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丙戊酸抑制NK细胞产生干扰素-γ并增加对单核细胞增生李斯特菌感染

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发表时间:2020-10-21 16:29作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

丙戊酸(VPA)是一种常用的癫痫控制药物。近年来,研究发现VPA改变了多种免疫细胞的活化,包括NK细胞,这些细胞在抑制病毒和细胞内细菌中起着重要的作用。虽然VPA能增加细胞外病原菌的易感性,但其抑制作用是否影响细胞内细菌感染的过程尚不清楚。本研究旨在评价VPA在临床上的作用。单核细胞增生李斯特菌(L.M)感染,NK细胞活化是否受影响。我们发现VPA显著增加了L.M感染小鼠的死亡率。这种作用与增加脾脏、肝脏和血液中的细菌负荷有关。同时,血清IFN-γ水平下降,脾指数降低.体外分析表明,VPA处理降低了L.M感染脾细胞内产生γ的NK细胞的频率。同样,VPA能抑制IL-12和IL-18刺激NK细胞产生IFN-γ,这是李斯特菌早期产生IFN-γ的重要机制。最后,VPA可降低STAT 4、p65和p38的磷酸化,而不影响IL-12和IL-18受体的表达。总之,我们的结果表明VPA增加了对单核细胞增生李斯特菌感染并提示NK细胞是VPA的主要靶点之一,但其作用尚需进一步研究。

导言

丙戊酸(valproicacid,vpa)是一种用于控制神经系统疾病的药物,包括癫痫、双相情感障碍、焦虑危机、抑郁症、精神分裂症、创伤后应激和偏头痛。1。VPA对这些条件的影响是由于它能够提高γ-氨基丁酸(GABA)、去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺的水平,以及它阻断电压依赖性钠通道的能力。2。一些临床试验也表明,VPA可以改变表观遗传调控,并可用于控制不同类型的肿瘤。3。VPA通过发挥组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)的作用,影响DNA修复、细胞周期和凋亡相关基因的表达。4。其他研究也揭示了vpa的抗炎能力,它是通过选择性地降低不同急性或慢性加重炎症模型中细胞因子的产生来实现的。5。事实上,vpa可以抑制先天免疫细胞和适应性免疫细胞的各种功能,例如巨噬细胞。6、肥大细胞7、树突状细胞(DC)8中性粒细胞9、自然杀伤(NK)细胞10、γδT细胞11,B细胞12,细胞毒性T细胞13,和T辅助细胞14。VPA的选择性抗炎作用表明,该化合物可用于非甾体类抗炎药物(Nsa Id),对心血管有不良影响,可引起肾毒性和消化道出血。15.

NK细胞属于天然免疫系统,通过其细胞毒活性和分泌大量干扰素-γ的能力,在防御细胞内病原体和控制肿瘤中起着核心作用。16。干扰素-γ激活巨噬细胞和dc,促进mhc分子、共刺激分子、活性氧(Ros)、一氧化氮(NO)的表达,并诱导自噬,这对于抑制多种细胞内病原体的发生至关重要。17。NK细胞产生的干扰素-γ受白细胞介素-12和白细胞介素-18的严格调控,通常由吞噬细胞在感染细胞内病原体后产生。18,19.

李斯特菌病是一种食源性疾病。单核细胞增生李斯特菌(L.M),一种胞内革兰氏阳性细菌。20。早期控制L.M感染依赖于IFN-γ的产生21,22。虽然干扰素-γ是由几种细胞类型在L.M感染期间产生的,但在整个感染过程中它们是不同的。23。在这方面,先前的研究表明,在李斯特龙病早期,NK细胞是这种细胞因子的主要来源。24,25。体外研究表明,NK细胞产生IFN-γ依赖于L.M.感染的吞噬细胞释放的IL-12和IL-18。18,26。值得注意的是,以往的研究表明vpa能干扰NK细胞的活化,降低NK细胞的杀伤能力,并在体外对IL-12、IL-15和IL-18产生IFN-γ。10,27。因此,在本研究中,我们分析了VPA是否增加了小鼠体内对L.M感染的易感性,以及VPA是否改变了小鼠L.M感染模型中NK细胞在体外产生IFN-γ的作用。

