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5-Fu通过p53介导的wnt/β-catenin途径激活促进结直肠癌的干细胞

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发表时间:2020-10-23 09:15作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

5-氟尿嘧啶(5-Fu)仍是结直肠癌(CRC)的一线治疗方法.虽然5-Fu最初可减轻肿瘤肿块,但化疗后复发是影响CRC患者有效临床疗效的障碍。在这里,我们证明了p5 3促进了WNT3转录,导致wnt/β-catenin通路的激活。APCMin/+/Lgr5EGFP小鼠,CRC患者源性肿瘤器官(PDTOS)和患者源性肿瘤细胞(PDC).通过这一调控,5-Fu诱导肿瘤残留肿瘤干细胞(CSCs)的活化和富集,促进肿瘤治疗后复发。WNT抑制剂与5-Fu联合治疗能有效抑制CSCs的生长,减少肿瘤的再生。这些发现表明,p53是通过WNT/β-catenin信号通路激活5-Fu诱导的CSC的关键介质,并强调了联合治疗WNT抑制剂和5-Fu作为改善目前5-Fu治疗CRC患者不良结局的一种引人注目的治疗策略的意义。

导言

结直肠癌是全世界最常见的癌症之一。1。尿嘧啶的氟化类似物5-氟尿嘧啶(5-Fu)是大肠癌姑息和辅助治疗化疗药物的基本组成部分。2,3。然而,5-Fu治疗的临床益处往往是短暂的,而且大多数接受治疗的患者没有实现肿瘤细胞的完全根除,导致5-Fu治疗后复发的不良结果。4。以5-Fu为基础的治疗方法,如FOLFOX(5-Fu、leucovorin和oxaliplatin)或FOLFIRI(5-Fu、leucovorin和irinotecan)已被用作晚期CRC的标准治疗方法。5。虽然以5-Fu为基础的治疗使CRC患者的客观有效率提高到40-50%,但其无病生存率并没有得到有效的延长。6,7。因此,迫切需要提高5-Fu治疗的临床效果的策略,了解5-Fu治疗的CRC患者复发的机制,是提高5-Fu治疗CRC患者生存率的重要一步。

化疗的临床益处通常与癌症干细胞(CSCs)有关。8。CSCs是一小部分癌细胞,经过不断的自我更新和分化为异质细胞,产生了肿瘤的启动潜能。由于这个原因,cscs的存在使得接受化疗的肿瘤复发。9。对晚期结直肠癌患者的临床研究表明,高表达csc标记与化疗后总的生存率差有关。10,11。此外,越来越多的证据表明,根除cscs是一种通过预防肿瘤复发来克服化疗失败的潜在途径。12,13,14。然而,在化疗下导致干细胞增加的主要调控机制仍然是未知的。

Wnt/β-catenin信号通路是正常肠干细胞稳态的重要调节因子。15。从ISC邻近细胞分泌wnt 3和特异性表达R-海绵体1,建立了沿隐窝-绒毛轴的wnt/β-catenin梯度,控制子代细胞从隐窝底部向绒毛的向上移动,分化为构成肠道的所有细胞类型。16,17,18。在crc中,wnt/β-catenin信号通路异常激活,主要原因是大肠腺瘤性息肉病 (APC)90%的CRC患者发生突变,破坏wnt梯度,使iSCs沿着隐窝-绒毛轴增生,并通过cscs促进肿瘤的发生。19。在大肠癌进展过程中,wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌的活化和维持中也起着重要的作用,该通路的激活是大肠癌患者预后不良的标志之一。20,21。尽管wnt/β-catenin信号通路在大肠癌CsC富集中起着重要作用,但其在化疗后复发中的作用尚未得到研究。

序列特异性转录因子p53通过抑制细胞增殖或诱导细胞程序性死亡,在细胞应激反应中起关键作用。此外,p5 3是5-Fu抗肿瘤作用的主要途径,并决定了细胞对细胞毒性5-Fu的敏感性。22,23,24。5-Fu处理可提高p5 3和p53靶基因的翻译、稳定性和转录活性,促进细胞周期阻滞、凋亡和衰老等多种抗癌过程。25。尽管在确认p53和5-Fu反应之间的联系上做出了巨大的努力。5,26,27抑癌基因p53在5-Fu治疗后复发中的作用尚未见报道。新出现的证据表明p5 3与其他信号通路合作,在各种生物过程中发挥额外的作用。28,29。根据这些最新发现,p53通过转录激活Wnt通路,在调控小鼠胚胎干细胞(ESCs)死亡和存活方面具有双重功能。28,29我们研究了p53在5-Fu治疗的大肠癌中CSC激活中的作用.

在本研究中,我们证实了5-Fu通过p5 3诱导的cSCs活化。WNT3转录后激活大肠癌细胞株和异种移植瘤中的wnt/β-catenin通路,以及患者的化身模型,如患者源性肿瘤器官(PDTOS)和患者源性细胞(PDC)。WNT/β-catenin通路在5-Fu激活和富集CSCs中的关键作用表现在5-Fu联合作用下的CsC抑制作用。此外,WNT抑制剂和5-Fu联合治疗对PDTOS和异种移植物肿瘤停止治疗后的再生也有抑制作用。综上所述,我们的数据揭示了p53与WNT/β-catenin信号通路之间的直接和功能性联系,并强调了它们通过5-Fu治疗参与了大肠癌的csC激活。此外,这些结果表明,联合应用WNT抑制剂和5-Fu可以有效地克服5-氟尿嘧啶(5-Fu)治疗大肠癌后生存率低下的问题。

