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胶质瘤来源的IL-33组织了一个炎症性脑瘤微环境，加速了胶质瘤的进展

二维码

发表时间：2020-10-10 11:37作者：武汉新启迪Xinqidibio

尽管人们对胶质母细胞瘤有了更深入的理解，但它仍然是最难治疗和最致命的癌症之一。众所周知，巨噬细胞和小胶质细胞的存在会影响胶质母细胞瘤的发生并阻止持久的反应。在此，我们发现双功能细胞因子IL-33是促进肿瘤发生的胶质母细胞瘤微环境的协调因子。我们发现IL-33在大量人脑胶质瘤标本和小鼠模型中的表达与肿瘤相关巨噬细胞/单核细胞/小胶质细胞增多有关。此外，IL-33的核和分泌功能调节趋化因子，这些趋化因子共同招募和激活循环的和常驻的天然免疫细胞，创造一个有利肿瘤的环境。相反，失去核白细胞介素33损伤招募，显着地抑制胶质瘤的生长，并提高存活率。我们的数据支持这样一种范式：在适当的指导下，免疫细胞的招募和激活提供了一种治疗策略，将重点从单独的癌细胞转移到包含正常宿主环境的治疗策略。

导言

摘要胶质母细胞瘤是一种高级别胶质瘤，尽管对其基因组突变有较深的分子理解，但中位生存期仅限于14.6个月。1,2。虽然最大手术切除联合放射治疗和辅助替莫唑胺化疗在治疗GBM方面取得了进展，但长期存活者很少，其2和5年生存率分别为25%和10%。1,2。复杂的细胞组成，扩散的侵袭性，以及大量具有高侵袭性和耐化疗和抗放射能力的脑肿瘤细胞(Btics)的存在。3,4,5,6,7,8,9是发展有效治疗的主要障碍。此外，药物在血脑屏障的传递困难和肿瘤环境中的细胞适应，进一步导致了他们的难治性行为。

现在很清楚，在不同活化状态的肿瘤中，不同细胞类型的存在会极大地影响治疗反应。10以及与细胞外基质、肿瘤血管和正常间质间的复杂相互作用，包括免疫细胞和促进肿瘤进展。11,12,13,14,15。具体来说，大脑独特的细胞类型，包括神经元和胶质祖细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质/巨噬细胞和脑内皮细胞，都有能力影响胶质瘤的生长和侵袭。16肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)在包括胶质瘤在内的许多癌症中与肿瘤分级高、预后差有关。17,18,19,20。虽然小胶质细胞和血液传播的单核细胞和巨噬细胞在胶质瘤发生中的相对重要性仍在争论中，但关于这些细胞在胶质瘤中的相互作用，已有大量的文献报道。21,22，包括它们抑制免疫监视功能的能力23,24。根据上下文的不同，巨噬细胞的功能被定义为经典激活(M1)抗肿瘤。25,26,27,28,29,30,31,32或活化(M2)促肿瘤33,34,35,36,37。虽然根据体外数据，这些状态被描述为二进制状态，但在体内的特性仍然更加复杂，并且更符合动态光谱相反端的m1和m2表型。38。利用这些特性，我们在以前的条件下，通过编程小胶质细胞来抑制胶质瘤的生长，以及组织浸润的巨噬细胞与两性霉素B一起抑制肿瘤生长，提高患者来源的异种颅内移植模型的整体存活率。39。同样，乔伊斯和他的同事的一项研究40发现抑制CSF-1R通路可改变巨噬细胞的极化，并将促肿瘤转化为抗肿瘤表型，从而抑制胶质瘤的生长。

