC组中,LC患者的次级卵泡增大,边缘区相对较薄(图1)。3A,b)。此外,LC患者的原发性B细胞滤泡数量明显减少,伴随着次级卵泡计数的增加(见图)。3C,d)。有趣的是,LC患者的原发性卵泡大于HC患者(图1)。3E),可能反映出一种更活跃的状态。这些二级结构的增加与增加的Trans&GC B细胞相一致,而伴有MZB细胞丢失的LC脾细胞缺乏一级结构。

图3:免疫化学染色显示LC患者GC反应增强,MZB富集的原发性卵泡减少。

福尔马林固定石蜡包埋健康供体脾切片(n=6)和LC患者(n6)采用苏木精-伊红(HE)和免疫组织化学染色。aHE和CD 20、IGD、CD1c和Ki-67在3例HC和3例LC患者的连续/或相邻脾脏切片中的表达。b用CD 20、IGD、CD1c染色放大HC和LC的代表初级卵泡和次级卵泡。c, dHC原代和次级B细胞滤泡的平均计数(n=6)和LC(n=6)学科。eHC组和LC组原发性卵泡的平均直径。注意,在两个HC和一个LC受试者的切片中找不到次级卵泡。*P < 0.05, and **P < 0.01, as determined by Mann–Whitney U-测试。

大容量RNA-seq显示LC患者脾B细胞代谢缺陷

为了进一步探讨肝硬化对LC患者B细胞亚群的整体影响,我们对HBV-LC和HC患者的脾B细胞、MZB细胞和cMBCs进行了大量的RNA-seq检测。我们通过主成分分析分析了B细胞亚群的转录组。4A)。结果表明,样本是按B细胞亚群聚类的,而不是按被试群聚类的。MZB细胞和cMBCs的转录序列比较相似,但与单纯B细胞的转录结构不同。在正常人B细胞中检测到41条上调基因和65条下调基因,MZB细胞中检测到30条上调基因和87条下调基因,LC患者cMBCs中检测到36条上调基因和297条下调基因。4B).

图4:正常人脾B细胞亚群与LC患者脾B细胞亚群的转录比较。

aPCA图显示了正常人B细胞、MZB细胞和来自HC和HBV-LC患者的cMBCs的转录.每一点代表一个样本。b火山图显示HC和HBV-LC受试者在幼稚B细胞、MZB细胞和cMBCs中差异表达的基因(DEGS)。每个点代表一个基因,有log2(折叠)<−1或>1的基因PWald试验测得的值<0.05分别为下调基因和上调基因。显示下调或上调基因的数量。cGSEA图谱显示,HBV-LC患者的mTORC 1信号通路、氧化磷酸化通路中的丰富基因序列明显下调,在正常人B细胞、MZB细胞和cMBCs中均有明显下调。这个X绿色曲线的轴是根据信号到噪声值排列的基因的等级,以及Y轴是富集分数(ES)。黑棒表示基因在某些通路上的等级。峰右侧的基因表示对ES贡献最大的前沿子集基因。d热图显示参与mTORC 1信号和氧化磷酸化通路的基因(按信号到噪声排列的前50位,见“材料和方法”部分),这些基因在乙肝病毒-LC患者的正常B、MZB和cMBCs中被下调。

用基因集富集分析(GSEA)检测LC患者B细胞亚群的功能改变。根据MSigDB中的标志基因集,我们证实LC患者的三个B细胞亚群中的mTORC 1信号和氧化磷酸化通路均有明显的下调(图一)。4C)。RNA-seq数据还揭示了LC患者脾B细胞、MZB和cMBCs的糖酵解缺陷(图一)。S3A)。事实上,mTORC 1信号、氧化磷酸化和糖酵解途径中多个基因的表达水平下降(图一)。4D还有无花果。S3B)。这些结果强烈提示LC患者脾B细胞存在广泛的代谢缺陷。此外,在LC患者的cMBCs和MZB细胞中,参与细胞凋亡负调控和细胞增殖正调控的基因也被下调。S3C)。因此,我们推测,在肝硬化中,脾脏B细胞在代谢、抗凋亡途径、增殖和/或分化方面表现出严重的功能障碍。

