维生素D类似物钙三醇促进人胰腺CAFs的抗肿瘤表型，但降低T细胞介导的免疫功能

胰腺肿瘤基质由具有促肿瘤功能和抗肿瘤功能的表型异质性癌相关成纤维细胞(CAFs)组成。在这里，我们研究了维生素D钙三醇的影响。3类似物，利用二维和三维(2D，3D)细胞培养模型对人胰腺CAFs和T细胞的激活作用进行了研究.我们发现钙泊三醇降低了CAF的增殖和迁移，减少了促肿瘤因子前列腺素E的释放。2、IL-6、周围素和白血病抑制因子。钙泊三醇可促进PD-L1的上调，影响T细胞介导的肿瘤免疫监测。钙泊三醇可抑制T细胞增殖和IFN-γ、颗粒酶B和IL-17的产生，而增加IL-10的分泌。在2D培养中存在CAFs，在3D培养中存在CAFs和胰腺癌细胞系(PAC-1)时，这些效应更为深远。对肿瘤浸润淋巴细胞的功能测定也显示钙泊三醇对T细胞的激活减少。这表明钙泊三醇在降低CAFs的肿瘤支持活性的同时，也降低了T细胞的效应功能，从而损害了患者对肿瘤的免疫监测。因此，维生素D3类似物在胰腺癌中似乎具有双重功能，这可能具有重要的临床意义。

由于胰腺癌缺乏有效的治疗方法，自20世纪70年代中期以来，5年生存率仅从3%上升到9%。1。据估计，到2030年，它将成为第二大癌症死亡原因。2。摘要胰管腺癌(Pdac)的主要特征是肿瘤微环境由常驻的胰腺星状细胞和其他浸润性癌相关成纤维细胞(Cafs)促进的大量促干反应组成。3。在癌细胞存在下，胰腺星状细胞被激活，失去其特有的胞浆脂滴，表达肌成纤维细胞蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，并获得增殖表型，导致细胞外基质蛋白的病理性释放。4。硬结间质包裹癌细胞，阻止治疗的传递。3,4以及一种有效的效应免疫反应5,6.

人们已经试图从肿瘤中根除CAF。然而，α-sma的局部损耗+实验PDAC中的CAFs与肿瘤进展有关。7。根据α-sma等因子的表达模式，cfs对肿瘤细胞的生长有正向或负作用。8，IL-68，白血病抑制因子(LIF)9Podoplanin10,11和骨膜素11,12除其他外。具有不同功能甚至相反功能的不同CAF亚群的存在可能解释了为什么胰腺肿瘤间质的耗竭会导致肿瘤侵袭性的增加。13,14免疫监测反应不佳7在小鼠模型和随后的临床试验中。Hlund等人.最近在胰腺肿瘤中发现了两个典型的不同的CAF亚群。α-SMA+肌成纤维细胞caff定位于肿瘤巢附近，并被描述为抑制肿瘤细胞生长，而产生炎性caff的IL-6与癌细胞的距离更远，被认为是更有利于肿瘤生长的。8.

为了克服将肿瘤间质相互作用仅局限于促肿瘤性caf亚群的困难，新出现的方法旨在将激活的caff恢复到静止状态，而不是将其耗尽。15,16。Sherman等人15维生素D激活维生素D受体(VDR)3CAFs中的类似物可以减少胰腺纤维化，改善PDAC小鼠对化疗药物的反应。然而，维生素D的免疫抑制作用3在这种情况下，免疫细胞、癌细胞和间质之间的下游相互作用仍然是难以捉摸的。

一种有效的T细胞介导的抗肿瘤免疫同时涉及CD8。+T细胞和CD4+Th1子集。维生素D3以前曾证明有促进Th2免疫反应和抑制Th1细胞因子的作用。17。由于维生素D的免疫抑制作用3，已被建议用作移植病人的佐剂。18也适用于自身免疫性疾病，如银屑病19。有争议的是维生素D3此外，还提出了有益于癌症患者的补充剂和维生素D的临床试验。3类似物与其他标准治疗相结合目前正在进行(ClinicalTrials.gov标识符NCT 02052492，NCT 03331562)。

然而，三项独立的观察研究显示，系统性维生素D水平之间存在差异。3(25 OHD)3)和患胰腺癌的风险20,21,22。Stolzeberg-所罗门等人.20发现高水平的维生素D3与患胰腺癌的高风险有关。相反，其他研究发现高水平的25 OHD3与较低的胰腺癌风险有关21和长期生存22。综合来看，这些结果强调了维生素D的作用3胰腺癌还没有定论。

我们曾证明胰腺CAFs对T细胞有较强的免疫抑制作用，并能促进pd-1、Tim-3和ctla-4等共抑制性标记物的表达。23。我们和其他人还表明，大多数T细胞被包裹在肿瘤的间质室中，进入恶性细胞的途径有限，这凸显了增加对基质微环境如何影响T细胞反应的知识的重要性。5,6,23。值得注意的是，维生素D的作用3在这方面还不清楚。因此，我们开始研究维生素D是如何3可影响人胰腺CAFs及其对T细胞功能的影响。为此，我们进行了一系列体外试验，以研究维生素D的影响。3钙三醇类似物，在二维(2D)和三维(3D)模型中对人源性CAFs的激活，以及钙泊三醇在CAFs和T细胞调控中的可能作用。

