新冠肺炎患者独特的免疫学特征

严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)与宿主免疫的关系尚不清楚.我们对32例严重新冠肺炎患者的免疫反应进行了广泛的分析，其中一些人已经死亡。包括健康受试者的对照人群。新冠肺炎患者外周血淋巴细胞分布改变，成熟自然杀伤(NK)细胞比例增加，T细胞数减少。NK细胞和CD8+T细胞过度表达T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(Tim-3)和CD 69.NK细胞衰竭表现为程序性细胞死亡蛋白1(Pd-1)阳性细胞频率增加，NK细胞自然杀伤组2成员D(NKG2D)-、DNAX辅助分子-1(dNaM-1)和唾液酸结合Ig样凝集素7(Siglc-7)表达减少，NK细胞分泌干扰素(IFN)的能力降低。预后不佳的患者显示未成熟的CD 56收缩。明快和成熟CD 57的扩展+FCεRIγ内格与幸存者相比，适应性NK细胞。与幸存者相比，血清IL-6水平的升高在死亡患者中也更常见。值得注意的是，单核细胞分泌大量的IL-6、IL-8和IL-1β，在恢复数周后维持在较低水平，伴随着CD 69、pd-1和Tim-3的正常表达和CD8的恢复。+T细胞数在严重的SARS-CoV-2感染中，一种过度激活/精疲力竭的免疫反应占主导地位，这可能是由于单核细胞不受控制地分泌炎性细胞因子。这些发现揭示了新冠肺炎患者独特的免疫学特征，这将有助于为这种潜在的致命疾病设计有效的特定阶段治疗方法。

严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)是造成这一大流行的原因，迄今已导致超过3300万例冠状病毒病-19例(新冠肺炎)，目前的病例/死亡率为3%。1这种感染通常伴随着轻微的症状，包括低热、缺氧/异位症、结膜炎和腹泻，但可能与严重间质性肺炎、心肌炎、急性肾损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官衰竭和死亡有关。2SARS-CoV-2的全身性参与被认为源于血管紧张素转换酶2受体在人体中的普遍表达，这种受体被病毒用来进入细胞，并且在肺上皮细胞中高表达。3实验室检查表明，严重进展的新冠肺炎患者有继发性噬血细胞淋巴组织细胞增生症(HLH)。HLH是一种以可能致命的细胞因子风暴和多器官功能衰竭为特征的炎症综合征，可由病毒感染触发。4与HLH类似，新冠肺炎的特点是淋巴细胞减少，血清铁蛋白、D-二聚体、C-反应蛋白(CRP)和乳酸脱氢酶(LDH)升高，这些水平也被认为是预后不良的预测因素。5此外，新冠肺炎期间几种血清细胞因子浓度增加，证实了病毒驱动的炎症反应起着重要的致病作用。2

天然免疫反应的特点是抗病毒Ⅰ型和Ⅲ型干扰素水平相对较低，趋化因子表达增加。6这种低效率的先天抗病毒防御，加上高度的促炎反应，目前被认为是新冠肺炎发病的原因之一。这种功能性二分法的天然免疫反应似乎与其他常见呼吸道病毒的结果不一致，在其他常见呼吸道病毒中，炎症趋化因子的产生是由功能上适当的宿主先天防御来平衡的。6自然杀伤(NK)细胞已经被证明在数量上减少，类似地，但不一致，特别是在重病患者中减少到T和B细胞。7值得注意的是，NKG2A抑制性受体频率8表面密度9新冠肺炎组高于健康对照组，临床康复后恢复正常。8此外，NK细胞上的免疫检查点分子Pd-1也增加了.9

关于适应性免疫，一个一致的发现是CD4+和CD8+T细胞的数量较少，特别是在有严重临床表现和结果的患者。10,11,12,13,14此外，新冠肺炎患者还观察到T细胞衰竭和向TH17倾斜。12