为了找出影响肿瘤进展的重要因素，我们利用了从患者源性btic中建立的具有高度致瘤性的原位异种移植模型。41，具有自我更新、区分的能力。12,42,43，隐藏在人类GBM中发生的分子遗传改变的光谱(如P53、PTEN、IDH 1、EGFR和MSH 6的突变)(参考文献6)。13,44,45,46)并在体内建立人体疾病模型。43,45,47。我们发现胶质瘤细胞分泌IL-33，这是IL-1细胞因子家族的一员，它通过结合和激活细胞表面受体ST2发挥作用。48)，以及它的下游信号通路或通过向核的易位来结合染色质来调节基因转录。49,50。与这种蛋白的复杂调控和定位相一致，IL-33可以在多种类型的先天免疫细胞和适应性免疫细胞中诱导多种生物学功能，包括作为2型免疫应答的有效诱导因子，诱导肥大细胞成熟，介导嗜酸性粒细胞的存活、扩张和募集，以及调节巨噬细胞的极化以发挥抗菌作用。48,51,52,53,54。在大脑中，IL-33由星形胶质细胞和少突胶质细胞表达。52,55，在中枢神经系统损伤模型中，它促进小胶质细胞和巨噬细胞的替代激活，这是一个限制胶质瘢痕形成的过程。56,57。星形胶质细胞来源的IL-33在早期中枢神经系统发育过程中也通过小胶质细胞促进突触内稳态。58。此外，有新的数据表明IL-33在各种癌症中具有促肿瘤作用。59，包括胶质瘤，其中IL-33的表达与预后不良有关。60,61大鼠胶质瘤模型巨噬细胞浸润促进肿瘤生长62.

在此，我们加强了IL-33作为脑肿瘤环境的主要调控者的作用，并提供了关于这种环境如何促进肿瘤发生的机械洞察。我们发现约50%的手术标本覆盖GBM患者的分子和临床异质性及其相应的BTIC培养物，在体内表达和分泌IL-33，这反过来改变了驻留的小胶质细胞，以及骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)、自然杀伤细胞和T细胞的募集和激活。此外，我们发现胶质瘤细胞中IL-33的表达足以推动肿瘤的进展，降低肿瘤的整体存活率，这一功能需要其分泌和核功能。IL-33是GBM细胞微环境的主要调节因子，它强调改变或共同靶向宿主环境的可能性，作为克服耐药性和改善GBM患者预后的额外治疗策略。

结果

炎症性GBM中IL-33的表达

在脑肿瘤治疗方面，许多有希望的体外研究失败的潜在原因之一是肿瘤微环境，尤其是免疫成分，在治疗耐药性中起着直接作用。为了鉴定和评价炎性脑肿瘤环境中分泌因子的作用，我们在含有肿瘤微环境分泌体(胶质瘤和宿主来源间质液)的两种不同的患者源性BTIC原位动物模型(Bt 25和BT 147)的间质液中使用了多种细胞因子/趋化因子珠阵列。BT 147模型是一种高侵袭性、快速生长的肿瘤，具有明显的Iba 1浸润。+TAMS，而Bt 25形成了侵袭性差，免疫静止的肿瘤(图)。1A，b)。评估从这些表型不同的肿瘤间质液鉴定共同和差异分泌的因素(图一)。1C)根据人类或小鼠特异性抗体鉴定为胶质瘤衍生蛋白(左面板)或宿主衍生蛋白质(右侧面板)。多重分析显示人IL-33、CXCL 10(IP 10)、CCL 2(MCP 1)、CXCL 8(IL-8)、CCL 7(MCP 3)、TGFα、KITLG和小鼠IL-4和CXCL 10在炎症性BT 147异种移植物的分泌中均有丰富的表达。1C，d)。此外，hVEGF、hLIF、hTSLP、hPDGFAA、mIL 10、mIL 1α、mIL 9和mCCL 3等细胞因子均有减少(MIP-1α；图1)。1C)。所有其他分泌因子要么没有改变，要么低于可检测的水平。重要的是，包括CXCL 10、IL-33、CXCL 8、KITLG、CCL 2和转化生长因子α在内的这些人源性细胞因子的一部分在体外并不是由BT 147细胞分泌或分泌的(补充图)。1A)，提示分泌增加是脑内胶质瘤与宿主细胞相互作用的结果。

我们观察到，IL-33是分泌最多的因子之一，其作用于一系列先天和适应性免疫细胞。51,63,64，我们把它列为进一步调查的重点。Bt 147异种移植物间质液的Westernblot分析证实存在33 kDa IL-33免疫反应带。1E)和免疫组织化学鉴定证实了IL-33在体内的存在，包括其在细胞核内的定位(h-核蛋白；图1)。1F)。用多重免疫荧光(IF)技术检测IL-33、巨噬细胞/小胶质细胞标记Iba 1和h-核蛋白(图1)。1g我们证实IL-33的主要细胞来源是人脑胶质瘤细胞(h-核蛋白阳性细胞)，在正常动物和荷瘤动物中都有少量寡突胶质细胞表达(补充图)。1B).

