重要的内膜蛋白YejM是一种金属酶

最近反复爆发的革兰氏阴性菌表明，迫切需要针对必需的细菌机制来对抗抗生素耐药性的增加。致病性革兰氏阴性菌已经开发了几种策略，以保护自己免受宿主的免疫反应和抗生素。其中一种策略是改造外膜，其中涉及多个基因。叶杰姆被发现是一种必需的基因大肠杆菌和[医]斑疹伤寒菌通过改变外膜的通透性，对它们的毒力起着至关重要的作用。内膜蛋白YejM及其胞质结构域如何改变膜性质尚不清楚。尽管两个YejM同系物的细胞质结构域与芳基硫酸盐酶等水解酶有着巨大的结构相似性，但以前还没有关于YejM酶活性的报道。我们的研究揭示了一个完整的活性位点与结合金属离子在YejM周质结构域。此外，我们还发现YejM具有一种磷酸酶活性，它依赖于镁离子的存在，并与其调节外膜性质的功能有关。了解YejM参与外膜重塑的分子机制将有助于在对抗抗生素耐药性增加的斗争中找到新的药物靶点。

滥用抗生素已导致出现抗药性细菌的危机。世界卫生组织支持更广泛的科学界的声明，即世界上正在耗尽有效的抗生素。1。靶向抗生素耐药的特定机制对革兰氏阴性细菌尤其重要，例如大肠杆菌 (大肠杆菌)和鼠伤寒沙门氏菌 ([医]斑疹伤寒菌)因为影响社会的反复爆发2,3,4.

致病菌，如大肠杆菌和[医]斑疹伤寒菌已经开发了几种策略来保护自己免受宿主的免疫反应和抗生素的影响。这些机制产生了抗生素耐药性，使革兰氏阴性细菌得以存活和复制。5,6,7。细菌细胞膜作为屏障，防止抗生素和其他有害化学物质扩散到细胞中，对限制抗生素的有效性起着至关重要的作用。8, 9。了解在细菌细胞膜界面作用的蛋白质和酶的功能作用，对于解决抗生素耐药性和解决细菌爆发的影响至关重要。

革兰氏阴性菌的细胞膜由内膜(IM)和外膜(OM)组成，细胞质间隙中含有一层薄薄的肽聚糖。9。OM是一种不对称的脂双层，内小叶由磷脂组成，外叶由脂多糖(LPS)构成。脂A(内毒素)是内毒素的组成部分，也是内毒素休克的关键毒力因子。10。与LPS连接的O-抗原多糖具有高度的抗原性，具有明显的灵活性和结构多样性。11。革兰氏阴性菌生存或躲避宿主免疫系统的一种策略是修饰脂类脂多糖(LPS)。这是由各种内膜酶，如磷酸乙醇胺(PEA)转移酶，即EPTA和动员大肠杆菌素耐药(Mcr)家族属于碱性磷酸酶超家族。12,13,14。它们介导脂质A与PEA的修饰，导致OM对阳离子抗菌肽(CAMP)的抗药性和对Toll样受体4的亲和力降低。7, 12。另一种重构OM的策略是增加心磷脂的结合，这是细胞质膜的一个重要组成部分，在孢子形成和细胞分裂过程中与细菌蛋白结合。15, 16。心磷脂在内膜(IM)合成，而心磷脂在沙门氏菌对OM的控制是由双组分Phopq系统完成的。17。当细菌受到压力时，如温度升高(≥42°C)，OM中的心磷脂含量增加。18，增加渗透压19，处于静止状态20，以及在发病过程中遇到宿主免疫应答。5.

