Sars-cov-2变异体的点突变偏倚导致刺激炎症反应的能力增强。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染可引起严重肺炎，是世界范围内大流行的原因。冠状病毒，包括SARS-CoV-2，其基因组中含有RNA校对酶，导致基因突变比其他RNA病毒少。尽管如此，SARS-CoV-2变异体仍然存在，并可能引起不同的症状；然而，这些变异的因素和影响尚不清楚。我们发现SARS-CoV-2变异体的突变存在偏差，与尿嘧啶(U)的突变不成比例。这些向U点突变主要来源于胞嘧啶(C)，这与宿主RNA编辑酶APOBECs的底物特异性一致。我们还发现了与其他RNA编辑酶ADARs一致的点突变。对于C到U突变，上游尿嘧啶和下游鸟嘌呤变异位置的背景被发现是最普遍的。此外，与武汉地区分离病毒的ssRNA序列刺激相比，SARS-CoV-2变异株U的增加程度与细胞因子如肿瘤坏死因子-α和IL-6的分泌增加有关。因此，RNA编辑是SARS-CoV-2变异体变异偏向的一个因素，影响宿主炎性细胞因子的产生。

严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2)感染是目前世界范围内首次报告为一种新型肺炎的原因，于2019年12月在中国武汉。1。自武汉第一次报告以来，世界上的病毒感染没有完全趋同，sars-cov-2感染导致高发病率和高死亡率。2。在SARS-CoV-2的长期感染中，研究病毒的毒力是否发生了变化是十分重要的。

被认为起源于蝙蝠，有可能是未知的中间宿主3，sars-cov-2的核苷酸序列与引起重症肺炎的病毒sars-cov的核苷酸序列相近。4这就是2003年人类爆发的原因。SARS感染会引起一种称为细胞因子风暴的过度免疫反应，从而导致严重的肺炎。据报道，sars-cov-2患者的tf-α和IL-6的产生与症状的严重程度成正比。5细胞因子风暴是引起重症肺炎的一个因素。6,7。出乎意料的是，在严重的sars-cov-2感染患者的外周血或肺中检测到少量的Ⅰ型干扰素。8.

在病毒感染的宿主中，炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6是通过模式识别受体产生的。9。RNA病毒是通过TLR 7和TLR 8识别的。10。在RNA序列中，TLR 7和TLR 8识别病毒核苷酸序列的特异性模式。TLR 7优先识别连续U，TLR 8偏好GU序列11,12,13。因此，可以推测从病毒RNA序列中产生细胞因子的能力。

人们认为，由于基因组中存在RNA校对酶，冠状病毒比其他RNA病毒有更少的基因突变。在典型的sars-cov中，开放阅读框(Orf)1b编码的非结构蛋白14(Nsp 14)基因具有典型的rna校对酶的3‘-5’外显子酶活性。14,15。然而，根据先前的基因组分析，sars-cov-2有几个变种，分为A、B和C三种类型。16。虽然这些SARS-CoV-2变异体含有多个基因突变，但这些突变对感染的影响尚不清楚。

细胞来源的RNA编辑酶是导致包括rna病毒在内的病毒基因组点突变的一个因素。17,18,19。RNA编辑酶在靶区具有底物特异性和上下文偏好。20,21,22。RNA编辑酶如腺苷脱氨酶(ADARs)和载脂蛋白B mRNA编辑-酶、催化多肽(APOBECs)在RNA病毒感染中得到了广泛的研究。ADARS是从腺苷中提取一个氨基并将其转化为肌苷的酶，这种功能主要作用于双链rna。22。胞苷脱氨酶家族APOBECs是从胞苷中提取一个氨基并将其转化为尿嘧啶(U)的酶。20。据报道，apobecs作为底物在ssdna上发挥作用。20。此外，APOBEC 1、APOBEC3A和APOBEC3G也承认单链RNA(SsRNA)为底物。23,24,25。有趣的是，APOBEC 3参与了冠状病毒NL 63的突变。26。然而，SARS-CoV-2变异体的突变是否是由宿主RNA编辑引起的，目前尚不清楚.为此，我们研究了SARS-CoV-2突变，以确定它们是由宿主RNA编辑引起的，并评估了这些突变对宿主细胞产生细胞因子的影响。

