TAS 0314是一种新型的多表位长肽疫苗，与pd-1/pd-L1具有协同的抗肿瘤免疫作用

肿瘤肽疫苗是一种很有前途的肿瘤免疫治疗方法，可诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。然而，最近对癌症疫苗的临床试验表明，这种疫苗的有效性是有限的。靶向单一抗原和短肽免疫是导致临床疗效不佳的部分原因。我们合成了一种新的多表位长肽TAS 0314。赫拉敲开老鼠。它还表现出优越的表位特异性CTL诱导和抗肿瘤活性。我们还建立了pd-1/pd-ll阻断疫苗的联合治疗模型。HLA-A*2402敲入小鼠，与TAS 0314具有协同抗肿瘤作用。因此，我们的数据表明TAS 0314治疗，尤其是与PD-1/PD-L1阻断联合治疗，是一种很有前途的肿瘤免疫治疗候选药物。

能够诱导肿瘤特异性免疫反应而不发生严重不良反应的癌症疫苗作为治疗癌症的一种方法是很有吸引力的。许多癌症抗原已经被发现并发展成为基于肽、dna或rna的癌症疫苗。1。肽疫苗自20世纪90年代以来发展起来，但在临床上仅显示出有限的治疗效果。

EGFR2莱克3,4,5、MRP 36、SART 27、SART 38,9,10、PTHrP11，TMEM 189(又称UBE2V)12，和WHSC 212这些抗原的表位肽在临床试验中有效地诱导了HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞(Ctl)的应答。13,14。然而，使用这些抗原的肽疫苗并没有延长患者在第三阶段临床试验中的总生存期。15。许多关于如何克服肽疫苗治疗效果有限的研究已经展开，并揭示了一些有关癌症肽疫苗的问题。

首先，肽疫苗诱导的特异性ctl不能在肿瘤中有效地积累。16。不完全弗氏佐剂被广泛用作肿瘤肽疫苗的佐剂。然而，最近的研究表明，在不完全弗氏佐剂的作用下，表位肽会导致表位特异性CTL在注射部位的积累，而不能诱导有效的抗肿瘤作用。然而，长肽不能诱导注射部位的蓄积，并能诱导有效的抗肿瘤作用。

第二，CTL上的免疫检查点分子导致精疲力竭。Pd-1是一种在耗尽的T细胞上表达的分子，它与肿瘤微环境中的pd-l1相互作用。17。Pd-1/pd-L1相互作用抑制细胞因子的产生和增殖，导致T细胞功能障碍。18。为了增强T细胞的免疫功能，pd-1/pd-l1被开发出来，对各种类型的癌症表现出了很强的临床疗效。19,20,21,22,23。据报道，疫苗诱导的CTLs也表达pd-1，肽疫苗与抗pd-1抗体的结合协同诱导小鼠肿瘤模型的抗肿瘤作用。24。因此，pd-1/pd-L1阻断有望提高癌症疫苗在临床试验中的有效性。

第三，癌症可以通过肿瘤抗原丢失来逃避疫苗诱导的CTL。肽疫苗诱导的CTL仅介导对抗原表达肿瘤的杀伤作用.在某些肿瘤中，肿瘤抗原的表达通过表观遗传调控或突变而改变，从而使肿瘤逃避免疫系统。25。例如，在圣公会-3肽疫苗的二期临床试验中，疫苗接种后复发的肿瘤显示丧失了圣公会-3抗原。26。多表位免疫是克服肿瘤免疫逃避的方法之一，可以提高肿瘤的抗肿瘤效果。27。因此，有可能提高抗癌肽疫苗的效力来克服这三个问题。

为了克服现有抗肿瘤肽疫苗存在的问题，我们设计并研制了一种新型多表位长肽疫苗TAS 0314，该疫苗含有SART 2和SART 3的4个表位。本研究旨在证明TAS 0314作为抗肿瘤肽疫苗的体内外免疫学特性。我们还评估了最近建立的pd-1/pd-ll阻滞联合治疗的疗效。HLA-A*2402老鼠。