IL-33胶质瘤伴TAM浸润

为了确定白细胞介素33(IL-33)在更多的bt IC和初级gbm标本中的表达率和水平，在35株btic培养物和26例初级gbm标本上进行了rna-seq检测。65。在这组样本中，超过50%的样本表达IL-33。2A，b有8/35个BTIC(22.9%)和8/26(30.7%)GBM标本表达高水平的IL-33(≥10条/千粒酶每百万个映射读)。Westernblot分析证实BTIC中有IL-33蛋白。2A在BTIC中，IL-33与其来源的原代GBM标本(21对配对)之间存在显著的相关性(P<0.0 1)；r=0.60；p=0.0043；见附图。2A)。为了确定IL-33与TAM浸润是否相关，我们选择了5个IL-33高。2C，上2行)和5只IL-33低/无(图1.2C根据rna-seq数据，将其植入免疫缺陷(SCID)小鼠的大脑中。小鼠在出现发病迹象时被处死。免疫染色证实IL-33蛋白，并由初步筛选预测(图)。1)，显示高水平的IL-33+BITC异种移植物含有明显较高密度的Iba 1。+塔姆斯p≤0.01，图1.2C(图)此外，从第二对炎症(BT 53)和非炎症(BT 73)异种移植物中分离出的间质液的多重细胞因子分析显示，炎性异种移植物中IL-33、CCL 2和CXCL 10的细胞因子水平显著升高(附图)。2B)。为了推广这些结果，我们使用了一组独立的GBM标本(组织芯片(TMA)，包含70例患者标本)，发现12/64例(18.8%)的IL-33高表达，主要分布在胶质瘤细胞核内(图)。二维空间，左面板)。当对这一组患者标本进行Iba 1检测时，观察到IL-33和Iba 1的表达呈显著相关(P<0.0 5)。p=0.17；图1。二维空间、中间面板和图。2E，左面板)，提示IL-33可能是招募TAM的一个因素。此外，如cd163所示，当评估是否存在亲肿瘤的M2巨噬细胞时，IL-33之间存在显著的相关性。+患者肿瘤与M2巨噬细胞表型p≤0.05；图1。2D，e(右面板)支持胶质瘤来源的IL-33招募亲致肿瘤巨噬细胞的假设。这与巨噬细胞和小胶质细胞表达IL-33受体ST2的报道一致(参考文献2)。66,67)而IL-33能使巨噬细胞分化为M2表型。68,69。此外，对胶质瘤细胞的RNA-seq和westernblot分析显示，ST2(补充图)很少或没有表达。2C，d进一步支持胶质瘤细胞分泌IL-33的作用于肿瘤微环境的其他成分。此外，虽然有一些相关数据显示不同的突变景观影响细胞环境的差异，但TCGA数据库的分析证实了GBM患者队列中IL-33水平的升高(补充图)。2E)未发现与任何明显的基因描述符相关，包括分子亚型、MGMT甲基化状态或常见突变(如p53、PTEN EGFRvIII)。同样，尽管最近的数据显示，IL-33的男性特异性表达调节了实验性自身免疫性脑脊髓炎的性别二异型易感性。70在人脑胶质瘤中IL-33的表达无性别差异，男女表达均与整体生存率差相关。

