血清CCL-18和IL-23水平与慢性阻塞性肺疾病进展的关系

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以持续气流受限为特征的疾病。在个体遗传易感性因子的前提下，各种毒性刺激对气道和肺的慢性炎症反应将逐渐引起小气道疾病(阻塞性支气管炎)和肺实质破坏(肺气肿)。1。对50,991人进行的中国肺健康研究(CPHS)调查显示，20岁及以上人群中COPD患病率为8.6%，40岁以上者高达13.7%。据估计，中国的慢性阻塞性肺病患者人数接近10亿。2。肺炎症、氧化应激、蛋白酶和抗蛋白酶失衡在COPD发病机制中起重要作用。3。炎症细胞、上皮细胞和其他结构细胞释放多种炎症介质，吸引循环炎性细胞，放大炎症过程，并诱导肺组织结构改变。4,5。研究表明，慢性气道炎症涉及多种细胞因子，导致粘液分泌增多，小气道阻塞，肺实质受损，导致气流受限，肺膨胀过大。3,4,5,6.

趋化因子(C-C motif)配体18(CCL 18)是由69个氨基酸组成的多肽，分子量为7.85KDa，是一种分泌蛋白，属于趋化因子β(ChemokineCC)家族。4。据报道，CCL 18在肺、淋巴结、胎盘、骨髓和树突状细胞中都有高表达，是一种趋化因子，能吸引淋巴细胞，而不是单核细胞或粒细胞。7。CCL 18的增加与慢性气道炎症、过敏性肺炎和肺间质纤维化有关。8。白细胞介素23(IL-23)细胞因子是由p19和p40两个亚基组成的异二聚体细胞因子，是T辅助细胞17(Th17)细胞的诱导剂，也是IL-23/IL-17免疫途径的组成部分。7。研究表明，IL-23可诱导幼稚的CD4。+T细胞分化为高致病性Th17/Thil-17细胞，后者产生一些炎症介质和细胞因子，如IL-6、IL-17和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，参与了多种疾病的发病过程。7,8,9,10,11。研究表明，体内IL-23升高可能引发瀑布状级联，导致气道黏液腺增生，粘液分泌过多，肺泡壁破坏和纤维化，气道结构重建。7,10,11。本研究旨在分析慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血清CCL 18和IL-23浓度的变化，探讨CCL 18和IL-23浓度与COPD临床指标的关系。

慢性阻塞性肺疾病患者血清CCl-18和IL-23水平高于正常人，血清CCl-18和IL-23的升高与COPD的临床分期有关。

慢性阻塞性肺疾病患者血清ccl-18浓度较高(209.86)。±62.64Ng/mL(122.53±40.76ng/mL)；t=11.732，p < 0.001) (Supp. Table 1)(图1.1a)。慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者CCL-18浓度(277.20)±35.76与稳定期的慢性阻塞性肺疾病患者(194.49)相比，NG/mL明显增加。±57.12吴荣奎/毫升)(t=−8.438，p < 0.001) (Supp. Table 1)(图1.1b)。慢性阻塞性肺疾病患者血清IL-23浓度(659.89)±112.8NG/L高于健康人(498.07)。±82.02Ng/L)(t=12.208，p < 0.001) (Supp. Table 2)(图1.1c)。729.01例急性脑卒中患者血清IL-23水平的研究±102.31与稳定期的慢性阻塞性肺疾病患者(643.74)相比，NG/L明显增加。±108.53Ng/L)(t=−3.416，p=0.001)(补充数。表2)(图1.1d)。

高血清ccl-18水平与COPD患者金分级高、MMRC评分高、临床病史长呈正相关。

金3-4型慢性阻塞性肺疾病患者血清ccl-18浓度较高(221.36)。±40.51NG/mL)，MMRC评分为4分(242.11)±40.85(NG/mL)和较长的临床病史(241.91±40.63(ng/mL)高于金1-2(161.05)。±57.48吴荣奎/毫升)(t=−5.896，p < 0.001) (Supp. Table 1)(图1.2(A)，mrc评分为2-3(190.05)±65.62吴荣奎/毫升)(t=−5.198，p < 0.001) (Supp. Table 1)(图1.2(B)及较短的病史(190.90)±65.80吴荣奎/毫升)(t=−5.093，p < 0.001) (Supp. Table 1)(图1.2c)。

