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摘要残留样1是胰腺癌和基底性乳腺癌共同表达的一种靶向性癌胎盘抗原。

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发表时间:2020-10-23 09:56作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

以细胞毒性T淋巴细胞(CTL)为基础的肿瘤免疫治疗在诱导肿瘤相关抗原(TAA)的临床回归中具有广阔的应用前景。为了拓展胰管腺癌(PDAC)的TAA前景,我们对35例PDAC患者的HLAⅠ类结合肽进行了串联质谱分析。本研究发现一种来源于共转录激活剂前庭样1(VGLL 1)的HLA-A*0101限制性肽可能是一种TAA,在多种肿瘤类型中均有过表达,在正常组织中低表达或缺失。我们在此证明,从PDAC患者的血液中扩增出的VGLL 1特异性CTL可以识别并以抗原特异性的方式杀死大部分HLA-A*0101异基因肿瘤细胞系,这些细胞系不仅来自PDAC,还包括膀胱、卵巢、胃、肺和基底样乳腺癌。基因表达谱显示VGLL 1是一种独特的癌症-胎盘抗原(CPA)的成员,它可能构成多种癌症患者的免疫治疗靶点。

导言

胰管腺癌(Pdac)是胰腺癌中最具侵袭性的一种,因其预后差、死亡率高而声名狼藉,总体5年生存率为8%,是所有类型胰腺癌中最低的类型之一。1,2。早期发现是不寻常的,85%的患者表现为局部晚期或转移性疾病。3。有效治疗的进展缓慢,与PDAC相关的死亡发生率继续上升。4,5。尽管最近通过优化手术和化疗治疗方案的顺序,在生存方面取得了一些令人鼓舞的进步,但对于晚期PDAC患者来说,开发新的、有效的治疗方案仍然是迫切需要的。6.

基于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的免疫治疗已经成功地诱导了多种癌症类型的客观临床反应。7。通过T淋巴细胞的非特异性激活作用的检查点抑制剂(Cpi)疗法对患者的长期生存产生了显著的积极影响。8。然而,cpi的好处主要局限于高度变异的肿瘤类型,如黑色素瘤和肺腺癌,它们可以在表面HLA分子中表达大量潜在的新抗原肽。5,9。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)疗法是将肿瘤自身的T细胞再注入肿瘤的方法,在诱导肿瘤消退方面也有很大的应用前景。10,11TILs是一种多克隆抗原,既能识别病人特异性的新抗原,又能识别肿瘤相关抗原,如黑素细胞分化抗原(Mda)或肿瘤睾丸抗原(Cta)。12,13,14。以抗原特异性内源性T细胞(ETC)或基因工程tcr-T细胞为靶点,通过抗原特异性内源性T细胞(ETC)或基因工程tcr-T细胞(tcr-T细胞)的输注,成功地诱导黑色素瘤和其他实体15,16,17,18,19.

不幸的是,基于cpi和ctl的免疫疗法在治疗PDAC患者方面没有显示出同样的有益效果。20,21。这种缺乏成功的原因是PDAC具有高度的免疫抑制性肿瘤微环境(Tme),加上相对较低的突变负担,导致了新抗原靶点的缺乏。22,23,24,25。在PDAC中已经发现了许多具有潜在靶向性的HLAⅠ类限制性肽抗原,其中最显著的是来自癌胚抗原相关细胞粘附分子(CEACAM)、粘蛋白16(MUC 16)、间皮素(MSLN)和突变的抗原。克拉斯,除其他外26,27,28,29,30。针对非突变的taa的治疗虽然很有前途,但也面临着固有的限制,包括在非肿瘤组织中诱导毒性,目标抗原表达率较低,或无法打破经常阻碍高亲和力ctl生成的自我耐受机制。20,31,32。除有限的例外情况外,针对这些抗原的临床试验产生了令人失望的结果,突出表明需要确定安全、免疫原性目标,以证明PDAC患者的高发病率。

为了拓展PDAC靶向TAA的应用前景,我们对35例PDAC患者肿瘤标本中的HLAⅠ类结合肽抗原进行了串联质谱(MS)分析。我们在这里报告了一种共同的,HLA-A*0101限制性肽的发现,该肽来源于在多个患者中表达和呈现的协同转录激活物前庭样1(VGLL 1)。从PDAC患者外周血单个核细胞(PBMCs)中分离和扩增的VGLL 1肽特异性CTL,除了识别一组异基因HLA-A*0101阳性的PDAC、卵巢、胃、膀胱、肺和基底样乳腺癌细胞系外,还能有力地杀伤自体肿瘤细胞。除乳腺细胞株外,VGLL1CTLs不识别大多数HLA-A*0101表达的正常原代细胞。患者注射自体VGLL1CTLs后,无自身免疫毒性,但也未能诱导临床反应,这可能是由于转移性肿瘤丢失了VGLL 1抗原所致。33。比较基因表达谱显示VGLL 1是一组独特的癌胎盘抗原(CPA),胎盘抗原在胎盘中高表达,在基本正常组织中表达低至缺失,在几种不同癌症中过表达。综上所述,我们的结果表明VGLL 1是一种免疫原性TAA靶点,具有很强的潜力使CTL介导的治疗PDAC和多种其他类型的癌症。

结果

PDAC免疫球蛋白分析鉴定肿瘤相关肽

为了确定PDAC CTL免疫治疗的肽靶点,我们对35例PDAC患者在安德森癌症中心治疗的39例肿瘤标本进行了分析。其中包括34例新鲜切除的外科标本(20例转移性肿瘤和14例原发性肿瘤),以及3例患者来源的异种移植(PDX)和2株转移性器官样细胞。肿瘤细胞经总HLAⅠ类免疫沉淀和酸洗脱后,串联质谱(MS)分析HLA结合肽。在SwissProt数据库(更新9/2018)上搜索洗脱肽片段谱,以确定编码在人类蛋白质组中的匹配。个体肽匹配使用多个正交参数进行评估,包括Mascot离子评分、ms1质量差(δ质量),以及通过高分辨率遗传测序确定的与患者HLA同种类型的结合预测。34,35。(1)用RNAseq法检测肿瘤组织转录本的表达;(2)正常组织转录本表达(GTEx Portal数据库);(3)肿瘤组织中的总表达(TCGA数据库)。1A) (Http://www.gtexportal.org/home/, Http://cancergenome.nih.gov/).

