质子敏感TDAG8对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

脑缺血时细胞外酸化已经被观察到，但是，pH降低的生理和病理生理意义仍然是未知的。本文分析了T细胞死亡相关基因8(TDAG8)、卵巢癌G蛋白偶联受体1(OGR 1)和G蛋白偶联受体4(GPR 4)在小鼠缺血再灌注模型中的作用。TDAG8缺乏症加重脑梗死和短暂大脑中动脉闭塞(TMCAO)及再灌注行为障碍，而OGR 1或GPR 4缺乏症对脑梗死和功能障碍行为无明显影响。预测梗死区pH值为6.5。在小鼠脑Iba 1阳性小胶质细胞中观察TDAGmRNA的表达。TMCAO可增加同侧大脑半球肿瘤坏死因子-α的mRNA表达，并引起脑损伤后小胶质细胞的形态学改变。TDAG8缺乏症可明显增强这些tMCAO诱导的作用。米诺环素可抑制小胶质细胞活化，改善tMCAO诱导的TDAG8小鼠脑梗死和功能障碍行为。因此，酸性pH/TDAG8对tMCAO所致的脑梗死有保护作用，至少与抑制小胶质细胞功能有关。

脑缺血或缺氧取决于多种因素，这些因素可能相互影响，从而产生复杂的机制，导致有害的结果。例如，在缺血状态下，血液供应不足会导致缺氧和有氧呼吸的抑制，从而增加糖酵解产生的乳酸，使pH从正常值降至6.1-6.8。1,2。酸性pH值在6.0左右会影响线粒体功能、自由基的形成、细胞成分的合成和降解、细胞体积的控制和内皮细胞的损伤；这些事件会导致不可逆转的神经细胞死亡。3。然而，pH 6.6左右的轻度酸中毒不会导致能量状态的恶化，也不会导致不可逆细胞损伤的形态学证据。3。因此，pH值可能是缺血时细胞事件输出的一个重要因素。然而，其在脑缺血损伤中表达酸性pH信号的机制尚未阐明。

报道了两种质子敏感受体：离子通道和G蛋白偶联受体OGR 1家族。4。质子感应离子通道包括酸敏离子通道(Asics)(根据离子通道的类型来感知pH 4-7)和瞬时感受器电位香草酸1(Trv 1)，它能感知pH 4-5。4。质子敏感OGR 1家族gpcrs包括卵巢癌G蛋白偶联受体1(OGR 1)、G蛋白偶联受体4(GPR 4)和T细胞死亡相关基因8(TDAG8)，它们的酸性pH值高于6.4。4。一些研究表明，质子感应gpcr在多种细胞类型中介导细胞活动。5,6,7,8。OGR 1在骨骼细胞和平滑肌细胞中表达，并被报道参与了对细胞外酸化的各种重要生理反应。6,9。GPR 4被认为可以诱导内皮细胞的炎症反应。6,10。TDAG8在淋巴组织中的表达11,12并已被证明介导抑制炎症细胞因子在巨噬细胞中的产生。7,13,14中性粒细胞产生超氧阴离子15.

质子感应GPCRs也在中枢神经系统和神经细胞中表达.TDAG8在新生小鼠培养的小胶质细胞中表达，并参与酸性pH诱导的通过cAMP/蛋白激酶A(cAMP/蛋白激酶A)抑制tLR介导的白细胞介素-1(IL-1β，IL-1β)的产生。16。小胶质细胞在大脑的免疫系统中发挥着中心作用。17,18。小胶质细胞的激活和促炎细胞因子合成的增加，如IL-1和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，已被证明发生在脑卒中过程中。19,20,21,22,23。众所周知，IL-1和肿瘤坏死因子-α在其神经变性中起着重要的作用。17,18,24,25,26,27,28,29,30,31。这些结果提示小胶质细胞TDAG8对缺血性酸化的反应可能与脑卒中有关。另一方面，GPR 4和OGR 1在小鼠胚胎皮层神经元和N1E115神经元中表达。6,16,32,33是脑酸中毒时调节细胞事件的潜在受体。

本研究探讨了质子感应GPCRs在短暂性大脑中动脉阻塞(TMCAO)再灌注脑缺血模型中的作用。我们发现TDAG8缺乏症加重了tMCAO及随后再灌注所致的功能障碍和脑梗死。但在相同的tMCAO方案下，OGR 1和GPR 4的缺失对梗死范围无明显影响。TTC染色、Nissl染色和MRI成像等多种实验表明，酸性pH/TDAG8对TMCAO脑损伤的保护作用可能与抑制小胶质细胞功能的机制有关。

质子敏感型GPCRmRNA在脑组织中的表达

我们首先研究了缺血状态下质子敏感型GPCRs的mRNA表达.定量mRNA检测表明，与TDAG8相比，OGR 1和GPR 4在小鼠脑组织中有丰富的表达(图2)。1)。在质子敏感的GPCRs中，TDAG8在同侧半球的表达明显高于对侧半球，这与诱导tMCAO 0.5h后和再灌注24h后Iba 1和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)mRNA的表达增加有关，OGR 1和GPR 4的表达在同侧和对侧半球之间无明显差异。在假手术中，同侧和对侧半球之间的mRNA无明显变化。

短暂性大脑中动脉闭塞(TMCAO)后，TDAG8在大脑半球的表达明显增加。(阿-戊)TDAG8基因mRNA表达的定量分析a)，OGR 1(b)，GPR4(c)，Iba 1(d)，以及GFAP(e对侧(Contra)和同侧(Ipsi)野生型(WT)半球，诱导tMCAO 0.5h，再灌注24h后，分别从假手术(n=6)和tMCAO小鼠(n=6)大脑半球制备总RNA。结果表示为相对于GAPDH的比率。误差条代表平均±扫描电镜。对侧和同侧半球的比较采用配对学生的比较。t-测试(N.S.，无重大意义)。TMCAO及继发性再灌注的作用显著(p < 0.01).

