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ACE 2小鼠模型:心血管和肺研究的工具箱

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发表时间:2020-10-15 15:53作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

血管紧张素转换酶2(ACE 2)是引起新冠肺炎大流行的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的宿主进入受体。ACE 2是肾素-血管紧张素系统的调节酶,在许多心血管、肺和代谢疾病中具有保护作用。本文综述了具有ACE 2全身性或器官特异性缺失或小鼠或人ACE 2过度表达的小鼠模型。本文旨在为研究人员进一步了解ACE 2生物学和研究新冠肺炎的发病机制和治疗提供遗传学工具。

导言

血管紧张素转换酶2(ACE 2)最初发现于2000年,是一种能将血管紧张素(Ang)-Ⅱ切割成较短的Ang-(1-7)肽的单羧肽酶。1,2。Ace 2的其他底物后来被证明包括des-arg。9-缓激肽,Apelin 13和36,β-酪蛋白,新钙吗啡,强啡肽A3。ACE 2基因位于X染色体上,在人类中含有18个编码外显子(小鼠19个),其中第9个外显子存在一个单一的锌结合区(Hemgh),这是对酶活性的限制。4。有趣的是,ACE 2的表达在很大程度上是由大多数组织中的一个近端启动子驱动的,但它在肺内由远端启动子控制。5。对于ACE 2的最初兴趣主要围绕肾素-血管紧张素系统和ACE 2对抗该系统过度活动的能力,特别是在心血管和肺疾病中。事实上,通过代谢八肽Ang-Ⅱ到Ang-(1-7),ACE 2降低了Ang-Ⅱ1型受体(AT)的激活。1负责交感神经兴奋、盐和水再吸收、醛固酮分泌、加压素释放和血管收缩。1)。ACE 2的表达对系统性高血压、肺动脉高压(PH)、心力衰竭、糖尿病、肾脏损伤和肝纤维化等疾病的发生有一定的促进作用。然而,翻译后的机制,如崩解素和金属蛋白酶结构域蛋白17(ADAM 17)介导的脱落。6,7和AT1R依赖内化8已经证明限制了ACE 2的有益影响(图2)。1)。为了克服这些限制,研究小组研究了使用重组人ACE 2、基因治疗或ACE 2提高ACE 2表达或活性的潜在治疗效果。活化剂9。出乎意料的是,ACE 2被确定为受体适用于各种冠状病毒,包括严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(sars-cov)。10在2002至2003年间,SARS在中国和其他25个国家蔓延。随后,据报告,ACE 2也是受体NL 63(HCoV-NL63)11,以及对2019年冠状病毒疾病(新冠肺炎)大流行负责的SARS-CoV-2。1)12。这一发现导致了大量的研究,研究sars-ACE 2之间的关系,并在过去20年中建立了一系列的小鼠遗传模型,以了解ACE 2在心血管调节和传染病中的作用(表)。13)。因为小鼠ACE 2不能有效地与sars-cov或sars-cov-2结合。13,已经产生了几条ACE 2-人化小鼠品系,并可与新冠肺炎疫情相关的研究相关(见表)。4)。不幸的是,并非所有模型都已提供给研究界,而且由于缺乏原始描述中提供的细节,往往难以为特定类型的研究确定一个具体的模型。本文综述了不同的敲除(KO)、敲除(Ki)、条件KO和人源化ACE 2小鼠模型、它们的主要表型及其在ACE 2和冠状病毒研究中的潜在应用。

图1:ACE 2翻译后调节和病毒感染的机制。
figure1

血管紧张素(Ang)-II与其1型受体(AT)结合1R)导致AT的内化1R-ACE 2复合物到早期内小体,从而阻止Ang-Ⅱ进一步水解为Ang-(1-7)。在…1然后r被回收到质膜,而ACE 2在溶酶体中被降解(左)。此外,AT1血管紧张素Ⅱ的激活导致ADAM 17从细胞质池中被激活,并转移到质膜上,从而使ACE 2外显子区释放出一种分泌型酶(SACE 2)(中间)。最后,ACE 2作为SARS-CoV-2的受体,通过clathrin包被的凹坑触发细胞内吞.由丝氨酸蛋白酶TMPRSS 2启动的尖峰蛋白也是病毒进入的必要条件(右)。

表1全球ACE2KO模型及相关表型。
表2条件ACE2KO模型及相关表型。
表3 ACE2Ki模型及相关表型。
表4人源化小鼠ACE 2模型及相关表型。

全局ACE2KO模型

在2000年发现ACE 2之后,有几个小组产生了具有全球缺失的小鼠。ACE 2基因利用传统的同源重组、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)技术,以及最近的crispr/ca 9。14,15,16,17,18,19,20,21。有趣的是,这些小鼠的表型在实验室中并不完全一致,这在一定程度上归咎于模型的遗传背景。22。为了方便起见,对这些ACE2KO型号的描述按原产国分类(表)。1).