序列数据的获取

SARS-CoV-2序列(8,845)从全球共享所有流感数据(GISAID)数据库(Https://www.gisaid.org/)。它们于2020年5月20日开始提供，收集于2020年3月23日，并注明为“完整(>29,000 BP)”、“高覆盖率”和“低覆盖率(不包括人类)”。这些序列由342个实验室提供，其清单载于补充表。沙一和S2。此外，还排除了GISAID中有以下注释的序列：(1)N>0.50%，(2)帧移位，(3)唯一突变>0.10%，(4)低覆盖率，(5)模糊收集日期。此外，具有重复名称和不匹配的序列在对齐和没有正确的收集日期被排除。这导致7804个序列进行分析。

系统发育网络分析

为了构建sars-cov-2序列的系统发育树，使用了由Next应变(github.com/nextray/ncov)发布的奥古尔管道。27,28。以武汉地区首次报道的基因组(MN 908947)为参照基因组进行比对。我们还掩盖了130个基地从开始和100个基地结束后，对齐。然后用计算出的系统发育树进行分析。利用Auspice可视化系统发生树。

序列上下文分析

“上下文”表示目标站点的上游(负数)和下游(正数)序列。这些背景来自参考基因组的未遮掩区域(MN 908947)。

我们定义了“观察比例”和“预期比例”如下，并计算了各自的数值。

“观察比例”是指特定碱基存在于突变位点的+1(或−1)位置的比例。

观察到的比例(%)=−1(或+1)位残基在突变碱基处的总数/每个突变碱基的总数×100。

“期望比例”是指特定碱基存在于A，(U，G或C)的−1(或+1)位置上的比例。

预期比例(%)=−1(或+1)残基的总数/每个碱基的总数×100。

为了分析语境的特点，我们比较了观察到的比例和预期的比例。

在图中。3E，F，我们在−3+3上设置上下文，并进行上述计算。用于计算图中观察到的和预期的比例的计数。3A-f列于补充表中。S3和S4.

用于细胞刺激的单链RNA序列

在细胞刺激实验中，从SARS-CoV-2变异体中筛选出4种不同的序列：EPI_ISL_419308、EPI_ISL_415644、EPI_ISL_418420和EPI_ISL_419846。这些突变序列分别在日本、格鲁吉亚、法国和澳大利亚检测到。在这四个变异体的ssRNA全长内，提取并合成了一个观察到U突变的区域。这些不同变异体的ssRNA序列如下：变异体1(5‘-AUUUUUUUUUUACCC-3’；EPI_ISL_419308中2946-2965个区域)，变异体2(5‘-UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU3’，EPI_ISL_415644中11,041-11,060个区域)，变型3(5‘-UUCUGUUGUUCACCCUU-3’；EPI_ISL_418420中14,392-14,411个区域)，变异体-4(5‘-AAUUUUUUUGAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU作为SARS-CoV-2突变序列的对照，参照序列MN 908947中的相同区域。每个突变体对应的参考序列如下：武汉-1(5‘-AUGUUGUUUUCUUCUUCUACCC-3’；3023-3042区)，武汉-2(5‘-UCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU-3’；11,066-11,085区)，武汉-3(5‘-UCUCUAUGUUUUUCCCACUU-3’；14,409个区域)，武汉-4(5‘-AAACCUUUUGAGAUAU-3’；22,946-22,965个区域)。以不含U(5‘-GAGAGAGAACAAG-3’)的序列为阴性对照，诱导TLR 7介导的细胞因子产生。单链RNA由日本基因研究实验室合成。公司(日本宫城县仙台)。

SsRNA对细胞的培养和刺激

人单核细胞白血病细胞系thp-1在rpmi-1640培养基中添加10%fcs、55 mm2-巯基乙醇、100 mm非必需氨基酸、1 mm丙酮酸和20 mm毫升。−1青霉素和链霉素。4×105用96孔平底板在150μl RPMI培养基中培养细胞。

我们根据严立等人的实验建立了假感染模型。29。为检测人肿瘤坏死因子(α)水平，细胞在pMA(0.2ng/ml，SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)存在下培养，用160个pmolssRNA刺激细胞(10μg，罗氏诊断学，德国曼海姆)。在50 ng/ml的PMA存在下培养细胞，用480 pmolssRNA刺激细胞(15μg)。

细胞因子检测

用OptEIA法测定培养上清液中人肿瘤坏死因子-α和IL-6的含量(BD生物科学，美国圣迭戈)。取培养上清液于18 h检测肿瘤坏死因子-α，48 h取培养上清液进行IL-6检测。

统计分析

使用Python3基包的ciply1.4.1进行了二项式测试。Mann-Whitney U测试使用Prism 8软件(GraphPad Software，San Diego，CA)进行.