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TDAG8缺乏症致TMCAO所致脑梗死加重

组织学染色观察梗死体积对组织损伤的影响。21,34。我们首先用甲酚紫染色法检测尼氏物质，以观察tMCAO 0.5h再灌注后梗死区的时间依赖性增加(补充信息图)。S2)。再灌注后梗死面积随再灌注时间的延长而逐渐增大，从6~24 h的纹状体逐渐扩大到72h的皮质。我们用几个TDAG8缺陷型(TDAG8)进行了tMCAO实验。TP/TP)小鼠7并发现TDAG8缺乏时梗死面积有增加的趋势。为了证实这一点，我们选择了再灌注后24小时的时间。TDAG8梗死面积明显增大。TP/TP小鼠比WT小鼠(图1)。2a)。除非另有说明，tMCAO实验是使用本协议进行的，E.0.5htMCAO及再灌注24h。接下来我们使用OGR 1-NULL(OGR 1)。−/−)小鼠9和GPR4缺陷(GPR 4)−/−)小鼠(补充信息图。研究OGR 1和GPR 4是否参与了缺血损伤的调控。在相同的tMCAO方案下，OGR 1和GPR 4的缺失对梗死范围无明显影响(图一)。2b和c)。因此，TDAG8似乎在缺血所致梗死的进展中起着保护作用；然而，在我们的实验条件下，没有发现OGR 1或GPR 4参与缺血所致梗死的证据。

TDAG8缺乏症加重了TMCAO所致的脑梗死，而OGR 1或GPR 4缺乏则无明显作用。(阿-丙)通过组织切片分析获得细胞损伤评分。TMCAO/再灌注24h后。TMCAO对TDAG8小鼠脑梗死的影响(英文)a)，OGR 1(b)和GPR4(c)。数据以WT小鼠(n=8)和TDAG8缺陷小鼠(TDAG8)每组的平均±扫描电镜显示。TP/TP9只WT小鼠(n=9)和OGR 1缺失小鼠(OGR 1)。−/−(n=9)，WT小鼠(n=10)和gpr4缺乏小鼠(Gpr4)。−/−，n=10)。用未配对学生的方法评估各组间的比较t-测试。TDAG8缺乏症的影响显著(p < 0.01). No significant difference was observed between WT and OGR1−/−小鼠或WT和GPR 4−/−老鼠。

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TMCAO对TDAG8小鼠的脑损伤与TTC染色结果一致(图1)。3)。但再灌注24h后所观察到的脑损伤是不可持续的。TDAG8缺陷小鼠和WT小鼠再灌注1个月后，TCC染色评价的梗死区几乎消失。这些结果表明，神经再生能力克服了TDAG8缺陷所致的损伤，至少在我们的0.5htMCAO(补充信息图)实验协议中是如此。(中3)。为了进一步证实tda g8在缺血所致神经功能缺损中的保护作用，我们进行了实验，以测量上述行为功能。35。为了显示赤字水平，包括第1级和第3级的图片作为例子(补充信息图)。S4B和S4B)。与梗死的结果一致(图)。2(A)杂合子TDAG8(TDAG8)的损伤不变。WT/TP)小鼠，但在纯合子的TDAG8中明显恶化。TP/TP小鼠(补充信息图。S4a)。

TTC染色显示，TDAG8缺乏症加重了tMCAO诱导的小鼠脑梗死。(a)西北地区和TDAG8的代表冠状剖面TP/TPTMCAO(0.5h)/再灌注24h后，小鼠脑组织TTC染色。用扫描仪采集前后两侧的图像。(b)通过TTC冠状切片对WT小鼠(闭合性圆周，n=7)和TDAG8的冠状面切片进行分析，获得梗死区。TP/TP小鼠(封闭方，n=6)。梗死(%)根据同侧半球的病变面积计算。误差条代表平均±扫描电镜。WT与TDAG8的比较TP/TP用未配对学生的方法对小鼠进行评估。t-测试。(N.S.，无重大意义)。

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TDAG8缺乏对局部脑血流量和pH值的影响

应用激光多普勒血流仪对MCAO术中局部脑血流进行监测，发现WT与TDAG8无明显差异。TP/TP小鼠(补充信息图。(第5条)。因此，TDAG8似乎不影响血管功能，以调节血流阻塞前后的动脉。

为了测量pH值，我们在tMCAO后0.5h在可预测梗死区的位置插入了一个pH传感器(如图所示)。4(A)并证实了先前的结果1,2同侧和对侧感兴趣区的胞外pH值分别为6.5和7.1左右。4b)。细胞外pH在长时间(永久性)缺血至少5h时也有变化(数据未显示)。同侧区域的酸性pH值在1h(未显示)和24h(如图所示)恢复到对侧区域的水平。4(C)再灌注后。重要的是，阻断和再灌注后细胞外pH的变化不受TDAG8缺乏症的明显影响。这表明TDAG8缺乏的小鼠梗死体积的变化反映了pH变化的下游事件，而不仅仅是原始损伤程度的变化。