加拿大

约瑟夫·彭宁格博士的小组建立了一个广泛采用的全球ACE2KO小鼠模型。14。KO小鼠以含锌结合催化结构域的230 bp区为靶点,将新霉素耐药基因盒置于反义方向(图1)。2)。这些KO小鼠的原始遗传背景为C57BL/6和129S1/SvImJ。在使用这一行的初步研究中,Crackower等人。14据报道,由于ACE/ACE 2平衡的解偶联,出现了严重的心脏表型。然而,回交到C57BL/6背景后,心脏表型不再被观察到。14。从那时起,这条线就被广泛地应用于各种疾病模型中。总之,这些研究表明,ACE 2对Ang-Ⅱ介导的或压力过载性心力衰竭有保护作用。23,24,心肌梗死25血管功能障碍与动脉粥样硬化26,27腹主动脉瘤28肝脂肪变性和纤维化29,30肥胖或糖尿病相关代谢和心血管疾病31,32肾纤维化和炎症33,34糖尿病或高血压相关肾病35,36...独立于ACE 2在Ang-Ⅱ/AT平衡中的作用1R信号转导,利用这个KO系的研究也证实了ACE 2和氨基酸转运体B之间的联系。0AT1,并删除ACE 2导致肠道色氨酸摄取减少,5-羟色胺代谢改变37,38。这些后一发现被认为是重要的调控微生物组。

图2:mAce 2基因在KO小鼠和条件KO小鼠中的靶向策略。
figure2

ACE2KO模型的原理图。老鼠ACE 2基因包含19个外显子,在这些模型中删除的区域以紫色突出显示。ACE 2活性位点的第9外显子(绿色)代码。浮子外显子的侧翼是氧氟沙星位点。

值得注意的是,使用这条线来理解ACE 2在急性肺损伤(ALI)中的作用的研究与正在进行的新冠肺炎研究特别相关。Kuba等人报告了首次在肺部疾病环境中使用这种ACE2KO小鼠的研究。39,作者用临床分离的SARS-CoV感染KO小鼠和对照组小鼠,发现ACE2KO小鼠对SARS-CoV感染具有耐药性。感染ACE2KO小鼠肺组织的病毒滴度比SARS-CoV野生型(WT)小鼠低5条。感染ACE2KO小鼠肺无炎症征象,而SARS-CoV感染的WT小鼠表现为轻度炎症并伴有白细胞浸润。然而,这项研究的意义被以下事实所削弱:在WT小鼠中观察到的轻微表型并不能反映SARS-CoV患者所观察到的疾病严重程度。在随后的一项研究中,一株小鼠适应的sars-cov株名为ma 15(通过体内15代sars-cov在幼龄BALb/c小鼠的呼吸道中获得),产生了与sars-cov感染的人相当的肺和全身表型。40。可以采用类似的方法来研究新冠肺炎。

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种危及生命的ALI.新冠肺炎患者的临床观察表明,ALI和ARDS是导致老年人过度死亡的主要因素。利用彭宁格实验室的ACE2KO小鼠研究了ACE 2在ALI/ARDS发病中的作用。IMaiet al.41我们的团队42显示ACE2KO小鼠与WT小鼠相比,在酸性吸入性感染或脓毒症后表现出严重的疾病进展。铜绿假单胞菌感染致ALI/ARDS表现为血管通透性增强,肺水肿增加,中性粒细胞积聚,肺功能恶化。除了ACE/AT的不平衡1我们的研究小组最近发现,缺乏肺ACE 2也会导致de-arg失活。9-缓激肽,可增强缓激肽B1受体的刺激,并在细菌内毒素刺激下加重肺部炎症。43.

ARDS的一个特点和长期后果是肺纤维化导致的肺顺应性降低。采用博莱霉素肺纤维化模型,Rey-Parra等。44观察到男性ACE 2−/y与WT相比,小鼠运动能力下降,肺功能下降,肺纤维化加重。与男性相比(ACE 2−/y)、女性(ACE 2−/−)博莱霉素暴露于小鼠体内,肺功能和结构得到改善,胶原沉积减少。44这表明性二分法与目前关于新冠肺炎在男性和女性中的流行情况相一致。

在病毒肺部感染方面,缺乏ACE 2的小鼠在甲型H5N1和H7N9感染后的肺损伤比WT小鼠更严重。45,46。呼吸道合胞病毒感染后也有类似发现。47。综上所述,上述观察表明,该品系小鼠可用于研究SARS-CoV-2感染所致ALI/ARDS。