结果

丙戊酸提高体内单核细胞增生李斯特菌的敏感性

VPA可以通过干扰或阻碍相关免疫细胞的激活来抑制对多种病原体的免疫应答。5。为了确定这些作用是否在小鼠李斯特菌病中观察到,BALB/c小鼠在感染L.M前15 min接种VPA。我们观察到,在感染后24和48小时,VPA处理的小鼠体重明显下降(Hpi)。p < 0.001) (Fig. 1与接受生理盐水(S.S.)的小鼠相比,L.M感染的死亡率增加(A,B)。p < 0.0001) (Fig. 1c)。此外,VPA处理的小鼠脾脏中细菌负荷增加了24和48 HPI。p < 0.01, 24 hpi; p < 0.001, 48 hpi; Fig. 2(A)、肝脏(p < 0.05, 24 hpi; p < 0.01, 48 hpi; Fig. 2(B)和血液(p < 0.05, 24 and 48 hpi; Fig. 2(C)与感染S.S.的小鼠有关。

图1
figure1

丙戊酸增加体内感染的易感性单核细胞增生李斯特菌。BALB/c小鼠在感染前15 min给予VPA(500 mg/kg)或S.S(2.5×10)治疗。5CFU L.M I.P.(A)小鼠体重(G)在24和(B)小鼠体重为48 HPI(*)p < 0.001, VPA + L.m vs s.s + L.m groups at 24 and 48 hpi). Data are expressed as adjusted means in grams (g) with 95% confidence intervals; one way-ANCOVA. (C)Kaplan-Meier小鼠在L.M感染后的存活曲线(*)p < 0.0001, VPA + L.m vs s.s + L.m groups). n = 9–14 per group.

图2
figure2

丙戊酸增加感染小鼠脾脏、肝脏和血液中的细菌负荷单核细胞增生李斯特菌。细菌负荷(A2.2.5×10感染BALB/c小鼠脾脏5经VPA(500 mg/kg)或S.S(n=11/组)处理后的CFU L.M;**p < 0.01 at 24 hpi and ***p < 0.001 at 48 hpi). (B)肝脏(每组4例;*p < 0.05 at 24 hpi and **p < 0.01 at 48 hpi) and (C)血液(n=每组4人;*p < 0.05 at 24 and 48 hpi). Data are expressed as median and range; Kruskal–Wallis.

小鼠体内细菌负荷增加可能是VPA直接促进细菌复制或改变宿主免疫应答的结果。为了区分这两种可能性,在有无VPA的BHI肉汤中培养L.M,并在不同时间用菌落形成单位(CFU)检测细菌的生长。我们观察到VPA在任何时间点都不促进细菌的生长,而是抑制细菌的生长。p < 0.001) (Fig. 3a)。接下来,我们评估了脾肿大,这是L.M感染免疫系统激活的一个指标。28,受VPA影响。我们注意到,24只经HPI VPA处理的小鼠脾脏指数比接受S.p < 0.001) (Fig. 3(B),表明VPA阻碍宿主的免疫应答。

图3
figure3

丙戊酸抑制早期脾肿大单核细胞增生李斯特菌感染。(A)L.M在含或不含52 mmVPA的BHI肉汤中培养,在不同时间用CFU法测定细菌活力(每组3例;*)p < 0.001). Data are expressed as mean ± s.e.m; two way-RM ANOVA (BBALB/c小鼠在感染前15 min给予VPA(500 mg/kg)或S.S(2.5×10)。5CFU L.M.24和48 HPI评估脾指数(n=15,每组15例;*)p < 0.001, VPA + L.m vs s.s + L.m groups at 24 h; N.S., Not Significant). Data are expressed as mean ± s.e.m; two-way ANOVA.