有关SARS-CoV-2免疫反应的基本问题仍然存在.除了对疫苗研制有明显影响的免疫保护和免疫持续时间相关外，还需要澄清新冠肺炎发病机制中尚未回答的问题，并将其与重症和可能致命性疾病的进展联系起来。这促使我们评估NK细胞，特别是单核细胞、CD4和CD8 T细胞的表型和功能状态，在新冠肺炎的背景下出现临床中到重度间质性肺炎的患者。

32例经X线胸片证实为中重度间质性肺炎的患者和SARS-CoV-2RNA阳性的鼻咽拭子或支气管肺泡灌洗者为新冠肺炎(CoV-2)组。所有患者在被救护车送往医院时，都出现呼吸困难，需要可变的氧气供应。第一次检查后24~48h，在使用任何抗病毒和/或免疫抑制药物之前采集免疫学研究血样。所有患者都在急诊室和常规实验室以及血气检测中进行了身体检查。出现后立即做了胸部X光检查。然而，从症状开始到入院的时间可能从几个小时到几天不等，视症状的进展而定，完全独立于调查人员。15例CoV-2例在发生ARDS后死亡，17例存活。人口统计、临床和实验室检查结果见表。1。所有病人均需氧气通气(呼吸机)。®-Flembare医疗有限公司(交付24%至60%)2不管有没有蓄水池。部分患者在出现时立即给予持续正压(C-PAP).25例临床健康者，SARS-CoV-2RNA阴性者作为对照(HD，中位年龄63岁，37~92岁).年龄超过75岁的部分年龄组(中位数78.5范围75-92)作为老年患者的对照(中位数81，范围56-92)。

PBMC的分离与表型

用标准技术分离PBMC，用90%胎牛血清(FCS；HyClone，GE Healthcare，SouthernLogan，美国犹他州)+10%二甲基亚砜+10%二甲基亚砜保存。简单地说，全血用等量的磷酸盐缓冲液(Pbs)稀释，稀释后的血液被分层在Lympholyte(雪松)上。500×离心后g在室温下，在不加制动器的情况下，用pbs-edta 400×离心仔细去除pbs-edta界面。g10分钟。PBMC微丸在含2%FCS的PBS中重新悬浮，250×离心洗涤。g在室温下10‘。在Burker室用光镜计数法测定细胞数。用台盼蓝染色鉴定不活细胞。将2例CoV-2患者及对照组的PBMC冷冻保存30 min，置于完全培养基RPMI-1640+10%FCS+2mm L-谷氨酰胺+抗生素抗真菌溶液(青霉素10 0U/ml，链霉素0.1μg/ml，两性霉素B 0.2 5μg/ml)中(西格玛-奥尔德里奇，圣路易斯，MO，美国)。随后，用补充表中详细列出的氟色素结合抗体对PBMC进行洗涤和染色以进行表型分析。1。为分析FcεRIγ的表达，采用FOXP 3/转录因子染色缓冲液集(eBioscience，HeatFisher Science，MA，USA)处理细胞，然后在渗透缓冲液中用抗FCεRIγFITC抗体(Merck Milli孔隙，Burlington，MA，USA)染色。数据采集用FACS Celesta(BD生物科学)进行。

NK功能测定

分别用100 U/mlIL-2(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，DE)和10 ng/ml IL-12(PeproTech，London，UK)刺激18 h后细胞功能。PBMC在MHCⅠ-不表达K 562细胞(E：t=5：1)、brefeldin A(GolgiPlug)和CD107a(BD生物科学)存在下孵育5h，然后用抗CD3、-CD 56抗体膜染色(详见补充表)。1)。固定和渗透(固定/渗滤液试剂盒，BD生物科学)后，细胞用抗干扰素γ染色，详情列于补充表。1。采用流式细胞术(FACS Celesta，BD生物科学)进行分析。

ADCC法

以SW 480结肠癌细胞为靶细胞，以头孢妥昔单抗(10μg/ml)为靶标，进行抗体依赖细胞介导的细胞毒实验。将未受刺激的PBMC置于完全培养基中，与SW 480结肠癌细胞共孵育5h，E：T比为5：1，分别加入brefeldin A(GolgiPlug)和CD 107 a(BD生物科学)。用细胞内染色法检测NK细胞中干扰素γ的产生情况，并进行流式细胞术(BD生物科学)分析。NK细胞分析的门控策略如图所示。2.