钙泊三醇对CaF激活的影响

CAFs的原代培养来源于胰腺癌手术切除患者的胰腺肿瘤组织。我们首先检测了维生素D受体(VDR)的表达，并与其他人的结果一致。15，VDR在分离的CAFs中表达。1a)。评估CAFs是否对合成维生素D有反应3衍生化钙三醇，测定vdr靶基因的相对mRNA表达。CYP24A1对维生素D的反应3模拟。表示CYP24A1加钙三醇后，所有供体的基因(n=8)均上调，中位数为10。6-与对照细胞相比增加一倍(见图)。1b)。自CYP24A1表达是vdr激活的既定指标。24这进一步证实了分离的CAFs表达功能VDR的结论。我们进一步发现，泻素抗菌肽基因的mRNA表达夏令营)，编码抗微生物肽LL-37的转录本，在VDR-接触后诱导(中位数10.3倍)。1b)。因此，CAFs有能力对钙三醇作出反应，这与以前的工作是一致的。

CAFs对维生素D的反应3类似的钙三醇。用DMSO对照(填充圆环)或100 NM钙三醇(蓝色填充圆)处理CAFs 72h。a)vdr基因在未经处理的CAFs中相对表达水平为18s。n=6)。(b(左)CYP24A(n=8)和(右)cAMP基因(n6)钙三醇治疗后恢复到DMSO对照水平。(c)(左)编码为DMSO对照的ACTA 2基因表达(左)n=8)。(中)αSMA在DMSO对照、钙泊三醇处理的CAFs中的表达。n转化生长因子β(开放圆)或转化生长因子β与钙三醇(蓝色开环)(n=8)在2D文化中。(右)有代表性的流式细胞仪斑点图显示不同处理的αSMA的表达。(d)(左)α-SMA在DMSO对照或钙泊三醇作用下培养的CAFs中的表达(左)n=13)。(中)三维模型中αSMA在与球体共培养的CAFs上的表达(英文)n=7)。(右)三维模型的免疫染色显示αSMA在CAFs(红色)与PAC-1球体(蓝色)共培养中的表达。(e)DMSO对照钙泊三醇(钙泊三醇)处理的CAFs中podoplanin的表达。n=10)，转化生长因子β或转化生长因子β与钙泊三醇(n=8)在2D文化中。用流式细胞仪观察了不同处理对podoplanin表达的影响。(f)(左)在DMSO对照或钙泊三醇(DMSO)处理的2D或3D模型上培养的CAFs中podoplanin的表达(左)n=13)。(右)POdoplanin在三维模型中与球体共培养的CAFs上的表达(英文)n=7)。(a–c)直方图条表示中间值。(c–f)点之间的线表示成对的样本。使用Wilcoxon匹配对烧录秩检验来检测统计学上的显着性差异*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

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有人认为维生素D3类似物可以将CAFs的反应表型恢复到静止的表型，这是通过下调ACTA 215，编码α-SMA的基因。根据这些研究，我们还发现ACTA 2在常规2D培养的原代CAFs中，加钙三醇72h后，CAFs明显减少(图1)。1c)。此外，当我们分析钙三醇在不同时间点的作用时，我们发现ACTA 2钙三醇在24h和72h均有类似程度的降低，但在48h无明显影响(附图)。沙一A在线)。流式细胞仪测定的蛋白水平未反映mRNA水平下降的观察模式。与此形成对照的是，在2D培养中加入钙三醇72h后，α-SMA的蛋白表达显著增加。1c)。如先前所示25添加转化生长因子-β促进α-SMA在CAFs中的表达，而钙泊三醇进一步增加α-SMA的表达。1c)。α-SMA的中位荧光强度(MFI)表现出相同的模式(见附图).沙一B在线)。

由于二维组织培养塑料对CAFs的细胞生物学有一定的影响，包括细胞粘附、旁分泌信号、激活、增殖和基因表达，我们还观察了VDR刺激对三维胶原基质培养的CAFs的影响。我们注意到，在三维培养的CAF中，α-SMA的蛋白表达明显低于2D培养，这说明2D培养中的塑性粘附促进了CAF的激活。然而，即使在三维培养中活性较低的状态下，钙泊三醇也不会降低α-SMA在CAFs中的表达(如图所示)。1D和补充图。沙一C在线)。为了更接近CAFs在肿瘤微环境中的生理状态，我们在胶原基质中加入了由胰腺癌细胞株PANC-1组成的肿瘤细胞球体。然而，钙三醇的存在并没有降低α-SMA的表达。1d)。在分析α-SMA的MFI时，观察到了同样的模式(见附图)。沙一C在线)。为了进一步验证我们的流式细胞术结果，我们对α-SMA在CAFs上的三维胶原培养物进行了免疫染色分析(以红色显示)，并与PAC-1球体(蓝色紫罗兰细胞示踪剂染色)共培养。1d)。α-SMA染色强度与未处理培养相似.因此，在我们的手中，我们没有发现维生素D的任何下调作用。3在蛋白质水平上，无论是2D培养还是3D培养，CAFs中的α-SMA类似物。相反，钙泊三醇促进α-SMA蛋白在CAFs中的表达。