TAS 0314诱导多表位特异性CTL

为了评价多表位长肽疫苗的有效性，我们合成了一种新的多肽TAS 0314，它包含SART 2和SART 3与精氨酸二聚体连接的四个表位。

首先，我们评估了TAS 0314的CTL诱导能力。赫拉以前建立的敲入式(Ki)小鼠28。HLA-A*2402限制性表位SART 2的CTL诱导能力93–101和SART 3109–118是通过使用HLA-A*2402Ki小鼠(图1.1a)。免疫小鼠的淋巴结细胞经抗原表位肽刺激后产生干扰素-γ，提示TAS 0314可诱导HLA-A*2402限制性表位肽特异性CTL。

TAS 0314疫苗诱导HLA-Ki小鼠CTL的实验研究。每周用TAS 0314(每肽300μg)处理10只小鼠。最后一次免疫后1周，分离引流淋巴结细胞，用表位肽IL-15和IL-21培养8天。用IFN-γELISPOT法(4孔/肽)评价CTL的表位特异性。(a)HLA-A24限制性表位特异性CTL诱导HLA-A*2402老鼠。(b)HLA-A2-限制性表位特异性CTL诱导HLA-A*0201老鼠。(c)HLA-A3超家族限制性表位特异性CTL诱导Hla-A*3101 KI老鼠。数据表示平均±标准差(n=4)。*使用双尾学生的p<0.05t测试一下。

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我们还证实了HLA-A*0201限制性表位SART 3的CTL诱导能力。302-310以及HLA-A3超家族-限制性表位SART 3734–742使用HLA-A*0201KI小鼠或HLA-A*3101Ki小鼠(图1.1b，c)。

TAS 0314高效诱导记忆CTL

我们比较了TAS 0314和SART 2诱导的表位特异性CTL的频率。93–101组成TAS 0314的肽，摩尔质量相等。有趣的是，TAS 0314诱发了SART 2的更高频率。93–101-比SART 2具体的CTL93–101肽2a)。为了阐明TAS 0314免疫后CTL功能的差异，我们重点研究了血液中CTL的细胞因子生产能力。TAS 0314显著增加干扰素-γ的数量。+/肿瘤坏死因子-α+双阳性CTL与干扰素-γ+/TNF-α+/白细胞介素(IL)-2+血中三重阳性多功能CTL与SART 2比较93–101肽疫苗接种(图1.2b)。

SART 2的比较93–101特异性CTL诱导及其在短程(SART 2)之间的作用93–101)和长肽(TAS 0314)。(a)SART 2频率的比较93–101-特定的CTL。Hla-*A 2402 KI小鼠(n=10/组)接种TAS 0314(100μg)或SART 2。93–101肽(21g，相当于TAS 0314的摩尔质量)。上次免疫后一周，SART 293–101-用IFN-γELISPOT法检测小鼠淋巴细胞产生特异性IFN-γ。数据表示平均±标准误差(n=10)。(b)SART 2的细胞因子多功能93–101-特定的CTL。免疫小鼠(n=10/组)制备外周血单个核细胞，用SART 2隔夜刺激外周血单个核细胞。93–101肽(10μM)。CD 90.2检测干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-2的产生。+/CD8+细胞。(c)SART 2频率的比较93–101-最佳疫苗接种条件下的特异性CTL。Hla-*A 2402 KI小鼠(n=5/组)每周3次接种TAS 0314(100 G)或SART 2。93–101肽(21g)。最后一次免疫后148天，所有小鼠均接种SART 2。93–101肽(21g)。数据表示平均±标准误差(n=5)。(d)TAS 0314抗原表达的评价。SART 3302–310用TAS 0314脉冲CD3培养表位特异性CTL+T细胞，CD11c+Dcs，或经环氧霉素处理的CD11c+DCS数据表示平均±标准差(n=4)。*使用双尾学生的p<0.05t测试一下。

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为了评估TAS 0314诱导的CTL能否进行长期监测，我们检测了SART 2的召回反应。93–101肽。用TAS 0314或SART 2免疫小鼠。93–101肽与SART 2促进作用93–101最后一次免疫后148天。2c)。与SART 2相比，TAS 0314增强后小鼠特异性CTL的数量显著增加。93–101.