单核细胞体外细胞因子检测

在采血后2h内，用细胞培养液(RPMI 1640)稀释全血1：1，37°与布来菲丁A孵育3h后，在室温下洗涤细胞，用抗CD 14、-CD 16和HLA-DR进行膜染色。随后，在每管中加入适量的BD生物科学(BD生物科学)，并在37°C下孵育，然后用PBS洗涤两次，细胞在室温下固定并渗透(固定/渗透溶液试剂盒，BD生物科学)。细胞渗透后，在室温下用抗IL-1β、抗IL-6、抗IL-8染色30 min。

细胞因子检测

血清可溶性IL-1β，−12 p70、-6、-8、-10和肿瘤坏死因子α用BD细胞计量学珠阵列(BCBA)人炎症细胞因子试剂盒测定。

统计分析

本研究的主要终点是比较新冠肺炎感染患者与对照组的免疫学特征。每组患者30例，有一个标准差，误差为90%，I型误差为5%。作为第二个终点，我们比较了这些组的住院死亡率。

使用GraphPad软件8.01(GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA)进行统计分析和图形演示。用非参数Mann-Whitney U检验评估各组间的统计学差异。配对数据用Wilcoxon符号秩检验进行分析。采用皮尔逊相关法对双变量关联进行评价。

学习批准

该研究议定书符合1975年“赫尔辛基宣言”的道德准则，并得到了机构审查委员会和IRCCS Policlinico San Matteo基金会道德委员会的批准(P-20200038894)。

新冠肺炎患者NK细胞呈衰竭型

新冠肺炎组患者NK细胞绝对计数明显低于对照组，而NK细胞频率在两组间无显着性差异(图5)。1A).

SARS-CoV-2感染的NK细胞特征。aCD3-CD 56+NK细胞的频率和绝对计数。bCD 56频率明快NK细胞c)成熟CD 57+NK细胞d)FCεRIγ阴性CD 56+/CD 57+健康供者和SARS-CoV-2患者外周血单个核细胞中NK细胞的表达。每个图的左边都显示有代表性的点图。全红色符号表示死者。中间的酒吧代表中庸。采用Mann-WhitneyU检验对两组进行比较。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

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NK细胞表型分析显示未成熟CD 56减少明快NK细胞1B，并在成熟时并行富集(CD 56)。昏暗/CD 57+)子集(图1.1C)新冠肺炎患者与健康对照者比较。值得注意的是，这些差异在有致命后果的患者中尤为明显(图中所示)。1B，c)。此外，在死亡的患者中，适应性/记忆性NK细胞的频率有统计学上的显著增加(图1)。1D)。因为死者的年龄比幸存者大(表)1我们分析了一小群健康老年人的NK细胞表型，两组间无显着性差异(补充图)。1A-c)。重要的是，NK细胞表达CD 69 C型凝集素有统计学意义(见图).2A)，是NK细胞活化的标志，也是表达检查点分子Tim-3的NK细胞的标志。2B)和pd-1(图1.2C在新冠肺炎患者中，NKG2D-、Siglc-7-、dNaM-1-和CXCR 6-表达的NK细胞频率显著降低(图1)。2D-g)。表达转录因子Aiolos的NK细胞增多，这是Ikaros家族的一员，在造血发育中起着重要的作用。15(无花果)2HNKG2C-、NKG2A-、NKp 46-、NKp 30-、CD 16-、TRAIL表达NK细胞(数据未显示)。