血清IL-23水平与COPD患者金分级、MMRC评分及临床病史呈正相关。

金3-4型慢性阻塞性肺疾病患者血清IL-23浓度较高(689.05)。±107.16(NG/L)，MRC得分为4分(701.38分)±97.29与较长的临床病史(724.76)±120.12吴氏/升)较黄金1-2(586.78)为高±116.56Ng/L)(t=−4.832，p < 0.001) (Supp. Table 2)(图1.2D)，mrc评分为2-3(633.47)±117.79Ng/L)(t=−3.651，p < 0.001) (Supp. Table 2)(图1.2(E)和较短的病史(626.98)±114.56Ng/L)(t=−5.128，p < 0.001) (Supp. Table 2)(图1.2f)。

慢性阻塞性肺疾病患者血清ccl-18和IL-23浓度呈正相关。

Pearson相关分析表明，慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血清CCL-18和IL-23水平呈显著正相关(P<0.01)。r=0.78，p < 0.001; F价值诺瓦=172.077，p < 0.001) (Supp. Table 3)(补编。图形1A、B)。回归系数经检验，相关系数为0.78(t=13.118，p < 0.001; 95% CI = 0.379 to 0.514). The linear regression equation was ^Y=-84.706 + 0.698X(苏普)表3).

慢性阻塞性肺疾病患者血清CCL-18浓度与FEV 1/FVC和FEV 1%呈负相关。

Pearson相关结果表明，血清CCL-18浓度与1秒用力呼气量(FEV 1)/用力肺活量(FVC)呈负相关(P<0.05)。r=−0.483，p < 0.001; F价值诺瓦=27.113，p < 0.001; t值=−0.508，p < 0.001; 95% CI = − 0.002 to − 0.001) (Supp. Table 3)(补编。图形1C)和FEV 1%的预测(r=−0.502，p < 0.001; F价值诺瓦=29.972，p < 0.001; t值=−5.465，p < 0.001; 95% CI = − 0.002 to − 0.001) (Supp. Table 3)(补编。图形1(D)COPD患者。线性回归方程^Y = 0.718–0.001X和^Y = 0.698–0.001X(苏普)表3).

血清IL-23浓度与COPD患者FEV 1/FVC及FEV 1%呈负相关

Pearson相关结果表明，血清IL-23浓度与FEV 1/FVC值呈负相关(P<0.01)。r=−0.421，p < 0.001; F价值诺瓦=19.129，P < 0.001; t值=−4.374，p < 0.001; 95% CI = − 0.001 to − 0.0001) (Supp. Table 3)(补编。图形1E)和FEV 1%的预测(r=−0.536，P < 0.001; F价值诺瓦=26.23，p < 0.001; t值=−5.121，p < 0.001; 95% CI = − 0.001 to − 0.0001) (Supp. Table 3)(补编。图形1(F)COPD患者。线性回归方程^Y = 0.834–0.001X和^Y = 1.048–0.001X(苏普)表3).

血清CCL-18和IL-23鉴别COPD与健康人的敏感性和特异性

ROC分析表明，血清CCL-18浓度为168.3 ng/mL可作为判断慢性阻塞性肺疾病与健康人的临界值(SUPP)。表4)，灵敏度为72.57%(95%CI 63.4~80.5)，特异性为92.50%(95%CI 84.4~97.2)(ROC曲线下面积(AUC)=0.870)。Z=14.652，p < 0.0001) (Fig. 3A)(补编。图形2a)。血清IL-23浓度为563.3 ng/L.表4)被发现是区分COPD和健康人的一个临界值(SUPP)。表4其敏感性和特异性分别为76.92%(95%CI 66.9~85.1)和77.50%(95%CI 66.8~86.1)(AUC=0.799)。Z=8.671，p < 0.001) (Fig. 3B)(补编。图形2b)。与CCL-18和IL-23比较，两者对COPD诊断的敏感性和特异性无显着性差异(区域间差异=0.0393)。Z=1.341，p=0.1799)(图1。3(补充)图形2c)。

