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Cep 55过表达促进小鼠基因组不稳定性和肿瘤发生

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发表时间:2020-10-23 09:35作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

在多种肿瘤中,中心体蛋白CEP 55的高表达与临床病理参数密切相关。尽管有重要的体外研究和异常高表达的CEP 55与不良预后的关联,但其在体内肿瘤发生中的因果作用仍不清楚。在这里,我们使用一个普遍高表达的转基因小鼠模型,我们证明Cep55过表达导致自发性肿瘤发生并加速Trp53+/−体内诱发肿瘤。在细胞水平上,利用小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs),我们证明Cep55过度表达通过调节多个细胞信号网络,包括PI3K/Akt通路的过度激活,诱导细胞增殖优势。值得注意的是,Cep55过表达的MEFs具有依赖Chk 1的S期检查点,导致复制速度加快和DNA损伤,导致分裂异常延长。重要的是,这种表型是通过药物抑制PI3K/Akt或表达突变体Chk 1(S280A)蛋白来挽救的,而Chk 1(S280A)蛋白对活性Akt的调节不敏感。Cep55过度表达MEFs。此外,我们报告说Cep55过度表达导致微管稳定。综上所述,我们的数据显示了放松管制的Cep 55对基因组稳定性和肿瘤发生的影响,这对肿瘤的开始和治疗的发展有潜在的意义。

导言

基因组不稳定性(GI)是几乎所有人类癌症的特征。染色体不稳定(CIN)是GI的一种主要表现形式,它指的是染色体数目或结构异常的获取。1。CIN在癌症中主要是由于有丝分裂缺陷,包括偏倚的染色体分离和没有进行胞质分裂。有丝分裂检查点的衰弱和/或过度激活也会导致CIN的发生,探索CIN的遗传学基础有可能揭示胃肠道在癌症中的主要机制和治疗方式。2.

Cpp 55是一种盘绕的中心体蛋白,在有丝分裂出口过程中对细胞动力学脱落起着至关重要的作用。3。Cpp 55是一种在胚胎发生过程中表达的肿瘤睾丸抗原,除睾丸外,在大多数成人组织中不表达,但在多种癌症中重新表达。4。在过去的十年中,多项研究表明CEP 55的过度表达与人类癌症预后不良有不同的关联(由Jeffery等人评论)。4)。另一方面,功能缺失突变CEP 55妊娠晚期致命性与梅克尔样和三月综合征5,6,7,8。值得注意的是,CEP 55在多个癌症类型中的表达增加与功能性非整倍体有关,这是由CIN 70基因标记9。它也是与耐药、cIN和细胞增殖相关的10基因信号的一部分。10。此外,作为31基因细胞周期进展(Cp)信号的一部分,它与活跃增殖的前列腺癌细胞密切相关。11。同样,我们已经证明CEP 55是206基因信号的一部分,代表在促进cIN过程中富集的基因,与三阴性乳腺癌(Tnbc)的侵袭性有关。12.

机械,野生型TP 53通过下调PLK 1抑制CEP 55,因此癌症TP 53突变常常会使CEP 55水平升高。13。在人类癌症中,CEP 55过表达通过与PI3K的p 110催化亚基直接相互作用,导致细胞转化、增殖、上皮间充质转化、侵袭和细胞迁移,其途径是上调PI3K/AKT通路。14,15。同样,CEP 55与JAK 2激酶相互作用并促进其磷酸化。16。我们最近证明Cep55小鼠过度表达PI3K/Akt途径可导致雄性特异性不育17。此外,我们还发现CEP 55是乳腺癌有丝分裂过程中非整倍体细胞命运的决定因素,并可能通过MEK 1/2-plk 1的抑制而成为靶点。18。此外,最近Cep55已被证明能调节减数分裂卵母细胞的后期Ⅰ19。总的来说,这些研究强调CEP 55过表达与各种人类恶性肿瘤的相关性。虽然这些体外和临床相关研究已经建立了CEP 55过表达与癌症之间的联系,但CEP 55促进体内肿瘤发生的潜在机制仍不清楚。

在这里,我们报告Cep55在小鼠模型中,过度表达会导致自发肿瘤的高发生率,并有广泛的高增殖和转移性肿瘤。值得注意的是,Cep55过度表达加速Trp53+/−-诱发肿瘤发生。利用小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs),我们发现Cep55过度表达通过调节多个细胞信号网络促进快速增殖,特别是PI3K/Akt通路的过度激活,从而影响Chk 1依赖的复制检查点。此外,我们发现Cep55过度表达导致数值和结构CIN由于稳定的微管。总的来说,我们的数据显示了过度表达的Cep 55与肿瘤发生之间的因果联系,这是由其多种细胞功能驱动的。

结果

Cep 55过表达促进体内肿瘤发生

为了研究CEP 55过表达在体内的病理生理作用,我们利用我们新近报道的转基因小鼠模型。17。自CEP 55在多种人类癌症中高表达,而不管其在细胞分裂中的作用(补充图)。1A-E),我们问是否Cep55过表达导致体内自发肿瘤发生。我们监视了一个野生型的队列(这里称为Cep55WT/wt, n=40,杂合转基因(Cep55WT/TG, n和纯合子转基因(Cep55TG/TG, n=50)Cep55小鼠(雌雄)在2.5年内自发形成肿瘤。我们观察到Cep55TG/TG小鼠在相对较长的潜伏期(中位生存期15个月)发展出各种类型的肿瘤(表)1)与其他著名的致癌肿瘤模型(K-rasG12D20, PTEN+/−21,和Trp53/−22,23)。不过,纯合子-Cep55过度表达的小鼠更早死于癌症(p < 0.0001) than Cep55WT/TGCep55WT/wt小白蚁(图1.1A)。值得注意的是,超过50%的Cep55TG/TG小鼠由于不可逆的体重下降(>15%)、不愿移动和/或进食而被宰杀13至15个月,并显示肿瘤的发展(补充图1)。2A).