TMCAO与TDAG8缺乏症无关，缺血区pH值下降。(a)用pH微传感器测量同侧和对侧感兴趣区(侧方1.5~2mm，腹侧3~3.5mm，Bregma前1mm)的局部pH变化。PH值传感器的预测位置由Nissl染色直方图图像上的黑色箭头表示，即tMCAO持续0.5h再灌注24h后细胞损伤。(b)小鼠(n=6)和TDAG8小鼠MCAO后0.5h缺血区酸化。TP/TP小鼠(n=8)。误差条代表平均±扫描电镜。对侧和同侧半球的比较采用配对学生的比较。t-测试。MCAO效果显著(p < 0.01, Contra vs. Ipsi). (c)tMCAO/再灌注24h后Wt小鼠(n=3)和TDAG8小鼠缺血区酸性pH的恢复(n=3)。TP/TP小鼠3只。误差条代表均值±扫描电镜。对侧和同侧半球的比较采用配对学生的比较。t-测试(N.S.，无重大意义)。

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TDAG8 mRNA在Iba 1标记的小胶质细胞中的表达

如图所示。1TDAGmRNA在同侧区域表达高于对侧区域，与Iba 1 mRNA表达增强有关。为了检测TDAG8在正常小鼠大脑细胞水平上的表达谱，我们进行了原位杂交，观察了TDAG8基因在皮层和纹状体区域的强信号。结果表明，几乎所有的TDAG8 mRNA表达细胞都有Iba 1标记(图1)。5).

TDAGmRNA在Iba 1标记细胞中表达。用原位杂交方法观察了地高辛标记的TDAGmRNA反义RNA探针在小鼠大脑中的表达。切片随后用抗Iba 1抗体(Alexa Fluor 488，绿色)染色。根据感官探针，对照组无明显信号。标度棒为50μm。

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TDAG8在脑损伤细胞因子表达调控中的作用

我们以前报道过细胞外酸化抑制脂多糖诱导的小胶质细胞IL-1β的产生。16。同样，在分离的小胶质细胞中，无论是LPS诱导的IL-1β的产生，还是LPS诱导的TNF-α的产生，都受到酸性pH的抑制，其程度依赖于TDAG8(补充信息图)。(中6)。在中性pH值为7.4左右时，无论是否存在TDAG8缺陷，对细胞因子的产生均无显著影响。细胞外酸性pH从7.2-6.4明显降低LPS诱导的IL-1β或TNF-α的产生，其抑制作用依赖于TDAG8。因此，TDAG8缺乏症可显著逆转弱酸性pH值为7.2~7.0对IL-1β产生的抑制作用，而pH值为7.2~6.4对分离的小胶质细胞产生肿瘤坏死因子-α的抑制作用具有明显的逆转作用(补充信息图)。(中6)。值得注意的是，当tMCAO在小鼠同侧区域达到pH值时，在pH6.4时细胞因子的产生受到抑制(见图)。4(B)肿瘤坏死因子-α对TDAG8敏感，对IL-1β不敏感.TDAG8不依赖于酸性pH抑制细胞因子产生的机制尚待建立。

上述结果提示TDAG8可能参与tMCAO/再灌注的细胞因子反应。因此，我们测定了tMCAO/再灌注24h后同侧和对侧大脑总RNA提取液中细胞因子mRNA的水平。6)。在假手术中，细胞因子mRNA在同侧和对侧半球的表达无明显差异。与对侧半球相比，tMCAO显著增加了同侧半球IL-1β或αmRNA的表达。如预期的那样，TDAG8缺乏症可显著增强肿瘤坏死因子-α的表达。6b)。IL-1βmRNA表达呈上升趋势，而TDAG8缺乏症的影响不显著(图二)。6a)。对IL-1β缺乏显著影响可能与同侧区域pH值低于TDAG8依赖范围有关(图1)。4B及补充资料图。(中6)。因此，TDAG8可以感受到由MCAO诱导的酸性环境，从中性到中度酸性pH值在6.4左右，并下调细胞因子(至少是肿瘤坏死因子-α)的产生。

TDAG8缺乏症可增强TMCAO诱导的脑梗死区肿瘤坏死因子-α的mRNA表达。(a，bTMCAO/再灌注或假手术24h后，从大脑半球制备RNA。IL-1β的mRNA表达a)和肿瘤坏死因子-α(b)。结果为同侧半球和对侧半球mRNA的表达。数据分别为假手术小鼠(WT=5，TDAG8TP/TP n=4)和tMCAO小鼠(WT=13，TDAG8TP/TP n=13)的平均±SEM。各组间的比较采用双向方差分析(ANOVA)，然后用Tukey检验进行多组比较(N.S.，无显着性)。与假手术相比，tMCAO可明显诱导细胞因子mRNA的表达。p < 0.01). The effect of TDAG8 deficiency for on TNF-α expression is significant (p < 0 .05).

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TDAG8在脑损伤小胶质细胞活化中的潜在抑制作用

脑内小胶质细胞的激活也被观察到与缺血性脑卒中脑损伤演变有关的形态学变化。24,36,37。同侧大脑半球包括三个区域，核心区、梗死周区和健康区，分别位于发育中的脑损害的远端。在健康区域，静息的小胶质细胞呈分枝状形态，有一个小的胞体和长而薄的初级突起。损伤引起小胶质细胞的胞体增大和过程退缩，小胶质细胞随后在梗死周围和核心区域变成阿米巴样细胞、棒状细胞和巨细胞。如补充信息图所示。S2B，TMCAO后脑梗死由纹状体向皮质的扩展取决于再灌注时间。因此，我们分析了tMCAO/再灌注是否在同侧半球的体感区发生了形态改变的小胶质细胞激活(图1)。7)。无论是否存在TDAG8(I和III)，对侧皮层主要观察到形态分化的小胶质细胞。在同侧皮层，偶见胞体增大，突起较短的细胞，但主要细胞类型在WT小鼠中呈分散的形态(II)。TDAG8缺乏时可清楚地观察到tMCAO所致同侧区的形态学改变。因此，在TDAG8中，胞体增大的小胶质细胞和粗壮的小胶质细胞显著增加。TP/TP小鼠(Iv)。提示TDAG8是损伤中小胶质细胞活化的抑制性调节因子。

