WNT 11-FZD 7-DAAM 1信号支持肿瘤的起始能力和黑色素瘤阿米巴样的侵袭

黑色素瘤是一种高度侵袭性的肿瘤，可在疾病进展早期转移。值得注意的是，黑色素瘤可以利用阿米巴侵袭策略传播。我们在这里表明，高的肌球蛋白Ⅱ活性，高水平的Ki-67和高的肿瘤启动能力是侵袭性阿米巴黑色素瘤细胞的特征。机械地，我们发现WNT 11-FZD7-DAAM 1激活Rho-ROCK 1/2-肌球蛋白II，并在调节肿瘤的起始潜能、局部侵袭和远处转移形成中发挥关键作用。重要的是，阿米巴黑色素瘤细胞同时表达增殖和侵袭性基因信号。因此，人类和小鼠黑色素瘤的侵袭性前沿在阿米巴样细胞中富集，这些细胞也是Ki-67阳性的。这种模式在转移性病变中进一步增强。我们建议在手术切除后根除阿米巴黑色素瘤细胞作为一种治疗策略。

恶性黑色素瘤是最具侵袭性的癌症之一，占皮肤癌相关死亡的80%以上。黑色素瘤是一种非上皮性肿瘤，起源于黑色素细胞，色素产生细胞来源于神经嵴(NC)。NC是一个高度迁移的多能细胞群体，在胚胎发生过程中经历上皮向间充质转变(EMT)。1。黑色素瘤的高转移和耐药特征与其具有干细胞特性的nc样表型有关。1,2,3,4。黑色素瘤是非常异质的，由具有干细胞性质的不同的细胞亚群组成。5,6。这些细胞是启动和维持肿瘤生长，治疗抗药性和随后的肿瘤复发所必需的。4,5.

迁移性黑色素瘤细胞表现出较高的细胞可塑性，在拉长和变形虫运动模式之间移动，以适应不断变化的微环境。7,8,9,10。这两种迁移方式在一定程度上都需要肌球蛋白Ⅱ的活性，但变形虫细胞的特征是rho-roCK 1/2信号的高激活。9,10,11,12。ROCK 1/2在RhoA/C下游激活后，肌球蛋白磷酸酶活性降低，MLC 2磷酸化和肌球蛋白Ⅱ活性增加。阿米巴细胞在体内迁移速度更快，并在原发肿瘤的侵袭前和继发性病变中富集。7,10,12,13,14,15,16。另一方面，在上皮性肿瘤中，通过emt获得移行性和侵袭性表型与干细胞样性质的增加有关。17。在黑色素瘤中，从增殖状态转为侵袭状态与黑色素瘤的进展和转移有关。18,19。虽然这种表型转换类似emt样行为，但与黑色素瘤中的肿瘤起始能力之间的联系仍然很难理解。20,21。此外，岩石驱动的变形虫入侵行为是否与干细胞的性质有关尚不清楚。

在本研究中，我们展示了具有高肌球蛋白Ⅱ活性的阿米巴侵袭性黑色素瘤细胞是如何具有肿瘤起始能力的。我们发现ROCK 1/2调控EMT相关的基因，作为回报，它控制着变形虫的特征。WNT 11-FZD 7-DAAM 1激活Rho-ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ，控制肿瘤的发生、局部浸润和远处转移形成。我们发现，人类原发性黑色素瘤的侵袭性前沿富含阿米巴样，侵袭和增殖细胞，表达非典型的Wnt和肿瘤干细胞标记物。

阿米巴细胞在体外和体内支持黑色素瘤肿瘤的发生

为了探讨变形虫黑色素瘤细胞是否表达与nc发育相关的基因或干细胞样特征，对阿米巴黑色素瘤细胞进行了单样本基因集富集分析(SsGSEA)。10。具体来说，将阿米巴样A375M2黑色素瘤细胞的转录序列与ROCK 1/2抑制剂(ROCK 1/2抑制剂)或博比司他汀(一种直接的肌球蛋白II抑制剂)处理的A375M2细胞进行了比较，或者将其与肌球蛋白II活性较低的A375P黑色素瘤细胞进行了比较。10,12,15。SsGSEA分析显示，A375M2细胞在不同的基因标记中富集，这些特征赋予了干细胞样特性的本质属性，包括NC基因、肿瘤干细胞或胚胎干细胞标记(图1)。1A).

接下来，我们评估了A375M2和A375P细胞在免疫缺陷的NOD/SCID/IL2Rγ−/−(NSG)小鼠皮下注射限制稀释液(50万、5万和5000个细胞)的体内肿瘤启动潜能，并采用极限稀释分析(Elda)。22。阿米巴A375M2细胞在肿瘤的发生中效率较高，但在肿瘤发生频率(TIF)上有显着性差异(图一)。1B)，与A375P细胞相比，在所有条件下肿瘤生长都有增加(如图所示)。1C)。圆形细胞的富集(图1.1D)和肌球蛋白II活性，用磷酸化的MLC 2(p-MLC 2)水平测定。1E与肿瘤体(TB)相比，在A375M2肿瘤的侵袭前沿(IF)观察到，而A375P肿瘤的细胞聚集和肌球蛋白Ⅱ水平下降(图一)。1D，e)。重要的是，我们还观察到与TBS相比，A375P肿瘤的IFS中的变形虫特征有所增加，尽管不那么明显(图一)。1D，e)。为了进一步研究肿瘤内肌球蛋白Ⅱ水平的异质性，根据p-MLC 2的强度，将肌球蛋白Ⅱ的活性从0(低)到3(很高)进行评分。A375M2肿瘤显示在IF中肌球蛋白II非常高的细胞增多(补充图)。1A)。高水平的Ki-67与皮肤黑色素瘤的侵袭性有关。23。虽然在体外培养7天后细胞数量没有变化(附图)。1BA375M2肿瘤在体内有较高的增殖指数，可见Ki-67染色(补充图)。1C)。有趣的是，所有肿瘤的IFS都在Ki-67增殖细胞中富集.这些数据表明，具有内在高肌球蛋白Ⅱ活性的阿米巴样细胞在体内也具有增殖和促进肿瘤生长的作用。

其次，我们研究了黑色素瘤细胞在低粘附条件下的体外自我更新能力。我们介绍了另一对黑色素瘤细胞系WM983B(转移性、圆形变形虫和高肌球蛋白Ⅱ)和WM983A(原发肿瘤，细长和低肌球蛋白Ⅱ)。15,24来自同一个病人。利用这两种模型，我们对低水平肌球蛋白II的细长黑色素瘤细胞进行了连续的球形传代。12,15,24(A375P及WM983A)(附图)1D)。连续传代导致细胞的黑色素圈形成能力随着时间的增加(图一)。1F)。虽然肿瘤的起始细胞被描述为处于缓慢的增殖状态。25，在某些肿瘤中也发现了增殖干细胞的亚群体。26。免疫组化分析显示黑色素瘤细胞的肌球蛋白II活性增加(图二)。1gKi-67阳性细胞百分比较高(见图)。氢)随着通道数的增加。贴壁条件下的细胞形态和连续传代球分离的单个细胞的形态也在Ⅰ型胶原基质上进行了评估，以再现真皮环境。7,8,10,12,14。重要的是，连续传代导致圆形细胞的富集(如图所示)。1I)有较高的肌球蛋白Ⅱ水平(图二)。1J)和更多的气泡(如图所示)。1K)。因此，自我更新能力的提高与变形虫特征的增加有关。虽然浓缩效果不那么明显，但在已经有变形虫表型的细胞(A375M2和WM983B)中进行连续的球形传代(补充图)，得到了类似的结果。1 E-j)。此外，MLC2-GFP被导入WM983A细胞(补充图)。1K，l这会增加黑色素圈的形成，增加细胞的聚集，增加肌球蛋白II的活性(附图)。1M-O).