必需基因叶杰姆发现于大肠杆菌和[医]斑疹伤寒菌21, 22。同系物[医]斑疹伤寒菌被称为PbgA(PhoPQ-屏障基因A)，并建议在增加OM中的心磷脂水平方面发挥关键作用22. 叶杰姆编码的内膜蛋白与五个预测的螺旋跨膜结构域(5TM)，其次是一个正电荷精氨酸丰富(RR)连接区和一个C端周质结构域(Pd)(图一)。1a)。根据其序列，YejMPD在功能上被预测为硫酸盐酶，是OM修饰和免疫应答的基础。缺乏pd的突变体是可行的，而5tm结构域的缺失对革兰阴性菌是致命的。21, 22。重要的是，大肠杆菌缺乏YejMPD的lh530菌株对温度和万古霉素等抗生素的敏感性增强。21。然而，大肠杆菌缺乏YejM的菌株通过过度表达非活性或活性形式的磷酸肽酶(ACPT)而获救。21，在脂代谢中起次要作用。大肠杆菌K-1223, 24。YejMPD也是毒力的关键。[医]斑疹伤寒菌缺乏YejMPD的菌株在OM中不增加心磷脂含量，在高辛烷值激活环境下增加了通透性，不能在宿主细胞内存活。22。最近，YejM已经被证明参与了其他的膜内平衡途径。最近的一些文献和晶体结构表明，YejM通过防止LpxC过度降解来调节LPS的生物合成，LpxC是该途径中的关键酶。25,26,27,28,29，而YejMPD的缺失导致IM中脂A核心分子的增加25。Lpxc是一种锌依赖的金属酰胺酶，在LPS生物合成中执行第一步。30，并不断被FtsH蛋白酶降解。31。YejM通过与另一种蛋白YciM(又称LapB)相互作用来干扰LpxC的降解，该蛋白将LpxC呈现给蛋白酶FtsH进行降解。26。因此，YejM在维持LpxC水平方面起着至关重要的作用，因而参与了OM中PL/LPS比值的稳态，这对细胞的存活至关重要。对YejM提出了在固定相中的另一种作用，即促进磷脂环丙烷环的形成，特别是在应力作用下。25。这种机制被LpxC和YciM(LapB)的某些突变所绕过，因此它必须与防止LpxC降解的机制相联系。这些最近的发现揭示了YejM对革兰氏阴性细菌的重要性，表明YejM参与了几种膜重塑途径。

YejM的结构、结构和系统发育与大水解酶超家族中某些成员的系统发育联系概述。(a)YejM结构概述。说明了含有5个螺旋(5TM)和带正电荷精氨酸残基(RR)的N端跨膜结构域，提示心磷脂类脂与RR连接区结合，PE和PG类脂不区分形成膜平面。α/β水解酶核心结构域为Ⅰ绿松石、Ⅱ橙和Ⅲ深紫色三层通配型YEjMPD的结构域(PD)。浅紫色的盖子覆盖了第二层和第三层之间的疏水心磷脂结合口袋。C端(CT)深蓝色。RR链接器区域和结构开始之间的序列是以浅灰色的虚线表示的。(b)α/β水解酶核心结构域序列的系统发生树，如果存在CT结构域，则仅来自水解酶超家族中的不同成员。每个类别都由一个颜色框表示，它命名了蛋白质家族，它们已知或预测的酶功能，以及已知的金属离子对它们各自的酶功能至关重要。(c)具有指示活性位位置的YejMPD晶体结构。(d)LTAS可溶性结构域，其活性位点的指示位置。(e(1)EPTA胞浆结构域，活动位点的指示位置。

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两种YejMPD同系物的结构与芳基硫酸盐酶和碱性磷酸酶等水解酶相似。32。尽管序列相似性很低，但α/β水解酶的核心结构与水解酶超家族的成员相似，包括LTAS的胞外结构域。金黄色葡萄球菌32。Ltas的可溶区结构为结合Mn。2+催化亲核苏氨酸残基附近酶活性部位的离子13。EPTA和MCR等PEA转移酶的结构与金属离子和底物具有相同的折叠和活性位点。保守且关键的亲核苏氨酸残留物在催化中尤为重要，因为细菌在MCR-1中被丙氨酸取代时，对cAMP(如大肠杆菌和多粘菌素)的抑制作用减弱。33。YYjM/PbgA的新晶体结构S.Typhimurium揭示了5TM区域的一个新褶皱，它显示了一个跨越5TM和周质域的深而长的裂痕。34。在结构中描述了两个CL结合位点，它们都位于膜嵌入区，几乎占据TM结构域的相反方向。值得注意的是，两个CL分子都位于周边，而不是在5TM区域的裂缝内。该结构中的一个CL分子的头基团与两种精氨酸R 215和R 216直接接触，这两种物质对CL的结合是很重要的。22。该结构揭示了5TM结构域中一个保守的D-X9-H基序，它被认为是一个类似于磷脂酶的催化位点。34。YejM是如何促进外膜重构的，无论是通过协助心磷脂易位，还是通过参与LPS合成途径，目前尚不清楚。