分泌型和核型IL-33促进肿瘤的进展

因为IL-33是一种可溶性细胞因子，通过激活st2受体复合物和具有转录调节特性的核因子而发挥作用。71我们观察了分泌型和(或)核型IL-33对TAM募集和肿瘤生长的影响。为此，我们构建了含有270个氨基酸全长人IL-33或突变型IL-33的质粒载体，其中的核定位信号(氨基酸1-65)被删除(IL-33Δnls；图1)。3A)49。然后，在两种缺乏IL-33表达的人胶质瘤细胞株中表达构建物，并以其在体内的肿瘤生长和相关特征(U87，U251N)为特征进行了广泛的表征。72,73,74。Westernblot分析证实了全长(33 KDa)和IL-33ΔNLS(25 kDa带)的表达。3A和补充图。3A)，并揭示在不存在核固存(Δnls)的情况下，IL-33不被保留在细胞内(细胞裂解液)，而是分泌在高水平的培养基中(条件培养基；CM)，正如其他人所观察到的那样。75。较小的异构体的分泌与观察结果一致，即不同的蛋白酶将IL-33切割成较短的生物活性形式，但仍能与ST2结合(参考文献2)。76,77)。以表达pcDNA载体的胶质瘤细胞为对照。我们证实，全长度的IL-33，而不是IL-33ΔNLS，导致了IL-33的核积聚，而在核转运抑制剂柔霉素B处理后，这种积聚作用进一步增强(如图所示)。3B和补充图。3B)，这一结果支持IL-33在细胞质和细胞核之间穿梭，类似于其他已知的转录调控器。78。其次，将胶质瘤来源的IL-33、表达IL-33的肿瘤细胞或核定位缺陷的IL-33植入SCID小鼠脑内，并监测肿瘤负担。植入后三周，小鼠体内有白细胞介素-33+肿瘤出现症状，所有小鼠都被处死，大脑被摘除，用福尔马林固定，石蜡包埋。全脑切片用抗IL-33、Iba 1和h-核蛋白抗体进行免疫染色。3C和补充图。3C)。同样，第二组小鼠接种对照(PcDNA)或ΔNLS IL-33胶质瘤细胞被监测，直到注射后6周，对照组小鼠出现症状。如图所示。3C和补充图。3C，IL-33在两种胶质瘤细胞系中的异位表达均导致肿瘤生长显著增加，而iba 1则随之增加。+TAMS和整体存活率显著下降(p < 0.0001; Fig. 三维空间和补充图。三维空间)。流式细胞术证实CD11b显著增加。+/Gr1−巨噬细胞在IL-33中的表达+肿瘤与假注射对照组或载体控制荷瘤小鼠比较(图一)。3E)。此外，核定位的丢失可以消除IL-33诱导的肿瘤生长，并显著延长生存期(如图所示)。三维空间和补充图。三维空间)。出乎意料的是，虽然在3周时在ΔNLS异种移植体中发现了小肿瘤(如图所示)。3C和补充图。3C注射后6周，在两种不同基因的胶质瘤中均未检测到ΔNLS肿瘤，提示这些肿瘤要么经历了细胞死亡，要么被天然免疫系统清除。此外，在体外观察到，IL-33主要定位于胶质瘤细胞的细胞核内，而IL-33在Δ神经胶质瘤细胞的细胞核中未检测到(如图所示)。3C和补充图。3C)。此外，IL-33或ΔNLS、IL-33在体外对细胞增殖无显着性差异(附图)。3E)，这些数据进一步证实了体内效应是胶质瘤与宿主相互作用的结果。此外，用表达IL-33或ΔNLS IL-33的胶质瘤细胞的重组IL-33(rIL-33)或CM可在体外诱导BMDM(补充图)。3F，g)。这些数据支持这样的观点，即IL-33的分泌足以招募TAM，但IL-33的核功能需要促进一种促肿瘤巨噬细胞表型。

由于上述研究依赖于需要使用免疫不合格动物的人异种移植模型，并且取决于人类因素对小鼠宿主细胞的攻击能力，我们在一种小鼠同基因模型中进行了类似的研究。神经胶质瘤细胞株NF1的鉴定−/+p53−/+小鼠胶质瘤模型79IL-33的表达范围较广，至少有一株内源性表达IL-33(K 1491)，而包括K 1492在内的其他细胞系则没有检测到IL-33的表达(补充图)。3H)。为了评价IL-33在免疫功能模型中的作用，我们构建了一株表达小鼠IL-33的K 1492变异株。与人脑胶质瘤细胞一样，小鼠胶质瘤细胞也在细胞核和分泌细胞两个部位表达IL-33(附图)。3H)。重要的是，与人异种移植相似，IL-33的单纯表达导致肿瘤生长增强，浸润性TAMs增加，整体存活率降低(图1)。3F，g)。此外，虽然与IL-33阴性的胶质瘤相比，表达IL-33的胶质瘤的肿瘤负担大幅度增加，但肿瘤的实际大小表明，并非完全由于肿瘤负担而达到终点的临床标准。相反，这些数据表明，其他因素，包括建立高度炎症的细胞因子环境，支持IL-33在调节TME中的作用。