为探讨TAS 0314抗原提呈的机制，我们检测了TAS 0314抗原提呈细胞(DC)和非专业抗原提呈细胞(T细胞)对TAS 0314抗原提呈的影响。如图所示。2D，TAS 0314-脉冲CD11c+DCS能有效激活CTL，而TAS 0314脉冲T细胞的IFN-γ反应明显降低.此外，蛋白酶体抑制剂环氧霉素可显著降低TAS 0314脉冲DC对ctl的激活。29.

TAS 0314诱导的CTL体外杀伤抗原表达细胞

为了证实TAS 0314诱导的CTL是否对肿瘤细胞有细胞毒性，用51-铬(51Cr)对表位特异性的细胞毒性进行了评价。51(Cr)细胞毒性试验。SART 293–101将TAS 0314免疫小鼠的肽特异性CTL扩增一周，与表达b16f10的细胞共培养一周。HLA-A*2402(B16F10.A24)和表位肽。SART 2对B16F10.A24细胞有较强的细胞毒作用93–101肽被脉冲(图)。3a)。

SART 2抗原特异性细胞毒活性的研究93–101-TAS 0314诱导的特异性CTL。(a)SART 2的评估93–101表位特异性细胞毒性。SART 293–101-体外培养特异性CTL51标记为B16F10.A24，SART 293–101肽脉冲B16F10.A24或B16F10.A24/SART 293–101细胞。(b)SART 3的评估302–310表位特异性细胞毒性。SART 3302–310-体外培养特异性CTL51Cr标记SART 3302–310肽或WT1 p 126肽脉冲T2细胞。效应器：目标比为80：1。c)HLA中和抗体阻断SART 293–101-特异性细胞毒性。SART 293–101-体外培养特异性CTL51Cr标记B16F10.A24/SART 293–101细胞在抗HLA-ABC阻断抗体或同类型对照抗体存在下(20g/mL)。数据表示平均±标准差(n=3)。

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SART 3302–310用HLA-A2阳性细胞株T2评价表位特异性细胞毒性.培养的SART 3302–310肽特异性CTL对肽脉冲T2细胞有细胞毒性作用。3b)。

我们测定了对肿瘤细胞株B16F10.A24/SART 2的细胞毒性。93–101细胞，这两种细胞都过高表达HLA-A*2402和SART 293–101肽。如所料，TAS 0314诱导的CTL对B16F10.A24/SART 2具有较强的细胞毒性。93–101细胞(图1.3a)。HLA中和抗体的加入使细胞毒性降低40%。3(C)。这些数据表明TAS 0314诱导的CTL能够以HLA依赖的方式识别抗原表位。

TAS 0314对B16F10.A24/SART 2的抗肿瘤作用93–101肿瘤细胞

我们评价了抗皮下B16F10.A24/SART 2的抗肿瘤活性。93–101同基因小鼠模型中的肿瘤。为比较SART 2免疫小鼠的疗效，采用SART 2免疫小鼠。93–101肽或TAS 0314摩尔当量剂量(图)。4a)。肿瘤植入后18d，TAS 0314与对照组相比，肿瘤体积减少70.25%。SART 293–101肽只使肿瘤体积缩小47.7%，与对照组相比无显着性差异(图5)。4b)。这些数据提示TAS 0314比SART 2具有更好的抗肿瘤活性。93–101.