慢性阻塞性肺疾病患者血清CCL-18和IL-23浓度与临床参数的Logistic回归分析

Logistic回归结果显示，回归方程中最终包含的变量为黄金等级(p=0.006，OR=2.764，95%CI=1.334~5.728)和临床病史(p=0.008，OR=7.358，95%CI=0.784~70.971)，提示这两个因素对血清CCL-18浓度的影响较大(Logistic回归方程: P=1/[1+e]−(−4.193+1.017 GOLD级+2.009病史)](补编。表5)。此外，黄金等级(p < 0.001, OR = 4.215, 95% CI = 2.052 to 8.656) seemed to directly affect the serum concentrations of IL-23 (Logistic回归方程：：P=1/[1+e]−(−2.153+1.439 GOLD级)](补编。表6).

人们普遍认为COPD的特点是气道、肺实质和肺血管的慢性炎症。肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞(尤其是CD)和中性粒细胞在肺不同部位增加。3,12,13。研究发现，各种炎症介质和细胞因子的激活贯穿于整个慢性炎症过程，包括白三烯B4(LTB 4)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。3,9,12,13,14,15。本研究检测了COPD患者血清CCL 18和IL-23浓度的变化，发现COPD患者血清CCL-18和IL-23浓度高于健康人，说明这两种蛋白与COPD的发生和发展有关。此外，我们发现他们在AECOPD中的浓度显著高于稳定期COPD，这表明他们能够对COPD的疾病进展迅速作出反应。研究表明，ccl-18能诱导炎症细胞聚集，参与多种炎症信号通路的激活，从而参与炎症的扩大和慢性化。16,17,18。据报道，IL-23是Th17细胞增殖和稳定的重要伴侣之一，它能促进IL-17A、IL-17F、IL-22的产生，从而参与炎症性疾病的发展。10,11。IL-23通过IL-23/IL-17途径介导肺炎症和肺气肿的形成。19。红霉素减轻慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者气道炎症的潜在机制可能与抑制IL-17/IL-23介导的信号通路有关。20.

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的严重程度(金分级)是建立在FEV 1/FVC和FEV 1%两项临床指标基础上的，这两项指标是评价气流受限的敏感指标。21,22。金推荐MMRC呼吸困难量表作为评估呼吸功能的工具。23。研究发现，慢性阻塞性肺疾病患者血清CCL-18和IL-23水平与COPD患者的金分级和MMRC评分呈正相关，提示CCL-18和IL-23水平的升高与COPD病情的恶化有关。持续高水平的ccl-18可上调TNF-α、INF-γ、基质金属蛋白酶-2和MMP-9的表达，从而加重肺部炎症反应。24。慢性阻塞性肺疾病患者ccl-18升高与FEV 1下降的比例及未来急性加重的风险显著相关。17,18。有趣的是，我们发现慢性阻塞性肺病患者血清CCL-18和IL-23浓度呈线性正相关，提示它们可能在COPD的进展中发挥协同作用。我们还发现，COPD患者血清CCL-18和IL-23浓度与FEV 1/FVC和FEV 1%呈负相关，提示CCL-18和IL-23介导的炎症反应与COPD患者肺功能损害程度密切相关。先前的一项研究表明，ccl-18在肺中高表达，对淋巴细胞有趋化作用，但也被证明能刺激肺成纤维细胞中纤维蛋白原的活性和胶原的产生。18。COPD患者呼吸气流受限与气道粘液分泌增加有关，过多粘液分泌与FEV 1降低有关。IL-23能刺激支气管上皮杯状细胞和粘膜下腺体分泌粘液。9,10,11，这被证明是由弹性蛋白酶诱导的肺部炎症和由IL-23/IL-17通路介导的肺气肿形成所致。7,8,9,10,11,19.