TDAG8通过tMCAO调节梗死区附近体感区小胶质细胞的形态学变化。观察小鼠TMCAO 0.5h和再灌注24h后，Bregma前1mm冠状面体感区小胶质细胞的形态学变化。a)WT和TDAG8中同侧和对侧区域Iba 1标记细胞的典型图像(褐色、民建联)。TP/TP老鼠被展示了。插入显示代表细胞的更高的放大率。(b肉眼观察20~50个细胞(20~50个细胞)，形态变化以阿米巴样细胞在细胞总数中所占的百分比表示。数据以WT小鼠(n=5)和TDAG8小鼠的平均±扫描电镜显示。TP/TP小鼠7只。各组间的比较采用双向方差分析(ANOVA)，然后用Tukey检验进行多组比较(N.S.，无显着性)。TDAG8中tMCAO明显诱导了带收缩和粗壮过程的Iba 1标记细胞。TP/TP老鼠(p < 0.01), and the effect was not significant in WT mice.

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米诺环素对小鼠短暂性MCAO发病的抑制作用

据报道，抗生素米诺环素与抑制胶质细胞活化有关，可延缓小鼠缺血模型的发病和进展。38,39,40,41。如补充信息图所示。S7、米诺环素抑制脂多糖激活的小胶质细胞因子TNF-α、IL-1β、proIL-1β的产生.另一方面，米诺环素处理不影响LPS诱导的星形胶质细胞的细胞因子和VCAM-1的表达.因此，该药物对小胶质细胞具有抗炎作用，但至少在体外对星形胶质细胞没有抗炎作用。.为评价米诺环素在体内的作用，采用四次腹腔注射米诺环素：每日1次，开始于tMCAO/再灌注后3天及即刻。如补充信息图所示。在手术后24小时，用MRI仪可以对活体小鼠的梗死情况进行评估。MRI显示TDAG8患者梗死体积较大。TP/TP小鼠比WT小鼠(图1)。8(A)与TTC和甲酚紫染色结果一致。TDAG8中的严重梗死TP/TP米诺环素治疗后小鼠数量明显减少。在WT小鼠中，其作用呈下降趋势，但作用不显著。与梗死面积的结果一致，TDAG8患者的神经损伤更为严重。TP/TP小鼠比WT小鼠(图1)。8b)。米诺环素对WT小鼠的神经功能评分无明显影响，但能显著减轻TDAG8小鼠的损伤程度。TP/TP小鼠达到了WT小鼠的水平。因此，米诺环素治疗可减轻TDAG8患者的梗死范围和神经功能损害。TP/TP老鼠。提示TDAG8可能具有保护和抑制tMCAO所致脑梗死的作用，其机制可能与其对某些小胶质细胞功能的抑制作用有关。

米诺环素对脑梗死和神经功能缺损的影响。小鼠(WT和TDAG8)TPTP)用米诺环素或车辆治疗。小鼠经TMCAO/再灌注后，头部MRI_T2增强图像进行评价。(a)米诺环素对WT小鼠(对照组5只，米诺环素5只)和TDAG8小鼠tMCAO梗死面积的影响TP/TP对照组9只，米诺环素7只。误差条代表平均±扫描电镜。各组间的比较采用双向方差分析(ANOVA)，然后用Tukey检验进行多组比较(N.S.，无显着性)。TDAG8的病变更为严重。TP/TP小鼠比WT小鼠(p < 0.01). The effect of minocycline on infarction size is significant in TDAG8TP/TP老鼠(p < 0.01) but not in WT mice. (b)米诺环素对WT小鼠(对照组19只，米诺环素19只)和TDAG8小鼠tMCAO神经功能评分的影响TP/TP对照组24只，米诺环素24只。数据显示为神经学评分(闭合圆圈)和中位数(红线)。各组间的比较采用未配对的Mann-Whitney检验(N.S.，无显着性)。米诺环素显著减轻tMCAO诱导的TDAG8神经功能损害TP/TP老鼠(p < 0.01) but not in WT mice.

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脑酸中毒，伴随缺氧，是急性脑损伤的一个标志，如缺血和创伤性损伤。质子感应离子通道，如asics和trv 1，已被认为参与了酸中毒所致的神经元细胞死亡。42。除了离子通道，大脑还表达大量的质子感应gpcr，包括tda g8、ogr 1和gpr4，它们的酸性pH值高于6。5,6。然而，中枢神经系统中的细胞事件及其机制在轻度酸性条件下的反应很大程度上是未知的。在目前的研究中，我们重点研究了质子感应GPCRs在脑缺血后损伤中的作用，发现TDAG8可能通过改变小胶质细胞功能的机制在缺血性脑梗死的进展中发挥保护作用。