图1:免疫球蛋白体分析显示两个PDAC患者来源的细胞器系表达的VGLL 1衍生肽。

a从35例MDD患者39个肿瘤标本中鉴定PDAC肿瘤特异性、HLAⅠ类结合肽的实验策略。b生物信息学筛选策略,从洗脱的PDAC相关肽中筛选出具有潜在靶向性的TAA。比较53例GTEx门静脉正常组织中PDAC肿瘤RNA seq表达与转录表达的差异。除睾丸外,正常组织分为四类(非必需组织、警告组织、危险组织和危险组织),它们反映了肿瘤外对不同组织的潜在毒性(表中列出)。S2)。所有肽编码基因依次使用四个相应的表达阈值(30、10、3和1 TPM,以绿色虚线表示)进行筛选,以消除CTL治疗中最有可能引起自身免疫毒性的候选TAA(红色虚线)。从PDAC患者MP 015和MP 081的肿瘤细胞株中分离到的高置信度肽的筛选结果表明,很少有洗脱肽符合这些严格的标准。cHLA-A*0101-限制性VGLL 1衍生肽从两种不同的PDAC细胞株MP 015和MP 081中分离得到的质谱。患者源性肽与合成同位素标记的vgll 1肽LSELETPG的质谱裂解谱进行了共洗脱和匹配。KY(包含13c/15标记的赖氨酸残基)y+碎片离子序列(用蓝色显示)显示了预期的8个原子质量单位的移动,不像b+碎片离子(底部面板)。IP免疫沉淀,TPM每百万转录本,TAA肿瘤相关抗原。

HLAⅠ类免疫沉淀量与新鲜肿瘤标本大小相关(P<0.01)。R2其中8例(21.6%)HLA-Ⅰ类表达较低,经westernblot分析,其余8例(21.6%)HLAⅠ类表达相对较低。39例肿瘤标本共获得23,245例独特的高置信度肽,其中7966个肽(34.3%)为8~13-肽,可与一个或多个HLA-Ⅰ类异型结合。新鲜肿瘤标本产生的多肽数量变化很大,从238到1657(平均=542)。对于三名患者,PDX衍生导致肿瘤标本更大,产生更多的洗脱肽。两株病人源性器官细胞系(MP 015)中,有一株产生了最高数量的洗脱肽。n=1903),强调在MS分析之前在体外扩大肿瘤标本所提供的数量优势(补充表)1).

表达谱分析确定VGLL 1为胰腺癌TAA

为了评估是否有任何被洗脱的肽构成潜在的治疗性CTL靶点,参照含有来自53个不同人类组织的RNAseq数据的GTEx门户数据库,分别评估肽编码基因的正常组织转录表达。正常组织(不包括睾丸)被分为四组,反映抗原特异性CTL(补充表)预期的非目标杀伤活性的潜在毒性。2)。肽编码基因被筛选使用四个相应的表达过滤器增加严格,以消除候选TAA最有可能引起自身免疫毒性在CTL治疗(图一)。1b)。因此,虽然TAA转录表达在非必需组织(如前列腺、乳腺和脂肪组织)中最高可达30 tpm,但对于心脏和大脑等高度基本组织,最高表达阈值为1 tpm,CTL识别对这些组织是致命的。36,37。使用这些严格的标准,12个TAA肽被认为是最安全的靶标,编码这些肽的基因是MUC 16(编码5个独特的肽),MUC 19,ZNF 717,EIF5AL1,RGPD 1,SLC30A8,Mia 2,和VGLL 1(每个编码一个唯一的肽)。TAAS MSLN和IDO 1编码的多肽也被检测到,但由于RNA转录在正常肺组织中的高表达而被排除在筛选中(分别为88 TPM和16 TPM,如图所示)。1B)。在被认为对目标最安全的TAA中,只有两个肽(来自Mia 2VGLL 1)均由多于一名PDAC患者的肿瘤呈现(补充表)。1)。许多同样的多肽,包括从MUC 16和IDO 1中分离出来的多肽,也被报道在卵巢癌的免疫球蛋白中表达。38.

10-聚肽LSELETPGKY,唯一编码VGLL 1,分别从PDAC细胞株mp015-org和mp081-org(补充数据)中洗脱。12)。预测该肽与HLA-A*0101(51 NM)具有高度亲和力,RNAseq分析证实具有较高的亲和力。VGLL 1在两种细胞器系中的转录表达(表)1)。用靶向性LC-MS对多肽进行鉴定,将合成的肽与有机肿瘤相关肽作为混合物的一部分进行分析。如图所示。1C,合成同位素标记肽LSELETPGKY与PDAC细胞器系MP 015-Org和MP 081-Org中检测到的天然VGLL 1肽具有高度相似的断裂谱,并在相同的LC-MS保留时间共同洗脱。对另外两个表达HLA-A*0101的细胞系(PANC 10.05和BXPC 3)的靶向-MS分析表明,在PANC 10.05上也能检测到相同的肽,提示LSELETPGKY可能构成广泛共享的TAA(补充图)。1).

表1从两种HLA-A*0101中洗脱的VGLL 1衍生肽+PDAC患者肿瘤器官。

VGLL 1在多种癌症中均有表达,与生存不良有关。

VGLL 1,以前被称为通都,最初被认为是人类的同系物。果蝇机翼发育的关键调节因子--残留蛋白(VG)39,40。由于vgll 1是一种转录共激活因子,与参与癌症发展的转录因子(Tead)家族结合,我们对此进行了研究。VGLL 1TCGA中所列33种肿瘤类型的转录表达。如图所示。2A,与大多数正常组织相比VGLL 1在几种不同的癌症中过表达,包括PDAC、膀胱、卵巢、乳腺癌、肺癌和胃癌。有趣的是,VGLL 1似乎优先表达在基底样乳腺癌中,而在其他乳腺癌亚型中的患病率相对较低(补充图)。2)。癌症细胞株百科全书(CCLE,补充图)中所列肿瘤细胞株的基因表达分析证实了一个类似的图谱。3)。根据GTEx RNAseq数据库,最高的中位数VGLL 14种非必需组织:膀胱(15.3TPM)、唾液腺(3.9TPM)、乳腺(1.3TPM)和垂体(1.0TPM)均有转录表达。最高层VGLL 1在正常肺(1.0 TPM)、食管(0.73 TPM)和肾脏(0.34 TPM)中有转录表达。VGLL 1心脏和脑组织中的表达几乎是无法检测到的(如图所示)。2A)。总的来说,这一数据表明VGLL 1可能构成一种安全的、针对多种癌症类型的TAA。