美国

Gurley等人报告了另一种流行的ACE2KO模型。152006年,与千禧制药公司合作,采用了与Crackower等人类似的战略。(无花果)2)14。嵌合小鼠最初被回交到C57BL/6J或129/SvEv背景上。肾中缺乏ACE 2 mRNA转录或蛋白。ACE 2−/y动物。据报道,这些ACE2KO小鼠生育能力强,缺乏任何大体的解剖或结构异常,寿命正常。15。然而,在我们和其他人手中48,49与WT C57BL/6J相比,这些小鼠发育速度慢,体积小。妊娠期也受到负面影响。ACE 2−/−DAMS表现为妊娠期增重、胎儿生长受限和幼犬吸收增加,这与胎盘中Ang-Ⅱ水平升高、胎盘缺氧和脐带血流速降低有关。50,51。类似于Yamamoto等人所生成的ACE2KO线。17,这些ACE 2−/y混合遗传背景的小鼠被发现缺乏最初由Crackower等人报道的心脏表型。14。相反,收缩压(BP)轻度升高,回溯到C57BL/6J,而不是129/SvEv背景时,血压保持不变。15。然而,这些小鼠表现出高血压增强。15和心肌功能障碍52皮下输注高水平Ang-Ⅱ后。同样,在高脂饮食喂养后,这些aec2ko小鼠的收缩压也有所增加。53或诱发1型糖尿病48。使用该模型的其他研究表明,ACE 2缺失导致空腹血糖升高49,葡萄糖不耐受49,减少葡萄糖刺激的胰岛素分泌和β-细胞质量。54,易患动脉粥样硬化斑块55、自主神经功能障碍56,氧化应激增加56,以及腹主动脉瘤57.

作为包括472个小鼠KO系在内的一个系统表型项目的一部分,另一个ACE2KO是由Genentech-LDicon利用外显子1的同源重组而产生的(图1)。2)16。与其他ACE2KO不同的是,在这些实验中观察到了产前致命性。ACE 2−/−纯合突变体虽然缺乏细节,但有系统的筛选表明,突变影响了多器官系统,包括心脏、大脑和眼睛。在男性中,在基线时观察到的体型稍小,体重增加也有所减少。58。当受到肝损伤治疗时,这些小鼠表现出更强的肝脏炎症反应和对肝纤维化的敏感性。58。当暴露在香烟烟雾中时59或微粒物质60与WT对照组相比,ACE2KO小鼠的体重下降更为严重,静息呼吸频率、肺炎症反应和支气管增生明显增加。这条线已经在突变老鼠资源和研究中心(#031665-UCD)被冷藏.

日本

不是针对酶的催化位点,Yamamoto等人。17引导他们的新霉素盒外显子3,从而删除密码子116-147,包括剪接供体和受体位点(图1)。2)。以C57BL6J为背景培育小鼠,Westernblotting和实时qPCR证实缺乏ACE 2。作者未能看到Crackower等人报告的心脏功能改变和肥大。14,虽然是一项后续研究61证实了这些小鼠出生后心肌肥大。在压力过载的情况下,观察到心脏收缩力下降和左心室扩张。17。在该模型中,心脏和血清Ang-Ⅱ水平升高,AT升高。1下游信号,被AT阻断1受体阻滞剂坎地沙坦提示ACE 2缺乏对Ang-Ⅱ的清除是导致该病的原因之一。17。虽然体重、平均血压、肾重、血清Ang-Ⅱ、肌酐在两组间无显着性差异(P>0.05)。ACE 2−/y与WT对照组相比,肾血管紧张素Ⅱ水平在基线时增加了3倍,诱导1型糖尿病可导致早期蛋白尿和更严重的肾小球/肾小管间质损害。ACE 2−/y小鼠62.

对此ACE2KO模型的进一步研究显示,袖口诱导的新内膜形成增加。63葡萄糖不耐受与胰岛素抵抗64,葡萄糖转运体(GLUT)4和肌细胞特异性增强因子2A在肌肉中的表达64,动脉粥样硬化性病变65,认知功能受损伴随AT的增加1海马R的表达与氧化应激66。血管紧张素相关基因表达增强,血管紧张素-(1-7)输注可改善肌肉力量不足和骨丢失。ACE 2−/y小鼠67。而ACE 2缺乏引起的代谢紊乱与新冠肺炎的报道一致。68SARS-CoV-2感染对这些患者认知功能缺陷和肌力的影响尚不清楚。

中国

靶向同源重组(−2000~+489 bp)ACE 2)在D3胚胎干细胞中利用秦氏等人的基因。18(无花果)2)生成ACE2KO模型,并通过westernblot分析证实缺失。第一阶段胰岛素分泌受损,葡萄糖敏感性增强,肝脏GLUT 2表达减少,氧化应激增强,β-细胞去分化,尽管基线体重、空腹血糖和胰岛素水平没有改变。69,70,71. ACE 2−/y经肢体缺血再灌注治疗后,远端肾、肺损伤增强,死亡率增加。72,73。缺乏ACE 2也会导致更严重的急性胰腺炎。74。此外,ACE 2−/y小鼠对脂多糖致肺损伤的反应增强,骨髓间充质干细胞过度表达ACE 2所致肺损伤。75。该模型可从中国医学科学院和北京协和医学院实验动物科学研究所(北京,中国)获得。