肝硬化患者B细胞室的功能损害

我们进一步证实了LC患者脾B细胞代谢缺陷。葡萄糖对B细胞的激活是可有可无的,氧化磷酸化也是由其他营养物质推动的。40。我们发现CMBC上葡萄糖转运体GLUT 1的水平和CD 98(SLC3A2)的表达,这是一条与增殖细胞相关的异二聚体氨基酸转运体的重链。41,MZB细胞和AMBC亚群在LC患者中明显减少(图1)。5A)。此外,三种B细胞亚群CD 36(脂肪酸转运蛋白)在LC患者和HC患者中的表达也是相似的(图一)。S4)。然而,我们确实观察到在LC患者中,天真B细胞、MZB细胞和cMBCs的脂肪酸摄取明显减少(图1)。5A)。线粒体动力学在免疫细胞的能量产生中起着重要作用。42。我们还测量了脾脏B细胞线粒体的质量,以评估代谢活性。43使用MitoTracker Green44并观察到LC患者的cMBCs、MZB细胞和aMBCs明显低于HC患者(图1)。5A)。此外,我们还用海马分析了B细胞耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR),分别测定了糖酵解过程中线粒体能量的产生和乳酸的产生,发现肝硬化患者培养的B细胞在未经治疗和刺激的情况下,在耗氧量和糖酵解功能方面都存在严重缺陷(图1)。5B)。尤其是肝硬化患者的B细胞经CpG刺激后,其最大呼吸电位明显降低(图1)。5B)。24小时培养还显示肝硬化患者脾B细胞摄取2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG,一种用于监测活细胞葡萄糖摄取的荧光葡萄糖类似物)低于正常人(如图所示)。5C)。这些数据表明,肝硬化很可能对利用氨基酸和脂肪酸进行各种脾脏B细胞亚群的氧化磷酸化造成严重损害。

图5:LC患者B细胞代谢不良,功能受损。

a结果表明,HC脾脏B细胞亚群表达GLUT 1、CD 98、BodyProbe和MitoTracker Green(MT Green)等代谢标记物。n=4)和HBV-LC(n=4)学科。b测定了体外培养的富脾B细胞的耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。n=3)和HBV-LC(n=3)受试者使用海马分析仪。这些细胞不是未经处理就是用CpG刺激。同时加入寡霉素、羰基氰化物-4-(三氟甲基氧化)苯肼(FCCP,线粒体解偶联剂)、抗霉素A、鱼藤酮(A/R)和2-脱氧葡萄糖(2-DG)。cHBV-LC和正常人脾B细胞对2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG)的摄取n=6;HBV-LC,n=5)或IgM(HC,n=4;HBV-LC,n=4)24小时。dHC脾B细胞Pakt(Thr 308)和pS6(S 235/236)水平n=3)和HBV-LC(n(4)未受刺激者或用CpG(1μM)、CpG(1μM)+雷帕霉素(RAPA)或CpG(1μM)加CD40L(5 0 ng/mL)刺激者。eHC脾B细胞产生细胞因子(TNF和IL-6)n=4)和HBV-LC(n(4)在未刺激或刺激的条件下,加入CpG(1μM)或R 848(1μg/mL)培养18h。fHC对脾B细胞增殖的影响n=4)和HBV-LC(n4)用CpG体外培养4d。用CFSE标记富集的脾B细胞,用CFSE标记富集的脾B细胞。低层检测细胞增殖情况。没有刺激。数据显示为平均值和SD。*P < 0.05, and **P < 0.01, as determined by Mann–Whitney U-测试。

我们接下来研究肝硬化患者的B细胞是否在刺激后的mTORC 1相关信号转导、细胞因子产生和细胞增殖中表现出功能障碍。事实上,我们观察到在CpG或CpG/CD40L刺激的HBV-LC脾B细胞中,Pakt和pS6水平明显降低(见图)。5D),确认mTORC 1激活存在缺陷。我们还发现HBV-LC患者脾B细胞亚群的细胞因子生成明显低于HC患者(图1)。5E)。此外,HBV-LC患者脾B细胞培养4天后,其体外增殖能力明显低于正常对照组(图1)。5F)。因此,我们的数据显示来自LC患者的B细胞是过度活跃和功能受损的,并且表现出较弱的增殖能力,这与他们的能量代谢缺陷有关。

讨论

关于肝硬化是如何影响脾脏B细胞的,目前知之甚少。在此,我们描述了脾B细胞区紊乱及其在LC患者中的过度激活表型。我们的研究还表明,代谢缺陷是LC患者脾B细胞功能受损的潜在机制。这些B细胞亚群的缺陷可能与肝硬化患者体液免疫功能下降有关。

调节失调的B细胞室在肝硬化患者中是独一无二的,并且不同于以前在其他慢性炎症疾病中报道的B细胞间隔,如HIV、HCV、疟疾和自身免疫。16,17,18,19,20,21。虽然CD 27+记忆B细胞明显耗竭,肝硬化不促进CD11c的扩增。+特贝特+AMBCs,但显着地增加天真的B细胞和Trans&GC B细胞的数量。此外,CD 21在IGD中的表达+/−/CD 27+B细胞亚群主要维持在LC中,这与其他条件不同。16,20,21。脾B细胞区的扰动与HBV感染无关,因为非HBV肝硬化的B细胞区也表现出与流式细胞仪数据类似的扰动。连同其他报告13我们的数据表明,在肝硬化期间,B细胞间隔失调是一种非HBV依赖的机制。虽然持续存在的HBV抗原可能对B细胞有非特异性的影响45,46,47在本研究中,我们没有观察到CHB患者的成熟B细胞室有明显的变化。未来的研究应该检查乙肝相关抗原是否会影响不同临床阶段的较大患者群体的B细胞特性。