细胞因子在L.M感染的控制中起着至关重要的作用,特别是干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α与感染控制密切相关。23。因此,我们研究了VPA对L.M感染小鼠血清干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α水平的影响。有趣的是,我们注意到与感染S.S的小鼠相比,24和48 HPI VPA使血清中的IFN-γ水平显著降低(p < 0.001) (Fig. 4a)。然而,我们观察到VPA并不能改变L.M在24 hPI下诱导的肿瘤坏死因子-α,而是在48 hPI时引起肿瘤坏死因子-的增加。p < 0.05; Fig. 4b)。因为IL-12是L.M感染早期产生干扰素-γ的关键29,我们评估了VPA是否改变了它的生产。值得注意的是,我们观察到VPA在24或48 HPI时没有改变L.M诱导的IL-12p70(图1)。4c)。另一方面,IL-10对L.M感染的IFN-γ产生有很强的抑制作用。30我们接下来评估VPA治疗是否有利于L.M感染过程中IL-10的产生。我们注意到L.M感染不能在24或48 HPI诱导产生IL-10,而VPA在这些时间点不影响IL-10。4d)。这些发现表明vpA的细胞因子特异性作用影响了早期γ的产生,这与细菌控制不良和小鼠对L.M感染的易感性增加有关。

图4
figure4

丙戊酸降低干扰素-γ水平单核细胞增生李斯特菌体内感染。BALB/c小鼠在感染前15 min给予VPA(500 mg/kg)或S.S(2.5×10)治疗。5CFU L.M I.P.24和48 HPI细胞因子(A)干扰素-γ(*P<0.001,VPA+L.M组与S.S+L.M组比较,分别为24和48 HPI组),(B)肿瘤坏死因子-α(*P<0.0 5,VPA+L.M组对S.S+L.M组在48 hPI时),(C)IL-12p70及(D用ELISA法检测血清中IL-10水平。(n=每组11例;N.S.,无显着性)。数据以中值和范围表示;Kruskal-Wallis。

丙戊酸抑制单核细胞增生李斯特菌体外感染NK细胞产生干扰素-γ

小鼠脾脏是L.M感染的靶器官,在感染早期已发现多个脾淋巴群产生干扰素-γ。24,25。其次,我们研究了VPA对L.M诱导的脾细胞产生干扰素-γ的影响。为此,BALB/c脾细胞用2mMmVPA处理,其浓度不影响细胞活力(见图)。沙一),用0.1moiL.M感染24h后,我们发现VPA抑制了L.M感染诱导的干扰素-γ的产生,这与只受细菌刺激的脾细胞有关。p < 0.001) (Fig. 5a)。

图5
figure5

丙戊酸抑制干扰素产生γ的NK细胞单核细胞增生李斯特菌体外感染。1×106将健康BALB/c小鼠脾细胞与VPA孵育1h,以0.1:1的摩尔比与L.M共培养。A)用ELISA法检测细胞上清液中干扰素-γ水平,每组9例;*p < 0.001 VPA + L.m vs L.m groups; Untr., Untreated cells). (B用L.M感染脾细胞,用流式细胞仪对18例HPI细胞进行染色和分析。图描述了与未感染的培养相比,L.M感染后产生干扰素-γ的细胞数量增加了一倍。与NK细胞相比,该盒显示了不同免疫细胞群体间的统计学意义。(n=每组6例)。(C典型的流式细胞仪斑马图显示CD3-CD49b+IFN-γ产生NK细胞的频率.脾细胞未感染,仅用VPA处理,或在VPA存在或不存在时用L.M感染。(D)IFN-γ+NK细胞百分率。(n=每组6人;*p < 0.001 between VPA + L.m vs L.m groups; Untr., Untreated cells). Data are expressed as median and range; Kruskal–Wallis.

为了确定L.M感染后产生干扰素-γ的主要细胞群,我们首先用流式细胞术评价诱导产生干扰素-γ的细胞的最大比例的时间。我们发现,18 HPI,干扰素产生γ的细胞百分比最高(图).S2)。接下来,我们用流式细胞仪测定了在这一点上产生干扰素-γ的细胞群(图)。S3)。我们观察到在感染L.M的脾细胞中,NK、NKT、Tγδ、T CD4+、CD8+、IKDC或B细胞诱导IFN-γ生成(表)沙一).