刘等人19最近描述了用CRISPR/Cas9技术生成的鼠标线,具有最广泛的ACE 2基因缺失到目前为止(图1)。2)。在mRNA和蛋白质水平上证实了跨外显子3-18的缺失。目前没有这些小鼠的表型数据。CRISPR/Cas9基因打靶技术也被用于产生移码突变。ACE 2基因位于未知位置,形成了一条新的ACE2KO基因系20SU 5416/低氧诱导的PH加重,内皮型一氧化氮合酶磷酸化明显降低。另一种使用CRISPR/Cas9设计的模型可在C57BL6J背景下使用(B6/JGpt-)ACE 2Em1Cd/GPT),来自国家模型小鼠资源中心(NRCMM);Www.nrcmm.cn南京大学动物模型研究中心(MARC)。

利用TALEN诱导的双链断裂技术,构建了ACE2KO小鼠系。ACE 2启动密码子的下游位置(如图所示)。2),导致ACE 2移码突变21。生成ACE 2−/y以昆明为背景的小鼠,对葡聚糖硫酸钠所致结肠炎的易感性增强,结肠组织学损伤增强,炎症细胞因子表达上调。21.

全球ACE2KO模型综述

虽然上述现有的全球ACE 2 KO模型在基线(体重、血压、心脏表型等)上表现出一些差异,但它们对心脏代谢挑战或炎症性侮辱的反应基本一致,突出表明ACE 2在心血管、肺和代谢疾病中的保护作用。Sars-cov-2劫持细胞ACE 2并破坏这些保护作用,这可以解释新冠肺炎在高血压、糖尿病和代谢疾病患者中的发病率和严重程度,他们已经患有Ang-ii/AT。1R信号和/或降低ACE 2功能68.

条件ACE2KO模型

我们小组最近报告了一种ACE 2适用于特定细胞或组织缺失的模型76。这些小鼠是在彭宁顿生物医学研究中心(路易斯安那州立大学)利用从Knockout小鼠项目获得的胚胎干细胞而产生的,该项目位于该项目的侧翼(图4)。2)。鞋匠等人也曾报道过类似的模型。77。使用CRISPR/Cas9,在C57BL6J背景(B6/JGpt-)上可获得另一种条件ACE2KO模型。ACE 2Em1CFlox/GPT)来自NRCMM和MARC,但没有列出关于该结构的详细信息。表中列出了条件ACE2KO模型和相关表型2.

神经元ACE 2缺失

据报道,ACE 2通过将Ang-Ⅱ转化为Ang-(1-7),从而抑制氧化应激,改善心脏压力反射和自主神经功能,从而有助于预防神经源性高血压。56,78。利用突触素1-cre小鼠,我们的研究小组研究了ACE 2在参与bp调节的特定下丘脑神经元群中的作用。76。选择性删除ACE 2与脑内ACE 2活性显著降低有关。对投射到肾脏的下丘脑神经元进行膜片钳,显示抑制性突触后电流减少,提示ACE 2支持这些神经元的抑制性张力。这一点得到了GABA能神经元ACE 2的进一步支持。76。该模型可能与研究sars-cov-2对中枢神经系统的外显和取向有关。79.

肺上皮细胞ACE 2缺失

使用相同的ACE 2浮线76,我们生成了一个鼠标模型,其中ACE 2从Forkhead盒蛋白J1(Foxj 1)中特异分离基因+肺上皮细胞(ACE 2ΔFoxj 1)用Foxj 1杂交小鼠。CRE小鼠42。后代健康、肥沃,无明显肺表型,按预期孟德尔比例繁殖。正如预期的那样,这些小鼠的肺中ACE 2的表达和活性降低。当受到铜绿假单胞菌细菌性肺炎模型ACE 2ΔFoxj 1与WT相比,小鼠体重减轻,中性粒细胞浸润增加,肺损伤和炎症反应明显。42。这些结果表明,肺上皮细胞ACE 2在对致病性侮辱的肺炎症反应中起着重要的调节作用。