ROC曲线分析表明，CCL-18(敏感性为72.57%，特异性为92.50%)和IL-23(敏感性为76.92%，特异性为77.50%)可用于COPD与健康人的鉴别。这个Logistic回归分析表明，金分级(OR=2.764)和临床病史(OR=7.358)是CCL-18浓度升高的主要原因，金分级(OR=4.215)影响血清IL-23浓度。提示CCL-18和IL-23参与COPD的炎症过程，与不可逆气道炎症和气流受限有关，可作为COPD疾病评估和疗效评价的炎症标志物。我们推测，正反馈监管可能会出现恶性循环。慢性阻塞性肺疾病的恶化促进了促炎因子ccl-18和IL-23在体内的释放，导致巨噬细胞和中性粒细胞在肺内的积聚，进一步加重了COPD气道的慢性炎症，反之亦然。7,11,16,17,18,19。我们的发现将为进一步解释COPD的病因和发病机制提供一些参考。

本研究的不足之处可能有以下几点。纳入研究的这些患者可能并不能反映不同地理条件和种族的特点。本研究只是一项非干预的观察性研究，没有对COPD患者在任何治疗后CCL-18和IL-23的变化进行测试。本研究未重点研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者CCL-18和IL-23变化的分子机制.本研究的研究对象主要是稳定期COPD，AECOPD只是其中的一小部分。如果将“稳定的COPD”和“AECOPD”作为两个单独的组，这项研究会更加有力。在今后的研究中，应注意以上问题。结论提示CCL-18和IL-23参与COPD的发生和发展，对判断病情严重程度和判断患者预后具有一定的临床价值。它们有望成为COPD的生物标志物，干预措施有望成为COPD治疗的新靶点。

COPD患者血清CCL-18和IL-23浓度高于正常人，AECOPD患者血清CCL-18和IL-23浓度高于稳定期患者。CCL-18和IL-23的升高与COPD患者的金分级、MMRC评分呈正相关，与FEV 1/FVC和FEV 1%的预测值呈负相关。血清CCL-18和IL-23的检测有助于COPD的诊断和评价，其浓度受金分级的影响最大。

道德声明

这项研究是一项回顾性观察性研究，不涉及任何形式的治疗干预。从参与研究的所有患者中获得书面知情同意。这项研究得到了研究所研究伦理委员会(济宁第一人民医院、张掖第二人民医院、中国民勤民勤县人民医院、中国兰州甘肃省医院、西安医科大学第一附属医院)伦理委员会的批准。我们确认所有的方法都是按照相关的准则和条例进行的。

病人

2018年1月至2019年12月，5家医院(济宁第一人民医院；张掖第二人民医院，中国张掖；民勤县人民医院，中国民勤；甘肃省医院，兰州；西安医科大学第一附属医院，中国西安)的113名COPD患者和80名健康对照者参加了本次观察研究。根据患者和健康对照者对每一家医院的访问时间，确定患者和健康对照者的登记顺序。稳定期COPD组92例，AECOPD组21例，其中男性61例，女性52例，平均年龄(68.85±12.4)岁。健康体检者80例，男35例，女45例，平均年龄(69.43±11.7)岁。两组在性别、年龄、吸烟等人口学特征上无显着性差异(p>0.05)(表1).

肺功能试验

所有稳定期COPD患者和健康对照者在采集血样前均接受肺功能检查。AECOPD患者由于病情严重，不能配合这项检查，不需要强制性检查(需要以前的肺功能检查报告来确认COPD的诊断)。用肺功能测定仪测定肺功能，记录1秒用力呼气量(FEV 1)/用力肺活量(FVC)和FEV 1%预测值。在不同时间进行三次测试，取平均值进行统计分析。25.