LC患者脾B细胞持续活化明显,但记忆B细胞丢失和功能损害的机制尚不清楚。在这里,我们表明,有缺陷的新陈代谢很可能是这样的缺失环节之一。LC患者的炎症信号可能会重新连接代谢调节网络。大量转录数据揭示了LC患者切换和非切换记忆B细胞亚群中细胞能量代谢途径的广泛缺陷,这些数据随后被体外功能检测证实,表明B细胞的代谢能力和增殖能力受损。这些现象与脓毒症患者所报告的免疫麻痹状态相似。48糖酵解和氧化代谢都有缺陷。此外,MZB细胞的优势丢失可能是由于LC过程中B细胞激活和分化为浆细胞所致。以前的一项研究表明+CD 27+B细胞向CXCL 13迁移的能力较强49表明这些细胞有进入B细胞卵泡的能力。事实上,我们观察到CXCL 13在肝硬化患者中有较高的表达,脾脏Tfh细胞的增加可能促进浆细胞的分化。26。这些数据表明,在肝硬化时,MZB细胞在GC反应中的增加可能会耗尽脾MZB细胞池。另一种可能是激活诱导的细胞死亡增加,这与CD 27的丢失有关。+B细胞50。我们的转录分析显示,与LC患者B细胞死亡和存活相关的调节网络受到干扰。事实上,我们观察到LC B细胞有缺陷的增殖能力。这与脾Ki-67免疫组化染色的增强并无矛盾,后者主要集中在假GC区,主要表现为胃癌B细胞。因此,通过对LC患者脾脏B细胞亚群的综合分析,我们认为存在缺陷和受损的代谢能力以及较高的分化和激活水平可能会耗尽记忆B细胞池和功能。

SLOS是B细胞对抗原产生反应的部位。脾脏是最大的SLO,含有大量的B细胞,特别是MZB细胞。23,24。尽管肝硬化期间外周记忆B细胞的缺失已被报道3,13,对于SLO中的记忆B细胞的耗尽知之甚少。脾脏组织学表现为B细胞分布的深刻变化,以及患者体内B细胞的增加和记忆B细胞的减少。推测GCs周围独特的单纯B细胞环可能影响体液免疫反应是很有趣的。更重要的是,我们在脾脏B细胞中发现了一系列肝硬化相关的通路,以供将来研究.

总之,肝硬化会对B细胞产生深远的影响,这可能是导致体液免疫缺陷的原因之一。更好地理解这一过程可能有助于设计干预策略,以重振B细胞的功能。

材料和方法

在册科目及样本处理

本文收集44例乙型肝炎病毒相关性肝硬化(HBV-LC)患者和11例非乙型肝炎病毒相关性肝硬化(非HBV-LC)患者进行脾切除术,以缓解门静脉高压和脾肿大的症状。取27例肝移植供者的健康脾脏标本作为对照。从24例HBV-LC,16例非HBV-LC,34例慢性乙型肝炎(CHB)患者和27名年龄匹配的健康献血者中抽取血液样本,无感染、肝病或自身免疫性疾病的证据。所有患者和健康捐献者均从深圳市第三人民医院招募。获得了所有参与者的知情同意。该协议经深圳市第三人民医院伦理委员会批准(参考资料2020~130)。报名科目的基本人口学信息列于表中。1.

脾细胞和PBMC是根据我们先前发表的协议分离出来的。26。FACS染色采用新鲜法或冷冻保存法。用新鲜细胞进行大体积RNA测序。细胞培养实验采用冷冻保存样品。

抗体与流式细胞术

补充表中列出了用于分析B细胞亚群、表型和功能的抗体的详细信息1。用BODIPY™FL C16(Invitrogen,Cat)测定脂肪酸吸收。(D 3821)。为了鉴定和排除死细胞,水荧光活性染料(Invitrogen,Cat)。L 34957)是根据制造商的指示使用的。表面标记染色:将细胞与冰上抗体孵育30 min,洗涤固定,进一步分析。细胞内染色用PERM/Wash缓冲液(BD生物科学)或Foxp 3/转录因子染色缓冲液集(EBioscience)中的相关抗体进行。TM、猫(Cat.)00-5523)。用FACS Frotessa分析B细胞标志物,FACSCantoⅡ流式细胞仪(BD生物科学)分析代谢标志物,用Flowjo软件v.10(TreeStar)对数据进行进一步分析。