表1 Cep 55转基因小鼠癌谱分布
图1:cep 55过表达导致体内自发肿瘤发生。
figure1

a不同基因型小鼠的Kaplan-Meier生存分析(n(每组≥40)Cep55TG/TG与对照组相比,小鼠更容易形成肿瘤;用对数秩法(mantel-cox)进行检测。P值 < 0.0001. b表明基因型小鼠的癌症发病率百分比(n(每组≥40);进行费舍尔精确检验以确定P值 < 0.00001 (****). c(1)荷瘤肝脏血管肉瘤的大体形态学(上板)和H&E染色显微图像(下板)的表示图像Cep55TG/TG建立肿瘤细胞系(Tcl)的小鼠(详见附图4)(Ii)不同器官的其他肿瘤病变(T细胞淋巴瘤、肝细胞癌和肺腺癌)。Cep55TG/TG老鼠(鳞片条,200米)。d在转基因队列中观察到的具有不同癌症类型的动物的百分比。e在各自的荷瘤动物中观察到的淋巴瘤类型的动物百分比Cep55TG/TG老鼠。费舍尔精确测试P-数值<0.0029(*)。f代表图像的B 220和CD3免疫染色用于分类的不同类型的淋巴瘤。B 220+Ve和CD3-Ve为B细胞淋巴瘤,CD3+Ve和B 220-Ve为T细胞淋巴瘤(标度条,200 m)。g在肿瘤组织中观察到的腺癌在各自器官中所占的百分比Cep55TG/TG老鼠。

我们观察到70%(35/50)的Cep55TG/TG小鼠出现了广泛的肿瘤病变,包括淋巴瘤、肉瘤、白血病和各种腺癌(Fisher精确检验)。p < 0.00001; Fig. 1B-d,补充图。2B和表1的比率为17.5%(7/40)Cep55WT/TG和5%(2/40)Cep55WT/wt小白蚁(图1.1B)。值得注意的是,观察到的肿瘤负担Cep55TG/TG小鼠在每只动物1到3个肿瘤之间变化(补充图)。2C)原发于多种组织类型的肿瘤(附图)。二维空间)与Cep55WT/TG,仅在肺内形成腺瘤。同样,Cep55TG/TG小鼠还表现出更高的淋巴瘤发病率,尤其是B细胞淋巴瘤(1.5倍)比T细胞淋巴瘤(图1)。1D,e1)。B 220(B细胞标记物)和CD3(T细胞标记物)免疫组织化学染色分别说明B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤的发生率(Fisher精确检验)。p < 0.0029; Fig. 1E,f)。我们独立观察到肉瘤的发病率,尤其是血管肉瘤的发病率高于纤维肉瘤(肝脏和脾脏)(附图)。2D,E与其他癌相比,肺癌和胃腺癌的发病率更高(如图所示)。1g)。我们还观察到增生性病变(肝、脾和子宫内膜)显著增加。Cep55TG/TG小鼠与其他基因型组的比较(Fisher精确检验)p < 0.0001; Supplementary Fig. 2F).

中观察到的原发癌Cep55TG/TG与邻近组织相比,小鼠在性质上具有高度的侵略性,Ki 67阳性染色增加,从这些肿瘤起源的器官的大体形态和质量可以看出(图1)。1C,补充图。2G,H)。此外,我们观察到~16%的小鼠发生肺和肝脏转移(附图)。2I)。总的来说,这些数据突出表明Cep55单是过表达就足以驱动小鼠的肿瘤发生,引起广泛的癌症,并与转移有关。

Cep55过表达加速Trp53+/−小鼠肿瘤诱导发展

我们的数据表明Cep55过表达诱导的肿瘤发生类似于观察到的肿瘤发生模式。Trp53−/−小鼠22,23,因为它诱发的淋巴瘤(~51%)和肉瘤(~25%)的百分比明显较高(图1)。1D)。以前的报道表明野生型tp 53通过plk 1抑制cpp 55的表达。13。此外,数据挖掘表明CEP 55在表现等位基因的肺和肝细胞肿瘤中水平显著升高。TP 53拷贝数丢失TP 53二倍体肿瘤(均P<0.0001,Mann-Whitney)U测试)(附图。3A)。与此相一致,我们观察到p5 3蛋白水平较高,这很可能是突变的迹象。Trp53,以及减少其代表的p21目标染色。Cep55TG/TG肿瘤组织比正常邻近组织(图1)。2A、b)

图2:cep 55杂合子转基因表达加速Trp53+/−-小鼠致瘤。
figure2

aP53免疫组织化学染色在不同亚型肿瘤切片上的代表性图像Cep55TG/TG与同一只小鼠的癌旁正常组织相比,小鼠肿瘤病变中有p53阳性细胞(标尺,500 m)。bP21免疫组织化学染色在不同亚型肿瘤切片上的代表性图像Cep55TG/TG显示肿瘤病变中p21阴性细胞的小鼠与同一小鼠相邻正常组织相比较(标尺,300μm)。cKaplan-Meier生存分析强调了所述基因型小鼠的无瘤生存(n(每组≥10)Cep55WT/TG;Trp53WT/−与对照组相比,小鼠更容易形成潜伏期较短(~14个月)的肿瘤;对小鼠进行对数秩(mantel-cox)检验。P值 < 0.0001. dh占整体癌症发病率的百分比(d)、增生性病变(e),癌症谱(f)、淋巴瘤(g)和肉瘤负担(h)表明基因型的小鼠(n≥每组10例)。进行了费舍尔精确检验。P值 < 0.01 (**) and <0.0001 (****).

接下来,我们穿越Cep55TG/TG雌性小鼠Trp53−/−建立雄性小鼠双转基因队列Cep55WT/TG;Trp53+/− (n=15),Cep55WT/wt;Trp53+/− (n=17),Cep55WT/TG;Trp53+/+ (n=11),以及Cep55WT/wt;Trp53+/+ (n=10)老鼠。对这些小鼠队列进行定期监测,为期2.5年,以促进肿瘤的自发发展。有趣的是,我们观察到Cep55WT/TG;Trp53+/−小鼠由于潜伏期减少(中位生存期13.8个月)而死于广泛的癌症发展(脾、肝和肺);p < 0.0001) when compared to the Cep55WT/wt;Trp53+/−队列(中位生存21.6个月)(图)。2C,补充图。3B-F,补充表1)。这些肿瘤的组织学特征见附表。2。值得注意的是,Cep55WT/TG;Trp53+/−小鼠肿瘤发生的时间框架与小鼠的肿瘤发生时间相似。Cep55TG/TG老鼠(图1.2C).