图2:VGLL 1在多种肿瘤类型中过度表达,与胰腺患者生存不良有关。

a通过RNAseq分析,VGLL 1在正常组织(彩色点,GTEx门户数据库)和人癌症(黑点,TCGA数据库)中的表达。每个点代表一个正常供体或病人肿瘤样本。颜色对应于图中定义的四个正常组织类别。1绿色的,非必需的组织;黄色的,小心的组织;橙色的,危险的组织;红色的,危险的组织.而95%以上的正常GTEx警告、危险和危险组织样本低于3/百万转录本(TPM,虚线),大量TCGA癌症患者的VGLL 1转录本表达高于此阈值(红色框)。bKaplan-Meier曲线显示TCGA PDAC患者整体生存(OS)由肿瘤VGLL 1转录本表达(n=178)。P用Gehan-Breslow-Wilcoxon检验,将3组VGLL 1表达的患者与低表达或无表达的患者的OS进行比较,显示出对数秩显着性检验结果。c一组独立的MDAnderson转移性PDAC患者肿瘤的患者来源的异种移植(PDX)n在免疫缺陷小鼠中生长后进行RNAseq分析。图显示PDX标本分为三组,分别对应于OS时间和相应VGLL 1转录本的表达。数据以平均值+/−标准差表示。P-值表示对数秩显着性检验结果,用方差分析对每一组进行比较。作了多次比较调整。

我们接下来评估肿瘤VGLL 1转录本的表达与癌症患者的生存有关。如图所示。2B,TCGAPDAC患者生存(n=179)与VGLL 1表达:高表达患者的总体中位生存期明显短于低表达或无表达患者(16个月和37个月)。p=0.001)。这是由42名医学博士组成的独立队列证实的。安德森PDAC患者可获得PDX组织:患者的总体生存期少于18个月,其平均PDX明显高于正常人。VGLL 1与存活时间超过36个月的患者相比(48.5TPM对4.4 TPM),p=0.003,图1。2C)。值得注意的是VGLL 1PDAC肿瘤细胞株和PDX组织中转录本的表达明显高于手术切除的PDAC肿瘤,这可能是由于许多PDAC原位肿瘤的高基质含量所致。2A,c1)。高架VGLL 1表达也与乳腺癌患者的总生存期缩短有关(p=0.037)和胃癌(p=0.047),但与卵巢癌的生存无相关性(补充图)。4)41。有趣的是,低或不存在VGLL 1表达与膀胱癌生存期缩短有关(p=0.036)。一个潜在的解释是,失去正常的膀胱组织抗原,如vgll 1,可能预示着肿瘤的去分化,这与膀胱癌和许多其他类型的肿瘤的预后较差有关。42.

VGLL 1是一种具有治疗潜力的癌胎盘抗原(CPA)。

VGLL 1在人类胎盘发育的早期事件中被认为具有调节作用,是细胞滋养层细胞增殖和侵袭的特殊标志。43。根据这一结果,来自7个人胎盘组织的RNAseq基因表达数据表明,VGLL 1在这个组织中表达最高的是一个大的边缘(平均=302.7 tpm),几乎是正常膀胱中表达的20倍(如图所示)。3A)。这促使我们探索癌症-胎盘抗原(CPA)可能构成一个与癌症-睾丸抗原(CTAs)类似的可靶向TAA的不同类别,后者已被CTL治疗成功地靶向。为了鉴定其他与VGLL 1表达谱相似的注册会计师,我们在GTEx、TCGA和其他RNAseq数据库中搜索了具有以下特征的基因:(1)胎盘组织中表达最高的正常组织;(2)其他正常组织中低至缺失的表达;(3)胰腺、乳腺、膀胱和/或卵巢癌组织中的高表达。这项研究获得了9个额外的基因,包括胎盘特异的1(PLAC 1),以前被认为是癌症患者体液抗肿瘤免疫的靶点。44。有趣的是,绒毛膜促性腺激素(CG)β亚基3和5(CGB 3/CGB 5妊娠期间胎盘滋养细胞产生的CG激素复合物组分,由于其在胰腺癌、睾丸癌、子宫癌和膀胱癌中的过度表达,也被确定为潜在的CPA。3B)。其他6名假定的注册会计师表现出不同的表达特征,从仅在一组有限的癌症类型中发现的表达谱(IGF2BP3,ADAM 12),在大多数癌症类型中过度表达,但在正常女性生殖组织中也表现出高表达(CAPN 6,MMP 11)(图1.3,补充图5-15,补充表3-6)。虽然我们没有在这组PDAC标本中检测到这些基因的多肽,但其中几个假定的CPA的表位已被确定为多种肿瘤类型,并被列入免疫表位数据库(IEDB)。44.

图3:VGLL 1是癌胎盘抗原(CPA)在正常胎盘和肿瘤中的高表达。

基因表达谱显示了另外9个与VGLL 1相似表达谱的注册会计师。a热图显示不同CPA在正常胎盘(TOP)、GTEx正常组织、转化淋巴细胞和成纤维细胞(底部)中的平均转录表达。根据RNAseq分析,组织中VGLL 1的表达从高到低依次排列。b用RNAseq法测定34例不同肿瘤类型CPA阳性肿瘤标本的平均CPA转录本表达(左)和频率(右)。CPA阳性标本定义为肿瘤CPA转录表达>5 TPM。肿瘤组织按VGLL 1流行率从高到低依次排列。

从PDAC患者MP 015中扩增出vgll 1特异性CTLs。

患者MP 015于2011年12月首次诊断为原发性PDAC。正如先前报道的那样,在原发性胰腺肿瘤切除两年后,2013年11月对左肺病变进行了胸腔镜楔形切除,并将其用于获得器官样细胞株MP 015-org。33。通过一系列化疗方案,这个病人的疾病又被控制了近两年,但随着治疗的进展,他被纳入了M.D.Anderson癌症中心临床试验机构审查委员会批准的细胞治疗方案,接受自体的、扩展的肿瘤抗原特异性CTL。2015年5月对扩展的类细胞器细胞系MP 015-Org进行免疫球蛋白分析后,鉴定出6个HLA I类结合肽(其中4个来自MUC 16,1个来自ZNF 717和VGLL 1),符合我们的安全、目标明确的TAA标准(见图)。1B和补充表1)。自定义的临床级四聚体可用于6个潜在靶点中的3个:两个HLA-B*3502限制性MUC 16肽和一个HLA-A*0101限制性VGLL 1肽。