结果

5-Fu诱导Lgr5富集+细胞

尽管以5-氟尿嘧啶为基础的治疗(如FOLFOX或FOLFIRI)的敏感性高于仅使用5-Fu的治疗,但患者在治疗后的总生存率仍然很低(补充图1)。1A)和不同阶段的CRCs(补充图。1B-d)。为了了解5-Fu治疗与预后不良相关的基本问题,我们研究了5-Fu治疗是否丰富了CRC患者的CSCs。5-氟尿嘧啶能有效地减少肠道肿瘤组织的数量和大小。APCMin/+/Lgr5EGFP并显著抑制小鼠的生长(图一)。1A,b然而,在残留的肿瘤器官中,用GFP信号监测CSC标记物Lgr5的强度明显增加(图1)。1C)。5-Fu激活CSCs的实验证实,5-Fu的mRNA表达水平显著升高,证实了CSCs的激活。Lgr5, CD 44, CD 133,和CD 166(无花果)1D)。通过GFP强度分析,对Lgr5在肿瘤组织中的表达进行时程分析,结果表明,随着肿瘤器官的生长,CSC的活性没有变化。然而,5-Fu处理增加了CSCs的活性,同时抑制了肿瘤器官的生长,如GFP强度在48h时的增加所显示的那样(见图)。1E这种渐进式的变化出现在补充电影中。12)。5-氟脲嘧啶(5-Fu)的体内免疫组织化学(IHC)分析也证实了5-Fu对CSCs的富集和激活作用。APCMin/+/Lgr5EGFP小鼠肿瘤(图1.1F).

图1:5-氟尿嘧啶处理诱导小鼠CRC CSC富集.
figure1

af年肠道肿瘤中的肿瘤有机物分析APCMin/+/Lgr5EGFP5-氟尿嘧啶(1.5μg/ml,48h)治疗小鼠。a5-氟尿嘧啶治疗肿瘤器官的亮场图像。相对数(n=每组4个生物独立样本)和大小(n与对照组比较,每组肿瘤组织中的23种不依赖生物的细胞器与对照组比较,呈倍数变化。标尺=5毫米。b5-氟尿嘧啶治疗后肿瘤器官的生长。(n=每组5个生物独立样本)cLgr5(GFP)共焦图像及5-Fu治疗后GFP的平均强度。标尺=50μm.n=每组5个生物独立样本)d相对mRNA水平Lgr5, CD 44, CD 133,和CD 1665-氟尿嘧啶治疗后。数据显示为折叠变化与控制相比较。(n=每组3个生物独立样本)e5-Fu治疗后Lgr5(GFP)表达的时程分析。标尺=100μm.n=每组4个生物独立样本)f苏木精、伊红和免疫荧光染色小鼠肠道切片后,经5-氟尿嘧啶(25 kg/ml,3周)治疗后,用抗体指示的蛋白质。平均强度用ZEN软件3.1测量。标尺=50μm.n=每组4个不依赖生物的样本)数据为平均±S.D.,双面学生的数据。t-测试*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a Source data file.

5-Fu激活大肠癌Wnt/β-catenin通路

为了确定5-Fu导致CSC活化和富集的机制,我们评估了Wnt/β-catenin信号通路的状态。5-氟尿嘧啶治疗可显著提高肿瘤组织中β-catenin的总含量和活性。APCMin/+/Lgr5EGFP小鼠,如免疫印迹和免疫细胞化学(ICC)分析所示(图。2A,b)。5-Fu对wnt/β-catenin信号通路的激活也被Wnt报告小鼠的β-半乳糖苷酶染色显著增强所证实。Axin 2拉兹30,交叉APCMin/+老鼠(APCMin/+/Axin 2拉兹;图1.2C)。5-Fu处理后β-catenin表达的时程分析显示,处理12h后β-catenin水平显著升高,提示Wnt/β-catenin信号通路的激活发生在5-Fu激活和富集CSCs之前。1E和二维空间)。此外,ihc分析表明,β-catenin在5-Fu治疗的肿瘤中明显升高。APCMin/+/Lgr5EGFP这些水平与Lgr5的表达密切相关(图5)。2E,f)。此外,5-氟尿嘧啶治疗小鼠肿瘤器官来源于APCMin/+/K-RASG12DLA2/Lgr5EGFP小鼠体内注射5-FuAPCMin/+/K-RASG12DLA2/Lgr5EGFP小鼠证实β-catenin和Lgr5的表达增加,表明5-Fu诱导的Wnt/β-catenin信号通路和CSCs在晚期小鼠CRC模型中也发生激活(附图)。2A,b).

图2:5-Fu激活小鼠CRC的WNT/β-catenin通路。
figure2

a免疫标记蛋白APCMin/+/Lgr5EGFP5-氟尿嘧啶(1.5μ/ml,48 h)治疗肿瘤组织.bβ-catenin(红色)的共焦图像APCMin/+/Lgr5EGFP5-氟尿嘧啶治疗或不加治疗的肿瘤器官。β-catenin的百分比/+细胞(n=4个生物独立样本(每组)和平均强度(n=每组3个生物独立样本)。标尺=50μm。c肿瘤组织的β-半乳糖苷酶染色APCMin/+/Axin 2拉兹用或不加5-Fu治疗的小鼠。标尺=100μm。d大鼠β-catenin表达的时程分析APCMin/+/Lgr5EGFP5-氟尿嘧啶(5-Fu)治疗或未治疗的肿瘤器官,并对其平均强度进行量化。标尺=100μm。e, f APCMin/+/Lgr5EGFP用5-氟尿嘧啶(25 mg/kg,3周)治疗小鼠。e小肠肿瘤切片中β-catenin和Lgr5的苏木精和伊红染色及dda染色APCMin/+/Lgr5EGFP用车辆或5-氟尿嘧啶治疗小鼠。标尺=100μm。f肿瘤中Lgr5和β-catenin表达的线性回归曲线APCMin/+/Lgr5EGFP5-氟尿嘧啶治疗小鼠。平均强度用ZEN软件3.1测量。(n=在每组4只独立动物上检查的21个字段)数据为平均±S.D.,双面学生的数据t-试验,**p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a Source data file.