此外,观察到的肿瘤发生的发生率Cep55WT/TG;Trp53+/−小鼠也显著高于对照组(~85%;费舍尔精确试验)。p < 0.0001) in comparison to Cep55WT/wt;Trp53WT/−(~50%)每只动物有1~3个肿瘤(图1)。二维空间)。这个Cep55WT/TG;Trp53+/−小鼠的增生性病变的发生率也明显较高(Fisher精确检验)。p < 0.01) (Fig. 2E),其发生率与Cep55TG/TG小鼠(附图)2F)。组织病理学分析显示有一些肿瘤性病变(如图所示)。2F,补充图。3B,补充表1)类似的观察到的Cep55TG/TG老鼠(图1.1C,d,和表1)。值得注意的是,虽然类似的分数Cep55WT/wt;Trp53+/−Cep55WT/TG;Trp53+/−动物患上淋巴瘤和肉瘤(见图)。2F);然而,他们的淋巴瘤频谱是不同的。B细胞淋巴瘤的发病率高于T细胞淋巴瘤。Cep55WT/TG;Trp53+/−小鼠相比较Cep55WT/wt;Trp53+/−老鼠(图1.2G)。此外,Cep55WT/TG;Trp53+/−小鼠出现类似的纤维肉瘤和血管肉瘤(在肝脏和脾脏),如Cep55TG/TG老鼠(图1.2H)。综上所述,当p53杂合子对p53的保护作用减弱时,Cep 55过表达的组织比p53野生型动物具有更好的肿瘤发生率。

Cep 55过表达通过激活信号网络获得生存优势。

在多种人类癌症中,CEP 55的解除表达与促进增殖、迁移、侵袭、上皮间充质转换和肿瘤发生有关。4。分析…的影响Cep55体外过表达,我们使用从E13.5胚胎中分离出的原代和自发永生化MEFs(附图)。4A)。我们观察到Cep55原发阶段的转录和蛋白质水平Cep55TG/TGMEFs与其他基因型的MEFs相比较(见图)。3A,b)。其次,为了确定初级MEFs的生长势和衰老速率,我们进行了3T3分析,并观察到Cep55TG/TG与之相比,原代MEFs具有更高的生长速度和更多的G2/M细胞。Cep55WT/TGCep55WT/wtMEFs(图1.3C,d)。同样的,永生Cep55TG/TGMEFs也表现出类似的增殖能力,随着时间的推移,Ki 67染色增强(图1)。3E和补充图。4C)。定义Cep55单是过表达可使增殖能力增强,而不依赖于有丝分裂信号,我们血清饥饿各基因型的永生化MEF,并观察到较高的细胞增殖能力。Cep55TG/TGMEFs(~60h)与来自其他基因型的MEFs相比,强调了在血清饥饿条件下自我有丝分裂原获得增殖和存活的能力(补充图)。4D).

图3:cep55通过信号网络的激活赋予生存优势。
figure3

aCep55转录本在转基因Cep55基因原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中的表达。进行了三个具有两个技术复制的独立实验。误差条表示±标准差(SD)。单因素方差分析测定P值 < 0.05 (*) and < 0.0001 (****). bCep 55在各基因型原代MEF细胞裂解液中表达的免疫印迹分析以β-肌动蛋白为负载对照,在不同基因型的MEF中观察到Cep55表达的相对折叠差异(用图像J进行密度分析表明)。n=2)。c第一次使用nih-3t3协议作为通道数[表示为cpd(累积种群密度)]的增殖量。Cep55TG/TG与其较少期限相比(n=3个具有两个技术复制的独立实验。误差条代表±SD)。单因素方差分析测定P值 < 0.0001 (****). d用碘化丙啶染色法测定培养24h后指示基因型的原代MEFs的细胞周期分布,然后用流式细胞仪(FACS)检测细胞周期。n=3个具有两个技术复制的独立实验)。误差条代表±SD)。采用双向方差分析方法进行测定。P值在补充表中演示3. eFACS图表示培养12h后各基因型细胞Ki 67阳性染色的百分比,每种基因型(左)收集100,000个活细胞。量化每种基因型在代表时间点的Ki 67阳性活细胞百分比(右)。误差条表示三个独立实验的±SD。单因素方差分析测定P值; <0.001 (***) and ns (not significant). f标记基因型(左面板)的永生化MEF培养24h后收集的全部细胞裂解物的免疫印迹分析(左面板)和从siRNA处理后48h后的免疫印迹分析Cep55TG/TGMEFs(右面板)显示Cep 55过表达对多个细胞信号通路的影响。以β-肌动蛋白为加载对照.g永生化处理24h后全细胞裂解物的免疫印迹分析Cep55TG/TGMEF含有BEZ 235(PAN-PI3K/AKT抑制剂)、BKM 120(PAN-PI3K抑制剂)、AKTVIII(AKT抑制剂)和AZD 6244(MEK 1/2抑制剂)。以β-肌动蛋白为加载对照.h从相应等基因采集的全细胞裂解物的免疫印迹分析Cep55-24小时耗尽TCL,验证Cep 55的表达水平。β-肌动蛋白作为加载控制(顶部面板)。对照和对照用结晶紫染色法测定14天菌落形成的代表性图像Cep55-耗尽的TCL(底部面板)。i6周龄雌性NOD/SCID组小鼠皮下注射对照组和Cep55-绝种克隆。增长率(面积,毫米)2)用数字卡尺测量肿瘤。学生的生长差异t测试,P≤0.0001(*)。图示肿瘤平均面积±SD,n=5只小鼠/组。

CEP 55通过与PI3激酶(PI3K)p 110催化亚基直接相互作用而上调AKT磷酸化,促进细胞体外增殖。14,15,17。同样,我们已经证明MYC在乳腺癌中可以转录地调节CEP 55。18。因此,为了表征与细胞增殖和存活有关的分子信号,我们研究了Cep55在PI3K/Akt-和Erk依赖的信号网络上过表达。有趣的是,利用来自每种基因型的MEF的全细胞裂解物的免疫印迹分析显示Cep55Akt磷酸化的剂量依赖性增加S 473及其上游调节器PDK 1S 241在……里面Cep55TG/TG与野生型和杂合子型MEFs相比(见图)。3F)。此外,我们还观察到mapk依赖的信号分子被上调,包括egr、erk 1/2、myc和β-catenin的磷酸化增强,以及增殖标记物增殖细胞核抗原的增加。Cep55TG/TGMEFs(图1.3F)。在有代表性的组织裂解物中也观察到了类似的变化(补充图)。4E)。值得注意的是,对信令网络的影响仅限于Cep55过度表达Cep55使用两种不同的siRNA寡核苷酸Cep55TG/TGMEFs可显著降低PI3K/Akt和MAPK依赖的信号通路活性。3F)。Cep 55在siRNA敲除MEFs中的重组挽救了PI3K/Akt和MAPK(补充图)的信号网络。4F)。此外,描述…的作用Cep55在通过激活信号通路促进细胞增殖和存活过程中,我们使用了广泛的PI3K/Akt、mTOR和ERK 1/2通路特异性抑制剂。我们观察到Cep55TG/TGMEFs对Akt、PI3K和PAN-PI3K/Akt/mTOR抑制剂更为敏感,而对mTOR或ERK 1/2抑制剂单独治疗则不敏感(补充图)。4G)。阻断其中一些信号通路,但不阻断其他信号通路,会显著降低Cep 55水平,提示Cep55与这些信号通路之间存在正反馈回路(图一)。第三代和补充图。4H)).