SARS-CoV-2变异体的点突变

为了研究SARS-CoV-2变异体中点突变的频率，我们使用GISAID中发表的7,804个序列进行了系统发育网络分析。这些序列收集到2020年3月23日，并通过系统发育网络分析计算了5000次以上的点突变。接下来，我们分析了这些点突变的位置。1a)。虽然每150个核苷酸点突变的平均数量约为28个，但我们观察到多个位点的点突变频率较高。为了进一步分析每个基因点突变的极化程度，我们统计了每个基因的点突变数。如图所示。1B，ORF-1a和ORF-1b点突变较多。然而，如图所示。1A、开放阅读框(ORF)-1a和ORF-1b比其他区域长得多，这可能导致更多的突变；因此，我们估算了每个基因中每100个碱基的点突变率(图1)。1c)。基因长度归一化后，点突变频率最高的是5‘-非翻译区(UTR)和3’-UTR。这些结果表明，SARS-CoV-2变异体中存在点突变，但它们在基因编码区域内不存在聚类。

SARS-CoV-2基因点突变的分布。(A上面的插图表示每个基因在全长单链RNA(SsRNA)中的位置.下面的直方图显示每个位置的突变数。每条代表SARS-CoV-2变异体，分组在150个核苷酸的垃圾箱中.(B)每个基因组点突变的数目。(二)C)每个基因的点突变数除以基因长度。

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SARS-CoV-2变异体的点突变与U的突变不成比例。

接下来，我们重点研究了变异的碱基，并研究了SARS-CoV-2变异体的点突变特征。点突变后取代碱基的频率分析表明，Uracil(U)发生突变的频率大约是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)的四倍。2a)。进一步分析表明，U点突变主要来源于C(约2400个总突变)或G(约1000个总突变)，但很少来自A(约100个突变)(图1)。2b)。此外，从G到A(G-to-A)、A-to-G和U-to-C的点突变也很明显，每一次约发生500次。突变的这种偏差暗示了宿主RNA编辑的参与，因为已知APOBECs可以导致C-to-U和G-to-A突变，而ADARs则导致A-to-G和U-to-C突变。有趣的是，图中的结果。2B与已知的APOBECs和/或ADARs的底物特异性部分一致。我们进一步分析了每个基因的突变偏差，发现基因之间的突变模式是相似的。2c，D)。这些结果表明，SARS-CoV-2变异株的点突变与U有明显的偏差，突变模式与APOBECs诱导的点突变和ADARs诱导的点突变部分一致，提示RNA编辑酶参与了突变。

SARS-CoV-2变异体点突变的偏差。(A, B)SARS-CoV-2变异体的点突变数。Y轴A)表示点突变后的替代碱基，以及(的Y轴)。B)在每个点突变处显示原始碱基和取代碱基。(C)每个基因的突变模式。(D)每个基因的点突变数除以基因长度。

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Sars-cov-2变体突变点的上下文偏好

以上结果表明宿主RNA编辑机制的参与。由于“上下文偏好”支持RNA编辑机制的参与，我们设置了代表变异站点上下游序列的“上下文”，并对上下文偏好进行了分析。C-to-U和G-to-A突变与APOBECs引起的突变一致，而A-to-G和U-to-C是ADARs的特征.为了考察这两种酶的参与情况，我们选择了四种模式(C-to-U、G-to-A、A-to-G和U-to-C)，并分析了相邻于一个碱基上游(−1)和下游(+1)的上下文的细节。在C-to-U突变中，观察到的−1位U和+1位G所占比例分别显著高于预期比例(图1)。3a)。在G-to-A突变中，−1位的C和+1位的G增加.相反，U在+1位置下降(图1)。3b)。同样，在A-to-G突变的+1位置，G增加，而A降低(图1)。3c)。在U-to C突变的−1位，A增加，U减少(图1).3d)。上下文中的这些偏差表明，在每4种点突变模式中，在+1或−1位置上，特定的碱基是首选的，这表明了上下文偏好。

变异站点中上下文的详细信息。每个碱基的上下文分别显示以下突变的上游(−1)和下游(+1)，C到-U(A)。G-to-A(B)。A-to-G(C)。U-to-C(D)。左边的图形描绘了所述突变站点的上游(−1)的基，而在右侧则描绘了所述变异站点的下游(+1)的基。白条代表预期的比例(E)和黑条代表观察到的比例(O)。*p < 0.00001. (E)观察到的三个碱基的上下文比例，每个碱基分别是C-to-U突变的上游和下游。0表示突变位点，负数和阳性数分别表示上游和下游。(F)在C-to-U的情况下，观察到的比例与预期比例的比率[%]。所观察到的比例和预期比例的计算，如材料和方法所示。