总之，这些数据表明，阿米巴细胞是更多的肿瘤发生，并维持自我更新和肿瘤的开始在黑色素瘤。

ROCK 1/2调控的EMT基因控制阿米巴侵袭性特征

黑色素瘤是一种非上皮性肿瘤，因此获得侵袭性特征并不被认为是典型的EMT。27。尽管如此，EMT基因的表达一直与干细胞样性质的获得有关.变形虫黑色素瘤细胞信号的ssGSEA分析10结果表明，阿米巴A375M2细胞在EMT和转移相关基因标记中均富集(图1)。2A)。值得注意的是，我们还发现阿米巴细胞表达来自nc的基因和与耐药相关的侵袭性特征。4,24(无花果。1一个,2A)。ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ抑制24h后，获得阿米巴样转录产物。10。为了更直接地评估roCK 1/2的抑制作用，我们在a375m2和wm 1361黑色素瘤细胞(Braf)中进行了一个由emt导向的qPCR阵列。V600E或NRASQ61L-驱动黑色素瘤，分别解释了主要的黑色素瘤致癌因素)，仅用Rocki处理4小时。此时，已经观察到细胞周围丢失和肌球蛋白II活性下降(图一)。2B)。有趣的是，Rocki在A375M2和WM 1361细胞中分别降低了72%和59%的EMT相关基因的表达。2C和补充图。2A)。罗基治疗导致关键的EMT调节因子的表达显著降低，如snai家族成员和间充质标记物N-cadherin、Vimentin和纤维连接蛋白(见图)。2C)。这些数据表明ROCK 1/2是EMT相关基因表达的正调控因子，与黑色素瘤的致癌背景无关。

为了确定与此基因特征相关的关键信号通路，进行了网络富集分析。最丰富的网络集中在Wnt和转化生长因子β信号，而第二个包括NF-κB和STAT 3信号(补充图)。2B，c)。我们从这些顶级网络中选择了与变形虫迁移无关的基因(WNT 11, WNT5B, AHNAK, TCF 4和CAV 2)并研究它们是否能调节变形虫的特征。作为阳性对照，SERPINE 1从我们之前描述的支持阿米巴行为的顶级网络中筛选出一个基因28。阿米巴细胞以圆形的形态和高的肌球蛋白Ⅱ活性为特征，因此我们首先在生长在I型胶原基质上的WM 1361细胞上测量了这两个特征。减少表达SERPINE 1, WNT 11, WNT5B, AHNAK和TCF 4导致细胞聚集减少，肌球蛋白Ⅱ活性降低(图一)。二维f)。在黑色素瘤进展过程中，黑色素瘤细胞与周围的角质形成细胞分离，侵入真皮。阿米巴黑色素瘤细胞与角质形成细胞的粘附较少，通过Ⅰ型胶原迁移的效率较低肌球蛋白II的拉长细胞更有效。7。我们发现SERPINE 1, WNT 11, WNT5B和CAV 2耗竭增加了WM 1361细胞与角质形成细胞的粘附(如图所示)。2G)，同时耗尽SERPINE 1, WNT 11, WNT5B和AHNAK减少通过I型胶原基质的3D侵袭(见图)。2H)。总之，WNT 11, WNT5B和SERPINE 1(我们的阳性对照)对所有的检测都有影响(图一)。2I)。接下来，我们验证了非正则Wnt配体在调节我们屏幕中的阿米巴样特征中的作用。使用三种不同的RNAiWNT 11表达，我们测量细胞周围减少，肌球蛋白Ⅱ活性和减少侵袭(补充图。2D-g)A375M2和WM 1361细胞。在此之后，我们得到了类似的结果。WNT5B击倒(附图)2H-j).

这些结果表明，非正则的Wnt配体支持黑色素瘤、阿米巴样的侵袭，而不依赖于致癌背景。

非正则Wnt配体支持黑色素瘤形成和变形虫行为

非典型的Wnt配体由ROCK 1/2调节，作为回报，这些配体控制阿米巴特征，产生一个正反馈环(图1)。2C-I)。ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ具有多种细胞功能，包括细胞增殖、迁移或侵袭。7,9,10,11,29,30,31，而emt与干细胞样性质的增加有关。17。我们首先探讨了ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ是否通过不同的Rocki(H 1152和GSK 269962A)阻断整个转录过程来支持体外肿瘤的形成。干细胞相关基因的表达。3A和补充图。3A)，细胞四舍五入和p-MLC 2水平(补充图.3B，c)治疗后下降。有趣的是，使用几个阿米巴细胞株，一个单一的治疗与罗基受损的黑色素圈形成(图一)。3B和补充图。三维空间)。值得注意的是，在体外2D细胞的活力下降后7天(图)。3C和补充图。3E)。同样的结果是直接用博比司他汀阻断肌球蛋白II(见图)。3B，c)。这些效应被进一步证实为ROCK 1/2-肌球蛋白II依赖性，因为这两个岩石基因(ROCK 1/2)或MLC 2基因(MYL 9和MYL12B)在A375M2和WM 1361细胞中减少黑色素圈的形成(如图所示)。三维空间和补充图。3F，g)。2D细胞存活率在7d后下降(见图)。3E)，3天后无明显影响(图1)。3F)。这些数据表明，我们可以在不影响黑色素瘤细胞活力的情况下短暂降低肌球蛋白Ⅱ的水平，但肌球蛋白Ⅱ的长期耗竭会损害细胞的存活。

因此，我们接下来将探讨ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ是否通过调节Wnt配体和独立于其他功能来维持肿瘤的生长。有趣的是，降低了WNT 11和WNT5B导致黑色素圈形成减少(图一)。3G，h)，而在体外培养7d后，2D细胞活力未受影响(图5)。3i，j)。这些数据表明，Wnt配体既支持变形虫特征，也支持体外黑色素圈的形成。另一方面，Wnt信号既可以由肿瘤细胞产生，也可以由肿瘤微环境中的基质细胞产生。32。伸长的A375P细胞经WNT 11或WNT5B配体处理后，细胞四舍五入增加(图1)。3K)。这些结果表明黑色素瘤细胞能够以自分泌和旁分泌的方式对非典型的Wnt配体进行调节。

WNT 11下游的FZD 7通过DAAM 1支持黑色素圈的形成和阿米巴样的入侵。

非典型的Wnt配体可以通过不同的Fzd受体和共受体信号。利用我们的微阵列数据检测阿米巴黑色素瘤细胞10我们发现大部分WNT 11和WNT5B受体在阿米巴A375M2细胞中都有过表达。4A)。因为阿米巴细胞的含量在黑色素瘤进展的晚期是富集的。7,8,10,12，我们使用了公开的数据33,34,35探讨非典型性Wnt配体在原发性和转移性黑色素瘤中的受体表达。4B)。特别是，WNT 11-同源受体FZD 7及其共受体雷克在大多数研究中，转移性黑色素瘤中均有持续升高的现象。重要的是，FZD 7沉默导致黑色素圈形成最强的减少(如图所示)。4C)，同时耗尽两者中的任何一种。FZD 7或雷克对体外培养的2D细胞活力无影响(图1)。4D). FZD 7沉默也会导致细胞四舍五入的丢失(如图所示)。4E)和肌球蛋白II活性下降(图一)。4F和补充图。4A，b)。此外，FZD 7耗竭损害通过三维胶原I基质的侵袭(图)。4G). FZD 7使用两种不同的shRNAs(补充图)进一步验证了效果。4C-g)。这些数据提示FZD 7是阿米巴细胞侵袭和黑色素圈形成的重要调节因子。