ACE 2在脂肪细胞上的缺失

ACE 2有助于肥胖和高血压的性别差异,因为雌激素被认为能增加肥胖女性脂肪细胞上ACE 2的表达,从而减弱代谢和血流动力学表型。53。探讨ACE 2在脂肪组织中的保护作用。77育成ACE 2Fl/y在脂肪细胞特异性启动子脂联素的控制下携带Cre重组酶ACE 2fl/fl)。ACE2mRNA在脂肪组织中下降约50%,而在其他组织中未受影响。虽然缺乏ACE 2的脂肪细胞对肥胖的发展没有影响,但这些动物的收缩期血压和对Ang-Ⅱ的急性升压反应增加。77。这些数据表明ACE 2在脂肪细胞上的表达以性别依赖性的方式调节BP,SARS-CoV-2诱导的ACE 2功能的改变可能加重肥胖个体的心血管功能障碍。

ACE2KI模型

这些模型对于函数增益的研究尤其有用。在这里,ACE 2基因要么发生突变,要么由一个特定的启动子控制其表达(如图所示)。3和表3).

图3:ACE 2在转基因小鼠和Ki小鼠中的表达。
figure3

由特定的鼠标(金)、人类(绿色)或其他(蓝色)启动子驱动的不同功能增益模型的原理图,用于普遍存在或靶向的ACE 2过度表达。Rosa 26:本构型和普遍存在的基因表达位点;K18:以上皮细胞为靶点的细胞角蛋白18启动子;CMV:巨细胞病毒启动子用于本构表达;hfh 4:肺纤毛上皮细胞特异性启动子;Syn:突触素1启动子用于神经元表达;α-mhc:α-肌球蛋白重链用于心脏特异性表达。氧氟沙星:cre-重组酶介导的终止密码子切除的位点。

ACE2 S680D KI

在探讨ACE 2在PH发病机制中的作用时,Zhang等。20发现AMP激活的蛋白激酶在ACE 2蛋白680位的丝氨酸(Ser)磷酸化可提高ACE 2的稳定性,从而增加Ang-(1-7),提高内皮细胞NO的生物利用度。为了探讨这一观察在体内PH和其他心血管疾病中的翻译意义,作者创建了一个ACE 2S680D Ki小鼠系采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,用天冬氨酸(D)代替丝氨酸(S),由于泛素介导的降解而导致功能增益突变。ACE 2S680D突变产物20。当受到SU5416/缺氧-复氧时,ACE 2与WT小鼠相比,S680D Ki小鼠右心室收缩压降低,富尔顿指数降低,但收缩压无明显差异。此外,SU5416/低氧复氧后,WT小鼠肺动脉肌化、管腔狭窄和血管形成异常等现象基本不存在。ACE 2S680DKI小鼠20。这些观察表明,一个功能增益突变ACE 2 680Ser对PH的发展具有保护作用。目前尚不清楚这些小鼠体内ACE 2的突变是否会影响SARS-CoV-2的感染。

Rosa26-ACE2KI

在这个自交系中,维持在C57BL/6和129/Sv的背景下,老鼠ACE 2基因在内源rosa 26启动子调控下的表达80。这些ACE 2Ki小鼠的ACE 2 mRNA表达从肾脏的5倍,心脏的60倍,下丘脑的230倍不等。80,81。血浆中ACE 2活性增加了4倍,而Ang-(1-7)水平仅增加了50%,而Ang-Ⅱ水平没有受到显著影响。80,81。尽管ACE 2的表达和活性大量增加,但在基线条件下心脏和血流动力学参数并没有改变。然而,在心肌梗塞后,这些小鼠被证明减少了梗死面积和相关的炎症。81。在这些动物中,Ang-(1-7)介导的焦虑和血浆皮质酮水平的降低也被注意到。80,支持中枢ACE 2/Ang-(1-7)/Masr信号通路的抗焦虑功能。使用CRISPR/Cas9生成的类似模型可在C57BL/6背景(B6JGpt-ACE 2Em1Cin(HACE 2-停止)/GPT)来自NRCMM和MARC。

Rosa26-ACE 2条件基

通过在rosa 26启动子和ACE 2上述基因ACE 2Ki小鼠,Wang等。82产生了一条新的能耐受组织特异性过表达的小鼠ACE 2。促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)阳性细胞的选择性表达是通过与CRH-cre小鼠杂交获得的.原位杂交证实下丘脑室旁核CRH细胞ACE 2 mRNA表达增加。CRH-ACE 2Ki小鼠被证明减少了焦虑样行为,降低了束缚应激后血浆皮质醇水平。82进一步证实中枢ACE 2在下丘脑-垂体-肾上腺轴调节中的作用。

使用上述rosa26-ACE 2条件基82,同一组小鼠用Villin-cre小鼠,将ACE 2的表达靶向于肠上皮衬里毛刷边缘的微绒毛,产生Villin-creACE 2KI(M.K.Raizada,个人通讯,2020),但尚未报告表型。