首先，在tmcao实验中，TDAG8的梗死范围明显增大。TP/TP老鼠比在WT的老鼠(图)。2A和8a)。此外，通过行为功能评分来评估缺血所致的神经功能缺陷在tda g8中要大得多。TP/TP老鼠比在WT的老鼠(图)。8b)。因此，TDAG8缺乏症加重了缺血所致的脑梗死和功能障碍行为.在所建立的闭塞模型中，我们发现缺血0.5h时，预测的同侧核内pH值为6.5的组织酸化，再灌注24h后恢复到正常pH值7.1(如图1所示)。4)。PH变化不受TDAG8缺乏的影响。不用说，脑梗塞的大小受脑血流量的影响。然而，动脉阻断前后的脑血流并没有受到基因缺乏的影响，这表明调节血流的血管功能似乎没有受到质子感受器的明显影响。因此，tMCAO会导致组织酸化，足以刺激活体组织中的TDAG8。这些结果提示，酸性pH刺激的TDAG8在体内可作为脑缺血损伤的保护受体，其机制可能与血管系统的变化不同。

第二，小胶质细胞参与调节缺血所致梗死的意义得到了一些观察的支持。TDAG8 mRNA在分离的小胶质细胞中大量表达，而gpr4或ogr 1的mRNA表达量很低或无法检测到。16。原位杂交实验表明，脑内主要表达TDAG8的细胞类型为小胶质细胞(图1)。5)。中等酸性的pH值可达6.4左右，能抑制脂多糖/TLR介导的肿瘤坏死因子-α的产生，其方式依赖于离体小胶质细胞的tDAG8(补充信息图)。S6和TDAG8缺乏症在体内脑损伤中促进了肿瘤坏死因子-α的表达(如图6所示)。6)。此外，TDAG8所获得的同侧半球体感区由静止的小胶质细胞向活化的小胶质细胞的形态学改变显著增加。TP/TP小鼠与WT小鼠的比较(图1)。7)。因此，通过TDAG8，酸中毒或细胞外酸性pH似乎在炎症细胞因子的产生和形态学变化方面抑制了小胶质细胞的激活。为此，细胞外酸化抑制了小胶质细胞的迁移。43和商店运营的Ca2+流入44。另一方面，缺氧是脑缺血的另一个方面，它增强了小胶质细胞的激活，并对神经系统产生了有害的影响。45。因此，缺氧和酸中毒(急性脑损伤的标志)似乎以相反的方式作用于小胶质细胞；缺氧可能通过HIF-1激活小胶质细胞并诱导炎性细胞因子的产生，而轻度酸中毒则抑制小胶质细胞的活化。TDAG8可能介导酸中毒对缺氧诱导的小胶质细胞活化的抑制作用.

最后，在分离的小胶质细胞中证实了米诺环素的抗炎作用，从而抑制了LPS激活的细胞因子的产生，但对分离的星形胶质细胞没有抑制作用(补充信息图)。(第7段)。虽然米诺环素对WT小鼠的脑梗死或功能障碍没有明显改善，但抗生素对缺血所致的TDAG8神经损伤有明显的改善作用。TP/TP老鼠(图1.8).

虽然我们的结果支持tda g8在小胶质细胞中表达缺血区的酸性状态并在缺血所致脑损伤后的恢复中发挥关键作用的观点，但不能排除缺血期间其他驻留细胞(如星形胶质细胞)和浸润细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)在脑内的参与。19,22,23。已知GFAP的增加是由于星形胶质细胞在梗死中心激活星形胶质细胞的过程所致。22。在缺血再灌注模型中，Iba1mRNA在同侧半球和GFAP中的表达几乎增加了一倍。1e)。然而，分离的星形胶质细胞对酸性pH没有任何反应。16。我们初步推测，小胶质细胞在病变部位积聚和/或增殖并激活，从而导致星形胶质细胞增多。Tda g8在小鼠腹腔巨噬细胞和人中性粒细胞中也有深刻的表达，并以抑制的方式调节酸性pH诱导的细胞反应的抑制，包括炎性细胞因子的产生。7超氧阴离子产生15。小胶质细胞被认为是tmcao等损伤后急性时间点炎症细胞因子的主要来源。18。然而，有报道称，缺血脑组织中含有巨噬细胞的浸润性外周炎性细胞。21。因此，浸润的外周血白细胞可能对TDAG8脑损伤的加重有一定的影响。TP/TP老鼠。

Tda g8以外的质子感应gpcr在大脑中也有相当丰富的表达；gpr4和ogr 1在皮层神经元中表达，gpr4在内皮细胞中表达。6,16,32。在N1E-115神经细胞中，细胞外酸化诱导Ca2+通过OGR 1与cGMP调控相关的动员，并通过未明确的机制激活PI3K/Akt通路32。GPR4通常与G耦合s/cAMP信号通路5。AKT，Ca2+CAMP信号通路被认为是神经元活动的关键，包括神经元细胞存活、神经元突起延长和神经元葡萄糖稳态。因此，OGR 1和GPR 4似乎参与了有益的神经细胞活动。另一方面，据报道，酸中毒可增加血管内皮细胞中趋化因子、细胞因子、粘附分子、NF-κB通路基因、cox-2和应激反应基因等炎症基因的表达。6,10而脑内皮细胞系bEND.3细胞(初步结果)表明，GPR 4参与了炎症细胞对脑损伤部位的渗透。因此，OGR 1和GPR 4可能感受到MCAO诱导的酸性环境，参与脑病理生理过程。然而，我们没有发现任何证据，无论是OGR 1或GPR 4参与使用我们的tMCAO/再灌注协议(图一)。2b和c)。结论表明，在酸性环境下，TDAG8可能通过改变局部小胶质细胞功能和部分侵袭巨噬细胞的机制，对脑缺血具有神经保护作用。虽然还需要进一步的研究来阐明质子感应GPCRs在缺血性损伤后脑功能中的作用，但它们可能有助于识别伴有酸中毒的脑损伤的治疗靶点。