核白细胞介素-33有助于肿瘤的发生。

因为已知的IL-33与染色质有关联并调节转录活性。49，IL-33的核表达促进胶质瘤的进展(图1)。3我们对3个独立的IL-33细胞克隆进行了全局基因表达分析，并与空白载体细胞(见图)进行了比较。4A)。差异表达基因的阈值大于或等于2.0倍，错误检出率(FDR)为0.01。利用这些参数，IL-33的异位表达诱导了340个基因的表达，另外377个基因被下调。基因本体论(GO)术语在IL-33诱导的基因中被过度表达，包括三个与细胞因子活性和炎症相关的主要簇。4B)。在IL-33诱导的前50位基因中，至少有两个克隆是炎症基因。IL1β, IL6, G-CSF, 利夫, CXCL 3, CXCL 8, IL1RA, MIP，和CCL 2(补充图。4A)。为验证外源性IL-33在表达数据中对基因的调控作用，并确定IL-33是否参与了这些细胞因子的调控，采用多重细胞因子/趋化因子分析方法对来自对照组(PcDNA)、IL-33和IL-33-ΔNLS表达细胞的CM进行了分析。我们证实了大量炎症细胞因子在IL-33中的表达和分泌。+胶质瘤细胞4C除CCL 2外，还表明这些基因受IL-33核的调控。此外，还分析了来自肿瘤基因组图谱(TCGA)和我们自己的GBMs群体(TFRI GBM)的基因表达数据。65证实IL-33mRNA表达与致瘤M2巨噬细胞标记呈正相关，与M1巨噬细胞标记呈负相关(图一)。4D和补充图。4B)。经单样本基因集富集分析(SsGSEA)总结，IL-33诱导的基因与TCGAGBM队列中M2巨噬细胞标记和T调节细胞标记呈正相关(见相关矩阵图)。4E)。我们还观察到伊-33在癌症干细胞集群中的表达，与其他(非干细胞)显微解剖结构相比，来自常春藤成釉细胞瘤图谱项目(补充图)。4C)。仅局限于干细胞簇或非干细胞解剖结构的分析，两者之间存在正相关关系。伊-33两例患者均有M_2表达和巨噬细胞标记物的表达(图1)。4F和补充图。4D)。这些数据证实了我们先前的观察，即IL-33促进了GBM的免疫抑制表型。最后，值得注意的是，当ssGSEA评分汇总IL-33上调基因的表达时，ssGSEA评分较高与疾病特异性生存有关(p=0.0002；图1。4G)，就像IL-33驱动的微环境的促肿瘤性质所预测的那样。