新冠肺炎患者NK细胞呈衰竭型。频率(a)CD 69-和(b健康献血者(HD)、新冠肺炎(CoV-2)患者NK细胞的TIM-3表达及相应的代表点图。cNK细胞上Tim-3检查点分子的表达水平。比例d)PD-1-，(e)NKG2D-，(f)西格勒克-7-，(g)dNaM-1-，和(h)CXCR 6-NK细胞阳性及相应的代表点图。i细胞内Aiolos在NK细胞中的表达，以平均荧光强度(MFI)的形式表达。HD(BLU系)、存活(绿线)和死亡(红线)NK细胞中Aiolos表达的代表直方图。中间的酒吧代表中庸。全红色符号表示死者。采用Mann-WhitneyU检验对两组进行比较。*p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

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新冠肺炎患者NK细胞功能缺陷

以K 562为靶细胞，以SW 480细胞为靶细胞，以西妥昔单抗为靶细胞，检测脱颗粒活性、干扰素γ和肿瘤坏死因子α的产生。对于后者，未观察到与对照组相比的变化，无论是总NK细胞还是适应性NK细胞亚群(补充图)。2B-C)。然而，在头孢妥昔单抗脓肿中，新冠肺炎患者NK细胞中干扰素γ的分泌较正常人明显减少(图1)。3A)。更重要的是，K 562细胞的功能实验表明，新冠肺炎患者NK细胞干扰素γ的产生明显低于健康献血者(图1)。3B)，这主要是在CD 56中观察到的。明快与大幅度减少脱颗粒活动有关的种群(如图所示)。3C)。脱颗粒率(CD107a)呈显著负相关。+)和干扰素产生γ的NK细胞和血清CRP值。三维空间)。NK细胞功能与CRP呈负相关，提示NK细胞在过度全身炎症条件下表现不佳，伴随着NK细胞的耗竭。

新冠肺炎患者NK细胞功能缺陷。aSW 480刺激NK细胞后脱颗粒和产生干扰素γ。b, cNK细胞(CD3)脱颗粒与干扰素γ的产生-/CD 56+)和CD 56明快经K 562细胞刺激后。a, b, c代表干扰素γ和CD107a点图的新冠肺炎患者(CoV-2)和对照组(HD)显示在每个面板左侧。中间的酒吧代表中庸。全红色符号表示死者。采用Mann-WhitneyU检验对两组进行比较。*p < 0.05. dCD107a和IFNγ表达与C反应蛋白(CRP)值呈负相关。用皮尔逊检验来检验相关性。

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泛T细胞超活化/耗竭表型是新冠肺炎的特征

CD4的数量和频率+和CD8+如以前经常报道的，T细胞明显低于健康对照组。10,11,12,13,14(无花果)4A，b)。而且，两者都是CD4+和CD8+新冠肺炎患者T细胞过表达CD 69。4C，d)和提姆-3(图1.4E，f)与健康对照组比较，这与超活化的PAN T细胞耗竭谱是一致的.值得注意的是，CD4的直接比较+和CD8+存活者和死亡患者的T细胞表型特征强调了T细胞亚群中的高活化状态，与存活者相比，死亡患者的CD8频率和T细胞计数显著下降(图1)。4B)。与老年健康对照组相比，新冠肺炎组CD8 T细胞计数无明显下降(补充图)。1D).

与NK细胞相似，也有CD8细胞。+重度新冠肺炎患者T细胞表达CXCR 6表达减少(图1)。4G而Aiolos细胞密度升高(见图)。4H).

CD 69-表达的T细胞在两组间无显着性差异(补充图)。1E-f).

新冠肺炎临床康复后NK和T细胞CD 69和Tim-3表达恢复正常。

为探讨新冠肺炎恢复期患者超活化/精疲力竭表型能否恢复，对7例患者在急性期和出院后30~45天的NK和T细胞表型进行了分析。所有患者均有CD8升高。+恢复后T细胞频率(图1)。5A)。此外，TIM-3表达的NK细胞明显减少(如图所示).5B)和CD8+T细胞(图1.5C)和CD 69-表达细胞的显着减少，迄今所有血统分析(图)。5D-f)。相反，并非所有患者都能观察到NK细胞功能的恢复，这表明SARS-CoV-2所引起的功能改变比预期的更为普遍(补充图1)。3A)。7例患者中5例恢复后，pd-1表达的NK细胞比例下降，但无统计学意义(P>0.05)。p=0.078，补充图。3B).