白细胞分离后,患者MP 015 PBMCs在IL-21存在下用单个肽脉冲DC刺激两次,然后以四聚体为基础对抗原特异性CD8+T细胞进行分选(图一)。4A)。虽然MUC 16特异性CTL未能从患者PBMCs中扩增出来,但VGLL1CTLs成功扩增,在DC肽刺激2周后,VGLL 1四聚体阳性T细胞占CD8+细胞的3.4%(如图1所示)。4B)。细胞分类后使用快速扩张方案(REP)重复两次,导致近200亿个扩展CTL,其中>90%为VGLL 1四聚体阳性,并显示限制了Vβ的使用(图)。4B和c)。功能VGLL 1特异性CTL也成功地从2名健康的HLA-A*0101阳性献血者中扩增出来,显示了LSELETPGKY肽的一般免疫原性(补充图)。16).

图4:从MP 015患者外周血中产生VGLL1抗原特异性CTL。
figure4

a原理图勾勒出vgll 1特异性CD8的实验过程。+人外周血单个核细胞T细胞。b用自体LSELETPGKY肽脉冲树突状细胞(DC)刺激PDAC患者MP 015患者外周血单个核细胞(PBMC)。经两次刺激后,用标准快速扩增法(REP)对CD8+和VGLL 1四聚体阳性细胞进行分类和扩增。VGLL 1特异性T细胞被重新分类和第二次扩展,原因是第一次代表之后抗原特异性细胞数量较少。第二代产量为19.6×109特定于VGLL 1的CTL,患者MP 015在个性化的ETC治疗方案下安全接受输液。c用对应于24种不同特异性的Vβ抗体对扩增的VGLL 1特异性CTL进行T细胞受体(TCR)库分析。d从患者MP 015扩增出的VGLL 1特异性T细胞在一项标准中进行了功能测试。51Cr释放试验评价LSELETPGKY肽滴定量为5:1效应靶(E:t)的黑色素瘤细胞(VGLL 1-阴性HLA-A*0101-阳性)的特异性裂解作用。在三个独立的实验中,数据表示为平均值+/−SD。

用标准对患者MP 015和健康供者#1的CTL进行功能检测。51铬释放试验Mel 888黑色素瘤细胞(VGLL 1阴性,HLA-A*0101-阳性)经滴定量的VGLL 1肽刺激后,在低至10 NM的浓度下,可引起识别和杀伤,表明与同源肽有较高的亲和力(图1)。4D和补充图。16)。重要的是,扩展的患者源性CTL也显示出对自体器官细胞系MP 015-Org的鲁棒性识别,其中VGLL 1肽最初是由MS检测出来的(如图1所示)。5A)。2015年10月,在环磷酰胺预处理方案治疗后,患者MP 015被注入196亿自体,扩大的VGLL 1特异性CTL,随后接受白细胞介素-2和彭布鲁克利祖马。尽管患者经历了短暂的发烧(T细胞输注诱导的细胞因子释放的频繁副作用),但他们没有出现潜在的CTL介导的毒性事件。不幸的是,2015年11月底的扫描显示疾病进展迅速,表现为肺部病变和胸膜转移性疾病的间隔增加。33。令人惊讶的是,在这个时候做的胸膜结节活检显示了一个分化很低的神经内分泌肿瘤。对过去18个月收集的连续液体活检的dna序列分析提供了证据,证明由于许多累进的遗传扩增、缺失、重排和表观遗传变化,患者MP 015的癌症发生了极其迅速的演变。对肺转移瘤的RNAseq分析还表明,2013年11月至2015年12月期间,VGLL 1转录本的表达(35.1 TPM至1.6 TPM)急剧下降,这为ETC治疗缺乏临床反应提供了可能的解释(补充图1)。17)。病人MP 015于2016年1月到期,原因是他们的肺转移进展引起广泛的并发症。33.

图5:VGLL 1特异性CTL识别并杀伤多个异基因胰腺癌细胞株.

a膨胀型VGLL 1-特异性CD8+将患者MP 015的T细胞与HLA-A*0101阳性的PDAC肿瘤细胞系按标准进行共培养。51CR释放法测定不同效应物对靶细胞(E:T)的细胞毒活性.以WM 793黑色素瘤细胞(VGLL 1阴性,HLA-A*0101-阳性)为阴性对照。VGLL1CTLs对原分离VGLL 1肽的自体细胞器细胞系MP 015有较强的杀伤作用,并对4株表达HLA-A*0101的PDAC细胞表现出细胞毒活性。结果表明,6个重复样品的均值和标准差均较好,数据代表了4个独立实验的结果。bWesternblot分析显示VGLL 1蛋白在5株PDAC细胞中均有表达,重复3次,结果相似。

VGLL 1-特异性CTL对PDAC肿瘤细胞有杀伤作用

虽然患者MP 015没有从他们自己的VGLL 1特异性CTL的过继转移中获得临床益处,但这些T细胞在体外所显示的强大的抗肿瘤活性使我们得以探索它们是否对其他PDAC患者具有治疗潜力。~30%的PDAC患者群体表达Hla-A*0101,对TCGA和MDACC PDAC手术标本和PDX的RNAseq分析表明,43.2%~62.5%的患者表达VGLL 1基因,表达水平>5 TPM。根据这些数据,估计12-15%的PDAC患者在HLA-A*0101背景下存在LSELETPGKY肽靶点,因此有可能受益于针对VGLL 1的CTL。