TAS 0314对同基因肿瘤的抗肿瘤活性。(a,b)TAS 0314预防性治疗的抗肿瘤活性。Hla-A*2402 KI小鼠(n=15/组)接种TAS 0314(100μg)或SART 2。93–101肽(21g)。上次免疫后一周，B16F10.A24/SART 293–101细胞接种于小鼠右侧。(a)实验方案。(二)b)肿瘤生长图。结果用平均±标准误差表示。(c,d)TAS 0314抗肺转移的活性。Hla-A*2402 KI小鼠(n=10/组)注射B16F10.A24/SART 293–101细胞免疫TAS 0314(300 G)。术后28天计数肺转移灶数。(c)实验方案。(二)d)肺转移的评估。结果用平均±标准误差表示。*使用双尾学生的p<0.05t测试一下。

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我们还评价了B16F10.A24/SART 2基因肺转移模型的抗肿瘤活性。93–101细胞(图1.4c)。TAS 0314治疗组肺转移结节数目较对照组明显减少(图1)。4d)。TAS 0314不仅在皮下模型中显示出抗肿瘤活性，而且在转移模型中也显示出抗肿瘤活性。

TAS 0314与pd-1/pd-L1协同阻断抑制肿瘤生长

我们评价了TAS 0314和抗pd-1抗体抗B16F10.A24/SART 2的协同抗肿瘤活性。93–101肿瘤(如图所示)。5a)。抗PD1抗体治疗部分抑制肿瘤生长，TAS 0314治疗显著抑制肿瘤生长(图一)。5b)。此外，TAS 0314和抗Pd-1抗体的联合治疗与单一治疗相比，对肿瘤的生长有明显的抑制作用。

TAS 0314与PD-1/PD-L1阻断的协同抗肿瘤作用。(a–cTAS 0314与抗Pd-1mAb联合治疗。Hla-A*2402 KI用TAS 0314(每只300 g)和(或)抗Pd-1mAb(100 G)处理小鼠(n=15/组)，然后植入B16F10.A24/SART 2。93–101肿瘤。(a)实验方案。(二)b)肿瘤生长曲线。(c)生存曲线。(d–fTAS 0314与抗Pd-L1单抗联合治疗。Hla-A*2402 KI用TAS 0314(每只300 g)和(或)抗pd-L1单抗(200 G)处理小鼠(n=15/组)，然后植入B16F10.A24/SART 2。93–101肿瘤。(d)实验方案。(二)e)肿瘤生长曲线。(f)生存曲线。结果用平均±标准误差表示。对小鼠进行监测，直到肿瘤体积达到2000 mm。3或者直到死亡。肿瘤体积由一个双尾学生评估t采用对数秩检验法进行生存评估。*p<0.001；**p<0.001。

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我们还评估了57天的存活时间。与对照组相比，抗Pd-1抗体没有延长生存期。5c)。TAS 0314和抗Pd-1抗体联合治疗较单纯抗Pd-1抗体(p<0.001.0 5)或单纯TAS 0 314(p<0.0 5)明显延长生存期。肿瘤植入后57d，对照组和抗PD-1抗体治疗组小鼠均死亡。TAS 0314组小鼠无瘤率为13.33%，TAS 0314与抗PD-1抗体联合治疗组为53.33%。

我们还评估了TAS 0314与抗PD-L1抗体联合应用的抗肿瘤活性。5d)。TAS 0314和抗Pd-L1抗体的联合也协同抑制肿瘤的生长，与单一治疗相比(见图)。5e)。抗Pd-L1抗体联合治疗可显著延长生存期(如图所示)。5f)。肿瘤植入后85天，TAS 0314与抗Pd-L1抗体联合治疗的小鼠无瘤率为66.67%。相反，其他各组均无小鼠存活。

提示TAS 0314与PD-1/Pd-L1阻断联合治疗具有协同抗肿瘤作用。

TAS 0314与抗pd-1抗体联合应用可增加肿瘤抗原表位特异性CTL的数量。

为了分析协同效应的机理，我们测定了SART 2。93–101SART 2在肿瘤抗原特异性T细胞中的应用93–101-HLA-A24四聚体(图1)。6)。TAS 0314免疫后检测到大量四聚体阳性T细胞，而载体免疫组未检测到SART 2特异性CTL浸润。令人惊讶的是，TAS 0314和抗Pd-1抗体联合治疗组的数量增加了大约3倍。肿瘤抗原表位特异性CTL的增加有助于TAS 0314和抗Pd-1抗体的协同抗肿瘤活性。