5-Fu通过p53激活大肠癌wnt/β-catenin通路

接下来,我们试图探讨5-Fu激活大肠癌WNT/β-catenin信号通路的机制。我们首先证实了5-Fu对不同人大肠癌细胞株WNT/β-catenin信号通路的激活作用。有趣的是,5-Fu能提高携带野生型的crc细胞β-catenin水平。p53(P53 WT)但在那些携带突变体的人中不存在p53(p5 3 mut;图1.3A)。ICC分析显示p53和β-catenin在5-Fu处理的大肠癌细胞株中的表达呈正相关(图1)。3B)。为了探讨p53在5-Fu诱导的wnt/β-catenin信号通路激活中的作用,我们研究了5-Fu对hct 116中wnt/β-catenin信号通路的影响。p53野生型(p53+/+),空(p53−/−),以及突变体(p53R248W/−)等基因人CRC细胞株。5-氟尿嘧啶处理提高β-catenin水平p53+/+细胞但不在p53−/−p53R248W/−细胞(图1.3C)。然后我们调查了p21的参与情况。Waf1/Cip 1(P21)在hct 116介导的wnt/β-catenin信号通路的激活过程中,介导p53诱导的细胞周期阻滞的下游p5 3靶基因。p21野生型(p21+/+)和NULL(p21−/−)等基因人CRC细胞株。5-Fu诱导的β-catenin活化增加与p21状况(图1.三维空间P53介导5-Fu诱导的WNT/β-catenin信号通路的激活,与其在细胞周期阻滞中的作用无关。抑制p53转录活性的P53抑制剂吡硫蛋白-α可抑制5-Fu诱导的β-catenin的增加,而p53激活剂RITA则使HCT 116细胞中β-catenin水平升高(如图1所示)。3E,f)。P53对β-catenin的增加也证实了其来源于肿瘤的类细胞器。APCMin/+/Lgr5EGFP老鼠(图1.3G,hP53活性对大肠癌WNT/β-catenin信号通路的调控作用。

图3:p53介导5-Fu诱导的WNT/β-catenin信号通路激活.
figure3

a不同细胞株经5-Fu(1.5μg/ml,48h)处理后的免疫印迹蛋白。b5-Fu处理前后HCT 116细胞免疫荧光共聚焦图像及p53中β-catenin的平均强度低层和p53细胞。标度棒=20μm.(P53)低层 n=7,p53 n=6个生物独立样本)。c免疫标记蛋白p53+/+, p53−/−,和p53R248W/−等基因HCT 116细胞株经5-Fu处理或不处理。d免疫标记蛋白p21+/+和p21−/−等基因HCT 116细胞株经5-Fu处理或不处理。e5-氟尿嘧啶(5-Fu)和吡咯菊酯-α(10μM,48 h)作用于HCT 116细胞的免疫印迹。fRITA(5μM,48h)作用于HCT 116细胞的免疫印迹。g, hβ-catenin的苏木精和伊红染色及免疫荧光染色APCMin/+/Lgr5EGFP5-氟尿嘧啶(5-Fu)和吡咯菊酯-α(g不管有没有丽塔(h)。标度棒=50μm,平均强度用ZEN软件3.1测量。(n=每组6个不依赖生物的样本)数据为平均±S.D.,双面学生的数据。t-测试,N.S.不重要,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a Source data file.

5-Fu通过p53诱导wnt 3转录

鉴于CSCs与ISCs具有共同的特性,我们研究了维持ISCs WNT/β-catenin通路激活的最基本的生态位因子WNT 3和R-Sendin 1是否参与了p53介导的激活WNT/β-catenin通路和5-Fu处理的CRC中CsC的激活。虚拟预测发现p5 3是wnt 3最重要的转录因子之一,并且WNT3在存在dna损伤的胚胎干细胞中被认为是p5 3的直接靶点。28,29.

因此,我们评估p53是否能调控大肠癌细胞WNT 3的转录。事实上,5-氟脲嘧啶(5-Fu)治疗可提高大鼠的mRNA水平。WNT3在肿瘤组织中APCMin/+/Lgr5EGFP老鼠(图1.4A)。P53在5-Fu诱导中的作用WNT3人大肠癌中的转录也有增加的迹象。WNT3野生型人大肠癌细胞株mRNA水平的研究p53但不是在那些窝藏着变种人的人身上p53(无花果)4B)。野生型(p53+/+),空(p53−/−),以及突变体(p53R248W/−) p53和野生型(p21+/+)和NULL(p21−/−) p215-Fu显示5-Fu诱导WNT3需要转录p53但独立于p21(无花果)4C,d)。与吡咯-α和5-氟脲嘧啶共处理可抑制5-氟脲嘧啶引起的细胞增殖。WNT3MRNA水平(图1.4E)。相反,治疗Rita诱导WNT3HCT 116人CRC细胞株的转录4F)。自从5-Fu诱导WNT3P5 3的dna结合突变使转录消失,推测p5 3可能是一种直接的转录因子。WNT3归纳法。事实上,p53与WNT3染色质免疫沉淀(芯片)分析显示,HCT 116细胞经5-Fu处理后,启动子增强。4G)。5-Fu对人肠类器官中wnt 3和β-catenin表达的影响APC敲除型p53(APC/p53威汤哥)但在那些APC敲除与突变p53 (APC/p53)31(无花果)4H)。这些结果表明,5-Fu诱导WNT3通过p53介导的转录激活。