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此外，我们的结果反映了APOBECs和ADAR的上下文偏好。U在−1位置的增加与APOBEC3s的参与是一致的。3a)。G到A突变位点+1处G的增加提示APOBEC3G的参与(图1)。3b)。因为APOBEC3G倾向于C在C到-U突变的−1位置，换句话说，当SARS-CoV-2被复制时，APOBEC3G会导致互补RNA上的C到U突变，从而导致G在病毒基因组中的+1位置发生Gto-A突变。A到G突变位点+1处G的增加与ADARs的上下文偏好是一致的(图1)。3c)。

在最常见的点突变，C-to-U，我们扩展上下文，这三个碱基上游(−3)和下游(+3)的突变位点(图)。3e、f)。虽然我们在观察比例中发现了高丰度的A和U(如图所示)。3(E)SARS-CoV-2基因组含有较高比例的A和U残基(A：30%，U：32%).为了排除SARS-CoV-2序列中富含AU的偏差，我们计算了观察到的比例与预期比例的比值(图1)。3f)。我们发现U更多地出现在−1和−2位置(p < 0.00001). This is consistent with the sequence specificity of APOBEC3s. In addition, G was more commonly found at position + 1 (p < 0.00001).

这些上下文偏好提供了RNA编辑机制有助于诱导点突变的证据。此外，APOBECs和ADARs是诱发SARS-CoV-2变异点突变的强候选基因.

随着U流行率的增加，SARS-CoV-2变异体诱导炎性细胞因子的产生增加。

为了检查每个RNA序列全长内U点突变的频率，我们从SARS-CoV-2变异体中选择了四个不同的序列。4a)。这四个不同的序列来自日本、格鲁吉亚、法国和澳大利亚。如图所示。4B，U点突变的频率远高于U到A、G或C的频率。以前的研究表明，富U的ssRNA通过TLR 7信号通路刺激天然免疫细胞产生炎性细胞因子。9,10。因此，我们假设点突变引起的大量U残基增强了人巨噬细胞对炎性细胞因子的诱导。为此，我们分析了人单核/巨噬细胞株THP-1在富含U区的SARS-CoV-2变异体刺激下产生的肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6。4B，方形符号)。如所料，缺乏U残基的ssRNA序列并不能促进肿瘤坏死因子-α的产生。4c)。点突变引起的U数增加，使变异体-1、3和4的细胞因子产量增加，与武汉地区的参考ssRNA序列相比，增加了细胞因子的生成。IL-6的产生低于肿瘤坏死因子-α，但我们观察到IL-6的产生也有类似的趋势。4d)。当然，我们也观察到肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的表达是通过刺激变异体-1、3和4来诱导的，与武汉地区的刺激相比。1)。这些结果表明，在SARS-CoV-2基因组中，U点突变可以刺激炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α和IL-6的产生。

点突变引起的U在基因组中所占比例的增加促进了炎症细胞因子的产生。(A4种SARS-CoV-2变异体的系统发育。距离中心的距离分别表示时间(左)和多样性(右)与祖先的距离。W表示武汉报道的SARS-CoV-2序列(MN 908947).(B)4种不同的SARS-CoV-2变异体中U或U突变的位置.向下三角形表示从V到U的突变，向上三角形表示从U到V的突变，其中V代表除U平方符号以外的所有碱基，表示用于细胞刺激的ssRNA序列。(C, D)ssRNA诱导的肿瘤坏死因子-α和IL-6的产生.用含10μgα的160个pGssRNA刺激THP-1细胞，用15μg DOTAP刺激480pGssRNA检测IL-6。观察刺激18h后肿瘤坏死因子-α的产生情况。C)，并测定刺激48h后IL-6的生成。D)。平均值为±SD(n=6)。数据代表了两个独立的实验，结果相似。*p < 0.05.

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在本研究中，我们发现SARS-CoV-2变异体中的点突变与U有显著的偏差，突变倾向和背景偏好提示两种RNA编辑酶APOBECs和ADARs作为SARS-CoV-2变异点突变的诱导剂。

此外，我们的数据表明，在SARS-CoV-2基因组中U残基的增加促进了天然免疫细胞产生炎性细胞因子。具体来说，我们发现来自SARS-CoV-2变异体的富含U的ssRNA序列上调了人单核/巨噬细胞株产生肿瘤坏死因子-α和IL-6的水平。病毒突变导致U残基增加，导致巨噬细胞产生炎性细胞因子。这被认为是激活先天免疫系统。由于天然免疫的激活增强了病毒的杀灭能力，因此SARS-CoV-2的毒性可能通过突变而减弱。此外，由于SARS-CoV-2患者检测到的I型IFN数量很少，因此我们主要研究促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α和IL-6。需要进一步的研究来研究细胞因子不成比例产生的分子机制。