a, b表示非典型wnt受体表达的log 2倍变化的热图aA375M2细胞与罗基(H 1152和Y 27632)、白比司他汀和金处理后的A375P细胞或A375M2细胞的比较b转移性对决来自GEO和TCGA数据库的原发黑色素瘤样本。c–f后FZD 7或雷克A375M2和WM 1361细胞的基因敲除c球体形成指数(n=A375M2=4，n=3(WM 1361)，d细胞活力(n=A375M2=5，n=3(WM 1361)，e细胞形态(>300个细胞)n=3)和fP-MLC 2级(n=A375M2=3，n=4(WM 1361)。g术后I型胶原基质三维侵袭指数的定量研究FZD 7A375M2击倒(n=5)和WM 1361细胞(n=3)。h–j后PLCB 1或DAAM 1A375M2和WM 1361细胞的基因敲除h细胞形态(>250个细胞)n=3)，i球体形成指数(n=4)和j细胞活力(n=A375M2=6，n=3(WM 1361)。k术后I型胶原基质三维侵袭指数的定量研究DAAM 1A375M2击倒(n=4)和WM 1361细胞(n=3)。lWNT 11刺激后A375P细胞在I型胶原基质上的典型相对比图像(左)和细胞形态定量(右)PLCB 1或DAAM 1击倒(>400个细胞)n=5)。标尺，100μm。m, n有代表性的免疫球蛋白(顶部)和定量(底部)m拉下样品中的RhoA-GTP和总溶出物中的总RhoA(n=3)和nP-MLC 2级(n=4)在A375P细胞中，WNT 11和DAAM 1击倒。c, d, f, g, i–k, m, n图为均值±S.E.M。e, h, l框限显示25和75百分位数，水平线显示中位数，而晶须显示最小和最大范围的值。c–nn意味着独立生物实验的数量。a, g, k双尾t-测试。b双尾t-用韦尔奇的修正进行测试。c, d, f, i, j单因素方差分析与邓尼特后测。e, hKruskal-Wallis和Dunn的多重比较试验。lKruskal-Wallis检验与本雅明，克里格和叶库蒂利校正。m, n单因素方差分析与图基后测。对于所有图，*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. The exact significant p值*p, **p和*p见补充表1.

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在与同源受体结合后，非正则的wnt配体可以通过两个关键的分子平台来信号：dvl-plcb介导的钙信号。36和DVL-DAAM1-Rho信号37,38。为了建立特异性，我们调查了PLCB 1和DAAM 1耗竭。PLCB 1在不同的亚型中被选择，因为它在黑色素瘤转移中被上调(补充图)。4H)。任一PLCB 1或DAAM 1沉默降低细胞包围和p-MLC 2的基础水平(见图)。4H和补充图。4i，j)，表明这两种途径均能控制基础肌球蛋白Ⅱ的活性。然而，只有DAAM 1但不是PCLB 1A375M2和WM 1361细胞的黑色素圈形成受损。4I)而不影响2D细胞的活性。4J)。此外,DAAM 1沉默减少通过3D胶原I基质的侵袭(图)。4K). DAAM 1使用两种不同的shRNAs(补充图)进一步验证了效果。4K-o)。此外，在sh中，干细胞相关标记的表达也降低了。DAAM 1细胞(附图)4P)。这些结果提示DAAM 1对阿米巴样的侵袭和肿瘤的发生具有重要的控制作用。

我们已经证明WNT 11能以旁分泌方式促进黑色素瘤细胞的变形虫特征。3K)。关键的是，我们发现在wnt 11刺激后细胞四舍五入的增加不再被观察到。DAAM 1耗尽细胞PLCB 1耗竭的细胞仍然对配体有反应(如图所示)。4L和补充图。4Q)。此外，WNT 11刺激黑色素瘤细胞RhoA活性和下游肌球蛋白II水平，但这种作用在DAAM 1被沉默了(无花果)。4m，n).

这些结果表明，WNT11/5B-FZD7-DAAM 1通路通过激活RhoA-ROCK1/2-肌球蛋白II的特异性池来控制黑色素圈的形成和变形虫的侵袭行为。

FZD7-DAAM1-RhoA-ROCK1/2支持体内肿瘤的发生和转移

接下来我们测试FZD7-DAAM1-RhoA-ROCK1/2-myosinII轴是否会在体内影响黑色素瘤。首先，用不同的Rocki(H 1152和GSK 269962A)体外预处理A375M2细胞5d。细胞的相对数量减少(附图)。5A)。然而，只有存活的细胞随后被注射到免疫缺陷的NSG小鼠皮下，数量相等，没有任何进一步的动物治疗。注射后18天，Rocki预处理的A375M2来源的肿瘤显示肿瘤重量减少了60%以上(如图所示)。5A)。重要的是，即使这些肿瘤从未在体内接受过任何治疗，我们也测量了罗基预处理肿瘤中细胞四舍五入、p-MLC 2水平和Ki-67阳性细胞的减少(图一)。5B-d)。同样，Rocki预处理B16F10黑色素瘤细胞(补充图)。c.)皮下注射到免疫能力强的C57BL/6J小鼠体内，肿瘤生长减弱(补充图1)。5D洛基预处理组阿米巴样细胞数减少(补充图1)。5E-g)。这些结果表明，ROCK 1/2支持人和小鼠黑色素瘤细胞通过支持变形虫特征形成肿瘤的内在能力。

为了研究fzd 7和dam 1在体内肿瘤发生中的作用，限制了这两种药物的稀释度。FZD 7或什DAAM 1将WM 1361细胞皮下注射到NSG小鼠体内。减少FZD 7水平(补充图。5H)注射50,000和5,000个细胞时肿瘤生长减少，而饱和浓度为500,000细胞时没有变化(图1)。5E)。重要的是，使用Elda的TIF明显减少(图1)。5E)。圆形细胞中的浓缩物(如图所示)。5F)和p-MLC 2水平(图1.5G与TBS相比，在shControl肿瘤中观察到补充5i)，而sh则测量细胞周围丢失和肌球蛋白Ⅱ活性降低。FZD 7衍生肿瘤(图1.5F，g)。什FZD 7肿瘤中肌球蛋白II含量极高的细胞在IF(补充图)中呈下降趋势。5I)。虽然在体外没有细胞数量的差异，FZD 7体内肿瘤中Ki-67增殖标记阳性细胞的比例减少(如图所示)。5H)。这些数据表明，FZD 7的丢失导致肿瘤中阿米巴样增殖细胞比例减少，导致肿瘤的发生减少。

接下来我们测定了sh的体内抑瘤能力。DAAM 1WM 1361细胞。DAAM 1耗竭(附图)5J)在限制50,000和5,000个细胞稀释时，TIF减少，肿瘤生长减少(见图)。5I)。什DAAM 1肿瘤表现出明显的细胞四舍五入丢失(如图所示)。5J)，肌球蛋白II活性(图1.5K和补充图。5K)和Ki-67阳性细胞。5L)。DAAM 1在黑色素瘤中的体内肿瘤起始能力通过另一个黑色素瘤细胞系A375M2(补充图)进一步验证。5L-p). DAAM 1耗尽导致TIF和A375M2肿瘤生长减少(附图)。5L)。这些结果证实了FZD7-DAAM1-RhoA-ROCK1/2通过维持黑色素瘤的变形虫行为而促进肿瘤的形成。

如果肿瘤的细胞是那些战略性的定位，离开原发肿瘤和传播到遥远的地点。摘要肺是黑色素瘤转移的主要部位之一，阿米巴细胞中的高肌球蛋白Ⅱ水平促进了肺的种植和定植。7,12,14。为了检测DAAM 1在这两个过程中的作用，我们使用了一个实验转移模型。尾静脉注射30分钟后肺血管内有相似的细胞数目(附图)。5q)。然而，shDAAM 1黑色素瘤细胞在24小时后对肺部的定植效率较低(如图所示)。五米)。值得注意的是，3周后转移灶的面积减少。DAAM 1已经耗尽了(图中所示)。五米)。这些结果表明DAAM 1对于早期的肺定植和后期的生长能力是非常重要的。我们的数据进一步表明，阿米巴样特征的丧失对早期肺播种和晚期转移生长都有影响。