材料

抗肌动蛋白抗体(A 5060)、醋酸甲酚、脂多糖(LPS，L 3012)、盐酸米诺环素(M 9511)和2，3，5-三苯基四氮唑胺(TTC)从Sigma-Aldrich(美国圣路易斯，MO)购买；小鼠肿瘤坏死因子-αELISA试剂盒(DuoSet)、小鼠IL-1βELISA试剂盒(DuoSet)、抗小鼠TNF-α抗体(AB-410-NA)、抗小鼠IL-1β(AB-401-NA)抗体、抗小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1，AF 643)抗体来自R&D系统(美国明尼阿波利斯，美国明尼阿波利斯)，BCA蛋白检测来自热疗(罗克福德，IL)，抗CD11b抗体(M 170.15)来自Acris抗体(德国赫福德)；抗F4/80抗体(BM 8)来自Sanbio BV(荷兰Uden)；抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体来自PROGEN(德国海德堡)，无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA，分数V)来自CalBiochem-Novabiochem Co.(美国加利福尼亚州圣地亚哥)；抗Iba 1抗体(019-19741)来自瓦科化学品(日本大阪)；抗兔Alexa Fluor 488来自生命技术公司(卡尔斯巴德，CA)；α(Mm 00443258)、IL-1β(Mm 01336189)、TDAG8(Mm 00433695)、GPR 4(Mm 00558777)、OGR 1(Mm 01335272)、Iba 1(Mm 00479862)、GFAP(Mm01253033)和甘油3-磷酸脱氢酶(GAPDH，4352932E)的定量实时PCR探针来自应用生物系统(美国福斯特市)。TDAG8缺陷小鼠TP/TP)由大阪大学(日本大阪)的DRS K.Horie和J.Takeda、东京大学的Takao Shimizu博士(日本东京)和秋田大学的Satoshi Ishii博士(日本秋田)提供。所有其他试剂的来源与前面所述相同。7,9,13,16.

小鼠

所有的动物实验都是根据动物委员会的动物护理和使用指南进行的，这项研究得到了Gunma大学动物委员会的批准(许可证号是14-29和18-13)。这些老鼠被关在无菌被褥上的无菌笼子里，并被安置在恒温恒湿的房间里。将无菌食物和水喂给小鼠。TDAG8TP/TP回交8代以上的TM88ICR小鼠经回交获得C57BL/6小鼠，其中含有转座子插入TDAG846。插入转座子的后代TDAG8用聚合酶链反应-基因分型法鉴定。7。OGR 1-NULL(OGR 1)−/−)如前面所述，老鼠是生成的。9。GPR4-缺陷(GPR4)−/−)小鼠如补充信息图所示。的第二外显子的一个大片段。GPR4从129/Sv小鼠BAC基因组文库中获得基因及其下游7.0kb片段，并亚克隆到pBlueScriptⅡ载体中。将含有β-半乳糖苷酶/新霉素磷酸转移酶融合基因的盒插入载体中，取代编码序列。GPR4外显子2(ATG至BclⅠ位点)。将靶向载体用NOT I线性化，电穿孔成129/Sv胚胎干细胞。用Southern印迹法筛选耐新霉素的ES克隆进行同源重组。S1b)。用尾尖基因组DNA对GPR 4缺陷进行PCR基因分型(补充信息图)。S1c)。将阳性ES克隆(J8)细胞注射到C57BL/6囊胚中，产生嵌合小鼠。与C57BL/6小鼠杂交8次以上。野生型(WT)和基因缺陷型(TDAG8)TP/TP、OGR 1−/−、GPR 4−/−)小鼠维持杂合子兄妹交配。TDAG8和OGR 1缺乏的小鼠与其幼小的WT小鼠相比，均未表现出明显的表型变化。7,9。例如，体重和后代数量的年龄依赖性变化几乎不受其基因缺陷的影响。对于gpr4缺乏的小鼠，早期的研究报告称gpr4-空的成年小鼠表现为正常；然而，有一小部分敲除胚胎和新生儿有自发性出血和血管肌细胞覆盖缺陷。47。另一方面，本研究中使用的GPR 4缺乏的小鼠在后代数量或体重方面没有任何异常变化。因此，本研究中使用的TDAG8、OGR 1或GPR 4缺乏小鼠似乎没有明显的血管系统异常，至少在阻断血管之前是如此。事实上，正如后面所示，在WT和TDAG8缺乏的小鼠之间，脑血流量并没有明显的变化。10周龄男性C57BL/6行手术阻断大脑中动脉(MCAO)的起源。培养1~2日龄C57BL/6幼仔，制备胶质细胞。

缺血手术、pH测定和脑血流量监测

MCAO基本上按照前面描述的方式执行。34,48使用6-0硅涂层单丝缝线(DoccolCorporation#6021910)。吸入2%异氟醚诱导麻醉，1.5%异氟醚维持麻醉。手术时用加热板维持小鼠体温。在体视显微镜下，对左颈总动脉(CCA)、颈内总动脉(ICA)和颈外总动脉(ECA)的分叉进行了仔细解剖。非洲经委会在永久缝合线和临时缝合线之间有一个小洞。将6~0硅包覆单丝缝线插入ECA.单丝缝合从ECA腔向ICA缓慢推进，距离CCA分叉9~10 mm，阻断MCA的起源。ECA上的7-0丝缝线紧紧地绑在一起，固定在单丝缝的位置上。在手术后(0.5h)，将笼中的小鼠置于加热板上的加热灯下。短暂性MCAO(TMCAO)，小鼠麻醉，手术野重新暴露.单丝缝合线被拔除并绑在ECA上。将CCA上的临时缝合线移除，以使血液再循环。皮肤用自动夹或4-0丝线缝合.将小鼠置于加热板上的加热灯下0.5h，观察小鼠恢复活动能力后，将小鼠送回笼中。TMCAO诱导0.5h后6、24和(或)72h，进行生物学和组织学分析。