图4:5-Fu通过p53依赖性激活wnt/β-catenin信号转导WNT3变身。
figure4

a相对mRNA水平WNT3在……里面APCMin/+/Lgr5EGFP5-氟尿嘧啶(1.5μg/ml,48h)治疗小鼠肿瘤组织.(n=每组3个生物独立样本)。b相对mRNA水平WNT3在不同的CRC细胞株中经5-Fu处理后。(n=每组3个生物独立样本)。c相对mRNA水平WNT3在……里面p53+/+、p53−/−,和p53R248W/−等基因HCT 116细胞经5-Fu处理后。(n=每组3个生物独立样本)。d相对mRNA水平WNT3在……里面p21+/+p21−/−等基因HCT 116细胞经5-Fu处理后。(n=每组3个生物独立样本)。e相对mRNA水平WNT35-氟脲嘧啶(5-Fu)和哌替比林-α(10μM,48 h)作用于HCT 116细胞。(n=每组3个生物独立样本)。f相对mRNA水平WNT3用RITA(5μM,48h)处理HCT 116细胞。(n=每组3个生物独立样本)。g芯片的相对输入率-qPCR分析WNT35-Fu处理HCT 116细胞后启动子使用指示抗体。(n=每组3个生物独立样本)hWNT 3(绿色)和β-catenin(绿色)的共焦图像APC/p53威汤哥APC/p53用或不加5-Fu治疗人结肠器官。标度棒=50μm.图中WNT 3和β-catenin平均强度的定量.4H。平均强度用ZEN软件3.1测量。(n=每组3个不依赖生物的样本)数据为平均±S.D.,双面学生的数据。t-测试,N.S.不重要,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a Source data file.

Wnt抑制抑制5-Fu诱导的csc活化

与p53依赖的细胞内wnt 3的增加相一致,5-Fu可显著增加wnt 3的分泌。p53+/+HCT 116细胞但不在p53−/−HCT 116细胞(附图)3A)。外源性wnt 3处理提高了β-catenin的总水平和活性,增加了csc标记物的mrna水平。p53野生型CRC细胞株、HCT 116和LoVo细胞(附图)。3B,c).

为了探讨wnt 3的诱导是否与wnt/β-catenin信号通路的激活以及随后的csc激活有关,我们从APCMin/+/Lgr5EGFP鼠用豪猪碱抑制剂LGK-97432还有五福。如图所示,5-Fu诱导的β-catenin和Lgr5表达增加被LGK-974有效抑制。5A)。经5-Fu单独或LGK-974联合治疗48h后,5-Fu有效诱导肿瘤干细胞标记物的时间点及诱导作用被LGK-974联合抑制(图5-974)。1E和5A)用新鲜培养基分离肿瘤组织,不加药物处理。在此,5-Fu处理后的细胞器克隆形成的起始阶段。APCMin/+/Lgr5EGFP肿瘤器官发生较早,生长速度快于5-Fu和lgk-974联合治疗后的生长速度。APCMin/+/Lgr5EGFP肿瘤器官。(补充图。4A-C表明WNT诱导的5-Fu激活CSCs与结直肠CSCs的功能特征有关。有效抑制5-Fu诱导的WNT 3分泌(图1)。5B5-Fu对HCT 116细胞株WNT/β-catenin信号通路和csc的激活有明显的抑制作用(如β-catenin和csc标记的蛋白和mRNA水平所示)。5C,d)。P53介导的转录诱导WNT3其次是激活wnt/β-catenin信号通路,并在携带野生型的lovo crc细胞中证实cscs的激活。p53(补充图。5A-I).

图5:WNT抑制抑制5-Fu诱导的CSCs富集和肿瘤再生.
figure5

a年β-catenin(绿色)和Lgr5(绿色)共焦图像APCMin/+/Lgr5EGFP5-氟尿嘧啶(1.5μg/ml,48h)和LGK-974(5μM,48 h)共处理肠肿瘤器官,并定量测定平均强度(右侧)。标尺=50μm.n=每组3个生物独立样本)。b用ELISA法检测HCT 116细胞经5-Fu和LGK-974共培养12h后WNT 3的分泌。(n=每组3个生物独立样本)。c5-Fu和LGK-974共处理HCT 116细胞的免疫印迹研究.dCSC标记物的相对mRNA水平Lgr5, CD 44, CD 133,和CD 166用5-Fu和LGK-974共处理HCT 116细胞。(n=每组3个生物独立样本)。ei将HCT 116细胞移植到小鼠体内,用5-Fu(25 mg/kg)和LGK-974(5mg/kg)共处理21d,然后停药14d,提取肿瘤,并进行分析。e治疗后观察肿瘤生长情况。(n=每组D0、D3、D7、D11、D14、D17和D21中的5只动物n=每组D24、D28、D31动物中的4只)。f肿瘤的大体图像。标尺=10毫米。g分离肿瘤经指示治疗21d后免疫标记蛋白的表达。h相对mRNA水平Lgr5, CD 44, CD 133,和CD 166孤立性肿瘤经指征治疗21天后。(n=每组3个生物独立样本)。i免疫组织化学方法分析肿瘤治疗21天后显示的蛋白及平均强度的定量。标度棒=100μm,平均强度用ZEN软件3.1测量。(β-catenin)n=3 in Control,LGK-974 and 5-Fu,及n=4在5-Fu+LGK-974组,CD 44n=3 in Control,LGK-974,及n=4在5-Fu和5-Fu+LGK-974组,CD 133n=3 in Control,LGK-974,及n=4在5-Fu和5-Fu+LGK-974组,CD 166n=3 in Control,LGK-974 and 5-Fu,及n=4在5-Fu+LGK-974组)。数据为平均±S.D.,双面学生的t-试验,**p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a Source data file.