进一步解读过度表达的影响Cep55在肿瘤发生方面,我们从一些在Cep55高表达小鼠(这里简称为肿瘤细胞系(TCLS)),特别是肝血管肉瘤(图1)。1词)。这些细胞表现出混合群体的非整倍体(双核和多核),意味着一个基因组不稳定的表型(补充图)。5A)。同样,在过渡时期Cep55在TCL中使用siRNA敲除后,这些细胞的生长速度明显慢于可激活的转染细胞,伴随着信号网络的减少,而Cep 55的表达在恢复后得到补充(补充图5)。5B、C)。同样,本构关系Cep55用shRNAs基因敲除可减少支抗非依赖性集落形成,G2/M细胞数量减少,增殖能力降低,肿瘤形成取决于Cep55水平的降低程度(图5 5所示)。3H,I,补充图。5D-G)。始终如一,Cep55敲除TCL对PI3K/Akt抑制剂敏感性有明显的耐受性(附图)。5H),暗示依赖PI3K/Akt信号。综合起来,这些数据突出了Cep55调控增殖和存活相关信号网络及其在肿瘤形成中的重要作用。

Cep 55过表达会导致chk 1分布的改变,导致复制压力以Akt依赖的方式出现。

AKT的过表达和(或)过激活与CHK 1的细胞质隔离有关,因此失去了检查点活性,最终会随着GI的增加而导致增殖能力的增强。24。由于cep 55过表达增加了Akt信号,我们研究了Cep55通过DNA纤维分析法检测复制叉的进展率,在复制上过度表达。我们发现Cep55-与野生型细胞(中位速度:1.03 kb/min)相比,过表达的MEFs在复制叉的速度(中位速度:1.47kb/min)上有显著的提高。4A,b)。相反,短暂的沉默Cep55在这些细胞中显著降低了复制叉的速度,这表明Cep55过表达通过允许细胞比Cep55WT/wt补充图6A,B)。如果叉子速度比正常的叉子速度高出40%,就会引起dna损伤和基因组不稳定。25。接下来,我们研究了复制速度的提高对dna损伤反应的影响。Cep55TG/TGMEFs。有趣的是,我们最初观察到Cep55TG/TGMEFs的γ-H2Ax阳性细胞百分比(每个细胞>5γ-H2Ax病灶)显著高于Cep55WT/wt补充图6C,D)。同样,我们发现Cep55TG/TG与对照组相比,mefs中edu阳性细胞的比例更高。Cep55WT/wtMEFs(图1.4C)。值得注意的是,γ-h2ax阳性细胞的百分比在edu阳性和edu阴性的人群中都有增加。Cep55TG/TG MEF,表明DNA损伤是持续的。4C)。尽管基线损伤增加,当这些细胞受到6 Gyγ照射时,这些细胞系之间的DNA损伤反应信号没有明显的差异(图1)。4D,补充图。6E)。然而,我们注意到Chk 1的总水平显著下降。Cep55TG/TGMEFs(图1.4D)。ATR依赖的chk 1是一种公认的dna损伤和复制应激反应效应,也是可靠的染色体分离所必需的。26。自Cep55TG/TGMEF有很高的Akt信号(图一)。3F),我们初步研究了Chk 1在不同类型MEFs中的亚细胞分布。Cep55基因型相比较Cep55WT/wt梅弗斯Cep55TG/TGMEFs在细胞质中的Chk 1水平相对较高,而在核分数中则降低(如图所示)。4E,左)。值得注意的是Cep55TG/TGPI3K或Akt抑制剂可显著改变Chk 1从细胞质到核部分的定位,证实Akt信号的激活在Cep55-过表达的细胞在细胞质组分中隔离Chk 1(如图1所示)。4E,右)。为了进一步证实act介导的复制应激的参与,我们治疗了Cep55TG/TGMEF用BEZ 235或AKTVIII抑制剂进行DNA纤维分析。我们的数据显示Cep55与DMSO处理的细胞相比,Akt抑制剂的过表达细胞显著降低了复制叉的速度(见图)。4FG和补充图。6f)。AKT在丝氨酸280处磷酸化CHK 1,削弱其核定位和检查点活性,而不依赖于ATR。24。为了确定cep55-akt依赖的检查点缺陷的关键作用,我们临时重组了Cep55TG/TG细胞S280 A突变体(不能被Active-AKT磷酸化),以及Cep55WT/wt细胞S280 E突变体(模拟本构式AKT依赖的磷酸化)。我们的数据显示S280 E突变体显着地提高了复制叉的速度。Cep55WT/wt细胞S280 A突变体重组Cep55TG/TG相反,细胞明显降低复制叉的速度,提示这些细胞的检查点活动以Cep55-Akt依赖的方式受损(图一)。4H,补充图。6g)。总的来说,我们的数据表明Cep55在我们的模型中,Chk 1介导的检查点激活会导致更快的复制细胞和持续的DNA损伤。

图4:cep55过度表达导致复制压力。
figure4

a, b叉子速度的统计表示(a)和分叉速度的频率分布(b)用DNA纤维分析法测定。用CldU(绿色)和Idu(红色)分别脉冲标记永生化MEF 20 min,对纤维进行成像和定量分析。代表不同基因型的图像显示在右侧面板上.每种基因型的500多根纤维来自两个独立的实验,A中的误差条代表±SD。未配对t两组患者进行韦尔奇矫治前后的检验,并进行统计学分析。P值; < 0.0001 (****). c有代表性的S期细胞免疫荧光图像(绿色),可与双链γ-H2AX(红色)标记在永生化MEF中标记一个小时。n每个实验计数150个细胞)左侧面板显示所示基因型。用DAPI(蓝色)标记DNA。γ-H2AX在EDU阳性或阴性细胞中的百分比在右侧面板显示。误差条表示三个独立实验的±SD。未配对t测试是为了确定P值 < 0.0067 (**). d6 Gy照射后标记的永生化MEFs DNA损伤反应蛋白的免疫印迹分析。以β-肌动蛋白作为负载对照。e用所指示的永生化MEFs进行细胞质核分馏的免疫印迹分析,测定Chk 1蛋白在不加抑制剂和不加抑制剂的情况下的分布。试验前用抑制剂处理细胞6h。核组分和细胞质组分分别以H3和Vincullin作为分馏负荷控制。f永久化中观察到的复制叉速度的量化Cep55TG/TGMEFs受BEZ 235(PAN-PI3K/AKT信号通路抑制剂)和AKTViii(抑制Akt信号转导)的刺激。Cep55TG/TG用指示抑制剂对MEFs进行6 h预处理,并测定分叉速度。每种基因型的至少300根纤维来自两个独立的实验,误差条代表±SD。单因素方差分析与褐连翘试验测定P值; < 0.0001 (****) and ns (not significant). g从面板中复制分叉速度的分布频率f. h如(a)。两株细胞均瞬时转染1.5g指示突变体(Chk 1突变体-S280 A第280 E,Westernblotting(右)分别进行24h和DNA纤维分析。每种基因型的至少300根纤维来自三个独立的实验,误差条代表±SD。单因素方差分析与褐连翘试验测定P值 < 0.0001 (****). β-Actin was used as a loading control in the Western blot.