阿米巴行为促进体内肿瘤形成、肿瘤进展和转移

我们已经证明，由FZD7-DAAM 1信号维持的ROCK 1/2-肌球蛋白II型变形虫表型支持肿瘤的形成和传播。利用原位自发黑色素瘤转移模型，我们再次回顾黑色素瘤进展的步骤。注射4599-BRAFV600E黑色素瘤细胞进入NSG小鼠真皮，导致原位肿瘤的形成。然后用罗基对小鼠进行系统治疗(如图所示)。6A)因为据我们所知，没有任何药物可以有效地/特异性地抑制体内非正则的FZD7-DAAM 1信号。我们观察到控制肿瘤的三个明确区域：TB，IF和进一步侵入真皮的局部区域(侵袭细胞或远端浸润前(DIF))(图)。6B)重述人类疾病39。DIF的所有侵袭细胞均呈圆形变形虫样特征：56%的细胞表现出最高的肌球蛋白II活性，60.4%的侵袭细胞为增殖标记物Ki-67阳性。6C)。尤其是在DIF的侵袭细胞中，有30.2%的细胞出现p-MLC 2评分3和Ki-67的共染色(如图所示)。6C)。这些数据表明，阿米巴样入侵细胞也是增殖的。细胞四舍五入6d)，总肌球蛋白Ⅱ活性(图1.6E)和Ki-67阳性细胞。6f)在控制肿瘤中，从TB逐渐增加到IF到DIF。肌球蛋白Ⅱ极高的细胞在IF中丰富，在DIF中进一步富集(图1)。6E和补充图。6a，b)。重要的是，Rocki导致细胞四舍五入丢失，导致IFS和DIFs肌球蛋白II活性下降(图1)。6d，e)，同时在Rocki治疗肿瘤的所有区域都观察到Ki-67阳性细胞的减少(图1)。6f)。这些数据表明，Rocki在体内损害了变形虫的特征和增殖。

从增殖状态到侵袭状态的表型转换被认为是黑色素瘤进展的原因之一。18,19,20。然而，我们的转录分析表明，阿米巴A375M2细胞在增殖和侵袭基因中都富集了(见图)。6g和补充图。6C，d)。此外，在A375M2肿瘤的IFS中发现肌球蛋白Ⅱ活性和Ki-67阳性细胞的富集(见图)。1E和补充图。1A，c)，提示ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ维持的阿米巴样表型在原则上可以支持肿瘤的形成和肿瘤的扩散。值得注意的是，根据它在调节增殖和侵袭基因中的作用，Rocki在4599个肿瘤中引起了原发肿瘤生长的减少(图1)。六小时)并导致黑色素瘤细胞丢失，离开原发肿瘤并侵入邻近组织(见图)。6i，j)。与局部侵袭减少相一致，罗基治疗的小鼠自发肺转移明显减少(图一)。6K)。我们的结果表明，变形虫黑色素瘤细胞的ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ活性控制肿瘤的生长和扩散。

在先前的实验环境中，由于原发肿瘤生长和局部浸润减少，很难将这些效应与转移效应分开。接下来，我们用尾静脉注射法评估了Rocki对黑色素瘤转移定植和生长的影响。4599细胞在静脉注射前用Rocki预处理24h，在体内继续处理6天。尾静脉注射30分钟后，细胞在血流中的存活没有改变，相似的细胞数量也没有改变(补充图)。6E)。然而，Rocki减少了肺转移的建立。6L)。当4599个细胞--没有任何预处理--被静脉注射时，肺转移减少，而在注射后4小时，小鼠接受Rocki全身治疗12天(如图所示)。6米).

我们的数据证实ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ的活性不仅对肿瘤的形成和侵袭很重要，而且对早期定植和后期的转移生长也很重要。这表明ROCK 1/2-肌球蛋白II的活性在黑色素瘤进展的各个阶段都起着至关重要的作用。

原发性黑色素瘤侵袭前的分析

为了了解原发黑色素瘤中的变形虫细胞是否增加了肿瘤的发生特征，我们分析了53例原发性黑色素瘤的TBS和IFS(补充表)。2)。细胞形态和p-MLC 2为阿米波样标记，Ki-67染色为增殖标记，WNT 11、WNT5B和DAAM 1为非典型Wnt标记，ALDH1 1、ALDH 1 3、CD 44、NANOG和OCT 4为肿瘤干细胞相关标记。根据先前对黑色素瘤患者的评估7,10,12,15我们可以测量到人类黑色素瘤的IFS在高肌球蛋白Ⅱ活性的圆形变形虫细胞中富集。7a，b和补充图。7A)。重要的是，正如我们的肿瘤模型所观察到的。1, 5, 6在人IFS中，肌球蛋白II含量极高的细胞占主导地位。此外，在IFS中，Ki-67阳性细胞的百分比也有所增加(见图)。7C)。有趣的是，DAAM 1、WNT 11和WNT5B水平较高的细胞也在IFS中富集。7D-f)。DAAM 1评分为3分的细胞在这些地区占优势(补充图)。7b)。重要的是，我们在这些IFS中发现了ALD-HA1，CD 44和NANOG的表达(如图所示)。7g-i)，而ALDH 1 A3和OCT 4无变化(补充图4)。7C，d)。我们提供的区域信息显示，阿米巴样/非典型Wnt/干细胞标记在人原发性肿瘤的IF区高表达(补充图1)。7E)。有趣的是，所有差异表达标记的主成分分析清楚地区分了原发性黑色素瘤中的TB和IF区域(图1)。7J)。在所有被调查的标记中，ALD-HA1的浓度最高，IFS平均增加13倍。值得注意的是，在我们的黑色素瘤患者队列中，高表达的ALD-HA1蛋白似乎会导致更糟糕的预后和更短的无病生存期(图一)。7K，l)。ALDh1A1是一种参与自我更新和增殖的功能标记物，具有重要的抗氧化作用。40。具有高肌球蛋白Ⅱ的侵袭性黑色素瘤细胞含有较低水平的活性氧(ROS)8,24，而抗氧化剂则促进黑色素瘤的侵袭和转移。41,42。此外，较高的活性氧水平会降低肌球蛋白Ⅱ的活性。8。沉默ALD-HA1导致黑色素圈形成减少(附图)。7F，g)。有趣的是，ALD-HA1消耗导致细胞四舍五入的损失和较低的p-MLC 2水平(补充图)。7H，i)，而FACS测量的ROS水平则有所增加(补充图1)。7J，k)。我们的数据表明，ALD-HA1通过调节ROS代谢支持阿米巴样肿瘤的启动特征。总之，这些数据表明，人类原发性黑色素瘤的IFS是富含阿米巴、增殖、非典型Wnt和肿瘤干细胞相关标记物的肿瘤区域。

人转移性黑色素瘤侵袭前的分析

为了进一步研究黑色素瘤细胞在继发性肿瘤形成过程中是否保持这种表型，对45例来自人黑色素瘤转移瘤的TBS和IFS进行了评估(补充表)。3)。转移性黑色素瘤在原发肿瘤中保留相同的区域分布，即阿米巴样(图1)。8a，b和补充图。8A)和增殖细胞。8C)在IF区显著，IFS在非典型Wnt标记中也有富集(图1)。8D-f和补充图。8B)和干细胞相关标记。8g-i和补充图。8C，d)。重要的是，所有指标在转移中的总体水平较高。事实上，来自转移灶的TBS是更多的变形虫，更多的增殖，并且有较高的基础水平的一些非典型的Wnt和干细胞相关的标记物(补充图)。8e-h)与原发肿瘤TBS相比。因此，转移性IFS中所有标记物的增加并不像在原发肿瘤中那样明显。这些结果表明原发于原发IFS中的阿米巴样肿瘤的表型在转移性黑色素瘤中被重新整合并进一步增强。总之，我们的数据显示，阿米巴细胞侵袭/增殖行为是在黑色素瘤进展过程中选择的。