跨膜糖蛋白podoplanin是另一个已经被证明在肿瘤巢周围密集的胰腺间质中表达的标记物。与上述观察到的对α-SMA表达的影响相似，钙泊三醇在2D培养中增加了podoplanin的表达(如图1所示)。1(E)TGF-β不影响CAFs中podoplanin的表达.在三维培养中，钙泊三醇的加入对podoplanin的表达没有明显影响。1f)。

我们还试图研究其他方法，钙三醇可以影响CAFs的激活在2D和3D模型。与一种更安静的表型一致，我们发现钙泊三醇降低了CAFs的增殖能力，这是由Ki-67在2D培养中的表达所决定的。2a)。CaF的增殖与α-SMA的表达呈负相关，在钙泊三醇的存在下，CAF的表达更为深刻。2b)。此外，划痕伤口愈合试验显示钙三醇在24小时和48小时后显著降低了CAFs的迁移能力(图1)。2c)。然后，在三维模型中进行胶原基质收缩实验，以评估CAFs的收缩能力及其重组纤维网络的能力，从而模拟肿瘤纤维化的发展。我们发现钙三醇对CAFs收缩胶原基质的能力没有明显的影响(图1)。2d)。

Cacipotriol降低了CAFs的增殖和迁移活性。用DMSO对照(填充圆环)或100 NM钙三醇(蓝色填充圆)处理CAFs 72h。a)DMSO对照钙泊三醇(钙三醇)治疗增殖性CAFs的频率n=10)，β(开放圆环)或β与钙三醇(蓝色开圆)(n7)流式细胞仪检测Ki-67的表达。(b(左)Ki-67和αSMA在未治疗的CAFs和(右)CAFs中的表达与钙泊三醇治疗的相关性(英文)n=16)。(c)(左)在24小时和48小时后用DMSO对照或钙泊三醇处理的CAFs法测定创面愈合情况。图显示已归一化为0h的面积百分比(n=11)。(右)具有代表性的伤口愈合实验(×4放大)在0，24，48小时后的图像。c)(左)胶原凝胶收缩实验：24h、48h和72h后，收缩面积的百分比在0 h时与面积成正比。n=9)。(右)一个供体的凝胶在24小时、48小时和72小时后的代表性图片。a–c)点之间的线表示成对的样本。使用Wilcoxon匹配对烧录秩检验来检测统计学上的显着性差异*p < 0.05, **p < 0.01.

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因此，虽然我们没有发现任何证据表明α-SMA和podoplanin在VDR信号后收缩能力下降或表达减弱，但钙泊三醇降低了CAFs的增殖和迁移能力。

钙泊三醇对CAF衍生免疫调节因子和促肿瘤因子的影响

接下来，我们研究了钙泊三醇是否能调节已知与CAFs的促肿瘤活性相关的免疫调节因子的表达。在此之前，我们已经发现胰腺cfs表达pd-l1和pd-l2这两种共抑制配体。23。值得注意的是，钙泊三醇上调了Pd-L1的表达，但另一方面下调了CAFs上PD-L2的表达。3a)。转化生长因子-β上调PD-L1和PD-L2的表达(图1)。3a)。在三维培养中证实了钙泊三醇对Pd-L1表达的影响，支持钙泊三醇促进CAFs上Pd-L1的表达。此外，在三维胶原基质中培养的CAFs表达的PD-L1水平高于2D培养的CAFs(图1)。3b)。Pd-L2在三维培养中的表达没有被研究，因为最初的实验表明，胶原酶能将CAFs从胶原基质中分离出来，从而大大降低了PD-L2的表面表达(见附图)。S2在线)。

IL-6、骨膜蛋白、LIF和前列腺素E2(PGE)2)，是被描述为在肿瘤进展中起作用的由咖啡豆衍生的可溶性因子。9,12,26,27。我们用酶联免疫吸附法(ELISA)检测了钙三醇存在或不存在时，2D培养的CAFs对这些因子的分泌情况。Cacipotriol对IL-6、膜蛋白、LIF和PGE的分泌有明显的抑制作用。2(无花果)3c)。在三维培养中，钙三醇能显著降低LIF和膜蛋白的生成。大多数供体的IL-6分泌减少(9例中有7例)。3d)。

总之，钙泊三醇可减少CAFs中多种促肿瘤因子和免疫抑制性可溶性因子的释放。但同时，它也促进了Pd-1配体PD-L1的上调，从而阻碍了T细胞介导的免疫应答。

钙泊三醇对CAFs作用下T细胞效应的影响

以前已经证明维生素D3可直接诱导肿瘤细胞生长停滞15,28。然而，数据也表明维生素D3抑制免疫激活和促炎反应17，它可能在肿瘤细胞生长的情况下以不利的方式起作用。因为CAFs对T细胞有免疫抑制能力23我们接下来研究了钙泊三醇在CAFs不存在和存在时对T细胞活化的影响。