利用HCT 116细胞移植小鼠模型,研究了LGK-974和5-Fu联合治疗对小鼠体内的影响。为了探讨WNT抑制对5-Fu术后复发的影响,我们有意停止治疗,并允许肿瘤在没有治疗的情况下复发。5-氟尿嘧啶单独治疗和WNT抑制剂LGK-974及5-Fu联合治疗均能初步有效地抑制肿瘤生长。有趣的是,停止治疗后,5-Fu治疗的肿瘤迅速恢复,并达到与未治疗组相似的肿瘤大小,而与LGK-974和5-Fu联合治疗的肿瘤在停止治疗后表现出抑制性的肿瘤再生长(如图1所示)。5E,f)。在停止治疗时,尽管肿瘤体积缩小,5-Fu治疗的肿瘤中β-catenin蛋白水平较高,csc标记表达较高。Lgr5, CD 44, CD 133,和CD 166然而,与未治疗肿瘤相比,用LGK-974和5-Fu联合治疗的肿瘤中,β-catenin和csc标记物的水平与未治疗对照组相比没有增加。(无花果)5G,h)。β-catenin和CD 44、CD 133和CD166CSC标记物经5-Fu处理后表达增强,LGK-974对5-Fu诱导的WNT/β-catenin信号通路激活及随后的CsC激活有抑制作用。5I)。因此,csc通过p5 3介导的活化。WNT3诱导对5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导的大肠癌复发有重要意义.

Wnt抑制抑制5-Fu处理后的再生

为探讨wnt 3介导的csc活化对大肠癌患者5-Fu治疗后复发的临床意义,我们进一步研究了lgk-974和5-Fu联合治疗对CRC pDC的影响。33和PDTOS。5-氟尿嘧啶可显著提高野生型pdc和pdtos中p53、wnt 3和β-catenin的水平。p53(补充表)1还有无花果。6A)的mRNA水平WNT35-氟尿嘧啶治疗也有增加(图1)。6B)。一直以来,Lgr55-Fu对野生型pdc和pdtos均有促进作用。p53(无花果)6C5-Fu诱导的wnt/β-catenin信号通路的激活并伴随csc的富集在pdc中没有发生。p53(补充图。6a,b5-Fu治疗证实了大肠癌患者CSCs的p53依赖性激活。此外,与LGK-974共处理可有效抑制5-Fu诱导的β-catenin在PDC和PDTOS中的增加(图1)。6d,e证实WNT配体参与了5-Fu介导的β-catenin信号通路的激活。为了进一步确定抑制wnt在体内的病理生理意义,我们评价了5-Fu和lgk-974联合治疗的疗效。p53野生型PDC异种移植小鼠模型。5-氟尿嘧啶单独治疗和LGK-974与5-氟尿嘧啶联合治疗均能有效抑制肿瘤生长,联合治疗可提高肿瘤对5-氟尿嘧啶的敏感性(图1)。6f和补充图。6C)。5-氟尿嘧啶单独治疗可增加β-catenin和csc标记物在剩余肿瘤中的表达,同时进行LGK-974治疗能有效抑制5-Fu对β-catenin和csc标记物水平的影响(补充图1)。6d,e还有无花果。6g)。这些数据共同验证了WNT在体内5-Fu激活CSC中的关键作用。

图6:WNT抑制剂能有效抑制5-Fu诱导的大肠癌患者CSCs的富集和肿瘤的再生.
figure6

aPDC和PDTOS经5-Fu处理后免疫印迹(1.5μg/ml,48h)。b, c相对mRNA水平WNT3 (b)和Lgr5 (c在PDC和PDTOS中,无论是否给予5-Fu治疗。(n=每组3个生物独立样本)。d用5-Fu和LGK-974(5μM,48h)共处理PDC和PDTOS中的免疫标记蛋白.eβ-catenin(绿色)与5-Fu和lgk-974(左面板)共焦图像及β-catenin含量的定量研究+每个肿瘤器官中细胞的数量(右上面板)(n=4个生物独立样本(每组)和平均强度(右下角)。(n=10个生物独立样本(每组),鳞片=50μm。f, g分别用5-Fu(25 mg/kg)或5-Fu(25 mg/kg)和LGK-974(5mg/kg)处理PDC#1小鼠16天,提取肿瘤并进行分析。f肿瘤在治疗过程中在小鼠体内生长。(控制)n=8,LGK-974n=6,5-Fun=8,5-Fu+LGK-974n=8只生物独立的动物)g相对mRNA水平Lgr5, CD 44, CD 133,和CD 166在孤立的肿瘤治疗后。(n=每组3个生物独立样本)h, i从患者2中提取的肿瘤器官分别单独使用5-Fu(1.5μg/ml)或5-Fu和LGK-974联合治疗10天,然后停止治疗28d。hPDTO 2在指示天数的生长。(n=10 in D0,n=3英寸D1,n=7 in D3,D6,D10,n=D17中的4,n=每组D24、D31和D38中的3份独立样本)。i5-Fu单独处理或5-Fu与LGK-974共处理后28d PDTO 2的亮场图像(左面板),用细胞滴度测定法(右面板)测定PDTO 2细胞生长情况(n=每组3个生物独立样本)。标尺=4毫米。j描述了5-Fu通过p53激活和富集CSCs的机制。平均强度用ZEN软件3.1测量。数据为平均±S.D.,双面学生的t-测试*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a Source data file.