Cep55过表达促进CIN的结构和数值

CEP 55作为CIN的调节因子,其作用是通过调节胞质分裂来实现的。3。与此相一致,我们发现全基因组重复(WGD)肿瘤有更高的水平。CEP 55MRNA比二倍体和近二倍体肿瘤(附图)。7A)。同样,永生化Cep55TG/TGMEFs的比例高出三倍(p < 0.0001) of binucleated and multinucleated cells (Fig. 5A,b)。此外,通过fcs分析,我们发现原始和永久化。Cep55TG/TGMEFs显示>4的比例显著提高。n亚种(图1.5C,补充图。7b)。我们还观察到,与小学相比,Cep55TG/TGMEF,自发永生Cep55TG/TGMEF所占百分比显著提高(p < 0.01) of >4n亚种(附图)7C)。在分离出的不同器官中也观察到了相似的结果。Cep55TG/TG老鼠和它们的小老鼠比较(补充图)。7D)。重要的是,我们发现Cep55TG/TG多边环境基金(p < 0.001) indicating the possible presence of CIN (Fig. 5D)。同样,当Cep55在tcl中,我们发现在>4中有显著的下降。n亚种(图1.5E,f,补充图。7E),表明cep 55过表达有助于癌细胞耐受非整倍体的能力,正如我们先前报道的乳腺癌细胞。18。与此相一致的是,当我们使用tcga的基因组范围spp 6阵列数据分析某些人类癌症的非整倍体水平时,我们发现CEP 55高表达肿瘤表现为结构或数值上的非整倍体增加,包括全染色体非整倍体和染色体臂水平的非整倍体(补充图)。8A-D)。此外,中期的光谱核型分析也是从Cep55TG/TGMEFs显示,与其他基因型相比,其数量和结构染色体畸变水平均明显增高(图1)。5G)。值得注意的是,这些MEF显示出复杂的染色体易位和数量异常,而两者都有。Cep55WT/TGCep55WT/wtMEFs显示低水平的结构和数值染色体异常(表)2)。总之,这些数据强调Cep 55过表达在某个阈值以上足以促进CIN的结构和数值。

图5:cep55过表达促进体内染色体不稳定。
figure5

a具有代表性的免疫荧光图像显示了永生化过程中的基因组不稳定性Cep55TG/TGMEFs,表现为多个细胞核的存在(用DAPI染色标记)与其他对应核相比。细胞质由α-微管蛋白(绿色)(鳞片条,100μm)标记.b观察到的永生化MEF中双核(左面板)和多核细胞(右面板)所占百分比的量化(n每基因型计数100个细胞)。误差条表示三个独立实验的±SD值,每个实验重复两个。单因素方差分析测定P值; < 0.0001 (****) and ns (not significant). c用流式细胞仪(FACS)对所指示的永生化MEFs中多倍体细胞百分比(>4N DNA含量)进行定量测定。误差条表示三个独立实验的±SD值,每个实验重复两个。单因素方差分析测定P值;< 0.0001 (****). d有代表性的图像显示微核(标记为DAPI)在指示的永生化MEFs(左面板)(标尺,100μm)中。每个视场/每个细胞核手工计数微核,n每个实验计数300个细胞,观察到所指示的永生化MEFs的微核百分率(右面板)。误差条表示三个独立实验的±SD值,每个实验重复两个。单因素方差分析测定P值; < 0.0001 (****). e分别用FACS测定的多倍体群体百分比(>4N DNA含量)Shc 55枯竭的等基因克隆。误差条表示三个独立实验的±SD值,每个实验重复两个。单因素方差分析测定P值; < 0.001 (***) and < 0.0001 (****). f在各自的sh中观察到的双核(左面板)和多核细胞(右面板)所占百分比的量化Cep55枯竭的等基因克隆。误差条表示三个独立实验的±sd值,每个实验有两个副本(n=每克隆100个细胞)。单因素方差分析测定P值; < 0.0001 (****) and ns (not significant). g光谱核型的典型中期Cep55TG/TGMEF(第25节),其中#1和#2表示永生化的独立于生物学的中期表示。Cep55TG/TGMEFs。

表2Cep55转基因MEFs

Cep55过表达延缓有丝分裂的退出

CIN在癌症中主要是由于有丝分裂缺陷,包括不平等的染色体分离和没有进行胞质分裂。我们对有丝分裂细胞百分比的初步分析表明,Cep55TG/TG与其他基因型相比,MEFs的有丝分裂指数显著增加(补充图)。9A,B; p < 0.001) and Cep55-耗尽的TCLs显示有丝分裂细胞数量减少(补充图)。9C)。接下来我们问Cep55在正常和不安有丝分裂过程中,过度表达可能促进这些细胞的结构和数量的CIN。为了破译,我们收集了双胸腺嘧啶同步MEF进行dna含量和时移活细胞成像分析.值得注意的是,我们观察到Cep55TG/TG与有丝分裂相比,MEFs在间期进展更快,进入有丝分裂速度更快。Cep55WT/wt补充图9d)。但是,Cep55TG/TG与野生型和杂合型MEFs相比,MEFs在有丝分裂过程中花费的时间相对较长,表现出胞质分裂失败的细胞比例更高(见图)。6a,b)。同样,Cep55WT/TG与野生型MEFs相比,MEFs在有丝分裂过程中花费的时间也更长,这表明MEFs对有丝分裂有剂量依赖性的影响Cep55有丝分裂持续时间过表达(图1.6A)。多核细胞通常需要更多的时间来完成有丝分裂,因为高dna含量和Cep55WT/TGCep55TG/TGMEFs表现出单核细胞、双核细胞和多核细胞的混合亚群体。c.和补充图。9E)。因此,我们对各个亚群体进行了分析,以确定有丝分裂的持续时间(如图所示)。6C)。令人惊讶的是,随着双核和多核化Cep55TG/TG细胞,单核细胞也花了更多的时间在有丝分裂,表明Cep55过表达延长有丝分裂持续时间,而不依赖于DNA含量(如图所示)。6d)。染色体分离错误是CIN的主要来源。27。接下来,我们研究了Cep55有丝分裂同步细胞在染色体分离中的过度表达。我们观察到更高的频率(p < 0.05) of multipolar spindle poles along with unaligned and lagging chromosomes in Cep55TG/TGCep55WT/wtMEFs(图1.6E,f,补充图。10A,B)。此外,我们还利用荧光和活细胞时间推移显微镜观察到Cep55TG/TGMEFs显示有染色质桥的后期细胞(后期桥)的频率显著增高。在有丝分裂过程中,后期桥的存在表明存在不完全分离的dna。Cep55TG/TGMEFS,这反过来导致染色体断裂和微核形成。6f)。与此一致,我们观察到Cep55TG/TGMEF的比例有所增加(p < 0.001) of micronuclei, a morphological characteristic of CIN, when compared to control MEFs (Fig. 6f).