恢复期患者CD8 T细胞的恢复及免疫重建。a新冠肺炎患者急性期和恢复期外周血CD8+T细胞循环频率及绝对值(Conv.)阶段。bNK细胞对Tim-3分子的围生(左)和表达水平(MFI，中间)。有代表性的点图显示(右)。cTIM-3阳性CD8+T细胞比例及典型点图。dNK细胞(中)早期活化标记CD 69表达CD 69的频率(左)和MFI。有代表性的点图显示(右)。e, fCD 69-表达CD8和CD4 T细胞的频率及相应的代表点图。配对数据用Wilcoxon符号秩检验进行分析。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001

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新冠肺炎患者血清单核细胞释放高水平炎性细胞因子

我们检测了新冠肺炎所有患者的血清炎性细胞因子，包括预后良好和不良的患者。分析细胞因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-12 p70和IL-10。新冠肺炎患者血清IL-6、IL-8、IL-10水平明显升高，与恢复期迅速下降的重症进行性疾病的炎症综合征相一致(图二)。6A-c)。此外，与存活者相比，死亡患者血清IL-6和IL-10水平明显升高(图二)。6A，c)。血清IL-6和IL-10水平与血清CRP和乳酸脱氢酶值直接相关(图一)。6d-g).

SARS-CoV-2感染恢复期血清炎性细胞因子水平正常.a–c左小组：血清(a)IL-6，(b)IL-8及(c)IL-10在健康献血者(HD)和SARS-CoV-2患者(CoV-2)中。中间的酒吧代表中庸。全红色符号表示死者。采用Mann-WhitneyU检验对两组进行比较。a–c右面板：血清(a)IL-6，(b)IL-8及(cIL-10在急性期和恢复期。配对数据用Wilcoxon符号秩检验进行分析。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. d, eIL-6与LDH、CRP的相关性研究。f, gIL-10与LDH和PCR的相关性。用皮尔逊检验来检验相关性。

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用体外分离的单核细胞进行的实验表明，新冠肺炎患者未受刺激的单核细胞能够自发分泌高水平的IL-6、IL-8和IL-1β(如图1所示)。7A-c)，即使在较低的水平上，在康复后的几个星期内也会持续(图中所示)。7A-c)。对经典单核细胞、中间单核细胞和非经典单核细胞的分析表明，这三个群体都能分泌更多的细胞因子(补充图)。4)。血清IL-1β水平与外周血单核细胞计数有统计学意义(P<0.01)。r=0.42，p=0.007)。

新冠肺炎患者PBMC的表型和功能信息有限。在这里，我们有机会评估因严重新冠肺炎间质性肺炎入院的患者，并与健康对照者进行比较。后者包括一些健康的老年人，他们为因严重新冠肺炎而死亡的患者提供了适当的对照，后者的年龄明显大于幸存者。除了CD8 T细胞计数外，从整个对照组和老年对照组收集的数据缺乏统计学上的显着性差异，这证实了我们研究结果的稳健性，是这项研究的独特资产，因为在这个环境下的大多数免疫学研究缺乏与患者相似的适当的年龄控制。

我们在此表明，新冠肺炎感染的全球NK和T细胞特征与过度激活导致的功能障碍/衰竭表型是相容的，如活化标志CD 69的过度表达和NK、CD4和CD8 T细胞上的Tim-3的过度表达。蒂姆-3是免疫细胞功能的负调节因子；事实上，与其配体的结合会导致不同病毒感染的T细胞和NK细胞衰竭。16,17还有癌症。18此外，TIM-3阻断剂还可挽救NK细胞功能受损。19,20TIM-3和CD 69的广泛过度表达，揭示了在这种临床环境下，这两种免疫手臂的高度激活和过度耗尽的特征。进一步支持NK细胞耗尽表型的依据来自pd-1的过度表达，这与最近发表的一项研究一致，9这似乎比蒂姆-3更普遍的变化，因为复苏后并没有完全正常化。