此外,在淋巴样细胞中,NK细胞是产生干扰素-γ的主要群体。5b)。有趣的是,VPA在体外对L.M感染诱导的IFN-γ产生NK细胞有显著的杀伤作用。p < 0.001) (Fig. 5c,D)。这些结果表明,vpa对NK细胞产生IFN-γ的作用对L.M的体外感染有负面影响。.

丙戊酸降低NK细胞对IL-12和IL-18的干扰素-γ生成

IL-12和IL-18是在感染过程中产生的,在早期的干扰素-γ生产中起着至关重要的作用。31,32。在L.M的体外感染中,被感染的吞噬细胞分泌IL-12和IL-18,从而激活NK细胞产生IFN-γ。18,26。先前的研究表明,vpa能降低人和c57bl/6小鼠NK细胞单独或联合作用于IL-12、IL-15和IL-18的IFN-γ生成。10,27。因此,我们评价了白细胞介素-12和白细胞介素-18对BALB/c小鼠脾NK细胞产生干扰素-γ的影响。我们观察到,用2mmVPA处理1 h后,IL-12+IL-18刺激后,NK细胞的IFN-γ产量显著降低(p < 0.001) (Fig. 6a)。VPA可影响多个免疫细胞膜上活化受体的表达5观察VPA对NK细胞IL-12和IL-18受体表达的影响.我们注意到VPA并没有导致NK细胞上两种受体的表达显著降低(图一)。6b、c)。提示IL-12+IL-18刺激NK细胞产生IFN-γ的减少与其受体表达水平的变化无关。

图6
figure6

丙戊酸可降低IL-12和IL-18诱导的NK细胞产生IFN-γ.(A)5×104纯化脾NK细胞用vpa(2mm)孵育1h,用IL-12(20 ng/mL)加IL-18(100 ng/mL)刺激18 h,用ELISA法检测培养上清液中IFN-γ水平(每组10例;**)p < 0.001, VPA + IL-12/IL-18 vs IL-12/IL-18 groups). NK cells were treated or not with VPA for 19 h and the expression of (B)IL-12Rβ2和(C)流式细胞仪检测IL-18Ra。直方图显示IL-12R、β2和IL-18Ra在未处理或VPA处理的NK细胞中的典型表达。虚线表示同类型控件(I.C.)。图为平均荧光强度(MFI)。(n=每组6例;N.S.,无显着性;Untr.,未处理细胞)。数据表示为中位数和范围;曼恩惠特尼或克鲁斯卡尔-瓦利斯,视情况而定。

VPA抑制免疫细胞活化的第二个机制是改变免疫细胞中不同激活受体的细胞信号通路。5。在此,我们评估了IL-12和IL-18对关键细胞信号分子的激活作用。19,33被VPA抑制。经VPA处理的NK细胞磷酸化STAT 4水平较低(p < 0.01) (Fig. 7(A),-p65(p < 0.01) (Fig. 7(B)及-p38(p < 0.01) (Fig. 7(C)用IL-12和IL-18刺激.这些结果表明,VPA通过抑制IL-12R和IL-18R通路中关键细胞信号蛋白的激活,抑制NK细胞产生干扰素-γ。

图7
figure7

丙戊酸对IL-12和IL-18诱导NK细胞信号转导的影响.5×104BALB/c小鼠脾NK细胞经VPA培养1h后,用IL-12+IL-18刺激不同时间,测定小鼠脾NK细胞的磷酸化。A)STAT 4,15分钟,(B)p65在30分钟内(C)流式细胞仪检测60 min时p38。直方图显示了不同刺激条件下磷酸化STAT 4、p65和p38水平的代表性例子。与未受刺激的NK细胞相比,平均荧光强度(ΔMFI)呈倍倍变化。(n=每组7-8人;**p < 0.01 (STAT4), **p < 0.01 (p65) and **p < 0.01 (p38), VPA + IL-12/IL-18 vs IL-12/IL-18 groups; Untr., Untreated cells). Data are expressed as median and range; Kruskal–Wallis.