人性化ACE 2模型

在这些模型中,人类ACE 2基因(HACE 2)已被控制在可选择的启动子的控制下,在小鼠中诱导特定组织或细胞类型的表达(如图所示)。3和表4)。这些菌株对SARS-CoV-2感染易感,对新冠肺炎的发病机制和抗病毒治疗的研究具有重要意义。

αMHC-hACE 2

在他们共同发现ACE 2之后1,Donoghue等人。83第一只ACE 2人化小鼠注射了一个9.4kb片段,其中含有HACE 2该基因由小鼠心脏α-肌球蛋白重链(αMHC)启动子控制,随后为人生长激素POLYA序列。这些小鼠是在FVB背景下产生的。Westernblotting证实心脏有特异性表达,血清ACE 2活性提高10倍。据报道,血压较低,但令人惊讶的是,死亡率高的是进展性心脏传导障碍、A-V传导阻滞和致死性室性心律失常。这种表型与心脏连接蛋白40和43的下调有关,也可能与缝隙连接重塑有关。这种有害的心脏表型在全球rosa 26中没有发现。-ACE 2KI小鼠81。我们的理解是,由于其致命性,这种模式已不复存在。

K18-hACE 2

正如我们之前所讨论的,小鼠ACE 2不像人ACE 2那样支持SARS-CoV或SARS-CoV-2的有效结合,感染SARS-CoV的小鼠很少表现出显著的临床疾病。为了解决这个问题,麦克莱伊等人。84生成了一种转基因小鼠,其中HACE 2是由人细胞角蛋白18(K18)启动子以上皮细胞(K18-)为靶点驱动的。HACE 2老鼠)。具体来说,转基因包含了完整的长度。HACE 2编码在K18启动子控制下的cDNA,然后是人K18基因的Polya信号。将该转基因导入受精卵原核(C57BL/6JXSJL/J)F_2小鼠卵子中产生转基因胚胎,并将后代回交2~3次,进入C57BL/6背景。K18启动子在气道上皮细胞(但不包括肺泡上皮细胞)和其他内脏的上皮细胞(包括肝、肾和胃肠道)中有高效的转基因表达。在转基因小鼠的肺、结肠、肝、肾等多个组织中检测到人ACE 2 mRNA的表达,证实了该基因的K18定向表达模式。

2.2.3×10次经鼻接种SARS-CoV后4菌斑形成单位,K18-HACE 2小鼠体重迅速减轻,呼吸困难,在感染后7天内全部死于感染(Dpi)。84。相反,非转基因小白蚁的感染并没有导致死亡或临床疾病.重要的是,病毒滴度在K18中高出3个对数单位-HACE 2小鼠比WT小鼠,表明病毒在K18中的复制能力增强-HACE 2老鼠。50%致死剂量的传染性非典型肺炎病毒K18-HACE 2小鼠经鼻接种后菌斑形成单位小于230。此外,在K18-中还发现广泛的炎症浸润,通过血管的炎症细胞增强,更多的上皮细胞脱落,更多的肺损伤迹象。HACE 2小鼠与他们的非转基因小白蚁相比,让人联想到对SARS患者所描述的肺发现。在K18-HACE 2然而,没有观察到在ARDS中常见的弥漫性肺泡损伤的证据,可能是由于缺乏HACE 2在肺泡上皮中的表达。相反,在某些K18的肺中发现有片状的、强烈的中性粒细胞浸润-HACE 2小鼠导致气道阻塞,中性粒细胞聚集变性,坏死性支气管肺炎灶,肺泡灌流血清蛋白液。此外,γ、CxCL 9、CxCL 10、CCL 2和CCL 7等促炎细胞因子和趋化因子在传染性非典型肺炎病毒感染的K18-肺组织中也有升高。HACE 2小鼠2dpi与WT小鼠比较。值得注意的是,在感染K18-的肺中未检测到干扰素-α/β基因。HACE 2小鼠,与sars-cov不能诱导有效的1型干扰素反应的观察一致。85,86。在一项使用同一行的后续研究中,netland等人。87报道说,鼻内接种导致一些病毒通过嗅球进入大脑,导致迅速的跨神经元扩散到脑的连接区域和神经元细胞死亡。这一发现表明神经元是sars-cov的易感靶点,这与在sars患者中观察到的脑感染是一致的。88。此外,Netland等人。89用K18-HACE 2用一种带有缺失包膜蛋白的减毒SARS-CoV来检测和验证免疫效果,以防止SARS的发生。加在一起,K18-HACE 2感染SARS-CoV的小鼠对SARS患者的大部分临床表现进行了概述,为新冠肺炎的研究提供了一个合适的模型。事实上,最近的一项研究表明,在K18中感染了sars-cov-2-HACE 2小鼠肺部病毒滴度高,肺组织学改变,间质炎性细胞浸润,肺泡间隔增厚。90。这条老鼠线可以在杰克逊实验室找到(股票编号:034860)。