SART 2特异性CTL浸润肿瘤的比较。Hla-A*2402 KI对照组和抗pd-1mAb组5只，TAS 0314+抗pd-1mAb组10只，分别用TAS 0314(25μg/个)和(或)抗pd-1mAb(100 G)，然后植入b16f10.a24/srt 2。93–101肿瘤。肿瘤植入后7天，SART 2的数目93–101采用流式细胞术分析肿瘤细胞表位特异性CTL。(a)实验方案。(二)b)SART 2特异性CTL浸润的比较。

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已经进行了许多临床试验，但癌症疫苗的疗效有限。30,31。为了研制出有效的肿瘤肽疫苗，必须提高其有效性。

我们研制了一种新型的多价长肽疫苗TAS 0314，并对其诱导CTL的能力、单药的抗肿瘤作用以及与抗PD-1抗体联合应用的效果进行了评价。我们以前曾报道过，表位特异性ctl的诱导受长肽中表位的影响。32。通过改变四个表位的连锁顺序，对众多的多肽进行了评价和筛选，获得了具有较高CTL诱导能力的合适的长肽。最后，我们设计了TAS 0314，可以有效地诱导表位特异性CTL的诱导。与短表位肽疫苗相比，TAS 0314具有更好的CTL诱导和抗肿瘤作用。

树突状细胞高效加工的合成长肽疫苗及其诱导的抗CD8抗体+T细胞反应已被报道。33。在我们的研究中，我们证实TAS 0314表位是由DC在蛋白酶体依赖的途径中提出的。相比之下，T细胞等非专业抗原提呈细胞对TAS 0314表位的抗原呈递很少。非专业抗原提呈细胞的抗原呈递可导致CTL的衰竭，而耗尽的T细胞则表现为多功能细胞因子的丧失。34。的确，我们获得了类似的数据，表明短表位免疫诱导的T细胞具有较小的多功能群(IFN-γ)。+/TNF-α+/IL-2+、干扰素-γ+/TNF-α+)CTL与TAS 0314诱导的CTL比较。我们认为DC介导的TAS 0314抗原表达可能有助于增强TAS 0314的CTL诱导和抗肿瘤作用。

根据目前的研究，TAS 0314免疫和增强148天后，最后一次免疫显著诱导了大量的CTL，提示TAS 0314接种导致了记忆CTL的诱导。在外周血单个核细胞中，中央记忆T细胞产生IL-2。35，在第二次挑战之后，要进行有效的扩展，就需要生产自分泌的IL-2。36。因此，TAS 0314诱导的多功能CTL可能分化为记忆性T细胞，有助于长期监测。据报道，在长期存活的癌症疫苗患者中，表位特异性记忆T细胞存在很长时间。37。因此，TAS 0314也可能通过诱导记忆CTL来长期控制癌症的进展。

肿瘤抗原特异性T细胞激活后可上调免疫抑制分子(如pd-1)，并通过与肿瘤中配体(如pd-L1)相互作用而导致功能障碍。17。事实上，据报道，肽疫苗诱导的抗原特异性ctl在癌症患者中高表达pd-1。38。认为肿瘤疫苗与PD-1/PD-L1阻断联合治疗能协同增强肿瘤的抗肿瘤活性。然而，由于人类肿瘤抗原的HLA-A2限制性表位肽与抗pd-1抗体联合应用于小鼠模型中，很少有人评价其与抗pd-1抗体联合应用的有效性。39。为了评价其他HLA等位基因限制性表位与抗PD-1抗体的结合，需要表达HLA等位基因的小鼠。在目前的研究中，我们的重点是HLA-A24限制性表位，这是最常见的HLA等位基因在日本。用我们的方法评价HLA-A24限制性表位与抗pd-1抗体的协同抗肿瘤作用。HLA-A*2402老鼠。