这些结果表明VPA通过降低IFN-γ的产生而增加L.M感染的易感性。我们的体外研究结果表明,这种效应可能是由NK细胞产生干扰素-γ所需的IL-12和IL-18信号通路受损所致。

讨论

NK细胞在肿瘤和包括细菌在内的各种病原体的天然免疫反应中起着至关重要的作用。16。有两种主要的效应功能与此相关:颗粒介导的细胞毒性,以及维持炎症的不同细胞因子和趋化因子的产生。34。特别是NK细胞衍生的干扰素-γ在调节巨噬细胞、树突状细胞和T细胞向Th1方向极化方面起着至关重要的作用,这有助于病原体的控制。35.

VPA对多种免疫细胞有调节作用,包括IL-12、IL-15和IL-18对NK细胞的活化作用。10,27,这是对病原体的早期免疫反应的关键步骤。19。在本研究中,VPA通过干扰免疫应答的关键因素,如干扰素-γ的产生,进而促进靶器官细菌载量的增加,从而影响BALB/c小鼠对L.M感染的易感性。

这一结果与vpa在其他传染病体内模型中的作用一致,如肺炎克雷伯菌白色念珠菌,吞噬细胞介导的天然免疫反应发生改变。8。有趣的是,体外感染模型已经报告了对比结果。例如,VPA治疗可使巨噬细胞复制更多的VPA。金黄色葡萄球菌大肠杆菌6,在结核分枝杆菌感染VPA抑制巨噬细胞内生长36.

虽然巨噬细胞在L.M的免疫反应中起着核心作用,但我们的研究重点是分析干扰素-γ的产生,因为这种细胞因子在早期控制感染中起着至关重要的作用。21,22VPA影响严重,γ产量下降与细菌负荷控制差有关。

有趣的是,在我们的研究中,vpa效应是细胞因子特异性的,因为γ在小鼠血清中的减少并不与调节IFN-γ产生的细胞因子的表达减少有关,例如IL-12,TNF-α和IL-10。23,30。在其他炎症模型中,对vpa的反应不同,例如,在缺血/再灌注损伤模型中,它通过增加IL-10的生成而促进抗炎环境。37降低pam3csk4诱导的毒性休克模型血清IL-12p40水平。8并能显著降低内毒素所致急性肺损伤模型支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α的水平。38。与上述结果相比较,vpa不能降低慢性化脓性脑病模型血清中TNF-α的水平。39。这些研究表明,VPA根据激活信号以一种特定的方式调节细胞因子环境。

在L.M感染过程中,已经发现了几种产生干扰素-γ的天然免疫细胞。23。在这里,我们注意到NK细胞是在体外感染L.M的脾细胞的主要产生细胞,这在C57BL/6小鼠中已经被描述过。24,25。值得注意的是,在这个体外系统中,vpa降低了产生γ的NK细胞的百分比,说明它们是L.M感染过程中的靶点。然而,必须指出的是,有几项研究表明NK细胞对L.M感染的控制是有害的。40,41,42。NK细胞只是早期产生干扰素-γ的众多细胞群中的一员,尽管这种效应在后期会减弱。42,而其他免疫细胞群体与NK细胞在感染后期维持在体内的干扰素-γ的产生方面具有同等或更重要的相关性。43,44。VPA体外作用于NK细胞的相关性有待于在体内进一步研究,以确定其在L.M感染过程中是否能影响其他γ产生细胞。

NK细胞产生干扰素-γ依赖于感染L.M的吞噬细胞产生的IL-12和IL-18信号。18,26。当IL-12和IL-18激活时,VPA能阻断NK细胞释放IFN-γ,而不影响其受体表达。这一结果与另一种HDACi曲古抑菌素A(TSA)的作用不同,后者抑制NK细胞中IL-2、IL-12、IL-15和IL-18受体的转录。27。这种差异可以通过vpa和tsa对hdac的特异性和亲和力的差异来解释。45.