黑色素瘤是一种高度侵袭性的肿瘤，能够从疾病的早期阶段转移。黑色素瘤细胞高度迁移能力的部分原因是它的NC来源。1。参与nc发育和黑色素瘤进展的信号通路是密切相关的。2,3。在这里，我们提供证据表明，阿米巴黑色素瘤细胞显示出更多的肿瘤启动能力。我们发现，具有高肌球蛋白Ⅱ活性和高水平Ki-67的圆形变形虫细胞在体外和体内均与肿瘤的起始能力增强有关。ROCK 1/2-肌球蛋白II通路是细胞增殖、迁移、侵袭和转移的关键调节因子。7,9,10,11,29,30,31。我们最近报道了肌球蛋白Ⅱ的活性驱动了黑色素瘤的治疗抗药性。24，一种与肿瘤发生细胞特性密切相关的机制。25,43。NC干细胞转录状态在黑色素瘤复发和耐药中起重要作用4。此外，我们对阿米巴黑色素瘤细胞转录信号的分析10显示阿米巴细胞富含nc和与耐药性相关的侵袭性特征。4,24。另一方面，肿瘤起始细胞被认为代表了一个处于缓慢增殖状态的小细胞群体。25。然而，据报道，它们能够活跃地增殖，并有高达25%的细胞发生肿瘤的报道。6,44,45。Ki-67能影响克隆性干细胞特性46，在某些肿瘤中也发现了ki-67增殖干细胞的亚群体。26.

重要的是，我们还发现变形虫黑色素瘤细胞表达由rok 1/2驱动的emt相关基因。47同时通过激活p38信号来促进转录改变48,49。有趣的是，ROCK 1/2调节着转化生长因子β的表达，β信号是与ROCK 1/2调控的转化生长因子基因信号相关的顶级网络之一。我们还发现变形虫细胞分泌高水平的转化生长因子β，其分泌是依赖于ROCK 1/2的。7,15,24。转化生长因子(β)通过诱导多个间充质基因的转录和提高emt转录因子的活性而成为emt的关键驱动因子。47,50。这表明TGF-β是岩石调控全球emt基因程序的可能机制之一，同时也是变形虫入侵的可能机制之一。7.

在这些受ROCK调控的EMT相关基因中，我们发现了Wnt配体.反过来，这些基因又驱动着阿米巴的特征。具体来说，我们发现WNT11/5B-FZD7-DAAM 1信号轴通过控制变形虫表型而影响肿瘤的发生。Wnt 11-DAAM 1信号被描述为在nc迁移中起着至关重要的作用。51,52,53在早期胚胎发育过程中NC的形成和NC规范54,55。Wnt5A透钙2+Pkc信号在黑色素瘤进展中起着重要作用。56，而其他的Wnt配体还没有得到详细的研究。我们发现WNT 11和WNT5B可以控制变形虫的自我更新和侵袭行为。此外，黑色素瘤细胞可以利用来自基质的旁分泌Wnt信号。32，维持变形虫的表型，只要它们表达正确的受体库。我们发现WNT 11/WNT5B配体下游的FZD 7受体在黑色素瘤进展过程中被上调，表明该受体具有阿米巴样行为。极限稀释分析揭示了fzd 7如何支持体内肿瘤的启动能力和黑色素瘤的肿瘤生长，这与以前关于其他肿瘤的报道是一致的。57。重要的是，我们的工作已经揭示了DAAM 1在促进肿瘤和转移的起始和在黑色素瘤后期转移生长中的重要作用，通过调节阿米巴样特征。DAAM 1是一种福尔马林同源蛋白，在将信号从wnt配体转化到肌动蛋白细胞骨架中起着核心作用。37。与其他福尔马林不同，DAAM 1的激活是通过其与DVL在Wnt刺激下的结合而不是通过它与活性Rho GTPase的相互作用而具体介导的。37,38。这种机制在发展过程中得到了描述，但在癌症的发生或发展过程中却没有被描述。因此，我们在这里强调癌症细胞劫持一个发展计划的另一个例子。另一方面，DAAM 1促进RhoA激活37,38通过征聘PDZ-RhoGlobal58。根据人类蛋白质图谱，我们发现与其他癌症相比，PDZ-RhoGF在黑色素瘤中高表达(补充图)。8I)。我们提出非典型的WNT11/5B-FZD7-DAAM 1轴，通过促进ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ驱动的变形虫增殖和侵袭性表型，特异地控制黑色素瘤的肿瘤起始潜能。8j).

此外，我们提供证据表明，阿米巴细胞是在黑色素瘤发展的几个步骤中选择的。在目前的研究中，我们使用有效的和选择性的Rocki来证明ROCK 1/2-肌球蛋白II轴是黑色素瘤肿瘤生长和转移的重要调节因子。我们已经报道过阿米巴黑色素瘤细胞通过重新编程免疫微环境来支持肿瘤的生长。15。此外，肿瘤微环境可以调节ROCK2-myosinⅡ来支持肿瘤的生长。59。在黑色素瘤中，ROCK 1/2-肌球蛋白Ⅱ也通过细胞自主机制发挥重要的促肿瘤作用。重要的是，阿米巴黑色素瘤细胞表达来自增殖和侵袭的基因。18,19。我们发现体内存在阿米巴样侵袭细胞，这些细胞对Ki-67增殖标记物呈阳性反应，并含有很高水平的肌球蛋白II，当用Rocki阻断整个通路时，这种细胞群也会受到损害。在最近的一项研究中，发现了黑色素瘤细胞的一个亚群，该细胞由于高转录的转化生长因子β信号激活而同时表现出增殖和侵袭的特性。60。因为他们的基因本体论分析显示阿米巴特征丰富。60这是诱人的推测，这是相同的黑色素瘤细胞的群体。

在本研究中，我们证明由非典型的WNT-DAAM 1信号所促进的阿米巴样增殖和侵袭表型是黑色素瘤肿瘤的起始和晚期转移所必需的。我们认为阿米巴黑色素瘤细胞能够维持EMT和干细胞相关基因的表达，从而成功转移。根据这一概念，对患者活检的评估显示，人类原发性黑色素瘤的IFS富含阿米巴样、增殖性、非典型性Wnt和与癌症干细胞相关的标记物。有报道称，促进肿瘤扩展和增殖的功能性干细胞存在于某些肿瘤的肿瘤边缘。61。此外，Ki-67指数和有丝分裂率是肿瘤进展的标志，是黑色素瘤预后的因素。23,62,63。此外，在这种阿米巴样肿瘤起始表型中，我们鉴定了ALD-HA1，这是肿瘤发生能力的关键基因。重要的是，ALD-HA1的丢失会导致变形虫表型的丧失，反之亦然。由于ALD-HA1与黑色素瘤的肿瘤起始能力有关，并与耐药有关。64,65我们认为ALD-HA1是黑色素瘤患者潜在的预后指标。重要的是，我们发现转移性黑色素瘤病灶可以再现原发肿瘤的行为，并显示阿米巴样肿瘤的形成模式。