TAS 0314与PD-1/PD-L1阻断联合治疗也具有协同抗肿瘤作用。联合治疗可明显抑制肿瘤生长，延长生存期。肿瘤表位特异性CTL数量增加约3倍，这可能是TAS 0314与Pd-1和Pd-L1抗体协同抗肿瘤作用的机制之一。

虽然含有SART 2的短肽疫苗93–101在最近的第三阶段临床试验中，表位没有引起明显的临床反应，我们的数据表明，Pd-1/PD-L1阻断联合应用可能会提高临床疗效。

据报道，抗pd-1抗体增强了肿瘤组织中趋化因子的表达和T细胞浸润。24,40。也有报道说抗pd-1抗体能抑制T细胞凋亡，促进T细胞增殖。41。根据这些报道和我们目前的数据，我们认为抗Pd-1抗体治疗会导致TAS 0314特异性CTL在肿瘤微环境中的浸润和积累，从而促进协同抗肿瘤作用。但是，在今后的研究中还需对其机理进行详细的阐述。

本研究存在一定的局限性。首先，我们评估了SART 2表达的肿瘤细胞的抗肿瘤活性。93–101作为具有代表性的表位肽。其他表位也有望表现出更好的CTL诱导和抗肿瘤活性，因为它们的行为可能类似。

我们还开发了不同的多价长肽TAS 0315和TAS 0316，它们包含来自EGFR、Lck、MRP 3、PTHrP、TMEM 189和WHSC 2的8个表位。与TAS 0314相似，这两个长肽对HLA-Ki小鼠也有CTL诱导能力(附图)。1)。根据我们的结果，TAS 0314、TAS 0315和TAS 0316有望与抗PD-1抗体具有抗肿瘤作用和协同作用，但建立新的HLA-A2或A24依赖的同基因抗肿瘤模型尚需进一步的研究。

其次，仅用HLA-A*2402和SART 2的人工模型检测TAS 0314的抗肿瘤作用。93–101稳定高表达细胞。虽然我们证实TAS 0314诱导的抗原特异性CTL在体外识别并杀死HLA-A24人癌细胞(附图)。2)TAS 0314的抗肿瘤作用有待临床试验进一步阐明。

总之，一种新的多表位长肽疫苗TAS 0314诱导HLA-A2，HLA-A24。,HLA-A3超家族限制性多表位特异性CTL。与短表位疫苗相比，TAS 0314具有更好的抗肿瘤活性。此外，我们还建立了疫苗与pd-1/pd-ll阻断的组合模型。HLA-A*2402抗Pd-1抗体或抗Pd-L1抗体联合治疗可增加肿瘤的表位特异性CTL，协同增强肿瘤的抗肿瘤活性。我们一直在开发一种多肽混合物，TAS 0313，包含TAS 0314，TAS 0315和TAS 0316，供临床使用。我们在此过程中获得的初步数据表明，TAS 0313治疗，尤其是TAS 0313与PD-1/PD-L1阻滞的联合治疗，是治疗各种癌症患者的一种新的治疗方案。此外，诱导的多抗原特异性CTL可防止抗原丢失引起的免疫逃逸，有助于长期的抗肿瘤活性。

小鼠

杂合子HLA-A*2402杂合子HLA-A*0201，杂合子HLA-A*3101Ki小鼠如前面所述28。所有的动物手术都是按照美国国立卫生研究院的指导原则进行的，并得到了太和动物保护和使用委员会的批准。

肽合成

合成了TAS 0314、TAS 0315、TAS 0316和TAS 0314的表位肽，并用Bachem美洲公司(美国加利福尼亚州托兰斯)的液相色谱-质谱(LC-MS)对其进行了分析。HER2p63、WT1p126和HIV gp 41770–780由日本东京东丽研究中心(Toray Research Center，Inc.)用LC-MS进行合成和分析.肽序列如表所示1.