由于细胞因子受体不受VPA的影响,我们评估细胞信号是否受到影响。IL-12信号通路促进STAT 4的磷酸化和二聚,而IL-18则促进NF-κB的激活和MAPK通路。19。此外,IL-12和IL-18在干扰素-γ的产生中具有协同作用,这是由于p38磷酸化,从而稳定了IFN-γ的表达。33。有趣的是,我们发现VPA降低了p65(NF-κB)、STAT 4和p38的磷酸化。据我们所知,这是第一份报告,显示STAT 4激活是以VPA为目标的。此外,最近的一项研究表明,STAT 4缺乏的小鼠对L.M感染更敏感,干扰素-γ的产量下降,细菌载量增加。46。在体内感染过程中,VPA是否改变NK细胞或其他IFN-γ产生细胞的STAT 4活化,需要进一步探讨。

以前,Alvarez等人。结果表明,VPA可抑制IL-12,IL-15 e IL-18刺激的NK细胞STAT 5磷酸化。10。STAT 5在IL-15受体的细胞信号转导中起重要作用。47。VPA如何抑制STAT激活尚不清楚。一种可能是VPA通过其HDACi活性改变由组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶和sirtuins紧密调控的恒乙酰化。有趣的是,STAT乙酰化对STAT激活和磷酸化起着至关重要的作用。48。STAT 4的活化是否受乙酰化的调控还有待进一步分析。

有报道显示hdcai对NF-κB活性有抑制作用,例如:vpa对IL-2刺激的人NK细胞NF-κB的活化有抑制作用。49降低IL-12、IL-15和IL-18刺激的NK细胞NF-κB易位;27。此外,vpa还能抑制单核细胞等其他细胞群中NF-κB的活化。50、巨噬细胞51、树突状细胞52成纤维细胞53上皮细胞54.

有趣的是,VPA对p38活化的影响是有争议的。对原始的264.7巨噬细胞的研究表明vpa降低了p38的磷酸化。55,而在其他报道中,vpa激活了小胶质细胞中的p38。56,脑内皮细胞57,以及视网膜色素上皮细胞58。这些研究表明,VPA调节p38的激活取决于细胞的谱系。

提示VPA可作为NK细胞在病理损伤中的靶点。事实上,vpa在肠道损伤、自身免疫性脑脊髓炎和急性同种异体排斥反应等不同病理模型中显示出良好的抗炎作用。14,59,60。有趣的是,NK细胞与许多炎症性疾病有关,如1型糖尿病。61银屑病62、扁平苔藓63,类风湿关节炎64牙周病65慢性阻塞性肺疾病66,动脉粥样硬化67等等。与上述炎症状态相关的主要病理机制是NK细胞产生的干扰素-γ的加剧。还需要进一步的研究,以确定VPA是否可以作为靶向NK细胞活化和治疗这些疾病的治疗药物。

尽管vpa作为一种抗炎药物的潜在治疗用途很有吸引力,但也需要考虑到vpa治疗可以增加患者对L.M或其他感染性药物(如机会性细胞外病原体)的易感性。肺炎克雷伯菌白色念珠菌8.据我们所知,VPA治疗与感染发病率增加之间的关系尚未得到描述,但仍需进一步研究,特别是在易感染L.M的患者中,如婴儿、老年人、孕妇、免疫功能低下的受试者、糖尿病患者、癌症患者、自身免疫性疾病患者和酗酒者。68.

总之,我们的研究表明VPA增加了对单核细胞增生李斯特菌通过降低干扰素-γ的产生而引起的感染。此外,我们的体外研究结果表明,这一效应部分可能是由于NK细胞在L.M感染期间产生干扰素-γ所需的IL-12和IL-18信号通路受损所致。8).