与其他研究相一致，我们发现钙泊三醇对T细胞有较强的免疫抑制作用，并能抑制CD8的增殖。+和CD4+T细胞经抗CD3单克隆抗体OKT 3刺激后(见图)。4a)。当CAFs和钙三醇同时加入时，细胞的增殖进一步减少。钙泊三醇对T细胞的抑制作用还表现为活化标志HLA-DR在CD8上的表达降低。+和CD4+T细胞在CAFs存在的情况下(图1)。4b)。与单纯加钙三醇相比，CAFs和钙泊三醇联合应用可显著降低细胞增殖和HLA-DR的表达(图一)。4a，b)。促炎细胞因子IFN-γ、IL-17和细胞毒分子颗粒酶B(GrzB)的分泌在钙三醇存在下也减少。4c)。相反，钙泊三醇对免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌无明显影响。4c)。然而，钙三醇在非刺激条件下，在CAFs存在下，IL-10的生成增加(见图)。4d)。CD8中位比例+和CD4+本实验使用的PBMC中T细胞占CD3的43.1%(范围35.0~50.9)和52.5%(范围46.2~63.2)。+T细胞。

为了研究钙三醇促进的T细胞抑制是否部分是通过改变钙磷三醇的免疫抑制能力来实现的，我们接下来研究了钙泊三醇预处理48小时后在无钙三醇的情况下对T细胞活化的影响。我们发现，与对照组相比，预处理前后CAFs对T细胞增殖和IFN-γ及GrzB表达的影响相似(图1)。4e)。总之，钙泊三醇降低了T细胞的激活和效应功能，在CAFs的存在下，其作用更为深远。然而，钙三醇似乎并不影响CAFs的免疫抑制功能，而是以加性的方式与CAFs结合后直接介导对T细胞的抑制作用。

钙泊三醇对CAFs和肿瘤细胞T细胞效应的影响

接下来，我们研究了在由CAFs和PAC-1球体组成的三维培养中，T细胞是如何受到钙三醇的影响的。即使在这种情况下钙泊三醇对细胞增殖没有明显抑制作用，但cd8中的pd-1和Tim-3共同抑制性标记物也被下调。+T细胞(图1.5a)。此外，CD8的比例+加入钙泊三醇后，表达IFN-γ、GrzB和穿孔素的T细胞对佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯和离子霉素(PMA/I)的刺激作用明显减弱。5b)。在对自体T细胞和CAFs(用星星显示)进行实验时，也可以看到同样的模式(如图所示)。5a，b)。

钙泊三醇对CD8的免疫抑制作用+T细胞三维模型培养及肿瘤浸润CD8的实验研究+T细胞(a,bPBMCs单独培养或与CAFs和PAC-1球体共培养。用DMSO对照(填充圆环)或100 nm钙泊三醇(蓝色填充环)处理PBMC，用OKT 3(25 ng/ml)刺激PBMC 5d。第5天加入聚甲基丙烯酸甲酯/离子霉素4小时。a,b)表示(a)Ki-67，PD-1，Tim-3(n=6)和(b)IFN-γ、GrzB和穿孔素(n=6)在受刺激的CD8中+流式细胞仪分析T细胞。星体与虚线相连，代表PBMCs和CAF的自体配对样本。(c,d从胰腺肿瘤组织和PBMC中分离细胞，分别用DMSO对照或100 NM钙三醇处理，用OKT 3(25 ng/ml)刺激3~5d。在第3~5天加入聚甲基丙烯酸甲酯/离子霉素，共4小时(c,d)(左)表示(c)Ki-67(n=7)，PD-1，Tim-3(n=8)和(d)IFN-γ、GrzB和穿孔素(n=5)在受刺激的CD8中+流式细胞术检测肿瘤浸润性T细胞。(右)有代表性的流式细胞仪斑点图和直方图显示刺激的TIL在黑色和受刺激的TIL在蓝色的钙三醇处理。FMO以红色显示。(a–d)点之间的直线表示配对样本，直方图表示中间值。使用Wilcoxon匹配对烧录秩检验来检测统计学上的显着性差异*p < 0.05.

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钙三醇对胰腺癌组织T细胞的影响

其次，我们评价了钙三醇对来自胰腺肿瘤组织的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的影响，以及对同一患者PBMC的影响。CD3比例+淋巴细胞门内T细胞与CD8百分率+和CD4+CD3中+分离的TILs和PBMCs的T细胞见附图。S3在线。Pd-1在CD4上的表达+和CD8+TIL中T细胞高于PBMC(见附图)。S3在线)。细胞在钙三醇存在或不存在的情况下培养，用OKT 3刺激3~5d。用PMA/I刺激培养4 h，观察IFN-γ和细胞毒分子的表达。与三维共培养相一致，钙泊三醇抑制TIL增殖，下调Pd-1和Tim-3共抑制标记物的表达。5c)。两种CD8细胞中GrzB和穿孔素的表达均有下降。+TIL和患者PBMCs经钙泊三醇治疗后，4/5供者为GrzB，3/5供者为穿孔素。然而，CD8的比例+钙三醇对表达IFN-γ的TILs细胞无明显影响。5d)。总之，钙三醇似乎减少了T细胞的激活和功能，在三维模型和病人来源的TIL。

在胰腺癌中，基质约占肿瘤总数的80%。3并被认为是治疗结果极不理想的主要限制因素。3,4,5,6,12。基质中的主要细胞类型是CAFs，CAFs与癌细胞和免疫细胞等其他基质成分相互作用，是肿瘤发展的关键因素。然而，肿瘤内CAFs的功能异质性对肿瘤的靶向性提出了挑战。新出现的维生素D治疗方法3类似物的目的是将CAFs的激活状态重新编程成静止的表型，从而导致基质的重塑和存活率的提高。15。研究还表明cafs具有表型可塑性，可以在亲和抗肿瘤表型之间进行切换。8。在这里，我们展示了人类胰腺原代CAF对维生素D的反应。3类似物，钙三醇，促进分化为较少肿瘤支持的CAF表型。然而，钙三醇对T细胞也有免疫抑制作用，在CAFs存在的情况下，T细胞的免疫抑制作用更强。因此，虽然VDR刺激可能对胰腺CAFs的表型有有利的影响，但一种潜在的T细胞介导的对肿瘤细胞的反应可能同时被维生素D所抑制。3.