图6:Cep 55过表达对有丝分裂的影响。
figure6

a所述基因型的永生化MEFs用于有丝分裂的平均时间的量化。MEFs用双胸腺嘧啶同步,释放到常规培养基中。单个细胞用明亮场奥林巴斯xcellence ix 81时移显微镜追踪完成有丝分裂所需的全部时间,从核包膜分解到子代细胞形成。18。每次实验至少计数50个细胞。误差条表示两个独立实验的±SD值,每个实验重复三个。单因素方差分析测定P值; < 0.01 (**) and < 0.0001 (****). b在所指示基因型的永生化MEF中观察到的胞质分裂失败率。从实验中获得的数据(a)。每个实验从50个细胞中提取百分比。c不同细胞群体在所指示基因型的永生化MEF中观察到的平均有丝分裂时间的量化。至少有100个细胞被计数。误差条表示两个独立实验的±SD值,每个实验重复三个。采用双向方差分析方法进行测定。P值 < 0.05 (*), < 0.01 (**) and < 0.001 (***). d用指示基因型的永生化单核MEF量化有丝分裂的平均时间。误差条表示来自上述两个独立实验的±SD。单因素方差分析测定P值 < 0.01 (**) and < 0.0001 (****). e有代表性的免疫荧光图像(标尺,100μm)和(f)永生化过程中观察到的有丝分裂缺陷的统计分析Cep55WT/wtCep55TG/TG三极纺锤体极、未对齐的中期板、落后的染色体以及染色质桥和微核的存在表明了MEFs的存在。箭头代表不同的有丝分裂表型。Cep55TG/TGMEFs。蓝色箭头代表未对齐染色体,黄色箭头代表落后染色体,紫色箭头代表三极纺锤体,橙色箭头代表染色质桥和微核的存在。误差条表示两个独立实验的±SD值,每个实验重复三个。n每个实验计数50个有丝分裂细胞。学生的t测试是为了确定P值<0.05(*)和<0.01(**)。

Cep 55过表达稳定微管

我们最近报道CEP 55过表达会在有丝分裂过程中导致过早退出,是非整倍体乳腺癌细胞存活的决定因素。18。与我们先前的观察一致,cep 55过表达对诺卡唑治疗有丝分裂的时间和时间有显著影响(图1)。7a,b)。特别是,Cep55TG/TG在诺康唑停止时,MEFs大部分提前退出有丝分裂,但Cep55WT/wtMEFs主要死于有丝分裂,尽管纺锤体组装检查点(SAC)蛋白、Bubr1和MAD 2蛋白的表达增加。Cep55TG/TG相比较Cep55WT/wtMEFs(图1.7C-f,补充图。11A)。此外,我们还发现,通过SAC蛋白复合物(Cdc 20)的组装,诺考唑治疗4h后,SAC活性没有受到损害。Bubr1和MAD 2(补充图1)11B)。相反,Cep55-耗尽的TCL对诺可唑治疗敏感,早期退出明显减少,凋亡增加(补充图5)。11C-E)。因此,这些数据表明Cep55过表达促进有丝分裂滑脱,而不是死亡的反应,以抗有丝分裂毒素,而不是正常激活的SAC。这与我们先前的研究相一致,其中我们证明cpp 55的过表达赋予了抗有丝分裂毒药的抵抗力,尽管sac通过细胞不能突破凋亡阈值而被长时间激活。18.

图7:CEP 55与微管稳定性的关系。
figure7

a, b有丝分裂平均时间的比较a)和完成有丝分裂的平均时间(b)在诺考唑(0.5μM)存在和不存在的情况下,对所指示基因型的永生化MEF进行时间推移显微镜测定。误差条表示两个独立实验的±sd。n每个实验计数50个细胞)。学生的t测试是为了确定P-数值<0.001(*)、<0.01(**)、<0.001(*)和<0.0001(*)。c如A和B组所示,A和B组所示的在诺可唑(0.5μM)存在下,所指示基因型的永生化MEFs的有丝分裂结局百分比由核分裂阻滞时的有丝分裂提前退出来定义,而死亡则通过膜泡来确定。由两个独立实验得出的平均值(宿命)n每个实验计数50个细胞)。d用流式细胞仪(FACS)测定诺可唑(0.5μM)存在与否时的永生化MEF细胞周期谱。误差条表示三个独立实验的±SD。如补充表所示,进行双向方差分析以确定P-值。3. e, f多倍体(>4N DNA含量)e)和亚G1人口的百分比(f)在诺可唑(0.5μM)存在或不存在的情况下,用FACS测定所指示的永生化MEFs。误差条表示三个独立实验的±SD值,每个实验重复两个。单因素方差分析测定P-数值<0.0001(*)。g永生化中期脱硫(红色)和乙酰化微管蛋白(绿色)的代表图像Cep55WT/wtCep55TG/TGMEF显示微管网络(标尺,100μm)。h永生化过程中乙酰化(上板)和脱囊(下板)微管蛋白平均积分密度(MID)的定量研究Cep55WT/wtCep55TG/TGMEFs。强度用ImageJ软件计算,其中n每基因型50个中期细胞。误差条表示两个独立实验的±SD。学生的t测试是为了确定P-数值<0.0001(*)。i有丝分裂缺陷的百分比(前面在图中描述)。6f论KIF2B在永生化MEFs中的过度表达n每试验计数100个细胞)。误差条表示三个独立实验的±SD。单因素方差分析测定P-数值<0.05(*)和<0.01(**)。