总的来说，我们已经揭示了变形虫细胞中的WNT11B/5B-FZD7-DAAM 1是如何支持肿瘤起始特性的，同时也是如何促进侵袭的。由于变形虫细胞在肿瘤边缘突出，我们的工作为黑色素瘤在远处传播和生长的早期能力提供了一些线索。我们认为黑色素瘤肿瘤的IFS是病理学家应该仔细评估的具有重要预后特征的区域。此外，在切除黑色素瘤后，我们建议抑制非典型的Wnt信号，以消除肿瘤边缘的侵袭性变形虫行为。

细胞培养

细胞在37°C和10%CO条件下培养2在DMEM(A375M2、A375P、B16F10、4599、HEK293T和HaCaT)或RPMI(WM 1361、WM983B和WM983A)中，添加10%FBS和1%青霉素/链霉素(均来自吉布科)。A375M2和A375P细胞来自Richard Hynes教授(HHMI，MIT，美国)，WM 1361细胞来自Richard Marais教授(英国曼彻斯特癌症研究所)，WM983B和WM983A来自Coriell研究所，B16F10细胞来自Hector Peinado博士(西班牙CNIO)，4599个细胞来自Amin Sadok博士(英国癌症研究所)和Richard Marais教授，HEK 293 T细胞来自Jeremy Carlton博士(英国Francis Crick Institute，UK)，HaCaT细胞来自Ester Martin Villar博士(IIBM，UAM，西班牙)。A375M2、A375P、WM983B、WM983A和4599经短串联重复序列DNA谱鉴定。对所有细胞系进行支原体污染常规检测。所有细胞系的培养时间最长可达3~4代，并定期检测细胞表型。

球体形成试验

球体形成实验如前所述。66。单个细胞在100升球体培养基(DMEM/F12+1：50 B27(Invitrogen)，20 ng/ml EGF(PHG 0315，Invitrogen)，20 ng/ml FGF(PHG 0026，Invitrogen)，4mg/ml肝素(H 3149，Sigma)和1%青霉素/链霉素)中添加1：50 B27(Invitrogen)，20 ng/ml EGF(PHG 0315，Invitrogen)，20 ng/ml FGF(PHG 0026，Invitrogen)，4mg/ml肝素(H 3149，Sigma)和1%青霉素/链霉素(1%青霉素/链2。连续传代，离心、酶法(胰蛋白酶37℃处理10 min)，25g针机械分离。结果产生的单细胞悬浮液被计数和重新镀在原来的密度。在所有的测试中，7天后黑色素圈的形成被量化。球体形成指数(SFI)综合考虑球体的数量和大小，计算方法是将形成的球体面积之和除以初始镀膜的单细胞数。在每个生物实验中，进行了2-3个技术复制，并考虑了平均SFI。利用ImageJ对图像进行定量分析。

Ⅰ型胶原厚层细胞培养

牛Ⅰ型胶原(编号5005-B；PureCol，高级生物基质)是在1.7mg/ml条件下制备的。10,12。聚合4h后，将细胞接种在含10%FBS的培养基上，使细胞粘附16h，将培养基改为1%FBS，并在适当的情况下进行处理。24h后进行细胞分析。在实验结束时，用4%甲醛固定凝胶，收集图像或溶解物。

细胞形态分析

用前面描述的ImageJ在牛Ⅰ型胶原基质上培养的细胞的相位对比度图像上量化了细胞的形态。12,15,24。手动绘制细胞形状后，用形态学描述工具“圆度”评价细胞形态。圆度指数计算为4×面积/π×主轴长度。2。接近1的值代表圆形的形态；接近0的值代表更多的扩展和/或纺锤形细胞。

药物治疗

本研究使用的收缩性抑制剂和浓度分别为：5μM H 1152(再悬浮于水中；#555550，CalBiochem)，1 M或5 M GSK 269962A(再悬浮于DMSO；#1167，Axon)和25 M BLIBistatin(95%DMSO中再悬浮；#203390，CalBiochem)。处理时间按每次试验规定。在无血清培养基中加入WNT 11(200 ng/ml；6179-WN-010，R&D系统)和WNT5B(500 ng/ml；7347-WN-025，R&D系统)。

转染和RNAi

2×105第二天，用Optimem-I和Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染20 NM siGenome Smartpool(SP)或ON-Targetplus(OT)siRNA寡核苷酸。球状细胞形成试验和细胞活力测定，24 h后再转染细胞，转染48h后收获细胞，并重作等量的种子分析。所有siRNA序列均来自Dharmacon(美国Lafayette)，列在补充表中。4。在所有的siRNA实验中，以非靶向的siRNA为对照。

黑色素瘤细胞慢病毒的产生与感染

4×105将慢病毒载体(1μg)和包装载体(p-MD2.VSVg(0.4μg)和pΔ8.91(1μg))在6孔板上转染HEK 2 93 T细胞，分别用Optimem-I和Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染HEK 2 93 T细胞。转染后48h收集上清，分离过滤(0.45μm)。慢病毒转导，2×105黑色素瘤细胞接种于6孔板内，感染慢病毒。用1μg/ml普罗霉素(LifeTechnologies)筛选稳定的细胞。FZD 7和DAAM 1使用表达来自Dharmacon的TurboGFP的pGIPZ慢病毒shRNA结构实现沉默(美国Lafayette)：shFZD 7#1(V3LHS_368263 5‘-AGAGCACGCTGAAGACGCC-3’)，shFZD 7#2(V3LHS_368264 5‘-CGTTTTCATGGGG-3’)，shDAAM 1#1(V3LHS_339679 5‘-TTGGATTGTCTCTCT-3’)，shDAAM 1#2(V3LHS_339678 5‘-TTAGATTGAGACTGGG-3’)，非沉默shControl(5‘-ATCTCGCTGGGGGAGTAAG-3’)。Pgfp融合的大鼠野生型mcl 2质粒是从Takaki博士和Erik Sahai教授那里获得的。67.

免疫印迹和抗体

细胞在Laemmli样品缓冲液中溶解，煮沸5 min，超声处理15s，然后向下旋转。裂解液用10%或12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到PVDF滤池(0.45m，固定化)。采用HRP结合二次抗体(GE Healthcare)的ECL检测系统(GE Healthcare)进行检测。用图像J.量化条带。校正相关蛋白的总水平后，计算磷蛋白的水平。抗体：来自细胞信号技术的pThr 18/Ser19-MLC2(1：750，#3674)，MLC 2(1：750，#3672)和RhoA(1：1000，#2117)；GFP(1：10000，sc-8334)来自圣克鲁斯生物技术；GAPDH(1：10000，MAB 374)。

RhoA-GTP下拉试验

RhoA-gtp下拉试验按所述进行。8,14。2×105细胞/井在6孔板上播种，血清饥饿，WNT 11处理。细胞在含50 mM pH 7.4，10%甘油，1%NP 40，5mm MgCl的裂解缓冲液中溶解。2、100 mM NaCl、1mM DTT和EDTA游离蛋白酶抑制剂纺丝而下。分离了一小部分蛋白质裂解物，用于测定总RhoA水平。将剩余的蛋白裂解液与与Rhotekin RBD微球结合的谷胱甘肽S-转移酶(GST)孵育1h，离心、洗涤、再悬浮于负载缓冲液中。所有样品均煮沸5 min，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.免疫印迹法检测RhoA。

共焦荧光显微镜与图像量化

细胞接种在I型胶原基质上，免疫染色如所述。12。用4%甲醛固定，0.3%TritonX-100渗透，5%牛血清白蛋白(BSA)阻断，用pSer19-MLC2(1：200，#3671，细胞信号)染色，用二级Alexa Fluor 488或647抗体(LifeTechnologies)检测。F-肌动蛋白用Alexa Fluor 546-phalloidin(生命技术)和核与Hoechst 33258(生命技术)染色.抗体用5%BSA-PBS稀释.在Zeiss LSM 510共焦显微镜上，分别用PLAN-Apochromat 40x/1.2 NA(水)物镜和Zeiss LSM 710共焦显微镜和PLAN-Apochromat 40x/1.3油或PLAN-Apochromat 63x/1.4 NA(油)物镜(Carl Zeiss)和Zen软件进行了成像。图像分析采用ImageJ。将P-MLC 2荧光信号量化，计算单个细胞相对于细胞面积的像素强度。