在此，我们报道了一种新的酶功能的YejM。我们解决了野生型和突变型YejMPD的高分辨率晶体结构，该结构显示了一个完整的活性中心，与结合金属离子和高度保守的催化亲核苏氨酸残基。我们证明YejM具有一种磷酸酶活性，它依赖于镁离子的存在。此外，我们还发现，YejM的酶活性取决于其完整的活性位点和5TM结构域的存在。

YejM活性位点和结构同源物的鉴定

我们解决了YejM(YejM残基241-586)的细胞质结构。[医]斑疹伤寒菌*野生型YejMPD和YejMPD丙氨酸突变在F 349处的晶体结构分别符合2.35 Au和2.05 Au的分辨率(表)1补充表1)。它们的一般结构类似于α/β水解酶褶皱，由交替的α螺旋和形成三层的β片组成。1a)32。α/β水解酶核是硫酸盐酶、磷酶、单酯酶、二酯酶和金属酶等大型水解酶超家族的标志性结构域。1补充表2)。与其他α/β水解酶折叠酶相比，YejM还有一个未知功能的C端(CT)结构域。1c)。此CT结构域与其他几种蛋白质(如秋水仙素)结构相似。35和激酶，如PLK 1(补充表)3)。有趣的是，在某些情况下，此域充当寡头化的站点。36.

尽管它们具有较高的序列变异性，来自水解酶超家族的蛋白质仍有一个保守的金属特异性活性位点，位于水解酶结构域第二层和第三层的基础上(如图所示)。1(c-e)这些蛋白质大多是金属蛋白(补充表)。2和3)。YejM预测了与抗生素耐药相关的细菌蛋白的结构和结构域相似性。这包括MCR蛋白14, 33,埃普空肠弯曲菌37，EPTA脑膜炎奈瑟菌12，等(补充表)3)。与编码在染色体上的YejM和EPTA/B/C不同，编码MCR 1蛋白的基因位于质粒上，可在不同物种间高度转移。14, 38.

我们在YejM中发现了一个金属离子结合位点，这个位点在更大的磷酸酶超家族的许多成员中都是保守的(如图所示)。1(B)位于第二层和第三层的底部(图二和图三)。1C和2(a-c)仅对磷酸酶超家族中的某些成员进行的系统发育分析表明，YejM与革兰氏阳性菌的LTA关系更为密切，而在革兰氏阴性菌中与PEA转移酶EPTA和MCR-1的关系更为遥远(如图1所示)。1b)。

YejM有一个类似于其他金属酶的活性位点。

我们的YejMPD结构显示了在保守的苏氨酸残基Thr 302附近的电子密度，这可以用Mg来表示。2+在结构的建立和完善过程中，暗示着金属结合位点的存在(如图所示)。2b，c)。基于多序列和二级结构的排列(集群Omega)39、Promals40)，表明LTAS和EPTA的活性位点残基与YejM的活性位点残基在结构上是一致的。2(c-f)在我们的YejMPD结构中的金属配位类似于MCR-1，EPTA和LTAS中的金属配位。2(d-f)YEJM的活性位点协调包括位于第二层和第三层底部的保守苏氨酸302(Thr 302)。Asp268、Asn 403、Arg 451和His468残基参与金属、水和底物的配位(图1)。2b，c)。我们比较了活性位点的配位，并发现了以下相似之处：(I)mcr-1及其锌周围的残基。2+在此结构中被磷酸化的Thr 70与TPO 70相协调，并进一步残基Glu31、Thr 32、His180、Asp250、His251、His263。41(Ii)锌周围残留的EPTA2+离子由Thr 280和Glu240、Asp324、His383、His453和His465配位12(无花果)2d，e)。YejM的活性位点也类似于Mn周围活性部位的配位。2+具有保守的苏氨酸Thr 300和Glu255残基，Asp475，His253，Trp 354，Arg 356，His47613(无花果)2f)。我们的结论是，虽然活性位点之间存在差异，但大多数残基及其电荷，特别是催化作用关键的亲核苏氨酸，在其他金属酶(补充图)的活性位点上高度保守。1和2).