胰腺肿瘤细胞周围的基质和CAFs具有异质性，可能具有保护和促进肿瘤的作用。最近在文献中描述了几种表型。α-SMA高肌成纤维细胞通常定位于肿瘤细胞附近。8，这被认为可以抑制肿瘤细胞的生长和迁移。7。炎性α-SMA低层细胞位于离肿瘤巢更远的地方，与促进肿瘤的细胞因子(包括IL-6)的高表达有关。8。肿瘤源性转化生长因子-β被描述为促进分化为肌成纤维细胞，而IL-1信号通过JAK/STAT激活正在推动分化为炎性钙纤维。29。最近的另一项研究发现了四种不同的胰腺CAFs亚群，它们的podoplanin、periostin和myosin-11的表达模式不同，它们与预后有关。11。骨膜蛋白(POSTN)基因的高表达与生存不良有关，而podoplanin的膜表达则与预后良好有关。

我们发现VDR信号增强了CAFs中α-SMA和podoplanin的表达，而IL-6、LIF和膜蛋白的分泌减少。为了将我们的发现与上述关于CAF异质性和预后的研究结合起来，我们的数据表明维生素D3总体上促进肿瘤支持性CAFs的减少。

与更多的抗炎表型一致，我们还发现钙泊三醇降低了CAFs的增殖和迁移能力。这与观察到的致瘤因子IL-6、骨膜蛋白、lif和pge的减少是一致的。2以前已经证明能促进肿瘤细胞的生长8,9,10,11,12,26,27。值得注意的是，我们还发现钙三醇不影响CAFs的收缩能力，胶原收缩试验可以模拟肿瘤纤维化的发展。这一结果与Sherman等人的研究结果形成对比。.15世卫组织显示，VDR信号减少了小鼠胰腺炎模型的纤维化。钙三醇治疗可能逆转CAFs的表型，导致旁分泌信号减弱，进而阻碍肿瘤细胞的迁移和侵袭。然而，需要进一步的调查，以确认下调这些因素对肿瘤细胞的直接后果。

以前的研究表明，胰腺星状细胞对维生素D有充分的反应。3类似物通过下调编码α-SMA的基因，ACTA 2。在这里，我们还显示了ACTA 2基因在24小时和72小时对钙三醇的反应。ACTA 2人胰腺CAFs在VDR结扎48h后的表达15，但由于未知的原因，我们没有发现对ACTA 2这个时间点的表达式。然而，我们发现α基因水平与蛋白质丰度之间没有相关性，但我们发现，在2D培养中，在72h时，钙三醇确实上调了-SMA的实际蛋白水平。与以前使用相同的α-sma抗体克隆的研究相一致，我们发现α-sma对成纤维前细胞因子tf-β的反应增强了表达，表明α-sma染色是可靠的。25,30。这种明显的悖论的一个可能的解释是，蛋白质水平取决于不同的转录和转录后过程，以及翻译速率和蛋白质稳定性。因此，基因转录的变化往往与蛋白质水平无关。31,32,33.

α-sma在肿瘤中的表达常被用来鉴别病理性肌成纤维细胞的表达，其表达与收缩和成纤维活性的增加呈正相关。34，以及糟糕的临床预后11,35。然而，α-sma的缺失+胰腺癌中的CAFs被证明能诱导肿瘤的发展而不是抑制它。7。器官纤维化实验模型的研究进展36,37和口腔癌38α-SMA的表达与成纤维细胞的收缩能力无关。符合hlund等人的研究报告.暗示α-SMA高CAFs表现出抗炎表型，其他研究发现α-sma的过度表达降低了cfs的增殖活性。30,38。在钙三醇存在和不存在时，Ki-67和α-SMA的表达均呈负相关。这些有争议的结果，再加上不同caf亚群体的巨大复杂性，表明α-sma的实际作用。+癌症中的CAFs需要重新考虑。

在先前的研究中，我们发现cfs诱导T细胞表达共抑制标记物，抑制T细胞增殖和功能，阻断pge。2Pd-L1/l2部分恢复T细胞增殖。23。在此，我们研究了钙泊三醇对CAFs免疫调节分子表达的影响及其对T细胞的抑制作用。我们发现pd-l1在CAFs中的表达上调是对维生素D的反应。3表明维生素D升高3信号转导可通过PD-1抑制抗肿瘤免疫。这与季米特洛夫等人的研究结果是一致的。.世界卫生组织显示，人，而不是小鼠，上皮细胞和髓系细胞增加pd-l1在vdr信号上的表达。39。他们进一步发现维生素D介导的对T细胞的抑制可以通过Pd-L1中和而恢复。维生素D也上调了pd-L2基因(CD 273)在髓系细胞中，而非上皮细胞中，虽然本研究未检测到该蛋白的表达。相反，我们发现Pd-L2在CAFs中的表面表达受VDR信号的影响而降低。Pd-ll与pd-l2竞争与pd-1的结合，pd-l2与pd-l1的亲和力高于pd-l1。40。因此，PD-L1表达的增加可能被PD-L2表达的减少所抵消，以弥补PD-1介导的T细胞阻滞的相对影响。Pd-l2在cfs上的表达在肺癌小鼠模型中也被发现是pd-1的主要配体，导致抗原特异性T细胞的杀伤。41.