CMV-hACE 2

麦克雷等人。84揭示了他们的K18菌株-HACE 2转基因小鼠,曾等。91报道了另一种由巨细胞病毒(CMV)即时早期增强子和鸡β-actin启动子组成的复合全球启动子驱动的小鼠人源化细胞系。转基因小鼠HACE 2用常规技术将表达盒注射到(C57BL/6J XC3H/HEJ)F1亲本的受精卵原核内,经2~3次回交至C57BL/6或BALB/c背景。总共建立了五个创始人线91HACE 2不同方正系的表达水平与sars-cov感染的严重程度和转归密切相关。91,92。经鼻接种SARS-CoV时,部分系表现为肺和脑感染,而另一些系表现为肺限制性感染。高剂量鼻腔接种HACE 2表达小鼠导致的临床表现包括皱皮毛,昏睡,快速和浅呼吸,以及持续的体重下降(在一些小鼠高达35-40%)。

在CMV中-HACE 2小鼠(高表达),死亡率从4 dpi开始,到8 dpi达到100%,而sars-cov感染的WT小鼠在整个学习过程中继续茁壮成长。91。类似于McCray等人。84据报道,肺部和大脑是病毒复制的主要部位。肺部的病毒滴度在1-2 dpi内达到高峰,而在大脑中,病毒在2 dpi开始检测到,在3 dpi时达到高滴度,然后维持到死亡,导致感染SARS-CoV的转基因小鼠的高死亡率。曾等人91进一步发现,虽然SARS-CoV感染不能诱导WT小鼠产生细胞因子,但转基因小鼠肺组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-12p40/p70、CXCL 1、RANTES和单核细胞趋化蛋白-1表达明显升高。此外,转基因小鼠第3天脑组织中IL-6、IL-12p40、粒细胞集落刺激因子、CXCL 1、巨噬细胞炎性蛋白-1α、单核细胞趋化蛋白-1水平明显升高,同时病毒滴度升高。

HFH4-hACE 2

Menachery等人93报告了一种具有气道靶向性高表达的转基因小鼠系HACE 2。这些小鼠通过微量注射C3H×C57BL/6(C3B6)F1杂交卵母细胞,其表达盒由肝细胞核因子-3/叉头同源基因4(HFH 4)/Foxj 1肺纤毛上皮细胞特异性启动子元件和肺纤毛上皮细胞特异性启动子区的编码区组成。HACE 2PTG 1载体中的cDNA。奠基人小鼠然后被交叉到C3B6来生产。HACE 2转基因小鼠。Menachery等人93显示出虽然强壮HACE 2基因在肺中的表达,转基因小鼠的其他组织,包括脑、肝、肾和胃肠道,都有不同程度的表达。HACE 2表达,表明hfh 4介导的表达比最初预期的更多的组织分布。作者用sars-cov Urbani株对这些小鼠进行鼻接种,发现hfh 4。-hACE 2小鼠在第4至第5天出现快速的体重下降和死亡,肺部和大脑都检测到了强劲的病毒复制。进一步使用该模型进行抗冠状病毒感染的治疗试验表明,sars-cov单克隆抗体可以保护这些小鼠免受sars-cov Urbani和sars样wv1-cov的致命攻击。93。这些老鼠已经被转移到突变鼠资源和研究中心(#066719-UNC)进行存档和分发。

顺-hACE 2

同样的4.4kb融合基因用于K18-HACE 2老鼠,含有完整的长度HACE 2CDNA由大鼠突触素1启动子驱动,随后由Polya尾巴微注射到爱荷华州大学转基因动物设施的C57BL/6JxSJL/J(B6SJLF2)小鼠胚胎中。94。从创建者所产生的,第10行表达了最高水平的转基因在大脑中,并被选择为进一步发展。实时定量PCR(QPCR)证实转基因的特异性,免疫组化法检测人ACE 2在脑内的分布。基线Ang-II水平和AT1在脑干和下丘脑,r的表达明显降低,尤以孤束核的表达最为明显,而AT的表达则明显降低。2R和Masr被上调了。对神经元和内皮型NO合成酶的免疫反应以及内皮型一氧化氮合酶的磷酸化形式增强,局部NO水平升高,与Ang-(1-7)/Masr信号增强一致。然而,基线血压、心率、压力反射和自主神经功能仍然正常。94。当注入Ang-II时,Syn-HACE 2与对照组相比,小鼠出现了迟钝的高血压和大幅度减少的水摄入量。阻断Masr后,Ang-Ⅱ型高血压恢复,证实Ang-(1-7)/Masr信号通路在ACE 2的有益作用中起关键作用。94。此外,Ang-II-注入Syn-HACE 2小鼠心肌肥厚减轻及增强HACE 2结果表明,ADAM 17介导的酶从质膜脱落,从而增强了Ang-Ⅱ的清除能力,降低了AT。1R信号冠状动脉结扎致心力衰竭后,西恩-HACE 2与对照组相比,小鼠肾交感神经活性降低,下尿路去甲肾上腺素水平降低,支持神经元ACE 2对抗交感神经活性增强的有益作用。95。这一发现在另一项研究中得到了证实。在另一项研究中,血管紧张素Ⅱ(Ang-II)也导致了Syn-的去甲肾上腺素水平降低HACE 2小鼠96.