为了确定来自患者MP 015的VGLL1CTLs是否能识别异基因PDAC肿瘤,我们测试了一组HLA-A*0101表达的PDAC肿瘤细胞系作为杀伤靶点。51Cr释放试验Westernblot分析证实VGLL 1蛋白表达,流式细胞仪检测HLA-A*0101在细胞中的表面表达(附图)。18)。对照细胞株WM 793(VGLL 1阴性,HLA-A*0101-阳性)未被识别,VGLL 1特异性CTL识别自体MP 015-Org细胞,4株异基因PDAC细胞中有4株被检测,包括诱导PANC 10.05、Capan-1和BXPC 3的强烈杀伤(如图3所示)。5A,b)。从病人MP 081中提取的PDAC细胞器细胞也被VGLL1CTL分解,但效率降低,这可能是由于培养中VGLL 1阴性细胞的生长所致。与泛MHCⅠ类抗体W6/32共同孵育,可阻断PANC 10.05的识别和裂解(附图)。19)。这些结果提供了证据,表明LSELETPGKY肽构成了一个共享的PDAC肿瘤抗原,可以有效地以VGLL 1特异性CTL为靶点。

VGLL 1 CTL对多种肿瘤细胞有抑制作用

TCGARNAseq数据分析表明,VGLL 1由多个癌型表达(34种肿瘤中有16种),其中75%-80%的膀胱癌、卵巢癌和基底型乳腺癌和15%-20%的肺癌和胃癌患者表达VGLL 1(如图1所示)。3B)。因此,我们着手确定这些癌症类型的细胞系是否是VGLL 1特异性CTL的靶点(图一)。6A)。对卵巢、基底型乳腺、膀胱、胃和肺癌细胞系的Westernblot分析显示,在分析的13种细胞系中,有11株VGLL 1高表达(如图1所示)。6B)。在8株自然表达HLA-A*0101的细胞系中,VGLL1CTLs杀死了3株卵巢细胞中的2株,3株乳腺细胞中的2株,1株膀胱癌细胞系中的1株(如图1所示)。6a)。干扰素-γ治疗对肿瘤细胞株的识别和杀伤无明显影响(补充图)。20)。另外5株HLA-A*0101阴性细胞系(胃2株、膀胱2株、肺1株)在作为VGLL1CTL的靶标前,分别导入HLA-A*0101表达。如图所示。6A5株HLA-A*0101细胞株均易被VGLL1CTL杀伤,表明经处理、内源性表达的VGLL 1蛋白存在LSELETPGKY肽。这些结果表明,除PDAC外,VGLL1CTLs至少对另外五种癌症类型有潜在的治疗价值。

图6:VGLL 1特异性T细胞识别和杀伤多种肿瘤类型,但降低了对原代组织细胞株的识别率。

a将VGLL 1特异性CD8+T细胞与来自卵巢、肺、乳腺、膀胱或胃癌的12株不同表达HLA-A*0101的肿瘤细胞按标准共培养。51CR释放法测定不同效应物对靶细胞(E:T)的细胞毒活性.对5株HLA-A*0101阴性细胞系(H 1299、HT 1197、HT 1376、GT-5和MKN 74)进行慢病毒转导,稳定表达HLA-A*0101;数据以三个独立实验的平均值+/−SD表示。bWesternblot分析显示VGLL 1蛋白在卵巢癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌或胃癌细胞系中的表达被重复了三次,结果相似。cVGLL 1特异性CTL与HLA-A*0101共培养,表达来自膀胱、乳腺、肺气道或皮肤黑素细胞的原代组织细胞。51Cr释放试验测定细胞毒活性。细胞溶解试验结果显示了6个复制样品的均值和标准差,数据代表了三个独立实验的结果。d用Westernblot法检测VGLL 1蛋白在原代细胞系中的表达,结果相似。

为了评估潜在治疗用途的VGLL1CTL的安全性,根据GTEx正常组织表达谱,我们对最有可能激发VGLL 1特异性反应性的正常原代细胞进行了测试(图1)。2A)。因为膀胱显示了最高的正常组织VGLL 1转录表达,我们检测了两种不同的HLA-A*0101阳性原代膀胱细胞系作为杀伤靶点.如图所示。6C特异性溶解率较低,仅在E:T比值最高时才能检测到。因为GTEx数据库表明VGLL 1转录本在正常乳腺和肺组织中也有低水平表达,我们检测了VGLL 1特异性CTL对原代乳腺和肺气道细胞HLA-A*0101表达的影响,并与原代黑素细胞作阴性对照。在这个小组中,乳腺细胞通过VGLL 1特异性CTL诱导中等程度的杀伤,结果与westernblot评估的VGLL 1蛋白水平一致(如图所示)。6d和补充图。22)。相比之下,VGLL1CTL没有杀死肺气道上皮细胞,尽管有大量的HLA-A*0101表面表达(补充图)。18)。这些结果提供了证据,证明VGLL 1特异性T细胞不太可能识别基本的正常组织;然而,由于可能对一些非必要组织(包括膀胱和乳腺组织)产生反应性,因此可能需要考虑安全性问题。

讨论

免疫治疗对PDAC患者的益处一直很慢,这可能是由于突变负担相对较低,肿瘤微环境高度抑制,以及缺乏已知的CTL治疗的TAA靶点。32,45。KRAS的致癌基因突变因其在PDAC、结直肠癌和肺癌中的特异性和高发率而成为最有前途的靶位点。在最近的一项令人兴奋的案例研究中,CTL从一例CRC患者的TILs中扩增出来,特异性地识别了含有g12d突变的HLA-C*0802限制性kras肽;此外,这些TILs还可以介导患者在输注后多个肺转移的客观肿瘤消退。26。尽管HLA-C*0802在世界范围内的流行率很高,但预测只有~1.5%的PDAC患者能从这个突变表位中受益。TCRs识别仅限于HLA-A*1101的突变KRAS表位的TCRs也有报道;尽管尚未在临床试验中测试,但相对较高的A*1101的流行率预测,潜在的病人群体将大大增加,主要集中在亚洲。46。在KRAS之外缺乏共同的突变表明,识别和靶向非突变的TAA可能是促进PDAC免疫治疗的最有希望的机会。对PDAC和卵巢癌进行了深入研究的两种TAA,MUC 16和CEACAM 5,说明了靶向非突变TAA的两个主要挑战:破坏T细胞耐受性的困难和反过来诱导靶标外肿瘤毒性的可能性。基于低整体正常组织和相对高的肿瘤表达,MUC 16似乎是一种理想的TAA;然而,分离识别非突变MUC 16表位的高亲和力CTL已被证明是难以实现的。23,47。这种缺乏免疫原性的原因可能是MUC 16的耐受性特性:在健康患者血清中可以在低水平上检测到,也是一个含有>50个细胞外串联重复区的非常大的蛋白质(>25,000 aa)。48。相比之下,CEACAM 5转录本在肿瘤中高表达,但在正常结肠和食管(>300 tpm)也高表达,导致抗原特异性T细胞治疗的患者出现严重结肠炎。30.