然而，由于PD-L1阻断可以恢复维生素D介导的T细胞抑制作用40,42钙泊三醇对cfs上pd-l1表达的增加可能与抑制CD8有关。+Pd-1参与T细胞活性。

在我们的2D文化中，根据以前的研究，维生素D3类似物强抑制CD8+T细胞增殖和功能增强，免疫抑制因子IL-10的产生增加。研究表明，维生素D促进了耐受性树突状细胞的产生，而树突状细胞又诱导了CD4。+CD 25+Foxp 3+和CD4+伊-10+小鼠模型中的调节性T细胞43。COX 2抑制恢复CAF介导的T细胞抑制作用23，暗示PGE2在这种情况下抑制T细胞活化是很重要的。虽然我们发现钙泊三醇降低了PGE的分泌2从CAFs中，VDR信号未能从CAF介导的抑制中拯救T细胞.事实上，CAFs和钙三醇的结合似乎进一步增强了对T细胞增殖的抑制作用，也部分增强了对T细胞功能的抑制作用。这些观察提出了一个问题：维生素D是否3类似物可影响CAFs的免疫调节功能。为了检查钙泊三醇是否同时作用于CAFs和T细胞，以介导T细胞的免疫抑制作用，我们研究了在加入钙泊三醇之前预先用钙泊三醇处理的CAFs如何影响随后的T细胞活化。钙泊三醇处理对T细胞的抑制程度与未处理的对照组相似，提示钙泊三醇直接介导T细胞的作用，而不是通过影响其免疫抑制活性。然而，也可以推测，钙三醇介导的潜在的钙三醇效应在没有钙三醇的情况下，在5天的培养过程中就失去了。总之，我们的数据表明，钙泊三醇对CAFs的抑制活性没有协同作用，但联合使用时对T细胞的抑制有加性作用。

在最近的研究中，科学界已经认识到使用三维细胞培养模型的优势。三维模型更准确地描述了组织环境，是研究细胞反应和相互作用的一种更合适的方法，也是模拟活体细胞命运和功能的更好方法。在这里，我们使用三维胶原细胞培养模型来更好地模拟CAFs、肿瘤细胞和T细胞之间的细胞相互作用。我们发现，与2D培养相比，α-SMA在三维培养中被下调，这表明细胞培养板的塑性表面触发激活的表型向更安静的表型逆转。Podoplanin在2D和3D培养中的表达相似，说明该标记的表达受塑料粘附的影响较小。虽然细胞在三维培养中采用了一种更安静的表型，但他们仍然通过下调促肿瘤因子IL-6、膜蛋白和LIF的释放来响应钙泊三醇，这与我们从2D培养得到的结果是一致的。然而，与2D培养相比，钙泊三醇对CAFs中α-SMA和podoplanin的表达无明显影响。我们进一步证明cfs和panc-1球体抑制了CD8的增殖活性和功能。+当钙三醇加入到共培养物中时，抑制作用更加明显。为了证实这些结果是否与天然肿瘤微环境相似，我们从人胰腺肿瘤组织中分离出细胞，并用钙泊三醇治疗。我们发现钙三醇对CD8有相似的作用。+肿瘤浸润T细胞，如3D和2D模型，通过下调增殖、Pd-1和Tim-3的表达，部分抑制T细胞的功能，从而阻碍T细胞的活化。因此，虽然对钙三醇反应的CAF活化标记在2和3D培养中可以检测到差异，但在这两种实验装置中，CAFs的促肿瘤因子的分泌和T细胞功能都有减少。

在研究vdr信号时要考虑的另一个方面是缺乏维生素D的保护。3非灵长类动物的反应元件。许多在vdr信号传递后在人类细胞中被激活的基因在小鼠细胞中没有被诱导。42,44。例如，抗微生物肽人β-防御素2和模式识别受体NOD 2在人类细胞中被诱导，但在维生素D刺激下没有在小鼠细胞中诱导，这导致在病原体威胁期间，人而非小鼠的天然免疫反应增强。42。同样，维生素D3能诱导抗微生物肽释放素的产生，当它被切割成活性形式LL-37时，参与宿主防御和免疫调节。高水平LL-37水平与PDAC肿瘤干细胞的生长、存活及促血管生成作用有关。44。由于编码ll-37的基因在人体内是由vdr激活控制的，而不是在小鼠体内，所以维生素D的正向效应。3在PDAC小鼠模型中观察到的PDAC应谨慎解释。由于适应性免疫系统在癌症监测中的重要性，可以推测2D或3D细胞培养模型可以更好地研究维生素D的作用。3肿瘤微环境。