尽管西恩-hACE 2小鼠还没有被用于sars的研究,它可能是一个有用的模型,因为大脑是冠状病毒复制的主要场所。79,84。这些老鼠已经被存放在杰克逊实验室(股票编号034899)。

MAce2-hACE 2

另一株人源化ACE 2转基因小鼠系是由Yang等人提出的。97,其中HACE 2表达式是由鼠标驱动的。ACE 2启动子(MAce 2)。半食动物没有表现出任何不利的表型,以及HACE 2用实时定量qPCR技术检测F1代子代肺、心、肾、肠组织中mRNA的表达。Westernblotting证实了一种类似的蛋白表达模式。在接种后第3天和第7天,SARS-CoV在转基因小鼠肺部的复制效率高于WT小鼠。此外,转基因小鼠肺间质充血、出血、单核细胞和淋巴细胞浸润、蛋白质渗出、肺泡上皮细胞增殖和脱落等肺损害较严重。转基因小鼠肺外器官也存在血管炎、变性和坏死,脑内也发现了病毒抗原。上述发现表明转基因小鼠对SARS-CoV的易感性高于WT对照组,这与严重的类似于人SARS感染的病理改变有关。

MAce2-hACE 2最近在sars-cov-2的研究中采用了lineline。98。像sars-cov,sars-cov-2感染MAce2-hACE 2与WT动物相比,小鼠在肺中的体重下降和病毒复制增加。典型的病理组织学表现为间质性肺炎伴炎性细胞浸润,支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞中均检测到病毒抗原(Spike-1蛋白)。与SARS-CoV相比,除了肠道外,肺外器官(包括脑、肾、心脏和肝脏)的SARS-CoV-2病毒载量很低或无法检测到。这一发现与患者SARS-CoV-2感染相关的低死亡率是一致的.这一及时的研究证实了MAce2-hACE 2小鼠在SARS-CoV-2的研究中,特别是在寻找治疗和疫苗新冠肺炎。该小鼠系还用于研究后肢缺血再灌注后远隔器官的损伤。与.形成对比ACE 2−/y小鼠后肢缺血再灌注后出现明显的远隔肾和肺损伤,MAce2-hACE 2小鼠似乎受到保护,不受这些影响。72,73.

这一模式起源于北京协和医学院实验动物科学研究所(北京,PR中国),但目前尚不清楚。

HACE2KI

使用CRISPR/Cas9技术,类似齐等人所描述的策略。81..HACE 2生成Ki行以允许有针对性地表达HACE 2在特定的组织或细胞类型中。这些老鼠可以从NRCMM和MARC(9340株)中存活。

结论和未来方向

在过去的二十年中,大量的转基因小鼠模型被创造出来,以了解ACE 2在心血管、肺和传染病中的作用。随着新冠肺炎的出现,人们对ACE 2模型的兴趣越来越大。虽然ACE 2是SARS-CoV-2的宿主进入受体,但冠状病毒感染导致肾素-血管紧张素系统功能受损所致的肾素-血管紧张素系统的改变,以及这对新冠肺炎的发展的贡献,再怎么强调也不为过。本文所讨论的ACE 2小鼠模型为研究冠状病毒感染的机制,包括心血管和代谢疾病高危患者的感染机制,以及寻找防治新冠肺炎大流行的治疗策略提供了有价值的资源。

ACE 2在多种生物过程中起着多重作用,新冠肺炎大流行也突显了我们对ACE 2在凝血和神经功能等领域的功能缺乏了解。虽然血小板不表达ACE 299,他们确实表示,Masr和ACE 2/Ang-(1-7)/Masr轴具有重要的抗血栓作用。100。同样,ACE 2在认知功能中的作用仍未被探讨。在新冠肺炎患者ACE 2功能减弱的情况下,直接增强Ang-(1-7)/Masr信号的策略可能是有效的治疗方法。最后,我们对肾素-血管紧张素系统外ACE 2功能的了解非常有限。例如,正如我们前面所报告的,ACE 2对于禁用des-arg至关重要。9新冠肺炎患者提出的缓激肽和肺ACE 2缺乏症可能导致肺血管水肿,加重肺部炎症。ACE 2功能受损引起的缓激肽代谢改变也可能参与新冠肺炎的发病机制。


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