角质形成细胞单层粘附试验

HaCaT角质形成细胞于10点在96孔板中播种。5细胞/孔和24小时后，用CMFDA绿色染料染色的黑色素瘤细胞(10 M，Life Technologies)在10的顶部播种。4细胞/很好。37°C培养2h后，观察细胞形态变化。然后用pbs冲洗两次盘子，并重新成像。按冲洗前与洗前比较的细胞数计算粘附细胞百分率。

三维侵袭试验

细胞以2.3mg/ml的浓度悬浮在无血清的牛Ⅰ型胶原中，最终浓度为1×10。4每100μ1基质细胞，在96孔板上播种，旋转至井底.经过基质聚合后，在基体上加入10%含fbs的介质，使细胞能像前面所述的那样向上侵入24小时。8,14。然后用4%甲醛固定平板，用5g/ml Hoechst 33258(生命技术)染色，ZEN软件在蔡司LSM 510或Zeiss LSM 710共焦显微镜(卡尔蔡司)上成像。共聚焦z-切片从每口井底部和50m处采集，计算三维侵袭指数，计算为50m处的侵入细胞数除以总细胞数。

细胞内活性氧的测定

取细胞在37℃下用5μM细胞绿试剂(生命技术)在黑暗中孵育30 min。然后用FACS缓冲液(pBS−、1%bsa、2mmEDTA、0.1%NaN)稀释细胞。3采用BD-LSRFortessa™系统(Barts肿瘤研究所流式细胞术核心)和FLOJO软件(附图)进行荧光分析。7K)。细胞首先在FSC-A和SSC-A上进行门控以消除细胞碎片.然后，对FSC-A对FSC-H和SSC-A对SSC-W进行双打的判别。仅用活细胞和单细胞进行分析。用平均荧光强度分析CellROX绿色阳性反应。

细胞活力测定

转染siRNAs 48h后，将稳定表达shRNA或细胞的细胞接种于6孔板(25,000细胞/孔)中。对于Rocki实验，在6孔板中播种了25000个细胞，允许细胞粘附，并按照每个实验的指示进行处理。所有实验7天后进行细胞活力评估，MYL 9和MYL12BSiRNA实验显示，3天和7天后对其进行评估。然后用1%甲醛固定细胞，0.25%结晶紫染色。空气干燥后，用10%醋酸溶解结晶紫染色.将每口井的样品转移到96孔板上，在595 nm的微板阅读器上测量吸光度，作为细胞数的间接测量。结果被标准化为初始镀膜细胞的值，并以每个样本中相对于对照组的细胞百分比表示。

定量实时一步PCR和qPCR emt阵列

用TriZol(生命技术)和RNeaseMini试剂盒(Chiagen)分离总RNA。QPCR引物和灿烂III超快SYBR绿色QRT-PCR主混合(Agilent Technologies)与50 ng RNA被使用，按照制造商的指示。GAPDH用作装载控制。采用来自中国生物学的qPCR引物：WNT 11(HP 101586)WNT5B(HP 101843)ALD-HA1(HP 100088)10月4日(HP 101756)。采用了来自齐根的定量引物：GAPDH(QT 00079247)ROCK 1(QT 00034972)ROCK 2(QT 00011165)MYL 9(QT 00072268)MYL12B(QT 00075264)FZD 7(QT 00213850)雷克(QT 00047292)PLCB 1(QT 00038689)DAAM 1(QT 005579)ALD-H1A3(QT 00077588)奈诺(QT 01025850)JARID1B(QT 00060648)CD 44(QT 00073549)SOX 2(QT 00237601)铝凸轮(QT 00026824)

上皮间充质转换(EMT)RT2 ProfilerPCR阵列(330231，PAHS-090Z，奇根)按照制造商的指示进行。利用RT2第一链试剂盒(Chiagen)将2g总RNA反转录成cDNA，并进行qPCREMT阵列。反应在QuantStudio 7 Flex实时PCR系统(热Fisher科学)上运行。使用基于web的工具(Https://dataanalysis.qiagen.com/pcr/arrayanalysis.php)由制造商提供，基因表达被标准化为管家基因。

人类数据库中基因表达数据的分析

来自公共数据库GEO(基因表达总括)，徐GSE 840135(31例原发性和52例转移性黑色素瘤)，Riker GSE 755334(14例原发性和40例转移性黑色素瘤)和Kabbarah GSE 4651733共提取31例原发黑色素瘤和73例转移性黑色素瘤。使用GenePattern平台(Https://www.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern).

肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中的70例原发黑色素瘤和319例转移性黑色素瘤的基因表达数据和临床资料均从Firehoss下载。Https://gdac.broadinstitute.org/)。仅考虑肿瘤切除前无新辅助治疗的TCGA标本。

基因富集分析

阿米巴黑色素瘤细胞(GSE 23764)规范化基因表达芯片数据10将阿米巴A375M2细胞与A375P细胞、ROCK 1/2抑制剂(H 1152和Y 27632)和白比司他汀(Bblebbistatin)处理后的A375P细胞和A375M2细胞进行比较分析。VerFaille细胞增殖和侵袭性信号的基因集19和虎克18研究：利用基因集富集分析(Gsea)软件下载和分析干细胞样信号和emt过程。68(Http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)具有特定设置：排列-1,000，置换类型-基因集，基因排序度量-t检验.在单样本基因集富集分析(SsGSEA)中，阿米巴A375M2细胞中存在明显富集的干细胞样/emt基因集。p-值<0.05，FDR<0.25，至少在4次比较中有3次。为了计算每个样本的基因特征评分，我们使用ssGSEA投影软件。68,69来自GenePattern平台(Https://www.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern)。用MeV_4_9_0软件生成热图(Http://mev.tm4.org/).

对qPCREMT阵列中至少一个细胞株的显著下调基因进行了网络富集分析，同时对另一个细胞株进行了下调或无表达变化的基因网络富集分析。

动物研究

所有动物都在特定的无病原体条件下饲养，并按照英国内政部动物福利机构委员会(1986年“内政部动物科学程序法”)处理。所有动物实验都由巴茨癌症研究所、伦敦国王学院和弗朗西斯克里克研究所的道德审查进程委员会批准，并在英国内政部的许可下进行。所有小鼠均来自英国查尔斯河。实验小鼠6~12周龄。动物被安置在每笼4到5只老鼠中，每只老鼠都能接触到食物和水。维持12 h交替的光照-暗周期，室温(21±1°C)和相对湿度(40~60%)。

A375M2和B16F10细胞经预处理后，用ROCK 1/2抑制剂(5 M H 1152，1 M或5 M MGSK 269962A)预处理前5天，每日添加新鲜药物。然后1×106A375M2细胞或2×10细胞5将B16F10细胞混合于100μl的还原性Matrigel(356230，Corning)中，皮下注射NOD/SCID/IL2Rγ−(NSG)小鼠(A375M2)或C57BL/6J小鼠(B16F10)。实验过程中未对小鼠进行治疗。

限制稀释试验，5×105，5×104，1×104或5×103细胞(A375M2/A375P细胞，稳定的sh)FZD 7#1/shDAAM 1#1/shControl WM 1361细胞和稳定的shDAAM 1将#1/shControA375M2细胞与100μmol的生长因子还原型Matrigel(356230，Corning)混合，皮下注射到雌性NSG小鼠体内。注射后3周评估肿瘤生长情况。肿瘤起始频率(Tif)由elda估算。22使用底部20TH每个实验中肿瘤大小的百分位数作为阳性生长的极限阈值。只有高于这个阈值的肿瘤才被考虑。