根据制造商的指示，使用针状光纤pH微传感器(尖端尺寸约为140μm)，根据制造商的指示(Preens精密传感公司，雷根斯堡，德国)，在体内测量血淋巴pH值。用标准pH值4.01、6.86、7.41和9.18缓冲溶液在25°C下标定pH探针。PH微传感器安装在立体定向装置的机械手上(日本东京Narishige)。诱导tMCAO(0.5h)和永久性MCAO(0.5h~24h)后，用2%异氟醚麻醉小鼠，头部固定在立体定向器内。皮肤切开后，用电钻在颅骨上做了两个与同侧和对侧感兴趣区相对应的孔。吸入1.5%异氟醚维持麻醉。用pH微传感器测量同侧和对侧区域的局部pH变化(ROIS：1.5~2mm侧、3~3.5mm腹侧和1mm前，以小鼠脑图谱为基础)。

激光多普勒血流仪(ALF 21和BF 04436，Advance，日本东京)偶尔用于MCAO手术期间的脑血流监测。49。在颞肌的皮肤上做了一个小切口，探针用速溶胶固定在颞骨的上半部分(外侧6mm，bregma后2mm)，如前所述。50.

米诺环素的体内治疗

用米诺环素(MIN)评价TMCAO诱导0.5h及再灌注24h后小胶质细胞活化及在缺血损伤恶化中的作用。盐酸米诺环素溶于5 mg/mL(10 mmol/L)生理盐水中，腹腔注射50 mg/kg，每日1次，于手术前3天及术后即刻开始。

神经学评分

神经功能缺损的评分如前所述。35。TMCAO诱导0.5h后再灌注24h进行行为学评估。三个独立的盲人调查人员对神经学评分进行了评分。神经功能缺损评分为：0，正常；1.轻微旋转行为，尾起时是否有不一致卷曲，<50%卷曲至对侧；2，轻度一致卷曲，>50%卷曲至对侧；3，强且立即持续卷曲，小鼠卷曲1~2s以上，小鼠鼻子几乎接近尾端；4，严重卷曲进展为呕吐反射，丧失行走或右倾；5，蜷曲或垂死。

组织学组织准备

小鼠心脏灌流生理盐水，然后在戊巴比妥钠(60 mg/kg)诱导的深麻醉下，将4%多聚甲醛注入磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。取脑4°C，用4%多聚甲醛固定24 h，在含30%蔗糖的PBS中浸泡24 h以上，然后用O.C.T.化合物快速冷冻(樱花Finetek Japan，东京，日本)。将组织包埋在石蜡块中，用上升的乙醇系列脱水，然后浸泡在二甲苯中，包埋在石蜡中。连续切片，相当于冠状面1mm前的bregma，5μm间隔的切片安装在幻灯片上。组织学图像由失明的研究者和技术人员使用不同的符号和数字对小鼠和组织样本进行独立分析。结果与相应的组织学比较。

原位杂交和免疫组织化学

为分析TDAGmRNA在小鼠脑组织中的表达，制备了上述冰冻块的冠状面序列切片。PCR扩增得到TDAG8基因片段：TDAG8_475(GenBank NM_008152中475 bp)，用5‘-ATCCCCACAGGAGAGACAG-CATG-3’和5‘-TCTTATGCACATCATGCTGT-CATCTGCTGT-CATCGT-CATCG-3’载体(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)亚克隆入pCR2.1载体(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)。利用这些质粒作为体外转录的模板，制备了地高木素标记的核糖探针(德国曼海姆罗氏诊断公司)。杂交基本上是按照前面描述的方式进行的。51。简单地说，冷冻切片在50℃下用20 ng/mL的DNA标记的RNA探针在杂交缓冲液中孵育16h(日本，日本东京)。切片用RNase A处理，然后用0.2×标准枸橼酸盐(SSC)冲洗15 min。用1.5%的封闭试剂(德国曼海姆的罗氏诊断公司)在37℃下浸泡1h，然后与碱性磷酸酶结合的抗DIG抗体(德国曼海姆的罗氏诊断剂GmbH)在4°C的同一缓冲液中稀释至1：2000，用相同的缓冲液冲洗16h，用相同的缓冲液(0.34 mg/mL的硝基蓝四氮唑盐(NBT)、0.18 mg/mL的5溴-4-吲哚磷酸-3-吲哚磷酸盐-甲苯胺盐(BCIP))处理，直到检测到可见信号。根据感官探针，对照组无明显信号。用免疫组化法检测Iba 1阳性细胞和抗Iba 1抗体(1：400稀释度)。用抗兔Alexa Fluor 488结合二次抗体(1：1000稀释度)检测阳性信号。经处理后，用荧光光镜对切片进行安装和观察。

尼氏染色

测量冠状组梗死面积。1在bregma之前，从上述石蜡块中制备了一系列冠状切片。切片用二甲苯分离，乙醇浓度下降，再水化，水洗。切片用0.1%甲酚紫染色，用95%乙醇和100%乙醇冲洗，直到背景基本清晰。处理后，切片用二甲苯清除，并安装在Entellan上。在明亮视野显微镜(KeyenceBZ-9000 BioRevo)下，用4×物镜获取图像.用ImageJ软件对梗死范围进行描述和量化，根据同侧半球的病变面积计算梗死面积(%)。