与原始病人数据一致(图1)。2和4D-f胶质瘤来源的IL-33在体内的表达导致精氨酸酶1(Arg 1)阳性细胞的丰度增加，提示肿瘤发生前巨噬细胞群(如图1所示)。5A，b)，而Iba 1+在没有核定位的情况下(ΔNLS)不表达Arg 1，这意味着表达该突变体的胶质瘤细胞所收集的巨噬细胞具有M1抗肿瘤表型，可能介导ΔNLS肿瘤在体内的清除和消退(如图所示)。3C和补充图。3C)。用小鼠v2炎症板进行基因表达分析，证实了IL-33中一些抗炎细胞因子的显著增加。+ΔNLS异种移植物中缺失的异种移植物(如图所示)。5C和补充图。5)。同样，对NF的评估−/+p53−/+K 1492同基因模型发现IL-33的表达也增加了arg 1的浸润。+肿瘤内的TAMS(如图所示)。5D)。此外，通过对其他基因工程免疫活性胶质瘤模型的评估，发现新生儿白细胞介素-33水平升高，这与IL-33促进肿瘤发生的环境是一致的。N/TV-a；Cdkna−/−；Ptenfl/fl小鼠(Xfm)PDGFB驱动的小鼠胶质瘤模型80(无花果)5E)，并相应地渗透到Arg 1中。+塔姆斯(图1.5F)。这一观察与PDGFA或shNF 1驱动的小鼠胶质瘤模型形成鲜明对比，即IL-33和Arg 1。+小胶质细胞/巨噬细胞检测到的水平明显较低(见图)。5E，f)。此外，微阵列分析显示PDGFB驱动的胶质瘤在其他抗炎介质(M2)中有显著增加，包括IL1R2、IRF 7和STAT 3(如图所示)。5G)。此外，这些免疫活性模型的使用允许对其他免疫细胞群体进行检查，而且自IL-33被证明在T细胞激活中起着作用。81,82,83我们首先检查了这些肿瘤的T细胞储备。虽然人们普遍认为人脑胶质瘤中的T细胞很少，但我们在TCGAGBM队列中观察到与T调节细胞标记呈正相关(见相关矩阵图)。4E)。免疫组织化学鉴定进一步证实FOXP 3的存在。+IL-33表达中的调节性细胞NF1−/+p53−/+K 1492N/TV-a；Cdkna−/−；Ptenfl/fl小鼠(XFM)PDGFB驱动的胶质瘤和原发GBM标本，尽管其含量较低，但可重复使用(见图)。6A-d)。对tcga数据的重新评估证实与IL-33和T-调节标记的表达呈正相关，并加强了与人脑胶质瘤生物学的联系；数据与一项显示st2的研究一致。+T-调节细胞被动员响应于IL-33(参考文献)。84)。这些数据表明，IL-33表达的胶质瘤细胞建立了一个有利肿瘤形成的抗炎环境，介导了肿瘤发生的急剧增加。

IL-33在脑肿瘤中的作用

由于IL-33环境丰富了BMDM的招聘，我们初步研究了IL-33的直接影响。7)。为此，我们分离和纯化(>97%的纯度，见附图)。6A)C57BL/6小鼠BMDM，用rl-33处理，用多重细胞因子/趋化因子阵列检测CM。Rl-33暴露于细胞因子(KC、CXCL 2、CCL 2、CXCL 10、IL-6、CSF 3、CCL 5、TNFα和LIF)中，可引起细胞因子的剂量依赖性增加。7A，c)。此外，当人胎儿小胶质细胞暴露于rl-33时，细胞因子/趋化因子的产生也有类似的增加(附图)。6B)，表明IL-33可能对巨噬细胞的吸收和居住有直接的影响。此外，这些数据表明，IL-33调节大量细胞因子的分泌，包括一些已知的调节先天免疫细胞的合成的细胞因子。51,85。接下来，为了从功能上评估这些IL-33调节因子，bmdm被暴露在来自IL-33的胶质瘤来源的CM中。+、IL-33-Δnls和IL-33−胶质瘤细胞。距IL-33厘米+细胞导致BMDM的迁移和增殖增加(见图)。7b和补充图。6C)，这与未表达IL-33的胶质瘤细胞的CM形成鲜明对比。此外，来自ΔNLS表达的胶质瘤细胞的CM对BMDM的迁移行为也有同样的影响。7b)。重要的是，IL-33和ΔNLS CM的迁移增加可以通过中和抗IL-33或CCL 2的抗体来减少(见图)。7b这种趋化因子类似于IL-33表达的胶质瘤细胞中趋化因子的上调，或存在于IL-33表达肿瘤的肿瘤间质液(TIF)。1D, 4C和7C)。最后，如前所述，仅仅rl-33就足以调节这种迁徙行为(附图)。第三代)，从而支持直接和间接(例如CCL 2介导的)对BMDM的影响。