动微管稳定性的提高导致dna的不完全分离,包括后期的落后染色体。28,29。在有丝分裂过程中将cep 55用于纺锤体微管。3有效地捆绑微管30,我们问是否Cep55过表达使微管稳定,从而增加有丝分裂时的分离误差。为了分析纺锤体微管的稳定性,有丝分裂细胞用识别稳定的脱落微管和乙酰化微管的抗体染色。Cep55TG/TG与有丝分裂相比,有丝分裂细胞表现出更强的脱丝和乙酰化微管染色。Cep55WT/wt细胞,表明这些细胞在中期或中体有稳定的微管(如图所示)。7g,h,补充图。11F)。其次,确认增加的染色体分离误差,包括滞后染色体,以响应Cep55过度表达是由于稳定的微管,我们表达gfp标记。KIF2B,微管解聚的激肽-13蛋白,在这两种蛋白质中。Cep55TG/TGCep55WT/wtMEFs。尤其是外生表达KIF2B在……里面Cep55TG/TG细胞显著减少落后染色体,后期桥和微核的频率(图)。7I同样,低浓度诺考唑在10 NM处理后,随着正常有丝分裂的增加,滞后染色体和未排列染色体的比例显著降低(补充图1)。11F,G)。总的来说,我们的数据表明Cep55稳定微管,这在一定程度上导致有丝分裂缺陷在这些MEFs中观察到。

讨论

我们以前报告过Cep55高表达小鼠模型,通过过度激活PI3K/Akt信号抑制Foxo 1核保留,显示雄性特异性不育17。在这项研究中,我们用同样的老鼠模型,据我们所知,第一次证明了Cep55过度表达会导致自发的肿瘤发生。我们的数据强调了剂量依赖性的影响。Cep55体内过表达对细胞增殖和肿瘤发生的影响。纯合Cep55TG/TG小鼠容易发展范围广泛的肿瘤(包括固体和血液学来源),发病率高,转移潜能高。有趣的是,杂合子Cep55WT/TG小鼠腺瘤(~20%)和增生(~8%)发生率较低,提示单拷贝高表达Cep55足以引发肿瘤发生,尽管Cep55TG/TGCep55WT/TG老鼠。值得注意的是,Cep55TG/TG与其他类型的恶性肿瘤相比,小鼠的淋巴瘤和肉瘤的发病率更高,这与在Trp53−/−老鼠。P53负调控CEP 55的表达13,利用双转基因小鼠模型,我们还证明了p53的单拷贝丢失(Trp53+/−)加速杂合Cep55WT/TG -诱导肿瘤发生有趣的是,这些数据也说明了Trp53这可能是一个早期的事件,在纯合子中观察到肿瘤的发生需要一个关键的二次打击。Cep55TG/TG老鼠。与此相一致,我们观察到高p5蛋白水平,这很可能是突变的迹象。Trp53,代表Cep55TG/TG肿瘤组织比正常邻近组织。值得注意的是,Cep55在异种移植模型中,TCL中50%(50%)明显延迟肿瘤的发生和进展,而近完全耗尽(90%)则完全破坏了肿瘤的发生。

Cep55已与GI及其过表达引起体内广泛的肿瘤有关,我们进一步研究了GI在体内的生物学特性。Cep55-过度表达细胞。Cep55TG/TGMEFs表现出较高水平的胞质分裂失败,伴随着基因组加倍。重要的是Cep55TG/TG与其他基因型相比,MEFs表现出较高的数量和结构CIN水平。重要的是,在这项研究中,我们发现Cep55过度表达导致有丝分裂缺陷,包括染色质桥的高频率和后期微核的形成。因为cpp 55是一种微管捆绑蛋白。30,染色体的错误分离Cep55过表达可能是运动微管(k-MT)超稳定性的标志.与这个概念一致,我们发现Cep55稳定的微管和易受CIN影响的细胞。值得注意的是,通过强制表达KIF2B来降低微管的稳定性。Cep55TG/TGMEFs显着地减少了落后的染色体。对.的影响Cep55姐妹染色单体分离错误伴胞质分裂失败的过度表达解释了观察到的延迟有丝分裂退出的原因。Cep55-过度表达细胞。综上所述,我们的数据表明,过度稳定的微管和Cep 55过表达细胞的胞质分裂缺陷可能是导致染色体分离错误和四倍体化的主要原因,从而使这些细胞容易发生GI,这可能会随着时间的推移而促进肿瘤的发展。

与以前的报告一致(由Jeffery等人审查。4.), Cep55过度表达导致细胞迅速增殖。我们观察到Cep55TG/TGMEFs显示出高磷酸化的Akt信号,下调PI3K/Akt下游信号,如GSK-3β、Myc和β-catenin,这可能是这些细胞中GI的进一步来源。已知AKT过度激活会导致Chk 1细胞质固存,这可能会导致S期检查点受损,从而增加复制叉的进程。Cep55TG/TGMEFs允许不受控制的细胞周期进程,从而促进GI。与此相一致的是,CHK 1突变体(S280A)的过度表达,该突变体不能被过度激活的AKT磷酸化,在Cep55TG/TGMEFs或他们的PI3K/Akt通路抑制剂治疗导致叉子进展减少。此外,Chk 1功能的丧失也会在后期引起染色体分离错误和染色质桥,导致cIN。26,31,与我们观察到的表型相似。

解除有丝分裂蛋白的管制一直被认为有助于早期细胞的转化和肿瘤的发生。32虽然它们很少在癌症中变异33,34,但很容易放大。关键有丝分裂蛋白的异常表达(丢失或增加),特别是包含在CIN 70基因信号中的蛋白,如MAD 235, 泡泡136, AURKA37, EMI 138, PLK 139,40, TTK 141更多的是,在基因水平上,已经证明可以诱发自发的肿瘤发生。这些模型观察到的主要表型是后期染色体分离缺陷,导致CIN和基因组不稳定的恶性肿瘤,类似于我们的模型所观察到的表型。因此,这些有丝分裂基因与Cep55过度表达需要进一步评估。重要的是,在我们先前对乳腺癌的研究中,我们已经证明CEP 55的过表达可以保护在有丝分裂过程中的非整倍体细胞。17。我们已经证明,随着CEP 55的丢失,高水平的CEP 55能显着地诱导TNBC有丝分裂滑脱,从而使细胞在受到抗有丝分裂药物的攻击后过早进入有丝分裂,从而导致有丝分裂细胞死亡。在此,我们一直证明cep 55作为非整倍体在异常有丝分裂过程中是非整倍体的保护者。Cep55TG/TGMEFs在抗有丝分裂药物作用下发生有丝分裂滑脱,并存活于有丝分裂细胞死亡。这也解释了高度多倍体的能力。Cep55TG/TGMEFs重新进入有丝分裂并继续增殖,因为CEP 55过表达使这些细胞群体具有较高的耐受性和更好的生存能力。

最近的一篇报道指出,细胞在发生恶性转化之前,会发生特定的基因组改变,主要影响有丝分裂基因的正常功能。42. CEP 55过表达与多种癌症的发生有关。然而,这是我们所知的第一份报告,证明了Cep55在肿瘤发生中起着重要作用。我们的数据清楚地证明Cep55过高的表达超过临界水平是自给自足的,可以诱发范围广泛的自发性肿瘤.重要的是,我们已经证明Cep55过度表达可诱导PI3K/Akt通路激活、Chk 1隔离、复制检查点受损、微管稳定以及染色体分离异常等,这些异常共同导致CIN的发生。随着时间的推移,这些异常的积累可能导致肿瘤的发生。总之,我们的小鼠模型可以作为研究CIN相关肿瘤发生机制和CIN靶向治疗发展的有价值的工具。