YejM的活性位点残基在同系物间高度保守。

为了研究YejM同系物中活性位点残基的保守性，我们选择了三个以Asp268(金属和底物结合)、Thr 302(催化残基和金属结合)和Arg 451(金属结合)为中心的序列。此外，我们还利用水解酶结构域的二级结构边界来定义这三个以Asp268、Thr 302和Arg 451(补充图)为中心的序列。2a)。我们的系统发育分析显示，围绕Asp268和Thr 302的序列具有很高的保守性，Arg 451周围的序列具有更大的灵活性。关键残基Asp268、Thr 302和Arg 451在所有同系物中显示出近100%的保守性。Asp 268在YejM同系物中100%保守，而Thr 302被替换为clade中的一种丙氨酸，包括肺炎克雷伯菌(KLEPN)和米氏克雷伯菌(KLEMI)(补充图)2a)。它们的序列在与YejM Thr 301相同的位置保留苏氨酸，这可能补偿Thr 302位置苏氨酸的损失。两种组成的类群阴沟肠杆菌(ENTCL)和[医]雷公拉乌尔泰拉(RAOTE)表示Thr 301处有丝氨酸替代；丝氨酸也可以充当亲核分子，形成共价磷酸中间体(补充图)。2a)。在Arg 451的位置上，我们观察到了组氨酸在某些物种中的变化；这保存了这个可能与金属结合有关的部位的正电荷和特征(补充图)。2a)。它们之间的主要划分是围绕His 468的保护定义的。而它是高度保守的大肠杆菌, 沙门氏菌和硝基杆菌, 肠杆菌有天冬酰胺，而且克雷伯氏菌和拉乌特拉在这个位置要有谷氨酰胺(补充图)。2a，b)。YejM同系物在保守的主要活性位点残基周围有轻微的差异，适合各种底物和金属结合。引爆我们的三个初始[医]斑疹伤寒菌序列(补充图)2(A)针对数据库，导致了围绕所有三个活性位点序列的几种保守的序列改变，构建了我们发现的跨物种组装的特定特征序列(补充图)。1)。此外，我们发现大肠杆菌只使用类型1和[医]斑疹伤寒菌只有类型2序列，和其他同系物使用多种不同类型的序列组合(补充图)。1)，这进一步增加了底物和金属在各种酶功能中的适应性。

YejM是一种镁特异性磷酸酶

根据保守性、活性位点的位置、二价金属离子的存在和苏氨酸Thr 302的保守性，我们推测YejM可能具有磷酸酶活性。为了验证YejM是否能水解磷酸盐基团，我们选择了6，8-二氟-4-甲基伞形磷酸酯(DiFMUP)作为底物。为了评估酶的活性是否依赖于金属离子，我们用等摩尔量的各种二价阳离子进行了测定。我们的数据首次揭示了YejM具有磷酸酶活性，这是高度特定于镁离子的存在(图一)。3)。镁离子存在下的YejM2+)导致磷酸酶活性比其他金属增加100倍，或不添加金属离子或添加EDTA(如图所示)。3)。因此，YejM具有一种磷酸酶活性，它特别依赖于Mg的存在。2+.