我们还探讨了lgk-974和5-Fu联合应用于携带野生型的crc pdto治疗5-Fu后复发的疗效。p53。5-Fu单独治疗和LGK-974共处理均能有效地抑制PDTO的生长.在停止治疗后,5-Fu处理的PDTO迅速返青,并达到与未处理PDTOS相似的大小,而与LGK-974和5-Fu共处理的PDTOS在停止治疗后明显减少再生(图1)。6h,我)。我们的体外、体内和体外结果共同证明了对WNT35-Fu处理的野生型慢性肾细胞csc活化和复发的诱导作用p53。尽管最初的肿瘤脱出,5-Fu治疗的肿瘤由于csc通过p5 3介导的转录激活而重新生长。WNT3归纳法。与5-Fu、奥沙利铂(OXA)和依立替康(Irinotecan)相似,可供选择的p53激活化疗治疗CRC患者。34,35,36,37,显著提高β-catenin水平及WNT 3和CSC标记的表达(附图)。7A-c)。这些药物作用主要由lgk-974共同作用于携带野生型的crc细胞株中消除。p53(补充图。7D-g)。此外,5-氟脲嘧啶抗性细胞系(5-Fu-R)具有野生型。p53,但不是那些变种人p53与亲本相比,β-catenin和WNT 3水平升高(附图)。8a,b)。与WNT/β-catenin通路激活相一致,LGK-974抑制5-Fu-R-HCT 116细胞球体形成能力和诱导CsC标记物的诱导,而缺口抑制剂DAPT则无明显抑制作用(补充图)。8C-e)。而LGK-974与5-Fu共处理对5-Fu-R-HCT 116细胞有部分抑制作用(补充图)。8F,g),与亲本HCT 116细胞经5-Fu处理后(73.5%)比较(附图)。8A)。这些结果表明,我们通过对5-Fu的瞬时处理所确定的机制在5-Fu敏感性和抗性中对cSCs的激活起着至关重要的作用。p53野生型CRC细胞,但其他驱动因素可能与5-Fu的抗药性有关.联合应用5-Fu和WNT抑制剂,阻断WNT/β-catenin途径的激活,抑制5-Fu诱导的CSCs活化和富集,有效地减少5-Fu治疗后肿瘤的再生,克服5-Fu治疗后的复发(图5-Fu)。6J).

讨论

自20世纪50年代以来,以5-Fu为基础的化疗一直是CRC患者治疗的重点.虽然5-Fu和leucovorin与奥沙利铂或依立替康的联合使用比单独使用5-Fu具有更大的生存效益,但近一半的CRCs对5-Fu的化疗具有抗药性。因此,广泛的研究集中在介导对5-氟脲嘧啶(5-Fu)治疗的耐药的生物学因素的表征,或确定预测的生物标志物,以确定那些最有可能受益于5-Fu基础化疗的患者。5,10,26,38。即使是对这种治疗有初步反应的患者,化疗后的复发仍然限制了患者的临床结果,这表明迫切需要有针对性的治疗来阻止化疗引起的复发。4.

P53是大肠癌最重要的抑癌因子之一,它决定了对5-Fu治疗的敏感性。22,23,24。除了其已知的转录活性控制多种基因的表达,在抗癌效应中,它与其他信号通路在不同的细胞过程中的串扰已被确认。28,29。最近的研究表明p53在小鼠ESCs中的作用是不可预料的。P53直接协调Wnt和Smad通路,在多能ESCs的分化中起重要作用。28,29。此外,在dna损伤后,p5 3通过wnt配体转录诱导激活wnt信号,显示p5 3的两面对p5 3均有调节作用。-和反生存的社会经济体系28,29.

在本研究中,我们发现p53参与了5-Fu诱导的CSC激活.有趣的是,经5-Fu处理后,p53通过转录诱导激活wnt/β-catenin信号通路。WNT3导致肿瘤内CSCs的活化和富集。基础β-catenin水平间无显着性差异(P>0.05)。p53+/+, p53−/,和p53R248W/等基因细胞表明,除了WNT3在p5 3的诱导下,p5 3介导的其他机制也可能参与了基础β-catenin水平的负调节,正如先前的研究所显示的那样。39,40。因此,p5 3可能在wnt/β-catenin信号转导中起负性和正向调节作用,但在5-Fu作用下,p53通过诱导wnt/β-catenin途径激活wnt/β-catenin通路。WNT3,将p53作为一种双面调节,发挥抗癌和csc激活作用。

我们的研究结果表明p5 3可能对5-Fu治疗携带野生型结直肠癌的临床疗效有一定的影响。p53通过其在抗癌和CSC诱导作用中的双重作用。另外,5-Fu通过p53介导的WNT/β-catenin信号通路激活CSC,提示WNT/β-catenin信号通路的靶向性是提高5-Fu临床疗效的关键。因此,以5 FU为基础的WNT/β-catenin信号抑制剂联合治疗可能有助于抑制大肠癌的发生,从而减少复发。在PDTOS和体内异种移植模型中,5-Fu处理激活了WNT/β-catenin信号通路,丰富了肿瘤中的CSCs,并观察到停药后残余肿瘤的再生。重要的是,联合应用WNT抑制剂和5-Fu能有效抑制剩余肿瘤CSC的富集,有效地抑制肿瘤的再生长。

作为维持ISCs的重要生态位因子,上皮和间充质产生的wnt配体是正常肠内稳态所不可缺少的。15。尽管具有CSCs的ISCs具有相似的特性,但WNT配体在CRC细胞CSC调控中的重要性尚未明确。虽然野生型和突变型APC的参与以及APC 2在CRCs下游信号对WNT配体的反应中的功能冗余尚不清楚,但我们的发现揭示了WNT配体在5-Fu治疗的CRC肿瘤中激活和富集CSCs的关键作用。WNT抑制剂和5-Fu联合应用可减少CSCs的克隆扩张,减少复发,因为CSCs的扩张会引起异质性的群体并导致复发。我们的研究发现,野生型p53在5-Fu处理时激活WNT/β-catenin信号通路和CSCs中起关键作用,提示5-Fu治疗对WNT/β-catenin信号通路的靶向作用可能是克服5-Fu治疗后复发的一种潜在的治疗策略。然而,我们提出的模型并不排除突变型p53对大肠癌WNT/β-catenin信号的激活。虽然其机制不同,但突变型p53和野生型p53都可能导致wnt/β-catenin信号的激活。因此,wnt/β-catenin信号转导抑制剂虽然可能不是lgk-974,但可能是细胞内的抑制因子,例如下游wnt/β-catenin信号抑制剂,这些抑制剂在抑制csc方面表现出有效的作用,如kya1797k。41WNT配体及下游WNT/β-catenin信号抑制剂可能有助于WNT/-catenin信号抑制剂在WT-Fu治疗后的复发。