免疫组织化学

苏木精-伊红(HE)和免疫组织化学染色采用石蜡包埋4-m脾组织系列切片。补充表中列出了有关主要mAb的信息。1。在室温(RT)条件下,首先与最佳的原抗体浓度共同孵育1h。然后,将切片与HRP-山羊-兔/鼠抗体(CAT)孵育。PV-6000,ZS-GB生物),随后由民建联(猫)开发.ZLI-9018,ZS-GBBIO)。所有的幻灯片在0.23μm/像素模式下,用NanoZoomer-XR数字幻灯片扫描仪C 12000进行可视化,并利用NDP.view 2软件对图像进行分析。用CD 20染色法检测B细胞卵泡,不检测生发中心形成,鉴定原代卵泡,次级卵泡处理明显的生发中心,IGD阴性,Ki-67阳性。30,38,39.

代谢分析

米托追踪器格林(Invitrogen,Cat。用M 7541检测线粒体质量。对于MitoTracker绿色染色和脂肪酸摄取,脾脏细胞或磁珠富集B细胞被重新悬浮在1/1000稀释的可固定活力染料eFluor 450(Thermo Fisher)中。然后将细胞在室温下孵育15 min,37°C下用预热、新制的丝裂霉素绿染色缓冲液(50M)或BODIPY™FL C16染色缓冲液(2M)洗涤再悬浮30 min。细胞离心,再悬浮,用其他抗体染色。B细胞耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)根据生产厂家的指示(Agilent Technologies),在SeahorXF平台上进行测定。2-NBDG(Thermo Fisher,Cat)N 13195)51.

MTOR 1信号转导与细胞因子产生分析

在检测Pakt和pS6水平时,富集脾B细胞(1×10)6用CpGODN 2006(1μM)、CpG(1μM)+雷帕霉素(RAPA,10 NM)或CpG(1μM)+CD40L(5 0 0ng/mL)培养10h,用PE抗PAKT和AF 488抗pSS 6细胞内染色分析pCK(Thr 308)和pS6(Ser2 35/2 36)。细胞因子产生试验用CpG(1μM)刺激脾B细胞,或在96孔U底板(共星、猫)中加bFA(1μg/mL)刺激18 h。(第3799条)。然后收集细胞进行表面标记染色,然后进行TNF和IL-6的细胞内染色,并进行流式细胞术分析。

体外B细胞增殖分化试验

用cfse标记脾B细胞,用含或不含cpG(1μM)的96孔U形底板在1×10的浓度下培养。6细胞/mL连续4天。然后,增殖细胞(CFSE)低层)流式细胞仪分析。

散装rna-seq样品处理

对于大量的RNA-seq,新分离的B细胞用B细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec,Cat)进行富集。130-091-151)。然后,用抗CD 19 percp-cy5、抗-cd 10 pe、抗-cd27 pe-cy7、抗IGD pe-cf 594和抗IgM apc染色30 min,在浓度为10的条件下进行洗涤和再悬浮。7细胞/mL用FACS Aria II细胞分类器对CD 19进行分类。+CD 10IGD+IGM+CD 27+MZB细胞,CD 19+CD 10IGD+IGM+CD 27幼稚B细胞和CD 19+CD 10IGDIGMCD 27+CMBCs至少1×106每个样本收集细胞。收集到的B细胞亚群经分离纯化后离心,亚组悬浮在TRIzol中,保存在−80°C处,直至RNA提取。共采集了5例HC患者和5例HBV-LC患者的27份标本,进行了大量的RNA-seq检测。

散装rna-seq图谱与GSEA

样品在Illumina HiSeq X十平台上进行了测序。构建成对端文库,插入长度为250~300 bp.每次阅读的长度为150 bp。清洁读取是通过应用HISAT 2映射到人类基因组(Hg 38)上的。52使用默认参数。然后,利用SUBREAD的特征数计算基因计数。53默认参数。基因计数少于10的基因被丢弃。然后,用DESeq 2的R软件包比较基因的丰度。54。DESeq 2对PCa进行rlog归一化基因丰度分析。差异表达基因(Degs)通过Wald试验计算,其中有一个原木基因。2<−1或>1(p值<0.05)分别为下调基因和上调基因。对David进行了GO分析(Https://david.ncifcrf.gov/)利用差异表达的基因。GSEA是使用集群Profiler的R包(3.12.0版)执行的。55,其中标记基因在MSigDB中设置。56用于注释。根据信噪比对gsea基因进行排序,并给出计算公式。μAμB/σAσB,在哪里μ是卑劣和σ标准差;σ最小值为0.2。


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