YejM是镁依赖性磷酸酶。不同二价金属和EDTA存在和存在时YejM的磷酸酶活性。等摩尔二价阳离子(Zn)2+Co2+镍2+锰2+铜2+镁2+、Ca2+)，在反应中加入EDTA。最大活度(镁存在时)2+)设置为100%，所有其他活动都相应地进行了调整。不同温度(25°C和37°C)下YejM的磷酸酶活性。37°C的YejM活性为100%，25°C的活性为100%。野生型YejM、YejMT302A、YejMH468A和YejMΔ5TM的磷酸酶活性。野生型YejM的活性为100%，其余的活性也相应地进行了规模化。所有数据平均有三个实验副本。误差条表示数据的标准差。

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与马铃薯酸性磷酸酶(PAP)相比，YejM的酶活性较低(补充图)。3(1)DiFMUP可能与YejM的天然底物有很大不同；(2)没有第二个底物作为磷酸盐受体分子，可能会减慢YejM的底物周转速率。我们测试了YejM的活性是否与温度有关，并在25°C和37°C进行了测定。与25°C相比，YejM在37℃时的磷酸酶活性提高了3.3倍。3)。37°C下的较高活性表明YejM能提高宿主感染时的活性，此时革兰氏阴性菌暴露于高于36°C的温度下，因此YejM是最有效的改变温度适应和改变透气性的OM修饰剂。

我们对活性位点进行了丙氨酸替代突变，并测试了活性。保守的Thr 302突变为丙氨酸，导致大约70%的磷酸酶丧失(如图所示)。3)。Arg 451突变为丙氨酸，其结构位置分别与EPTA和LTAS中的His453和His476相似(见图)。2B，e，f)导致磷酸酶活性下降约60%(图1)。3)。当His468取代丙氨酸时，活性也出现了类似的下降，丙氨酸与活性部位和结合金属离子(图1)相近。2c，3)。接下来，我们测试了单胞质结构域是否具有酶活性。缺少5TM结构域的YejMΔ5TM的磷酸酶活性下降了97%，低于镁以外的二价离子。3)。我们的结果表明，活性位点和包括RR连接区在内的5TM结构域对YEJM的镁依赖酶活性是必不可少的。

YejM与OM中的心磷脂含量增加有关，并被提议成为必不可少的心磷脂转运系统的一部分。22,32。最近的研究将YejM功能与脂多糖组装中的phopq依赖作用联系起来。25，LpxC稳态，最终调节外膜中PL和LPS的平衡。26,27,28。由于我们发现了一个完整的活性位点，结合金属离子和酶活性，我们提出了OM脂质组成的变化是否与YejM的酶活性直接耦合的问题。为了检验这一点，我们分析了IM和OM的脂类组成。大肠杆菌在不同条件下培养前10细胞，用薄层色谱法(TLC)定量测定PE、PG和CL三种主要脂类成分(补充图)。3和4)。我们的结果使我们可以得出结论，YejM很可能不直接参与特定的心磷脂或其他磷脂易位到OM。因此，我们认为YejM可能不是一种心磷脂转运体，它的酶活性与它在LPS中的作用以及其他未知的途径有关。