方法

试剂

Nocodolole、BEZ 235、BKM 120、AZD 6244和AKTViii是从Selleck化学品有限责任公司购买的。小干扰RNA(SiRNAs)来源于上海基因制药公司。Dulbecco改良的Eagle‘s Media(DMEM),Click-it Alexa Fluor 488 Edu(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)成像试剂盒和Lipofectamine RNAiMAX是从生命技术公司购买的。胎牛血清(FBS)是从美国勒尼卡市的SAFC生物科学公司(SAFCBiosciations™)购买的。CellTiter 96®从Promega公司购买了水溶液细胞增殖试验和双Glo荧光素酶试验。

畜牧业和伦理声明

所有动物工作均经QIMR Berghofer医学研究所、动物伦理委员会(编号A0707-606m)批准,并严格按照澳大利亚为科学目的照料和使用动物的准则执行。这些动物是按照指导方针饲养的。17.

组织病理学分析及免疫组织化学

组织学检查按Sinha等人所描述的标准方案收集并固定在PBS中的4%甲醛溶液中。17。用石蜡包埋组织,用4%甲醛固定后,制备5-μm厚切片,用于染色。免疫染色:Ki 67 1:500(抗兔,Novacasta#ncl-ki67p),B 220 1:500(抗大鼠,热费雪科学#14-0452-82),CD3 1:250(抗兔,AbCAM#b 5690),p21 1:500(抗兔,Abcamb 188224),p53 1:400(抗兔,AbCAM#ab131442)。

细胞培养与同步

为了产生MEF,小鼠在交配后的第二天早上,被指定为胚胎日,在交配插头的基础上获得怀孕。这种评估是为了在e13.5上分离MEF,并使用标准协议进行单细胞隔离。43。每48h连续传代一次,使各基因型的MEF永生化。为了产生原发肿瘤系(TCLs),首先手术切除肿瘤,然后用无菌手术刀将肿瘤进行机械分离,然后在0.1%胶原酶(Sigma Aldrich)中培养10 mL DMEM,其中含有20%FBS和1%青霉素-链霉素(100 U/mL)、1%L-谷氨酰胺,培养于25 cm。2组织瓶。24小时后,细胞被胰蛋白酶化,并在一个新的25厘米内培养。2组织瓶加100 L(100 g/mL)EGF,500 L(10 mg/mL)胰岛素和1%丙酮酸钠(生命技术)TM。在20%氧气和5%CO的条件下,37℃孵育小鼠细胞系。2。细胞在G1/S期通过双胸苷阻滞同步化。44.

基因型分析与定量实时PCR

基因分型、rna提取和定量实时聚合酶链反应(Rna)是根据标准协议使用的引物组进行的。17。简单地说,每种基因型细胞的总RNA都是用RNeaseplus Mini试剂盒(Chiagen)分离出来的。2利用随机引物(LifeTechnologies)和上标Ⅲ逆转录酶(LifeTechnologies)进行μ的初步合成。用轻型Cycler 480 SYBR绿色母料(Roche应用科学)在一台轻型Cycler 480实时PCR自行车(Roche应用科学)上进行qRT-PCR.

免疫印迹和免疫沉淀

在尿素裂解缓冲液(8M尿素、1%SDS、100 mm NaCl、10 mm Tris(pH7.5))中提取细胞裂解液和组织裂解液,在冰上孵育30 min,超声处理10s。WESTERNBLOTTING按照标准方案和一些用于免疫印迹的抗体进行。17。以下是本研究中使用的额外抗体:细胞信号抗体:PARP(#9542),PaktS 473(#4060),AKT(#9272),pPdk 1S 241(#3061),PDK 1(#3062)Chk 1(2G1D5)(#2360),p-GSK-3β(Ser9)(#9336),gsk-3β(#9315),p-组蛋白H3(#9706)(1:1000稀释);小孢子抗体:chk 2(1:500稀释)(克隆7)(05-649),γ-H_2Ax(1:1000稀释)S 139(05-636);BD制药原抗体:β-actin(1:2000)(612656);(S 824)(1:1000稀释)(A300-767 A)。免疫共沉淀是按照我们以前的出版物进行的。45。免疫检测采用Bubr1(Ab4637)、MAD 2(CST4636S)和CD 20(CST14866A)。

细胞增殖试验

使用IncuCyte S3活细胞分析系统(美国Essen生物科学公司)进行细胞增殖试验,如Kal方位角等人所述。18。每隔12小时分析一次倍增时间,计算细胞总数,并与使用伯爵夫人的原始种子种群进行比较。®自动小区计数器(生命技术)TM)。采用标准方案进行nih-3t3增殖试验。43.

集落形成试验

将5 0 0 0~1 0 0 0个细胞接种于12孔板上,再孵育14天,以确定其集落活力。菌落用0.05%结晶紫固定30 min。18.

流式细胞术与细胞周期分析

用流式细胞术检测细胞周期扰动和亚G1期凋亡,用ModFit LT 4.0软件对碘化丙酸丙酯染色的细胞进行分析。18.

免疫荧光

将细胞接种于果皮上,用4%多聚甲醛固定15 min,在0.5%TritonX-100-PBS中渗透15 min,用3%过滤牛血清白蛋白(BSA)阻滞于PBS中。一次抗体的Cover幻灯片在阻断液中稀释,4°C孵育一夜。Alexafluor结合的次级抗体稀释1:300,DAPI(1:500在阻断缓冲液中稀释1mg/ml),在阻断液中稀释45 min,37℃染色。oC在加湿器室。在PBS中用0.05%吐温20冲洗三次,用延金法冲洗三次。用GE DeltaVision反褶积显微镜成像和图像J分析,免疫荧光抗体为:γ-H2AX S 139(05~636;微孔)、p-组蛋白H3(#9706;cst)、α-微管蛋白(T 9026)、γ-微管蛋白(T 5192)、乙酰化微管蛋白(T 7451;Sigma)和脱粘微管蛋白(ab48389;ABCAM)。

DNA结合试验

正如我们和其他人之前所描述的那样,dna纤维协议得到了遵循。46,47。简单地说,用cldu和idu脉冲标记细胞各20分钟。渐进式复制叉的速度是根据使用ImageJ软件测量的Idu(红色)轨迹的长度来计算的。在两个独立的实验中,对每个样本至少有300个复制轨迹进行了分析。根据转换因子1m=2.59kb计算分叉速度。48.


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