图8
figure8

丙戊酸增加体内易感性单核细胞增生李斯特菌通过抑制IFN-γ的产生和抑制NK细胞的体外活化而感染。在L.M感染(左上面板)情况下,VPA降低NK细胞对吞噬细胞产生的IL-12和IL-18产生的干扰素-γ。在不影响IL-12和IL-18受体表达的情况下,VPA抑制STAT 4、p38和p65的激活,这些都是IL-12和IL-18受体信号通路下游的关键蛋白(左下角)。体内总体作用是降低感染小鼠的IFN-γ水平,促进脾、肝、血细菌载量的增加,降低对L.M感染的抵抗力。值得注意的是,VPA的作用是细胞因子特异性的,因为只有IFN-γ的表达,而不是IL-10,IL-12或肿瘤坏死因子-α的表达减少(右面板)。这个数字是由BioRender.com创建的。

方法

小鼠

5~6周龄雌性BALB/c小鼠,体重18~19 g,由UPEAL,UAM,墨西哥。所有动物都被安置在标准条件下,并能获得水和食物。所有的实验都得到了ENCB,IPN研究伦理委员会的审查和批准。(动物园-017-2019)根据墨西哥的规定。

伦理认可

所有方法都是按照墨西哥有关准则和条例进行的。所有动物程序都得到了国家环境局研究伦理委员会的审查和批准(动物园-017-2019)。

单核细胞增生李斯特菌

L.M菌株1778+H1b(ATCC 43249,美国马纳萨斯,VA,美国)在脑心输注液(BHI,BD-Difco,美国)中培养18h,在37°C持续摇动。培养物用HANKS(生命技术,美国)和细菌颗粒重新悬浮在RPMI-1640 GlutaMAX(生命技术,美国)中,添加40%的胎儿牛血清(生命技术,美国),在−70°C冷冻直到使用。在37℃培养18~24h的BHI琼脂平板中进行连续稀释和接种,测定细菌活力。

体内感染

所有小鼠随机分为:(1)生理盐水组,给予无菌生理盐水(S.S)(比萨,墨西哥);(2)VPA组,给予丙戊酸(VPA)(Depakene;Abbott,美国)500 mg/kg;(3)L.M组,给予S.S。15分钟后感染2.5×105(4)VPA+L.M组,动物用VPA治疗,15 min后感染L.M。.腹腔注射VPA、S.S、L.M。以盲肠穿刺结扎所致脓毒症小鼠模型为基础,选择VPA的给药剂量和给药时间。69的感染模型肺炎克雷伯菌白色念珠菌8.

每24h检测一次体重、小鼠存活率、细菌负荷、脾指数和血清细胞因子,感染后144 h终止存活曲线。据报道,存活率是按百分比计算的。体重下降20%以上的小鼠被安乐死,以避免不必要的痛苦。

将L.M组和L.M+VPA组进行安乐死,打开腹腔和胸腔,测定细菌载量。心脏穿刺取血10 0μL,用9 0μL无菌水稀释5 min。取脾取肝,机械解离,加入无菌水5mL。细胞悬液均质,在S.S.中制备十进系列稀释液。每批稀释液20μL在37℃BHI琼脂平板中培养18~24h,培养后测定L.M的存活数。数据以CFU/器官或CFU/100μL表示。

测定小鼠24、48h体重,计算脾脏指数,安乐死后取脾进行称重。脾指数=[脾重(G)/小鼠重(G)]×100。

为定量检测小鼠血清细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-12p70和IL-10),每组均经颌下腺静脉采血4 0 0μL。用分离凝胶(BD微保持器,美国)在毛细管中采集血液,离心获得血清。细胞因子按制造商的指示用ELISA(美国Biolegend)测定。

细菌生长曲线

L.M在BHI肉汤中隔夜培养。将培养物的20L加入BHI汤或BHI肉汤加52 mm VPA的试管中,37℃恒温培养。在BHI琼脂平板上连续稀释接种0、3、18和24h后,测定细菌活力,37°C孵育18~24h。

活力测定

1×106用不同浓度(1、2、5、10 mm)的VPA处理健康BALB/c脾细胞24h,用1μg/mL AnnexinV(美国生物图谱)和0.5μg/mL碘丙酸丙啶(EBioscience)对细胞进行洗涤和染色。染色后用流式细胞仪检测细胞活力。

离体感染和干扰素-γ生产

1×106将健康BALB/c小鼠脾细胞与2mMVPA预孵育1h,感染倍数(MOI)为0.1。培养24h后,收集培养上清液,用ELISA法检测IFN-γ的产生.