活化的NK受体NKG2D和Siglc-7的频率降低，其表达减少与病毒感染中NK细胞功能降低有关。21,22在这种情况下，也可能有助于降低NK细胞的效应功能。有趣的是，新冠肺炎患者血清中大量存在的IL-6可能下调NK细胞上的NKG2D，导致NK活性受损。23,24与NK功能障碍表型相一致，新冠肺炎患者NK细胞对干扰素γ的分泌受到损害，尤其是CD 56。明快子集。这些数据与另一项研究一致，8说明新冠肺炎感染过程中NK和CD8 T细胞功能受损。过度炎症状态很可能导致NK和T细胞在病毒驱动下的过度激活，如持续高水平的炎症细胞因子(即IL-6)所显示的，在预后较差的患者中，IL-6的水平也较高。炎症细胞因子的富集支持了新冠肺炎部分类似于巨噬细胞活化综合征(MAS)的假说，该综合症被认为与HLH密切相关，25一种罕见的危及生命的严重炎症性疾病，由分泌高水平炎性细胞因子的单核/巨噬细胞不受控制的增殖引起。我们的研究清楚地表明了这一点，并提供了对新冠肺炎过程中产生的炎症细胞因子来源的机械见解，这些细胞因子在恢复后持续数周。值得注意的是，类似于CRS的模式已经被描述为新冠肺炎和SARS。2,26,27

未成熟CD 56明快NK细胞在新冠肺炎患者中所占比例偏低，尤其是在随后死亡的患者中。同时，新冠肺炎NK细胞中CD 57作为高度成熟NK细胞的标记物显著升高。CD 57阳性NK细胞对细胞因子刺激的反应较弱，但对CD 16受体信号的反应较强。我们的发现与最近发表的一篇论文一致，28但与另一项研究不一致的是，ARDS患者成熟NK细胞的比例明显降低，推测这些变化将导致新冠肺炎最严重的表现。9这种差异的原因并不是立即明显的，可能是由于病人特征的差异。有趣的是，这些患者的NK和CD8 T细胞中的Aiolos转录因子也增加了。Aiolos被认为是NK细胞成熟和功能的重要调节因子，29因为它是最大限度的干扰素γ分泌和充分控制病毒感染所必需的。有趣的是，Aiolos的基因编码IKZF 3)，在耗尽的T细胞中诱导。30,31表明可能与观察到的精疲力竭的T细胞表型有关。有趣的是，CXCR 6在NK和CD8 T细胞上的表达降低，可能是由于这些细胞归巢于肺，而CXCR 6的配体CXCL 16高表达。32,33值得注意的是，新冠肺炎患者血清中CXCL 16水平显著升高。6

尽管在早期阶段很难精确地将新冠肺炎构建在一个免疫连贯的临床实体中，但也出现了一些特性，导致了其免疫特性的独特性，从T细胞和NK细胞衰竭到与MAS兼容的模式，尽管与后者不同的是，干扰素γ在这种情况下似乎是正常的或被抑制的。25我们的数据有助于描述预后不良患者的免疫学特征，他们表现为终末分化、功能衰竭的NK细胞、高活化T细胞和IL-6水平的增加，单核细胞在体外分泌大量炎性细胞因子。由于Tim-3、Pd-1和NKG2A是一种可药物的检查点分子，已被证明能在癌症中利用NK和T细胞免疫反应，因此可以设想使用检查点抑制剂来释放其抗病毒活性。34应精心规划和控制，以避免严重新冠肺炎典型的炎症状态恶化。了解对SARS-CoV-2的免疫反应的动态和质量，将提供宝贵的翻译信息，以设计有效的特定阶段治疗这一潜在的致命疾病。