方法

细胞培养和试剂

人CRC细胞(LoVo、HCT 116、RKO、SW 48、DLD-1、SW 480、SW 620和WiDR)是从美国型培养集(Manassas,VA)购买的。p53野生型(p53+/+),空(p53−/−)和突变体(P53)R248W/−)和p21野生型(p21+/+)和NULL(p21−/−)等基因HCT 116细胞株由B.Vogelstein(约翰·霍普金斯肿瘤研究中心,MD)提供。所有细胞系均采用短串联重复谱(CosmoGenetech,Korea)鉴定,并在RPMI 1640(吉布科,CA)或DMEM(吉布科)中添加10%胎牛血清(吉布CO)。将RITA(圣克鲁斯生物技术,CA)、哌啶酯-α-对硝基环(pificrein-α)(SantaCruz生物技术)、LGK-974(Selleckchem,TX)溶于二甲基亚砜(Sigma-Aldrich,MO)中进行体外研究。

5-氟尿嘧啶耐药细胞的建立

HCT 116、SW 480和HT 29细胞在DMEM和10%FBS中的初始5-Fu浓度为0.1g/ml。存活的细胞生长至80%汇合,并在9d内传代两次,以确保存活。5-Fu浓度为0.25、0.5和1.5g/ml时,5-Fu连续作用于5-Fu细胞,最大浓度为6次,直到细胞在5-Fu最大浓度下存活3天以上。5-氟尿嘧啶(1.5g/ml)处理72h后,MTT法证实细胞对5-Fu的慢性耐药,对照亲本细胞平行传代。

球体培养

总计1×104细胞/ml接种含DMEM/F12(Invitrogen,CA)的无血清培养基,加入B27(Invitrogen)和20 ng/ml EGF和10 ng/ml bFGF(PeproTech,NJ)于超低附着板(Corning,NY)中。球体形成培养5d后进行实验。用ImageJ软件V1.46测量球体的尺寸,测量球体的成形能力。

免疫印迹

用RIPA缓冲液(150 mm NaCl,10 mm Tris pH7.2,0.1%十二烷基硫酸钠,1%Triton X-100,1%脱氧胆酸钠和5mm乙二胺四乙酸)溶解细胞。将小鼠肿瘤组织标本保存在液氮中,用RIPA缓冲液进行匀浆。在10-12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质,并将其转移到硝化纤维素膜上(Whatman,Maidstone,UK)。免疫印迹按标准方案进行:抗p53(圣克鲁斯生物技术,sc-126;1:1000),抗p21(圣克鲁斯生物技术,sc-6246;1:1000),抗β-catenin(圣克鲁斯生物技术,sc-7199;1:3000),抗活性β-catenin(Sigma-Aldrich,05-665;1:1000),抗-wnt 3(英国剑桥,abcm,ab32249;1:1000),抗p-lrp6(细胞信号技术,MA#2568;1:1000,抗β-actin(SantaCruz生物技术,sc-47778;1:5000),辣根过氧化物酶结合抗小鼠(细胞信号技术,#7076;1:3000)或抗兔(Bio-Rad,CA,#1706515;1:3000)次级抗体。蛋白质带检测采用荧光图像分析仪(日本富士薄膜公司LAS-4000;化学博士XRS+系统,Bio-Rad,CA),用MultiGauge软件V3.0(富士薄膜)和ImageLab软件V6.0.1(Bio-Rad)进行分析。源数据中提供了最重要的印迹的原始扫描。

逆转录和定量实时PCR

用Trizol提取总RNA®试剂(Invitrogen,CA)遵循制造商的指示。用200单位M-MLV逆转录酶(Invitrogen),在42°C下反应1h,从总RNA(2g)中合成cDNA,用SYBR绿色PCR主混合物(HIDEN,HIDEN)进行PCR扩增,并对PCR扩增产物进行分析。正常化后mRNA表达水平β-肌动蛋白内源性控制采用Δ、CT(周期阈值差)法。进行了3个生物复制。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

WNT 3 ELISA试剂盒(#MBS 919345,MyBiosce,Sandigo)根据生产厂家的指示进行WNT 3分泌的测定。在37°C条件下,在WNT 3抗体结合的96井中孵育12h,37°C与生物素结合抗体孵育1h,37°C与亲和素-HRP抗体孵育1h,37°C与TMB底物孵育15 min,用FLUOstar Optima仪器(德国Ortenberg,BMG Laba)测定培养液中WNT 3的含量。

遗传动物研究

所有动物实验均按照韩国食品药品监督管理局的指导原则进行。协议由延世大学动物保护和使用机构委员会审查和批准。C57BL/6J-APC分钟//+ (APCMin/+)小鼠,B6.129S-克拉斯Tm3Tyj (克拉斯G12DLA2),以及B6N.129P2-Axin 2Tm1Wbm/J (Axin 2拉兹)是从杰克逊实验室(巴尔港,ME)获得的。Lgr5EGFP-IRES-CRERT 2 (Lgr5EGFP)小鼠由杨云刚(首尔国立大学,韩国)提供APCMin/+/Lgr5EGFP, APCMin/+/克拉斯G12DLA2/Lgr5EGFP,和APCMin/+/Axin 2拉兹。用从尾部提取的基因组DNA进行基因分型。为了控制遗传背景效应,以性别匹配的小白蚁作为对照.在体内实验,12周大APCMin/+/Lgr5EGFP (n=4),APCMin/+/克拉斯G12DLA2 (n3)腹腔注射5-Fu(25 mg/kg),每周3天,共3周。