YejM在水解酶和C端结构域之间有一个潜在的次级底物位点。

要去磷酸化Thr 302，YejM可能需要第二个底物或辅助蛋白的结合。在假设二次底物或蛋白质可能与PD结合后，我们分析了我们的结构中存在的空洞(图1)。2我-我，4, 5)。在α/β水解酶结构域的Ⅱ层和Ⅲ层之间提出了一个疏水腔来结合心磷脂的酰基链。4, 5)32。这个提议的心磷脂结合口袋是由疏水氨基酸组成的，即Val262，Phe 292，Leu 343，Phe 394，Trp 396，Val471，Leu 473，Trp 477，存在于第二层的β片上，以及第三层的Leu 309、Phe 310、Leu 334、Phe 349、Tyr 354和Phe 519，Phe 292是细胞存活所必需的，Phe 275、Phe 349、Phe362和Trp 396是在含有抗生素的培养基中生长所必需的。32。一个包括残基345-370的建议盖子被假设为一个门，关闭或打开酰基链结合到这个疏水腔。32(无花果)5)。在我们的YejMPD结构的不对称单元中，这个环在六个单体中的位置相差多达8，类似于以前报道的结构。32(补充影片)1)。除了疏水的心磷脂结合腔外，我们在YejMPDF349A结构中，在水解酶与CT结构域的界面处，观察到了一个位于负电荷腔中的未知电子密度(图)。2(g-j)对其带负电荷的静电表面的贡献是残基Asp488、Asp490、Asp493、Gln 514、Glu579和Glu580(图1)。2k)。这种电子密度仍然不明，尽管我们努力使用各种方法，包括模拟和完善结构与各种可能的配体和质谱鉴定。有趣的是，这个带负电的口袋可以通过结构中的两个带正电的漏斗获得(图1)。2l)。位置，静电性质和它的可达性，使我们可以建议，这个有趣的地点可能是第二个基板。我们在其他结构中的相似位置寻找类似的带负电荷的口袋，并在长期协议中确定了一个(如图所示)。4(a-f)本网站未报道LTA或其他硫酸盐酶和磷酸酶的功能。我们的发现表明，YejM可以结合第二个底物来脱磷Thr 302。

我们已经揭示了重要的内膜蛋白YejM在宿主感染过程中改变OM的新功能。我们的YejMPD晶体的结构测定揭示了一个位于水解酶结构域底部的含有金属离子的活性中心。对PD序列的系统发育分析表明，该活性位点存在于大磷酸酶超家族的许多成员之间。在YejM中发现了重要的活性位点残基，它们是重要的催化残基和金属粘结剂。系统发育分析和活性位点周围基于结构的序列测定表明，YejM的活性位点残基在同系物之间高度保守，但也表明可能适应不同底物和金属结合的变化。酶活性测定表明，YejM具有镁依赖性磷酸酶活性。活性位点和5TM结构域的完整性，包括RR连接区，对于YejM酶活性是必不可少的。第二个底物结合位点表明，YejM可能在一个多步过程中发挥作用，该过程将酶活性与OM重塑途径结合起来。综合起来，我们给YejM赋予了一个新的功能同一性：一种金属酶，其活性可能与OM修饰相耦合。我们的结果引起了一些有趣的问题：YejM是如何作为酶的作用的，其底物的性质以及它是如何在分子水平上起作用的，以及它是如何与OM脂质环境的变化相耦合的。我们的结果从根本上改变了我们对这种重要的膜蛋白的看法，这种蛋白最终使革兰氏阴性细菌在感染期间存活。

我们广泛的结构相似性搜索为我们提供了许多酶，我们将YejM与(补充表)进行了比较。2和3)。尽管具有中到低的全序列同源性，但关键活性位点残基的高序列保守性使得从更好的研究酶中获得的知识得以转移，从而开始了解新发现的YejM酶的性质。YejM以前曾被比作芳基硫酸盐酶和脂铁杉酸合成酶ltas。32。尽管它们在结构上有惊人的相似之处，但作者的结论是，由于缺乏关键的半胱氨酸和丝氨酸残基以及它们的结构中缺乏金属离子，所以YejM不能充当芳基硫酸盐酶，而且很可能不是一种金属酶。32。然而，我们的结构、系统发育和生化数据表明，YejM确实是一种金属酶，具有类似LTAS、EPTA和MCR 1的保守活性位点，具有依赖于镁离子和活性位点完整性的磷酸酶活性。2B-f，3)。有趣的是，与革兰氏阴性菌的PETN转移酶EPTA和MCR-1相比，YejM周质结构域的序列与革兰氏阳性细菌的LTA关系更为密切。1(B)，说明YejM和Ltas可能是远距离的同源词。较大的碱性磷酸酶家族成员在其活动位点周围的进化过程中具有特异性和滥交性，从而导致多维活动转变，这对于属于yjm亚家族的人来说也是正确的。36, 42, 43.