通过对35例PDAC患者的肿瘤标本进行无偏免疫球蛋白分析,发现VGLL 1是一种共同的TAA,在肿瘤表达方面仅次于MUC 16。然而,与MUC 16表位相比,HLA-A*0101限制性VGLL 1肽具有更强的免疫原性,能够从包括一例PDAC患者在内的多个供者中获得抗原特异性CTL。这种免疫原性在为癌症患者开发内源性T细胞(ETC)疗法方面提供了显著的优势。Hla-A*0101在西欧和北美国家的流行率相对较高(25-30%),表明这些患者群体最有可能从针对这一表位而受益。49。扩增的VGLL 1特异性CTL不仅识别并杀死了一组异基因PDAC肿瘤细胞系,而且对来自其他五种肿瘤类型的A*0101表达的肿瘤细胞也表现出反应性。我们估计,针对这个单一的VGLL 1表位可能对大量的西方癌症患者有潜在的益处,包括20%以上的卵巢癌、膀胱癌或基底性乳腺癌,~12%的PDAC患者,5-8%的肺癌、胃癌、宫颈癌、子宫癌或头颈部癌患者(图一)。3).

Vgl 1的高表达与多种癌症类型(包括三重阴性乳腺癌和子宫内膜癌)患者的生存期缩短有关。41,50。然而,它对生存的负面影响在PDAC中最为显著(如图所示)。2B,c),提示VGLL 1可能在肿瘤侵袭性中起一定作用。Vgl 1是一种共转录激活物,是人胎盘早期增殖滋养细胞的标志,与转录因子tad 4共同表达。43,51。Vgll 1被认为在河马信号通路中发挥作用,该信号通路控制器官的大小,并在多种癌症中起辅助作用,以推动肿瘤的进展。52,53。两个特征良好的癌基因yap和taz作为河马信号通路的共转录激活因子,在癌症中它们也与tead蛋白结合,导致几个促癌基因的上调。39,54,55。Vgll 1与tad 4的相互作用方式类似于yap/taz,导致促增殖基因Igfbp 5的上调,促进不依赖锚定的细胞增殖。51。这些研究表明VGLL 1可能直接促进肿瘤的发展,从而增加其作为治疗靶点的潜在价值。虽然VGLL 1在患者MP 015中观察到的转录本缺失可能与其作为一个重要的驱动基因的作用相矛盾,该患者在肿瘤进展过程中所记录的肿瘤进化程度异常高。33。尽管如此,它确实强调了抗原漂移的重要性,并强调了将TAA个性化识别和TAA特异性CTL治疗之间的时间缩短的必要性。需要进一步的研究来明确VGLL 1作为肿瘤发生的潜在驱动因素的确切作用。

VGLL 1的发现促使我们寻找其他可能在胎盘和肿瘤中过度表达的CPA,从而可能构成潜在的TAA靶点。这项研究发现了胎盘特异性1(Plac 1),最初被认为是胃癌和肝细胞癌患者自身体液免疫的靶点,也是第一次报道的CPA代表了不同于cta和癌胚抗原的taa。56,57。最近从PLAC 1中分离出一种识别HLA-A*0201限制性肽的tcR,在临床前的模型中,它对人乳腺癌细胞具有抗肿瘤活性,但尚未在临床试验中得到验证。58。如图所示。3, PLAC 1正常组织表达低,但总体发病率低。相反,胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)在我们的筛选中也被认为是一种很有前途的CPA,在包括胶质母细胞瘤、子宫癌、睾丸癌和肺癌在内的15种不同类型的肿瘤中的表达率相对较高(见图)。3)。高水平IGF2BP3在正常睾丸、转化淋巴细胞和转化成纤维细胞中的表达表明,这种蛋白也可能在癌症的发展中起一定的作用,这与其被认为是一个不良的预后因素是一致的。59,60。遗憾的是,IGF2BP3与IGF2BP2具有明显的氨基酸同源性,而IGF2BP2在几种基本正常组织中的表达水平较高,从而限制了安全靶向表位的数量。在已鉴定的10名注册会计师中,基质金属肽酶11名(MMP 11在25种不同类型的癌症中以高转录水平表达(如图所示)。3)。然而,除了正常的胎盘,MMP 11在子宫、子宫颈和卵巢中也有较高水平的表达,提示以CTL为靶点的MMP 11表位可能导致妇女的生殖毒性。

在安全性、癌症患病率和免疫原性方面,VGLL 1优于其他已知的TAA靶标。此外,一名PDAC患者经自体、高亲和力的VGLL 1特异性CTL治疗后,未发现明显的自身免疫毒性,证明VGLL 1可在体内安全靶向。然而,体外试验确实显示了对培养的HLA-A*0101原代乳腺和膀胱细胞的反应性,提示在靶向CPA时应考虑安全性考虑。这些发现的直接临床应用包括计划中的治疗HLA-A*0101的临床试验。+/VGLL 1+PDAC患者采用VGLL 1特异性等治疗,未来的队列可能包括膀胱、卵巢和/或乳腺癌患者。虽然目前研究的一个重要限制是仅在一例PDAC患者(MP 015)中验证VGLL 1特异性CTL反应性,但已经克隆了从该患者获得的VGLL 1特异性TCRs,目前正在为包括TCR-T细胞疗法在内的未来潜在临床应用进行验证。基于ms的额外vgll 1表位的鉴定工作也在进行中,该表位仅限于其他HLA异种类型,有望扩大符合治疗条件的癌症患者的数量。61。虽然单一抗原靶向由于抗原缺失变异体的选择、肿瘤的破译和随后的抗原表位扩散而显示出有限的临床应用价值是免疫治疗成功的重要方面,但结合检查点阻断等其他方式,这些过程可能会进一步加强。15,16。综上所述,我们的研究表明,VGLL 1是一个很有前途的TAA靶点,可用于免疫治疗,以解决PDAC和其他多种癌症患者严重的未满足的需求。