在SARS-CoV-2变异体序列中，我们发现了RNA校对酶(Nsp 14)的基因编码区。Shannon等人的研究。此外，sars-cov-2变异体中nsp 14的序列与经典sars-cov中的序列非常相似，nsp 14的基序在sars-cov-2变体中是保守的。30。这表明nsp 14可能是SARS-CoV-2变异体变异率低于其他RNA病毒的原因之一。考虑到nsp 14的纠错能力降低了病毒基因组中突变的频率，SARS-CoV-2变异体中出现的突变存在偏差这一事实是惊人的。

已知几种腺嘌呤和胞嘧啶分别被自发脱氨为肌苷和尿嘧啶。然而，由于以下两个原因，我们的结果，点突变不是随机的，而是通过生化机制。一是点突变有明显的偏差。另一种情况是，首选的上下文存在于变异的站点上。

RNA编辑酶是引起定点突变的一个因素。SARS-CoV-2变异体中常检出四种突变型(C-to-U，G-to-A，A-to-G，U-to-C).有趣的是，这四种模式与APOBECs和ADARs的底物特异性一致。APOBECs诱导C-to-U和G-to-A突变.ADARS可诱导A-to-G和U-to-C突变.此外，我们还发现了突变位点周围的特定序列，这些序列与APOBECs和ADARs的上下文偏好相匹配。这些结果提示APOBECs和ADARs是诱发SARS-CoV-2变异点突变的强候选基因。DiGiorgio等人最近的研究。提示apobecs和adr参与了sars-cov-2的点突变。31通过对新冠肺炎患者支气管肺泡灌洗液RNA序列的分析。此外，根据免疫基因组计划(ImmGen)，一些apobec3s或adar在肺上皮细胞系中被sars-cov-2感染而上调。32,33.

在SARS-CoV-2变异体中，我们的结果表明APOBECs而不是ADARs对点突变的诱导作用更大。因为C-to-U突变是最常见的，而且它们的上下文偏好与APOBEC一致.作为支持性数据，与健康的肺活检相比，RNA编辑酶在SARS-CoV-2患者肺活检中有升高的趋势.特别是APOBEC3A的增长率高于ADARs。人类基因组包含几个APOBEC基因，包括APOBEC 1、APOBEC 2、AID和APOBEC3A-APOBEC3H。据报道，APOBEC3F与人类免疫缺陷病毒(HIV)-1有关。34，据报道，APOBEC3G变异了乙型肝炎病毒(HBV)。35。最近的一些研究表明，APOBECs也与RNA病毒的ssRNA相互作用。如图所示。3A，F，我们的结果表明，APOBEC3s在SARS-CoV-2变异体中，由于检测到了−1位的U和C-to-U突变位点的−2，对C-to-U突变的贡献。值得注意的是，我们还观察到SARS-CoV-2中Gto-U突变的频率很高，这不太可能是APOBECs或ADARs的作用。据报道，8-氧鸟嘌呤是引起小鼠DNA G-to-T突变的候选分子之一。36。虽然不能否认8-氧鸟嘌呤可能也参与了SARS-CoV-2的G-to-U突变，但我们没有关于SARS-CoV-2 G到U突变的进一步信息。因此，需要进一步的研究，以确定参与这一过程的其他生化机制。

对于识别RNA序列的TLRs，有报道称U水平的增加会增强TLR 7的反应性。10。与先前报道一致的是，ssRNA刺激的THP-1产生的细胞因子依赖于TLR 7(补充图)。1)。如图所示。4在我们的假感染模型中，C，D，增加的U频率增加了肿瘤坏死因子-α和IL-6的产生.我们使用7804序列的SARS-CoV-2变异体进行系统发育网络分析，结果显示U的突变频率超过2500倍，此外，如图所示。4与原分离物相比，每个SARS-CoV-2变异体的全长ssRNA中我们的数量显著增加。因此，全长突变的ssRNA诱导炎性细胞因子的能力可能大于原分离物。这些结果提示这可能是SARS-CoV-2基因突变引起炎症激活的机制之一。

我们的发现表明，SARS-CoV-2变异体在宿主对病毒的防御反应中通过RNA编辑而引起的偏向点突变。因此，由于宿主防御的选择性压力，这种病毒的进化导致免疫激活增加。