TTC染色

大脑在上述深度麻醉下切除(戊巴比妥钠，60 mg/kg静脉注射)。取脑切取2mm冠状面，浸泡于2%TTC盐水溶液中，在25°C黑暗下染色20 min。用4%福尔马林固定脑组织。用扫描仪采集图像，用ImageJ软件测量未染色病灶面积，根据同侧半球每一层的前、后侧病灶面积计算梗死面积(%)。

磁共振成像

MRI是使用图标MRI扫描仪(Bruker Biospin K.K.Kanagawa，日本)在冈马大学研究生院生物资源中心进行的。TMCAO诱导后，用2%异氟醚麻醉小鼠，并将其安全放置于动物体内。用呼吸系统对小鼠进行监测，吸入1.5%异氟醚维持麻醉。用加热系统维持小鼠体温。头部解剖的影像学方法包括T2罕见高和T1罕见(第5.1段)。从2×7片、1mm厚、1mm间隙的T2罕见高层图像中提取梗死体积。感兴趣区(Rois)按t2加权磁共振成像(Mri)对每一层的病变区域和梗死体积(Mm)进行配置。3)取所有切片的面积之和，用OsiriXLite进行切片厚度积分。

RT-qPCR

总RNA是根据制造商的说明从大脑半球制备的RNAisoPlus(Takara，日本)。如前面所述，RT-qPCR是使用Taqman水解探针(应用生物系统)进行的。52。用DNaseⅠ处理总RNA(5μg)，去除可能的基因组DNA，并进行RT-qPCR。热循环条件为：50℃2 min，95°C 10 min，95°C 40次15s，60°C 1 min，靶mRNA表达水平与GAPDH mRNA表达的相对比率成正比。用三种不同的RNA浓度进行RT-qPCR检测.

小胶质细胞和星形胶质细胞的制备及细胞活性评价

制备小鼠星形胶质细胞(用抗GFAP抗体评价)。16。取1~2日龄小鼠大脑皮层切片，用0.25%胰蛋白酶在32℃消化20 min，分离细胞在含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle‘s培养基中收集、再悬浮、过滤(71μm)，然后在1.0×10的浓度下镀膜。6细胞/mLD-赖氨酸涂膜瓶(75厘米)2)。培养持续20天，直至汇合。以含10%FBS(G-DMEM)的胶质条件培养基保存。如上文所述，用温和的胰蛋白酶法制备了小胶质细胞。53。简单地说，用上面描述的0.25%的大脑皮层胰蛋白酶消化得到的细胞悬液被镀在常规的培养盘上。贴壁细胞在25200.0 5%胰蛋白酶(Invitrogen-GIBCO，DMEM稀释后的胰蛋白酶25200)中培养30~60 min，在37℃下去除星形胶质细胞。用0.25%胰蛋白酶在37℃下恢复10 min，再悬浮于G-DMEM中，过滤40μm。细胞悬液密度为3-5×10。5细胞/mL在6或12孔培养皿中进行后续实验，培养1天。由抗Iba 1抗体、抗CD11b抗体和抗F4/80抗体评价的小胶质细胞总数均大于95%。为探讨米诺环素对内毒素诱导的小胶质细胞或星形胶质细胞产生肿瘤坏死因子-α(TNF-β)、白细胞介素-1(IL-1)和血管内皮生长因子-1(VCAM-1)的影响，将细胞培养在6孔板上，在37°C培养基中30μ/L米诺环素预处理24 h，在含0.1%BSA和30μ/L米诺环素的新鲜DMEM中饥饿8h，用10 ng/mL LPS刺激细胞16h。在12孔板上镀上小胶质细胞，分析肿瘤坏死因子-α(TNF-β)和白细胞介素-1(IL-1)β的产生.将培养基转化为含0.1%BSA的新鲜DMEM，在适当的pH条件下，用含20 mmol/LHEPES、0.1%BSA和1μg/mL脂多糖的HEPES缓冲μ最小必需培养基刺激16h。

免疫印迹法检测肿瘤坏死因子-α、IL-1β、亲IL-1β、VCAM-1和肌动蛋白

用14,000 g离心法收集LPS刺激后6孔板培养1 min。然后用Ultracel-3K(德国达姆施塔特默克米利波尔有限公司)浓缩约10次，保存在−80°C，直至westernblot分析。为检测IL-1β(ProIL-1β)、VCAM-1和肌动蛋白的胞浆前体，用冰冷PBS洗涤两次，再加入1%IGEPAL、0.5%去氧胆酸钠、0.1%SDS、1 mmol/L EDTA和1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)组成的裂解缓冲液，从培养皿中提取。溶菌物在冰上孵育30分钟，然后在14,000×离心。g20分钟。用BCA蛋白法测定提取液的蛋白质浓度。用12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对浓缩培养基和回收的裂解液进行单抗Westernblotting分析。然后将膜与碱性磷酸酶结合的第二抗体孵育，然后用前面描述的nbt/bcip系统显示这些印迹。16。目的蛋白的表达水平与肌动蛋白的相对比例成正比。

ELISA法测定培养液中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β

用14,000×离心法收集LPS刺激后12孔板的HEPES缓冲液。g持续1分钟。加入0.5mol/LHCl或NaOH，将样品的pH值调节到7.4左右，保存在−80°C，直至细胞因子含量的测定。用市售ELISA试剂盒按说明书测定肿瘤坏死因子-α和IL-1β浓度。目标蛋白的表达水平被归一化为细胞蛋白裂解液的相对比率。