抗体和试剂

γ-藻红蛋白(PE)-结合抗-干扰素-γ单克隆抗体(MAb)(克隆：XMG 1.2)、藻红蛋白-氰化蛋白7(PE-Cy7)-结合抗IL-2-mAb(克隆：JES6-5H4)、藻蓝蛋白(APC)结合抗-TNF-α单克隆抗体(克隆：MP6-XT 22)、亮紫罗兰(BV)421结合抗-CD8-α单抗(克隆：53-6.7)、BV 510-CD90.2 mAb(克隆：30-H12)、纯化的抗HLA-αmAb(克隆：W6/32)、GoInvivo纯化的抗小鼠CD 274(PD-L1)单克隆抗体(克隆：10F.9G2)、GoInvivo纯化的大鼠IgG2b、κ等型Ctrl抗体(克隆：RTK 4530)和纯化的小鼠IgG2a、κ等型Ctrl(克隆：MOPC-173)均购自美国圣迭戈市。Pe-结合HLA-A*24：02 SART 293–101四聚体和异硫氰酸荧光素(FITC)结合抗CD8单抗(克隆：KT 15)是从日本爱知医药生物实验室有限公司购买的。CD11c微球超纯，小鼠，PanT细胞分离试剂盒II，小鼠，CD 90.2微球，肿瘤分离试剂盒，小鼠，从Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，德国)购买。依泊霉素是从肽研究所(大阪，日本)购买的。

肿瘤细胞株

B16F10和T2是从美国型培养集(ATCC，Manassas，VA，美国)购买的。B16F10.A24细胞和B16F10.A24/SART 2细胞93–101细胞是通过转导Hla-A24(Hhd)基因或两者Hla-A24(HHD)基因和SART 293–101使用piggybac载体的迷你基因(Transposagen生物制药公司，Inc.，Lexington，KY，USA)如前所述32.

小鼠免疫

每隔7天免疫小鼠3次。在Montanide ISA-51 VG(SEPPIC，巴黎，法国)中乳化的多肽混合物在尾部底部皮下注射(100 L/鼠)。

在评价记忆功能的实验中，用TAS 0314或SART 2免疫小鼠。93–101[TAS 0314：100 g/鼠，SART 293–101：21μg/鼠(相当于100μg TAS 0314/鼠)，148天后用SART 2免疫小鼠。93–101作为助推器治疗。治疗2周后，观察CTL在淋巴结内的诱导作用。

表位特异性CTL的培养

最后一次免疫后7d处死小鼠，制备淋巴结淋巴细胞。淋巴细胞在加靶肽(10μg/mL)、rIL-15(100 ng/mL)和小鼠rIL-21(100 ng/mL)的培养基中培养8d。用Lympholyte-M(CedarLane，Hornby，on，Canada)密度梯度离心法收集活细胞。

酶联免疫吸附试验(ELISPOT)

如先前报道的那样，用ifn-γPlus elispot(mabtech，斯德哥尔摩，瑞典)检测到特异性抗原的干扰素-γ产物。32。淋巴细胞拉基用靶抗原表位肽(10g/mL)或阴性对照肽(WT1p126，HLA-A*0201；Her2p63，HLA-A*2402；HIV-1 gp 41)培养小鼠。770–780在含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和50μm~2-巯基乙醇的培养基中检测HLA-A*3101；在培养的CTL中检测到抗原特异性IFN-γ产生的情况下，CTL与辐照(30 Gy)脾细胞和指示肽(100μg/mL)共同培养。根据Mabtech协议检测IFN-γ的产生.然后，用ELISPOT免疫分析仪S6(细胞技术有限公司，美国俄亥俄州沙克高地)对干扰素-γ斑点进行计数。

抗原提呈试验

CD11c+树突状细胞(DC)和CD3+T细胞用CD11c微球纯化，小鼠超纯，脾细胞PAN T细胞分离试剂盒Ⅱ，小鼠(Miltenyi Biotec)。HLA-A*0201老鼠。抗原提呈细胞与多肽共同孵育3h(37℃，5%CO)。2)并洗了三次。在加入TAS 0314前30 min加入依泊霉素。培养SART 3302–310-免疫后的特异性CTLHLA-A*0201KI小鼠SART 3302–310以100μg/鼠为效应细胞。CTL与抗原提呈细胞在抗小鼠IFN-γ包被板上共同培养.用ELISPOT法检测抗原特异性IFN-γ的产生.