维生素D的有利结果3癌症中的类似物由于其在细胞周期阻滞、抑制细胞侵袭能力等方面的作用，主要集中在癌细胞上。45,46，以及抗血管生成活性。47,48。然而，尽管这在癌症的早期阶段似乎是有益的，但在肿瘤进展过程中，癌细胞可以下调VDR，并对维生素D补体产生抗药性。49。最近一项关于胰腺癌的研究报告了维生素D类似物对PDAC准间充质亚型癌细胞的不利影响，导致转移的迁移和发展。50。因此，取决于分期和癌症亚型，维生素D补充剂可能不仅无效，而且可能产生负面影响，尽管这需要在更大的临床试验中证实，才能得出任何确切的结论。

T细胞是适应性免疫系统和CD8的关键因子。+T细胞是肿瘤监测的主要效应细胞。因此，在过去的十年中，免疫治疗药物由于其在增强患者的效应T细胞杀死癌细胞方面的新作用而在癌症治疗中提供了巨大的益处。我们的结果表明，VDR信号抑制适应性免疫系统，这可能危及患者的抗肿瘤免疫，因此，可能会抵消免疫治疗的效果。然而，正在进行的和未来的临床试验使用PD-1阻断和维生素D类似物治疗将确定维生素D是否能将CAFs转移到更抗炎和抗肿瘤表型，以及检查点阻断是否能促进T细胞介导的胰腺癌抗肿瘤反应。

病人样本

如前所述，在瑞典哈德丁格Karolinska大学医院上消化道疾病科从19例接受手术的患者中收集了胰腺肿瘤组织。23。采集患者和健康献血员外周血标本。所有研究都是按照相关准则和条例进行的。从所有与会者获得书面知情同意。所有患者均在18岁以上。这项研究和所有实验协议都得到了瑞典斯德哥尔摩地区伦理审查委员会的批准(条目编号)。2013/977-31.3和2017/722-32、2018/1792-31/2)。

细胞分离

肿瘤相关成纤维细胞(Cafs)是从刚刚切除的胰腺肿瘤组织中分离出来的。23。将组织切成小块，在Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(GE Healthcare，South Logan，UT，USA)中加入10%胎牛血清(PAA实验室，GMBH，奥地利帕斯清)和100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Hyclone，South Logan，UT，USA)在标准培养条件(37°C，5%CO)中培养。2)。将CAFs迁移出组织碎片，扩展至第3~4代，冷冻保存至分析。

分离的CAFs的表型以前已由我们的小组发表过。23。CAFs标记CD 29、CD 44、CD 73、CD 90、CD 105阳性，PD-L1、PD-L2和αSMA部分阳性。CAFs中内皮标记CD 31和上皮标志物EpCAM均为阴性。为了分离肿瘤浸润淋巴细胞，用手术刀将肿瘤组织块(平均160毫克)切成小块，用GentleMACS解离器机械分解细胞(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)。细胞悬液经70μm细胞滤池(VWR，RADOR，PA)过滤，洗涤后冷冻保存，待分析。采用密度梯度法(#1114547，AxisShield，Dundee，UK)从患者和健康献血者中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)。

维生素D3模拟

维生素D3类似物，钙三醇，(英国，阿宾登，杜格拉底)溶解在DMSO中，100μM的原液储存在−20°C。

CAF的2D培养

CAFs在25×10浓度的24孔板中培养。5细胞/在标准培养条件下。用钙三醇(100 NM)或二甲基亚砜(DMSO)处理细胞72h，用流式细胞仪进行分析。在一组实验中，加入了10 ng/ml转化生长因子-β(#MAB 246，R&D系统，明尼阿波利斯，美国)。

实时qPCR

为确定基因在CAFs上的表达情况，将细胞在6孔板上培养24、48和72h，用DNA/RNA Mini Kit(Chiagen，Hilden，德国)提取RNA，用SuperScript Vilo cDNA合成试剂盒(美国Waltham，Waltham，Thermo Fisher Science)进行cDNA合成，然后进行qPCR。成绩单VDR, CYP24A, 卡姆p，ACTA 2，还有看家基因18S用SYBR绿(Thermo Fisher Science)和正/反向引物混合扩增rRNA(见补充表)。沙一并在下列条件下使用实时qPCR(CFX 96实时PCR检测系统，Bio-Rad)进行测量：

VDR, CYP24A和夏令营92°C为10 min，95°C为45次，15 s为45次，65°C为1 min。18S和ACTA 295°C为10 min，95°C为45次，15 s为45次，60°C为1 min。资料采用三角洲-三角洲CT方法进行分析，并以褶皱变化表示.

球体

Panc-1球体是按照其他人以前的描述建立的。51。细胞首先在T75瓶中培养，在完全的DMEM培养基中培养。在含甲基纤维素的100μL培养基(#M 0512，Sigma-Aldrich，美国圣路易斯MO)中，培养96孔板，浓度为2500个/孔，最后浓度为0.24%。细胞在标准培养条件下连续4天形成球形，然后再进行三维培养。甲基纤维素的原液是按照先前公布的协议制备的。51.