方法

细胞株

人癌细胞株VGLL 1采用基于基因表达芯片的肿瘤细胞株百科全书(CCLE)进行mRNA表达鉴定。Hla-A*0101-表达癌细胞株PANC 10.05、Capan-1 OAW28、HT 1197、HT 1376、BXPC 3、UBCL-1和原代细胞系(ATCC和Sigma-Aldrich)。患者源性器官细胞系MP 015-Org(HMIA2D)是由冷泉港实验室的Tuveson实验室生成的。33。患者源性器官细胞系MP 081-Org是由Maitra实验室从楔形活检获得的肿瘤组织中产生的。胃癌细胞系GT-5和MKN 74是LeeEllis博士的赠品。WM 793、MKN 74、PANC 1005、GT-5和OWA 28细胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素(Pen-Strep)(细胞生长)和1%胰岛素-转铁蛋白-Seleum-A(GIBCO)的RPMI 1640培养基中培养。Bt 20和膀胱细胞系分别在等份DMEM F12K和MEM Alpha中培养,分别加入FBS、Pen-Strep和1%丙酮酸钠(GIBCO)。所有细胞系均在RPMI 1640、FBS和1%Pen-Strep中培养,加入HEPES(GIBCO)和Glutamax(GIBCO)。

慢病毒转导

将某些天然表达VGLL 1蛋白的HLA-A*0101阴性肿瘤细胞系与慢病毒基因转移载体转导,表达由人PGK启动子驱动的HLA-A*0101。62。用抗人HLA-A1-生物素和链霉亲和素-FITC(US生物学)染色和流式细胞仪(BD生物科学)检测异位细胞表面A*0101的表达。将表达表面HLA-A*0101生理水平的肿瘤细胞与自然表达A*0101的肿瘤细胞相比较,采用FACSAria融合技术(BD生物科学)分离、扩增并用于后续实验。

VGLL 1蛋白表达

Westernblot分析证实VGLL 1蛋白在所有细胞系中均有表达。从肿瘤细胞和原代细胞系中制备细胞裂解物,用热-Fisher法(Thermo-Fisher)将蛋白质含量归一化。采用标准Westernblot技术,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行细胞裂解,用VGLL 1特异性兔多克隆抗体(TA 322329,Origene)检测细胞膜。VGLL 1蛋白是用酶联抗兔单克隆抗体与科学皮尔斯快速西部布洛克工具包,根据制造商的指示。全扫描印迹可以在补充图中找到。22.

质谱法肽鉴定

患者来源的腹腔镜楔形活组织切片、异种移植物或细胞系用TritonX-100溶解,细胞裂解液在4℃孵育一夜,用50μg的PAN-HLA-ABC特异性单克隆抗体W6/32孵育10 mg蛋白。用蛋白A/G超链树脂珠免疫沉淀HLAⅠ类分子,用0.1M乙酸洗脱HLA结合肽。采用Westernblot法鉴定HLA-A、B、C的分离,用串联质谱(MS/MS)分析HLA阳性细胞。HlaⅠ类蛋白恢复采用Western blot谱带强度评分法,从0级(不可检测)到4级(最高强度)进行半定量评价。如果肿瘤标本足够大小(>250 mg),则采用分子量过滤器,但样本丢失使较小的标本无法使用这一技术。利用纳米帽LC系统(Dionex Ultimal 3000 RSLC-Nano)对洗脱肽进行了高灵敏度的LC-MS/MS分析。以0.1%甲酸为溶剂,0.1%甲酸为乙腈为溶剂进行色谱。梯度初始条件:2%B为5 min,35%B为40 min以上,1 min为80%B,停留5 min,再平衡为2%B。色谱柱为15 cm,柱内填充Exomenex动力学2.6微米XB-C18,100埃斯特罗姆颗粒.Ms条件电喷雾源,全ms1范围为265-1500。m/z在240,000分辨率的agc设置下,目标离子5-e5,最大时间为100 ms,对于双电荷前体,选择范围限制在400-750。m/z,对于三倍充电的前体,选择范围仅限于270-500。m/z。MS/MS在线性离子阱、AGC设置、目标离子4-e5、最大时间300 ms、分离窗口0.7 da、主扫描周期时间1.5s、前体细胞数、自动、动态排斥时间20s内进行分析,并利用Mascot算法在SwissProt完整的人类蛋白质数据库(更新9/2018)中搜索光谱,为常规标注肽提供了潜在的匹配条件。在选定的病例中,进行靶向-MS/MS分析以确定TAA肽的同源性。对于这些分析,保留时间窗口用于13c/15通过对合成肽的质谱分析,预先确定了N同位素标记的合成肽标准,然后利用每个3 Da的质量窗口,构建了寻找TAA肽的靶向方法。m/z。肽谱显示y+碎片离子颜色编码的蓝色,b+碎片离子红,不匹配碎片呈灰色。质谱蛋白质组学数据已通过数据集标识符PXD 018302(Https://www.ebi.ac.uk/pride/).

肽选择与验证

个体肽匹配通过多个正交参数进行质量评估,包括Mascot离子评分,ms1测量与计算的肽质量(δ质量)的差异,以及通过高分辨率遗传测序和netmhc和netmhpan算法确定的与患者HLA异种类型的预测结合。34,35。通过BLAST搜索分析肽匹配,找出所有潜在的源基因,然后交叉参照来自单个肿瘤样本的RNAseq数据,以进一步验证肽的同一性(验证要求最低源基因表达量为每百万转录本0.3,tpm)。通过应用序列RNA转录表达筛选筛选洗脱的TAA肽作为CTL的潜在靶点,以消除由于正常组织表达而产生自身免疫毒性的多肽(GTEx PortalRNAseq数据)。Http://cancergenome.nih.gov/)。除睾丸和胎盘外,非必要组织中最多可表达30 tpm的源基因转录本(见补充表)。2警告组织10 TPM,危险组织3 TPM,高度本质危险组织(如心脏和大脑)1 TPM。通过对TCGARNAseq数据的分析,筛选出TAA基因在不同肿瘤类型中的表达和流行情况。Http://cancergenome.nih.gov/)。RNAseq tpm阈值是基于以下原因选择的:两项已发表的研究报告了因通过工程抗原特异性tcr-T细胞过继转移而死亡的情况,发现MAGEA 3-特异性T细胞与心脏中的一种Titin衍生肽(gtex titin表达为60 tpm)发生交叉反应,导致心脏骤停;或交叉反应--与大脑中的MAGEA 12肽发生反应(gtex数据库显示MAGEA 12的表达中位数为0.3 tpm)。37,63。我们选择1 TPM作为心脏和大脑表达TAA的安全阈值,这些组织被认为是危险组织,但在低于1 TPM的水平下表达的抗原可能被T细胞识别。肺、肝、结肠、胃和食道被认为是危险组织,因为尽管它们显然是必不可少的,但T细胞治疗还没有被证明能导致任何致命的交叉反应。因此,我们选择一个3倍高的阈值(3 TPM)作为这些组织可接受的表达水平。我们选择10个tpm作为造血组织的阈值,30个tpm作为非必需组织的阈值,因为用肿瘤抗原特异性T细胞靶向这些组织不会导致死亡,尽管我们不能排除自身免疫毒性,正如我们在手稿中所讨论的那样。在我们试图从供者外周血中提取和扩增针对多个非突变肽的细胞毒性T细胞的经验中,我们发现,在任何正常组织中(可能由于缺失耐受),产生针对表达超过30 tpm的基因的T细胞具有很大的挑战性(可能是由于缺失耐受),这决定了TPM的上限。