抗SART 2的抗肿瘤活性评价93–101-表达同基因肿瘤

预防治疗，Hla-A*2402 KI用TAS 0314(100μg/鼠)和SART 2免疫10只小鼠(n=10)。93–101表位(21μg/鼠)，或车辆控制。最后一次免疫后7天，小鼠皮下接种B16F10.A24/SART 2。93–101肿瘤细胞(5×10)5)进入右舷。肿瘤接种后7天，用卡钳测量肿瘤大小。根据以下公式计算肿瘤体积：

为了治疗，Hla-A*2402 KI15只小鼠(n=15)静脉注射B16F10.A24/SART 2。93–101肿瘤细胞(1×10)6)。用TAS 0314(300 g/鼠)免疫小鼠3次，自接种肿瘤后第7天起，间隔7天。肿瘤注射后第28天，对小鼠进行安乐死，并计数肺转移灶数。

TAS 0314与抗PD-1/PD-L1抗体的联合治疗

评价TAS 0314与抗PD-1/Pd-L1抗体联合治疗的疗效。Hla-A*2402 KI15只小鼠接种TAS 0314疫苗(300 g/鼠)或车辆对照3次。最后一次免疫后7天，腹腔注射抗pd-1mAb(100μg/鼠)、抗pd-l1mAb(200 g/鼠)或同类型大鼠IgG2b(200μg/鼠)，然后注射b16F10.a24/sRT 2。93–101肿瘤细胞皮下接种(5×10)5)进入老鼠的右侧。

51Cr细胞毒性试验

体外培养的CTL对B16F10.A24细胞和SART 2细胞的杀伤作用93–101肽脉冲B16F10.A24细胞或B16F10.A24/SART 293–101用6h的时间对细胞进行评估。51释铬试验42。培养SART 293–101以TAS 0314免疫小鼠的表位特异性CTL(100μg/免疫)作为效应细胞。51Cr(5 MBq/10)6在靶细胞中加入10 0μmol/L肽，37°C孵育1.5h，用磷酸盐缓冲液冲洗靶细胞，悬浮于培养液中。五千51在96孔圆形底板上，以指示的效应/靶比三份法将CR标记的靶细胞与培养的CTL共同培养。

体外培养的CTL对T2细胞和SART 3细胞的杀伤作用302–310用培养的SART 3评价肽脉冲t2细胞302–310TAS 0314免疫小鼠的表位特异性CTL(300μg/免疫)作为效应细胞。

在测定上清液放射性(CPM)的基础上，用以下公式计算出比裂解率：

肿瘤浸润淋巴细胞的分离

用肿瘤分离试剂盒、小鼠和GentleMACS(Miltenyi Biotec)按制造商的程序制备肿瘤单细胞悬液。以70%/40%Percoll(GE Healthcare，芝加哥，IL，美国)梯度离心法分离活淋巴细胞。密度梯度离心后，用CD 90.2微球分离T细胞，在培养液中隔夜培养。培养的T细胞用SART 2染色93–101四聚体、抗CD8-APC单抗(克隆KT 15)和抗CD 90.2-BV 510单克隆抗体。CD90.2+CD8+细胞分析采用FACSVerse(BD生物科学，美国加利福尼亚州圣何塞)。

CD8法检测细胞因子的产生+T细胞

免疫全血细胞因子多功能评价Hla-A*2402 KI用BD生物科学(BD生物科学)裂解小鼠，用10μg/mL SART 2刺激小鼠。93–101肽，加Golgiplup(BD生物科学)培养18h。然后用抗CD8-BV 421单抗和抗CD 90.2-BV 510单克隆抗体对刺激后的外周血单个核细胞进行染色。用固定/渗滤液试剂盒(BD生物科学)固定和渗透，然后用抗IFN-γ-PE单抗、抗TNF-α-APC单抗和抗IL-2-PE-Cy7单克隆抗体染色。流式细胞术(FACSVerse)分析染色细胞。