我们的数据显示了在YejMPD结构中的二价阳离子和Mg存在下的二价阳离子。2+，YejM可以去除DiFMUP中的磷酸基团(图1)。3)。我们推测镁2+-早期的研究忽略了YejM的特异性酶活性。22,32。以前确定的结构大肠杆菌和斑疹伤寒杆菌YejMPD(PbgA)没有在YejM的活性位点显示阳离子结合。32。把YejM比作ltas，一种依赖Mg的脂质体酸合成酶。2+离子的作用，以及芳基硫酸盐酶铜绿假单胞菌(PDB ID 1 HDH)44。然而，在结构中没有观察到阳离子。32再加上没有经过评估的酶活性，得出的结论是PbgA/YejM不是一种酶32，同意以前的工作22。我们对PbgA/YejM与其他酶进行了广泛的比较，并进行了系统发育比较，对比了先前那些研究的合理建议，即YejM/PbgA不可能包含金属结合位点或具有酶活性。22, 32。然而，我们的YejMPD晶体结构倾向于YejM的金属结合态，很可能是通过晶化和晶体填充来实现的。因此，我们的结构数据以及广泛的系统发育和功能分析为YejM/PbgA在其酶活性所必需的保守活性位点与二价金属离子结合提供了有力的证据。值得注意的是，我们的结构显示出不太紧密的协调Mg。2+表明金属结合位点可能是可逆的，具有功能相关性，可能调节YejM的不同功能性质。25,26,27,28。镁2+已知的结合位点具有配位可塑性，特别是在主要是单齿配位的结合位点上。45。这表明，YejMPD活动站点很可能受到由RR链接区和5TM域调制的界面变化的影响。可能是yjmpd和rr链接器区域经历了巨大的构象变化，类似于对epta的报道。12.

我们假设，5TM和PD之间的RR连接区在为YEjM的底物结合和功能创造特定的功能环境中起着至关重要的作用。EPTA的分子动力学研究表明，与5TM和膜平面相比，pd可以以不同的方向存在。12。我们根据EPTA的全长晶体结构(PDB ID 5 FGN)建立了包含5TM和RR链接域的嵌合体模型，并将其与我们的YejMPD结构相结合。6a)。该模型可视化了活动位点相对于5TM结构域和膜平面的可能位置(图)。6a)。然后，我们将我们的YejMPD结构叠加在YejM晶体结构(PDB ID 6V8Q)的PD上，以显示金属结合活性中心的位置和环境。6b)。两者的比较表明Thr 302周围的活性部位可以是溶剂，可以暴露在膜上，也可以被掩埋在膜上(如图所示)。6A，b和补充图6).

我们的数据表明YejM在酶上更接近EPTA和MCR-1，而不是LTA.EPTA和MCR-1均将磷脂酰乙醇胺(PE)水解成磷脂酰乙醇胺(PETN)，然后将PETN转移到脂质A，从而中和脂质A，使多粘菌素类抗生素的结合失效。EPTA将PETN转移到脂质A上，脂质A由另一种蛋白呈现，并可能在其活性部位结合两种不同大小的底物。12。然而，MCR-1/2被认为具有二次底物结合位点，PETN向脂质A的转移是由MCR蛋白促进的。33, 41, 46。后者可能是YejM中带负电荷腔的性质(图1)。2(g-l)我们假设这个带负电荷的空腔作为底物的第二个结合位点，作为磷酸盐受体去磷酸化Thr 302。有趣的是，在我们的综合硅对接研究中，基于Planas-Iglesias的研究和分析。47，大多数负电荷的磷脂头群的心磷脂定位于活动部位(如图所示)。5(a-d)酰基链位置翻转到疏水口袋之间的第二层和第三层时，使用YejMPD模型与缺失的盖子序列(图1)。5c，d)。然而，我们怀疑疏水口袋是否足够大，以容纳四个酰基链的CL。