三维模型与培养

胶原基质是通过修改别人发表的协议来制备的。52。1×10浓度原代成纤维细胞5细胞/基质与PureCol牛Ⅰ型胶原蛋白(#5005，高级生物基质，圣地亚哥，CA，美国)和5×Dulbecco改良鹰培养基(#31600-083，Thermo Fisher Science)混合，pH值为7.2，添加L-谷氨酰胺(#SH 30034.01，HyClone)，NaHCO。3、FBS和PEST的最终浓度为2mg/ml的胶原I。添加的试剂的数量可作为补充表。S2在线。

在24孔板的非组织培养中加入200μL的脱细胞胶原层。30 min后，在脱细胞层顶部加入6 0 0μL的细胞胶原层，聚合2h后，用吸管将基质从壁上分离出来，加入100 NM钙三醇或DMSO的DMEM培养基。基质在标准培养条件下孵育72h，用流式细胞仪分离和分析CAFs。

在一组实验中，在细胞胶原层中加入20个PAC-1/孔球体。为用流式细胞仪区分CAFs和PANC-1，在37°C下，用细胞示踪紫(#C34557，分子探针，生命技术，CA，USA)(3μg/ml)对CAFs进行了10 min的染色。

将基质切成小块，用0.25mg/ml胶原酶Ⅳ(#C 5138，Sigma-Aldrich)和0.25μg/mlDNaseⅠ(#10104159001，Sigma-Aldrich)在37°C水浴中温和摇动。5~10 min后，在消化液中加入5mmEDTA，用70μm细胞过滤器过滤细胞。

收缩试验

在24、48和72h后，用CAFs制作三维模型，并对其进行图像处理，用图像J(NIH，Bethesda，MA，USA)测量其面积。数据表示为收缩面积百分比与凝胶面积在0h归一化。

免疫荧光

胶原基质中的细胞用4%多聚甲醛和0.5%戊二醛固定20 min，用PBS洗涤两次。阻断前(1%BSA和4%山羊血清在0.1%吐温-20-PBS中)，用0.3%X-100 Triton在PBS中渗透10 min，用PBS冲洗3次。以非共轭抗α抗体(小鼠单克隆抗体#14-9760-82，热费舍尔科学，稀释1：100)为一抗。采用山羊抗小鼠二次抗体(稀释倍数1：1000)进行荧光检测。为了检测PAC-1球体，细胞在加入胶原前先用紫罗兰色细胞示踪剂进行染色。使用奥林巴斯IX 71荧光显微镜，用奥林巴斯DP 71相机拍摄照片。这些数据是用Cellsens维度软件收集和编辑的(奥林巴斯，日本东京)。

划痕伤口愈合试验

CAF被镀在6孔板中，并生长到90%的汇合度.然后用10μL管尖进行划痕。培养物用钙三醇(100 NM)或DMSO处理。分别于伤后24h和48h拍照，用图像J分析伤区，将数据表示为伤区归一化为初始伤区的百分比。

二维和三维培养物的增殖试验

健康供者外周血单个核细胞在37℃的pBS中用羧基荧光素琥珀酰酯(Cfse)(#c34554，分子探针，生命技术)标记15 min，洗后细胞在24孔板(1×10)中镀膜。6)在有无30 Gy照射的情况下，以1：10的比例照射CAF(每10个PBMC 1个CAF)。培养基为RPMI-1640(Ge Healthcare，South Logan，UT，USA)，添加10%人AB血清和PEST。

从胰腺癌组织中分离出细胞悬液，在96孔圆形底板上镀钙三醇或DMSO。对于3D培养，来自健康供者的PBMC(1×10)6)在胶原层中加入CAFs和PAC-1球体。培养基为RPMI-1640+10%FBS+PEST。用OKT 3(25 ng/ml)(#317315，Biolegend)刺激2D和3D模型中的PBMC，培养开始时用钙三醇(100 Nm)或二甲基亚砜(DMSO)处理。在一组实验中，钙磷三醇预处理48小时后再加入PBMCs。第5天，直接从凝胶中提取或分离PBMCs，用流式细胞仪对其进行分析。在细胞内检测细胞因子时，用25 ng/ml pMA、1μg/ml离体霉素、10μg/ml bregeldin-A(#79346、#I 0634和#B 7651 Sigma-Aldrich)和高尔基停止(稀释1：625，#554715，BD)作用4h。

流式细胞术

取或分离2和3D培养的CAF和PBMC，用FACS缓冲液(2mm edta，0.2%牛血清白蛋白)冲洗，用96孔板进行适当的单克隆抗体染色(见附表)。S3在线)。细胞外染色用7AAD区分活细胞和死细胞。细胞内染色采用BD细胞固定/Cytoperm试剂盒固定。根据制造商的指示，使用固定性活性染色法来区分活细胞和死细胞。FACSCanto II(BD)用于数据采集，Flowjo(BD)版本10.6.1用于数据分析。

ELISAs

PGE水平2(#514010，开曼化学，安阿伯，美国，MI)，围乳素(#DY 3548 B，R&D系统)，lif(#DY 7734-05，研发系统)，干扰素-γ(#3420-1H-6，mabtech)和颗粒酶B(#3585-1H-6，mabtech)。针对IL-6、IL-10和IL-17，采用单克隆抗人捕获抗体#MAB 206、#MAB 127107和#MAB 317(R&D系统)，建立了重组人抗体#206-IL、#1064-IL、#317 IL(R&D系统)和生物素化抗人抗体#BAF 206、#BAF 217、#BAF 317(R&D系统)的ELISA。将链霉亲和素与多辣根过氧化物酶结合用于所有酶反应(#M 2032，Sanquin，荷兰阿姆斯特丹)。