慢性阻塞性肺疾病的诊断与临床分期

严格按照全球慢性阻塞性肺疾病倡议(GOLD)诊断COPD患者21,25：FEV 1/FVC小于70%，FEV 1<80%(抗痉挛药物后严格预测FEV 1)和已知特殊病理的气流阻塞性疾病，如囊性纤维化、闭塞性支气管炎等，均需排除。22。AECOPD是指咳嗽、气短、喘息、化脓或粘液痰量增加、发热等症状恶化；稳定期COPD是指上述症状稳定或相对较轻。22,25。所有健康对照者均接受肺功能检查，排除COPD。

COPD严重程度的金分级

稳定期COPD患者的严重程度是根据金标准的肺功能测试结果来确定的。22。金-1：FEV 1/FVC<70%，FEV 1≥80%预测，金-2：FEV 1/FVC<70%和50%≤FEV 1<80%预测，GOLD-3：FEV 1/FVC<70%和30%≤FEV 1<50%预测，金-4：FEV 1/FVC<70%和FEV 1<30%预测。

COPD患者的纳入和排除标准

纳入标准如下：(1)符合慢性阻塞性肺疾病诊断标准。22,25(2)在3天内有肺功能测试报告(AECOPD患者未提出此要求)；(3)COPD稳定期超过2周；(4)在过去1个月内未使用氧、抗生素、糖皮质激素和茶碱治疗。排除标准如下：(1)上个月使用免疫抑制剂；(2)支气管扩张、肺结核、肺囊性纤维化和肿瘤等其他限制气流的疾病；(3)严重心脏、脑、肝、肾、造血、内分泌系统和皮肤病；(4)精神疾病、精神障碍和认知障碍；(5)除AECOPD外，稳定期COPD患者不得有呼吸道感染，(6)呼吸系统以外的传染病。

试样制备

清晨空腹取静脉血5mL，无抗凝血，保存于离心管内，室温凝固。将凝固后的血液进行平衡离心(3000 rpm，5~10 min)，获得上清液。上清液从离心管中小心吸出，放入新的EP管中，保存在−20°C冰箱中。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

采用夹心ELISA法测定血清中CCL-18(中国上海金马生物技术有限公司)和IL-23(北京方辰生物技术有限公司)的浓度。将纯化的CCL-18和IL-23抗体包裹在微滴板上制成固相抗体.以单克隆抗体包被的微波细胞为模板，与HRP标记的CCL-18和IL-23抗体结合，形成抗体-抗原-酶标记抗体复合物。彻底清洗后，用底物TMB显色。在HRP酶的催化下，TMB转化为蓝色，在酸性作用下转化为最终的黄色。在波长450 nm的微板阅读器上测定吸光度(OD值)，用标准曲线计算样品中CCL-18和IL-23的浓度。群内变异分析：同一样本在同一微板上检测3次；组间变异分析：同一样本在不同时间重复检测三次；数据分析表明，同一样本不影响检测结果。

改良英国医学研究委员会(MMRC)评分

采用改良英国医学研究委员会(MMRC)量表评定患者呼吸困难。23。0年级的时候，我只有剧烈的运动才会气喘吁吁；1年级的时候，我在平地或小山上走的时候会气短；2年级，在平地上，由于呼吸困难，我比同龄的人走得慢，或者当我以自己的步调在水平上行走时，我不得不停下来呼吸；3年级，我走了大约100码或在平地上走了几分钟后，我停下来呼吸；4年级，我太屏气而不能离开房子，或者我穿衣服时呼吸很慢。

数据统计

运用的统计思想如下：(1)统计分析软件采用SPSS20.0；(2)测量数据用均值±标准差表示。M±SD)，并对两种抽样方法的比较进行了分析。t(3)在分析之前，利文方差相等检验数据进行检验；学生t检验用未知总体标准差σ分析正态分布数据，用t分布理论推断差异概率；将t检验结果进行均匀方差检验，校正t检验结果为不均匀方差；(4)用百分比表示计数数据，用卡方检验对两个样本率进行比较；皮尔逊相关检验(6)用接收机工作特性曲线(ROC)分析观测值的临界值、灵敏度和特异性；根据“诊断准确性标准(Stard)倡议指南”将ROC曲线分析应用于我们的研究设计中。26；和(7)P < 0.05 was considered statistically significant.