为了用流式细胞术评估产生干扰素-γ的细胞群体,我们遵循了以前报道过的方案。24。脾细胞经L.M感染18h,在培养的最后4h,加入蛋白转运抑制剂Breceldin A(美国Biolegend)。然后,用抗CD 16/32阻断剂对细胞进行清洗和阻断(小鼠BD FC阻滞,克隆:2.4G2)。BD-Bioscients(美国),用抗CD3(克隆:145-2C11)、CD4(克隆:GK1.5)、CD8(克隆:53-6.7)、CD49b(克隆:DX5)、TCRγδ(克隆:GL3)、B 220(克隆:Ra3-6b2)的混合物染色,全部来自美国Biolegend;CD11b(克隆:HL3,BD-生物科学,美国)。细胞固定,渗透。抗IFN-γ染色(克隆;XMG 1.2)。采用流式细胞仪进行分析。

NK细胞分离

用NK细胞阴性选择分离试剂盒(Militenyi Biotec,USA)从健康BALB/c小鼠的脾脏中获得NK细胞。经CD3(克隆:145-2C11)和CD49b(克隆:DX5)染色后,流式细胞仪检测≥的富集率为90%。

NK细胞产生干扰素-γ

5X104NK细胞在2mM VPA存在或不存在的情况下培养1h,然后加入20 ng/mL重组IL-12p70(美国PeproTech)和100 ng/mL小鼠重组IL-18(美国研发系统)。培养18h后,取培养上清液,用ELISA法检测IFN-γ.

NK细胞IL-12和IL-18受体的表达

用VPA处理NK细胞19 h,流式细胞仪检测IL-12和IL-18受体的表达,用抗IL-12Rβ2的生物素化抗体(克隆:REA 200;美国Militenyi Biotec)或抗IL-18Rα(REA 947;Militenyi Biotec,美国)检测IL-12和IL-18受体的表达,用链霉亲和素-APC(BD-Bioscience,美国)染色,然后用抗CD 16/32进行阻断。

NK细胞中STAT 4、p65(NF-κB)和p38磷酸化

NK细胞在VPA存在或不存在的情况下培养1h,用IL-12p70加IL-18刺激15 min,分别测定p-STAT 4,30 min,p-p65和60 min的p-p38。然后用固定缓冲液(BD-Bioscience,USA)保存细胞,用0.5×PERM缓冲液(BD-Bioscience,USA)进行渗透。细胞经抗CD 16/32阻断后,分别用P-STAT 4(克隆:38/p-STAT 4)、p-p65(克隆:K10-895.12.50)或p-p38(克隆:36/p38)的抗体染色。所有抗体均来自美国BD-生物科学。

流式细胞术

用流式细胞仪软件FACSCalibur(BD生物科学)检测细胞表面标记物、细胞内干扰素-γ和胞内磷酸化蛋白的荧光标记抗体,并对其进行分析。

统计分析

所有的统计分析都是用SigmaPlot软件版本14.0进行的,该软件版本来自美国圣何塞加州的系统软件公司。Www.systatsoftware.com。通过Lilliefors校正,用Kolmogorov-Smirnov评估数据正常度。数据显示为平均±标准误差均值(S.E.M)或中位数和范围或调整均值,其置信区间为95%(视情况而定)。两组比较采用Mann-Whitney秩和检验和Yates校正.对两组或多组进行比较,采用Kruskal-Wallis检验。采用方差分析(ANOVA)和学生-Newman-Keuls(SNK)方法对两个或多个具有两个因素的组进行比较。为比较两种或两种以上因素和重复测量方法,采用双向重复测量-方差分析(RM-ANOVA)和SNK后自评量表(SNK-ANOVA)。一种方法-协方差分析(ANCOVA)用于评估动物体重的变化。生存采用Kaplan-Meier法,对数秩和检验差异。A值P<0.05,差异有显着性(P<0.05)。


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