我们观察到YejM和YejMΔ5TM都在RR连接区进行蛋白水解处理。这种蛋白质分解可能会使蛋白质失活，就像ltas的情况一样。48，或如磷酸甘油转移酶OpgB所观察到的那样改变其功能。49。而对epta和mcr-1蛋白的蛋白水解处理尚未见报道。12, 50我们认为，这一过程可能对使YejM(5TM和PD)的两个结构域相互独立地与不同的蛋白质和底物相互作用具有重要意义。重要的是要注意的是，虽然YejM可能经过蛋白水解处理，磷酸酶的活性取决于蛋白质的完整性。值得注意的是，PD本身并不具有酶活性(如图所示)。3)。这与EPTA和lta形成了鲜明的对比，因为只有胞浆/胞外结构域才能保持磷酸酶活性。51, 52。引人注目的是，虽然EPTA和LTA的可溶性结构域都能水解它们的底物，但EPTA不能在脂A中添加磷酸乙醇胺12，而ltas不能由磷酸甘油单体合成脂铁卡酸。48在没有跨膜结构域的情况下。

我们的研究提供了第一个重要数据，为YejM提供了一个新的功能标识。这项研究拓展了我们的理解，并为未来的结构导向的跨学科方法提供了坚实的基础，以寻找特定于YejM的抑制剂，从而为防治传染病做出贡献。

诱变

利用正向(FW)和反向(Rev)引物产生以下突变体：YejMPD-F349A和反向引物：FW CTTTTTTCGGATGGCCGTATATATTATAGCGCTCCCTCTTCTC，Rev GACTATAAAGCGGTACTGCGGCGGCTGCGGCGGCGGCGGGAGAAGAAGAG；YejM-T302A使用FW CATTATTAGTTGTTGGAGGAGGAGTATAGTAGTATAGTATTAGTAGTCTC，Rev GCCATATATATATTATTATAGTAGCGTACTCTCTGCTTATG；YejM-45RTCAGGGCATCATGAGCCGCCGCCGCCGCATATG；YejM-R45TTCFGCATCATCATCCGCCGCCGCCGGATAG；突变位点下划线。采用PfuTurboDNA聚合酶(Agilent Technologies)和Q5 Hotstart突变试剂盒(NEB)。

YejM结构物的表达与纯化

在pBAD 24载体中克隆到了全长YejM，并在pBAD 24载体上进行了表达。大肠杆菌前10细胞并按22。在pET 28载体上克隆到YejMPD及其突变体，并在大肠杆菌BL 21(DE3)细胞并按53.

结晶、X射线衍射数据采集与处理

纯化的YejMPD野生型和突变蛋白53。最终的结晶条件为PEG-Rx HT条件C6的衍生物。HR2-086)，由0.1MHEPES pH7.5，12%w/v聚乙二醇3,350组成。用于数据采集的YejMPD晶体出现在0.1M HEPES pH6.8，13%PEG 3350的条件下，而在0.1M HEPES pH 6.8，5%PEG 3350的条件下，获得了YejMPD-F349A晶体。用Litho环(分子尺寸)或尼龙环(汉普顿研究)获得晶体，并在没有或用石蜡作为防冻剂的情况下冷冻在液氮中。在美国加利福尼亚州伯克利的先进光源光束线4.2.2上收集了100 K的衍射数据，每幅图像的振荡度为0.1°-0.2°。利用XDS对衍射图像进行索引和集成。54并使用ccp 4程序套件进行缩放和无目标合并。55.

结构确定

数据集YejMPd的YejM 241-586的结构在空间群中得到了解决。P 3221用相取代分子56从晶体结构中提取的单体沙门氏菌PbgA球状结构域191(PDB码5I5F)32)作为搜索模型。利用苯尼克斯对结构进行了进一步的细化。57。非结晶对称性(NCS)约束是在细化的早期阶段施加并释放的，而平移-解放-螺旋运动(TLS)则是在细化的后期应用的。结构被改进为2.35奥尔。以YejMPD单体(PDB ID 6VAT)为搜索模型，采用分子置换法确定了YejMPD-F349A的结构。将YejMPD-F349A突变体的结构优化为2.05Au。表中给出了这两种结构的精化统计量。1。结构已保存到PDB数据库(Https://www.rcsb.org/)，并分配了以下PDB ID：6 VAT和6 VC7。