异种移植物研究

无胸腺NU/NU小鼠和SCID/g(NOD-Prkdc)SCID tm1Baek)小鼠(GemBiosciations,Chungbuk,Korea)皮下注射HCT 116(5×10)。6细胞/小鼠)和PDC#1(1×10)7细胞/小鼠),分别在200毫升的PBS:Matrigel中®(BD生物科学,CA;1:1)。当肿瘤平均大小在100到200 mm之间时3将小鼠随机分为4组:载体组、LGK-974组、5-Fu组、5-Fu+LGK-974组.LGK-974每天5 mg/kg,5-Fu 25 mg/kg,每周腹腔注射3次。

免疫组织化学

用10 mm柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)孵育4m石蜡包埋的组织标本,蒸压15 min进行抗原提取。然后用5%牛血清白蛋白(BSA)和1%正常山羊血清(NGS,载体实验室,CA)的PBS混合液阻断30 min。阻断后,切片与绿色荧光蛋白(Santa Cruz BioTechnology,sc53882,1:100),β-catenin(AbCAM,abcm,b 2365,1:100),CD 44(蛋白质技术,#15675-1-AP,1:100),CD 133(Miltenyi Biotec,#130-108-062,1:50)和CD 166(AbBiotec,#251619,1:100)在4°C下孵育,然后与抗小鼠AlexaFluor 488(生命技术,CA,A11008;1:500)或抗兔亚历克斯氟555(生命技术,A 21428)孵育;1:500)二次抗体在室温下作用1h。然后用4‘,6-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI;Sigma-Aldrich)对样品进行染色,并安装在凝胶/芒特介质(Biomeda Corporation,CA)中。所有的孵化都在黑暗潮湿的室内进行。荧光信号用共焦显微镜(LSM 510;卡尔蔡司,德国)显示,并用ZEN软件V3.1(卡尔蔡司)进行分析。

小鼠肿瘤器官实验

小肠肿瘤APCMin/+/Lgr5EGFP, APCMin/+/克拉斯G12DLA2/Lgr5EGFP,和APCMin/+/Axin 2拉兹用冰冷pbs分离和洗涤小鼠,用含10 mLY 27632(Sigma-Aldrich)和100 g/ml prmocin的0.25%胰蛋白酶收集肿瘤细胞。(Invivgen,CA)作用30 min。培养后加入B27(Sigma-Aldrich),通过100 m和40 m细胞滤器(bd生物科学)进行筛选,收集单个细胞,然后将2 5 0个细胞与25μ1的生长因子还原Matrigel混合。®每口井。凝胶固化后,每2天更新一次含10%R-海绵胶-1CM、100 g/ml EGF、100μg/ml鼻凝素的N2培养基,每10~14d以1:5的比例传代。用细胞滴度-glo法测定肿瘤器官的生长情况。®发光细胞活力测定(Promega)根据制造商的指示。用FLUOSTAR最优测定仪(BMG LabTech)进行了发光测量。

CRC患者肿瘤源培养

CRC PDTOS和PDC33分别在获得患者知情同意和延世医院机构审查委员会和Asan医疗中心批准后使用。APC/p53威汤哥APC/p53根据Drost等人的详细描述,建立了人结肠器官。31并被Diakonessen医院的伦理委员会批准。研究的书面知情同意是从患者那里获得的。在涉及人类参与者的研究中所执行的所有程序都是按照“涉及人体的生物医学研究国际伦理准则”进行的。对于PDTO,每25升生长因子就有250个细胞减少Matrigel。®(BD生物科学)混合播种,N2培养基含10%R-海绵胶-1CM,100 g/ml noggin(PeproTech,NJ),1.25mm。N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich)、10毫米烟酰胺(Sigma-Aldrich)、50 ng/ml EGF(PeproTech)和bFGF(PeproTech)、10 NM胃泌素(Sigma-Aldrich)、500 NM A83-01(Sigma-Aldrich)和3M SB 202190(Sigma-Aldrich)。为了研究5-Fu效应,排除了500 NM A83-01(Sigma-Aldrich)、3 MSB 202190(Sigma-Aldrich)等抑制剂。培养液每2天刷新一次,细胞每隔10-14天传代一次,分裂率为1:5。用细胞滴度-glo法测定肿瘤器官的生长情况。®根据制造商的指示进行发光细胞活力测定。用FLUOSTAR最优仪进行了发光测量。

肿瘤器官免疫细胞化学

用5%福尔马林固定30 min,0.2%TritonX-100渗透30 min,用含5%BSA和1%NGS的PBS预封闭1h,然后与GFP(圣克鲁斯生物技术,sc53882,1:100),β-catenin(AbCAM,ab2365,1:100),p53(Santa Cruz BioTechnology,sc-126;1:100)和WNT 3(AbCAM,英国剑桥,ab32249)共同孵育;1:100)一次抗体在4℃下过夜,然后与Alexa Fluor 488或Alex Fluor 555二次抗体在4°C下孵育1h,然后在室温下用DAPI染色10 min。细胞孵育后,装在凝胶/载体培养基(Biomeda Corporation,CA)上。用共聚焦显微镜(LSM 700)在488 nm(Alexa Fluor 488)、543 nm(Alexa Fluor 555)和405 nm(DAPI)激发波长下显示荧光信号。


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