用4599个细胞2×10进行原位实验5将稳定表达hNIS-mCherry(4599.hNIS-mCherry)的4599细胞经皮内注射到雄性NSG小鼠体内。肿瘤可以在平均肿瘤体积为20 mm的第11天开始治疗。3。每日灌胃给药(GSK 269962A 25 mg/kg，溶于5%DMSO或车辆5%DMSO)。

对于上述所有肿瘤模型，肿瘤大小由卡尺测量来监测和确定，并以肿瘤体积(Mm)计算。3)=长×宽×高×0.52。实验结束时，在解剖肿瘤之前进行测量，或对解剖后的肿瘤进行称重。肿瘤采用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)进行免疫组织化学分析。

实验转移试验，1×106稳定SHDAAM 1并在NSG小鼠(雌雄配型)尾静脉注入100μmol/L PBS中的shControl WM 1361细胞。30 min后处死小鼠(以显示相同细胞数到达肺)、24、3周后，用4%甲醛固定16 h，在Zeiss LSM 510 Meta共聚焦显微镜下检测荧光信号(GFP)。对每只小鼠肺20~25张图像进行分析，并以每只小鼠肺荧光面积百分比表示肺保留率。

4599细胞(4×10)检测转移瘤的实验研究5用5M GSK 269962A预处理细胞24 h，在200 lPBS中注入NSG雌性小鼠尾静脉。每天25 mg/kg(GSK 269962A溶于5%DMSO或5%DMSO)口服灌胃。30 min和6天后处死小鼠，洗肺固定，免疫组织化学染色。同样，4×105将未经预处理的4599细胞注入NSG雌性小鼠尾静脉，用5%DMSO或5%DMSO溶于5%DMSO或5%DMSO中，每日给予GSK 269962A 25 mg/kg，连续灌胃12天。

免疫组织化学

案例选择

两个组织微阵列，包括53例原发性黑色素瘤和45例转移瘤的FFPE活检(补充表)2和3)包括在案例系列中。每个活检由来自肿瘤体(TB)的两个核心(直径1mm)和来自侵袭性前区(IF)的两个核心来表示。如前面所述，IF被定义为至少50%与基质接触的黑色素瘤细胞。7,10,12。肿瘤按照世界卫生组织的最新标准分类。肿瘤样本由IRBLleida(PT 17/0015/0027)和Hub-ICO-IDIBELL(PT 17/0015/0024)处理，这些生物基底被整合在西班牙国家生物银行网络和加泰罗尼亚肿瘤公司的Xarxa de Bancs de Catalunya，并经伦理和科学委员会适当批准后遵循标准作业程序。根据“赫尔辛基宣言”，在征得具体知情同意的情况下收集了样本。

皮下肿瘤的全部切片(A375M2/A375P肿瘤，shControl/sh)FZD 7/什DAAM 1WM 1361肿瘤和shControl/shDAAM 1A375M2肿瘤来自极限稀释试验)、皮内肿瘤(4599个细胞)和小鼠肺尾静脉转移试验(4599个细胞)。

此外，还包括一系列球体通道中的黑球。琼脂颗粒由每一通道的球体产生。球体被轻轻地收集起来，然后在300×g10分钟。用PBS洗涤两次，包埋于50 mg/L琼脂中。最后，用标准免疫组织化学方法将琼脂颗粒包埋在石蜡中。

实验程序

所有组织样品均为ffpe，切片(3-4μm-厚)，在65°C下干燥1h，然后在相应的去掩蔽液中进行离体化、再水化和热诱导表位的提取，在110°C处用生物标记室(Dc 2012)进行6 min的表位提取(补充表)。5)。内源过氧化物酶用双内源酶阻断剂(#S 2003，Agilent)阻断10 min.试剂在室温下在湿滑室中孵育。免疫组织化学染色所用的抗体、稀释液和条件的详细信息见补充表。5。所有染色均用苏木精染色。

成象记分

肿瘤组织的形态学分析采用了前面描述的苏木精和伊红染色(H&E)切片。10。细胞形态分级为0~3(0=圆形，1=卵圆形，2=拉长，3=纺锤形)，分值为：细胞形状分数=(细胞百分比为0×0)+(%形状1×1)+(%Sham 2×2)+(%form 2×2)+(%form 3×3)，评分范围为0(所有细胞圆)至300(所有细胞纺锤体)。采用连续切片，结合染色的百分比和强度，对所有标记物进行半定量分级。每个样本均获得组织学评分(H评分)，其值从0(无免疫反应)到300(最大免疫反应)不等。采用以下公式进行评分，H-评分=1×(%光染色)+2×(%中度染色)+3×(%强染色)。对WNT 11、WNT5B、CD 44、NANOG、OCT 4、ALD-HA1和ALD-H1A3染色进行盲评分，并进行H-染色。用iScope显微镜(IS.1159EPLi，Euromex)和ImageFocus4.0(Euromex)软件对具有代表性的图片进行H评分成像。对p-MLC 2、Ki-67、FZD 7和DAAM 1染色，用纳米动物园S 210型幻灯片扫描仪(Hamamatsu)对全断面图像(WSI)进行扫描。用QuPath 0.1.2软件进行染色定量70。阳性细胞检测，根据强度评分(0、1、2和3)采用3个不同的阈值。然后，对软件进行训练，结合强度信息创建随机树分类算法，以区分肿瘤细胞与坏死细胞、基质细胞和免疫细胞。然后，考虑染色的百分比和强度，对IHC染色进行半定量分级，并按上述方法计算H-评分值。此外，为了显示不同标记(ALD-HA1、CD 44、p-MLC2、DAAM 1和KI-67)之间的空间相关性，利用QuPath中的光密度平均(OD均值)-Chanel 2：VIP染色强度绘制了热点图。为了进行共定位分析，使用TrackEM 2模块对斐济v1.52p的p-MLC 2和Ki-67标记进行了比对。然后，用AEC-苏木精载体进行反褶积，每种染色用通道-2(红色)合成。该复合材料被调整，反转LUT对每个标记，并给予假彩色。以4599细胞为实验材料，采用mCherry染色法对原发肿瘤中的侵袭细胞进行定量检测。WSI采用纳米动物园S 210幻灯片扫描仪(Hamamatsu)进行扫描。用QuPath软件进行mCherry分析：在肿瘤浸润前划定一个浸润区，用阳性细胞检测插件计数阳性细胞。用QuPath软件对4599个细胞进行肺定殖试验。在每项研究中都进行了几项监督注释，以确定肿瘤、正常组织和空白区域。其次，利用随机树分类和低分辨率的方法，对所有情况下的图像进行像素分类.

统计分析

未配对t测试，曼-惠特尼试验，配对t-使用GraphPad Prism(GraphPad Software，Inc.)进行测试、Wilcoxon检验、带有Dunnett或Tukey的单向方差分析、或Benjamin amini、Krieger和Yekutieli校正，以及Kruskal-Wallis与Dunn的多重比较检验。用SPSS统计软件进行主成分分析、Kaplan-Meier法生存曲线估计和对数秩检验。极限稀释分析用ELDA软件(Http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)22。将数据绘制为平均±标准差的图表(S.E.M.)；或框限为25和75百分位数的盒形图，水平线显示中值，晶须显示图图中所示的最小和最大数值范围。P数值用双尾试验计算。P小于0.05的数值被认为具有统计学意义。在数字传说中，“n“指除非另有说明，否则独立生物实验的数目。