基因表达分析与患者生存

用Ribo-Zero Gold的Illumina TruSeq链总RNA试剂盒对PDAC肿瘤标本、异种移植物和细胞器细胞株的RNA进行了RNA序列分析,每个肿瘤RNA样本的末端读取量约为2亿对(Avera人类遗传学研究所)。基因表达谱VGLL 1并通过编制正常人原发性组织(GTEx Portal)和肿瘤组织(TCGA)的RNAseq数据,检测其他癌胎盘抗原。根据TCGA患者按肿瘤分层后的生存数据生成Kaplan-Meier曲线。VGLL 1转录表达

VGLL 1特异性CD8 T细胞的分离与扩增

肿瘤抗原特异性ctl如前面所描述的那样生成。64,65,66。Hla-A*0101阳性患者或健康供者外周血单个核细胞(PBMC)被VGLL 1刺激的自体树突状细胞(DC)刺激两次。231-240肽LSELETPGKY第二次DC刺激后第6天,培养细胞用VGLL 1染色。231-240肽/HLA-A*0101-PE-结合自定义四聚体(1:150稀释,FredHutchinson癌症研究中心),洗涤后用APC结合CD8抗体(1:25稀释)染色。用流式细胞仪(LSRFortessa X-20分析仪)对细胞进行洗涤和分析。用ARIAⅡ分类CD8和四聚体双阳性细胞,用PBMCs快速扩增法(REP)和EBV永生化淋巴母细胞(LCL)饲养细胞扩增VGLL 1特异性CD8 T细胞。TCR-Vβ用IOTestβ标记TCR-V法检测CD8 T细胞的增殖。β曲目套。CTL选通策略的一个例子可以在补充图中找到。21.

细胞毒性T细胞试验

用标准的铬-51评价VGLL 1特异性CD8+T细胞对肿瘤的杀伤作用。51(Cr)释放试验。用100μL51铬(Cr)1小时,然后在每孔每孔2,000个目标细胞上清洗和镀膜一式三份。VGLL 1特异性CD8+T细胞与靶细胞以不同的效应物对靶细胞(E:T)比例孵育4h。潜伏期过后,从井中采集上清液,51用γ射线计数器测量Cr。计算特定靶细胞裂解率,校正背景。51Cr释放量及其相对最大值51TritonX-100裂解靶细胞测定的Cr释放。

VGLL 1特异性T细胞过继转移

所有临床调查均按照“赫尔辛基原则宣言”进行。PDAC患者MP 015出现了转移性胰腺癌,在4年内接受了几种常规和实验性治疗,包括FOLFIRINOX、Bizumab、GVAX疫苗和最终无法控制疾病的吉西他滨/阿布拉谢恩(Gemcitabine/Abraxane)。由于这位病人无法接受治疗,并且已经用尽了常规治疗方法,因此人们认为应该同意并根据美国食品和药物管理局(FDA)和M.D.Anderson癌症中心临床试验IRB委员会批准的同情使用调查药物(CIND)协议来治疗他们。33。根据yee实验室建立的方法进行抗原特异性ctl的产生。15主要总结如下:采用白细胞分离技术采集PBMC,并在UT、MD、Anderson肿瘤中心的细胞处理设施中进行体内外操作。供者外周血单个核细胞(PBMC)在白细胞介素21(30 Ng Ml)存在下,用vgl 1肽刺激自体树突状细胞(Dc),每隔7天刺激两次。−1)。以前的研究表明,T细胞在体外启动过程中暴露于白细胞介素-21(IL-21)后,会产生一种独特的中央记忆型CD8 T细胞(TCM),其特征是CD 28和CD 127的高表面表达(通常为40-90%的CD 28)。+CD 127+),从而使转移的T细胞在体内长期持续存在。16,66,67。每次刺激的第2天,IL-2(12.5 IU毫升)−1),IL-7(5纳克毫升)−1),以及IL-15(1纳克毫升)−1)加入VGLL 1-反应性CD8+T细胞,经临床分级多药诱导分选(Nanosorter,Owl生物医学),用快速扩增法扩增至>1e10细胞。根据该方案,病人接受了非常小剂量的环磷酰胺(300 Mg M)。−2(Iv)第二天−2,然后输注1.9e10多克隆,IL-21启动抗原特异性CTL m。−2,紧接着是2周的低剂量S.C疗程。IL-2和PD1阻断(3毫克千克)−1每2周×16次)。根据基于mWHO的irrc标准评估放射学反应。33。虽然病人是为了监测潜在的细胞输注相关不良事件而住院的,但除了预期的暂时性(<24小时)培养阴性发热(≥38.3°C)并伴有ctl诱导的细胞因子释放综合征和持续时间<10天的淋巴细胞减少外,没有观察到严重的细胞毒性事件。33.

统计分析

使用GraphPad棱镜7.03版进行数据分析。正态分布数据采用参数检验(方差分析或非配对检验)进行分析。t测试)。用对数秩检验分析Kaplan-Meier生存曲线。测试差异被认为具有统计学意义P < 0.05.


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