为了进一步了解胶质瘤来源的IL-33如何组织TME内的变化，并基于抗炎介质的显著增加(图一)。5)，包括在IL-33中观察到的一些信号分子。+我们用质谱技术对荷瘤小鼠的大脑进行了磷蛋白组学分析.IL-33的酪氨酸特异性磷蛋白组学分析+肿瘤显示来自STAT 3、CDK 1、Cdk 2、FYN、MAPK 14和MAPK 3的许多磷酸肽增多(图3)。8A)根据氨基酸序列，可能与人脑胶质瘤或小鼠宿主起源有关。特别令人感兴趣的是，IL-33驱动的环境激活了STAT 3信号，磷酸化(P)-STAT 3(PY 705)的增加表明了这一点，这种状态与胶质瘤的进展有关。86,87。为了验证P-STAT 3的细胞来源，我们使用多重IHC和人(h-核蛋白)和小鼠(Iba 1)标记。我们发现在表达IL-33和Iba 1的胶质瘤细胞中，p-STAT 3显著增加。+，这一结果与胶质瘤细胞与iba 1之间的双向信号一致。+Tam(图1.8B，f)。虽然这个信号的具体驱动因素尚未确定，但IL-6和lif的表达由IL-33决定。+胶质瘤细胞4C)代表已知的STAT 3调节的细胞因子。88。相反，在Δnls肿瘤中，p-stat 3仅限于iba 1。+细胞(图1.8B，f)。与此相一致的是，用TMA的免疫组织化学直接评估患者肿瘤时发现，高水平的p-STAT 3与IL-33的表达显著相关(如图所示)。8C与这些观察相一致的是，在体内表达IL-33的BT 147、BT 53和PDGFB驱动的胶质瘤模型中检测到高水平的p-STAT 3。8D-f).

表达IL-33的胶质瘤新生外周免疫细胞

IL-33荷瘤小鼠TIF的上述评价+对抗IL-33−1492例胶质瘤显示趋化因子CCL 2、CCl 5、Kc和CxCL 10在IL-33中富集。+肿瘤微环境7A)。这些趋化因子对白细胞(如单核细胞、NK细胞和T细胞)的招募有很强的促进作用。此外，我们的免疫组织化学数据显示，IL-33+同基因胶质瘤和IL-33+异种移植物与Iba 1的增加有关+荷瘤半球的细胞(图)。3和补充图。3)。众所周知，胶质瘤微环境中的TAMS由小胶质细胞和浸润的单核细胞组成。89,90。由于iba 1是由小胶质细胞和浸润的单核细胞共同表达的，因此不能区分这两种细胞类型，因此，我们通过对白细胞介素33的荷瘤半球的白细胞进行鉴定，来评估小胶质细胞和浸润单核细胞的个体发育。+和IL-33−异种移植物，使用流式细胞术概述在图中。9A。在这里，我们研究了趋化因子的富集和Iba 1的增加。+细胞，在IL-33中观察到+同基因和异种移植小鼠的大脑与循环免疫细胞的募集有关。+肿瘤环境。首先，从白细胞介素33的荷瘤半球分离白细胞。+和IL-33−1492只同基因小鼠，用流式细胞仪对其进行鉴定。门控策略用于描述分离的脑白血球在补充图中显示。7A。分离CD 45的总数+白细胞数在白细胞介素33中的比例为2倍。+对抗IL-33−1492只荷瘤小鼠。利用CD 45的差异水平来区分居住和浸润的免疫细胞，我们发现CD 45的存在显著增加。高白细胞介素33(IL-33)荷瘤半球内的细胞+对抗IL-33−同基因小鼠。以确定哪些细胞浸润了IL-33+我们使用以下标记物：CD3识别T细胞，Nk1.1检测NK细胞，CD11b、Ly6G和Ly6C联合检测髓系细胞(即中性粒细胞和单核细胞)。CD11b的数量显著增加。+髓系细胞、T细胞、NKT和NK细胞存在于IL-33的荷瘤半球。+对抗IL-33−1492只同基因小鼠。9B)。当我们进一步评估CD11b的增加+髓系细胞是中性粒细胞和单核细胞增多的结果，我们发现白细胞33中的中性粒细胞数量没有显著差异。+然而，胶质瘤炎症性Ly6C的数量明显增加了四倍。高单核细胞(图1.9)。此外，利用CD 45在CD11b上的差异表达+区分小胶质细胞(即CD 45)低层)，活化的小胶质细胞(即CD 45)中间型和脑浸润白细胞(即CD 45)高)活化的小胶质细胞在IL-33中显著增加。+对抗IL-33−1492例同基因胶质瘤，这种增加与静息(稳态)小胶质细胞数量减少有关。与此同时，如上文所述，FOXP 3也有所增加。+T细胞(图1.6).

其次，利用异种移植模型，我们可以比较IL-33和IL-33在进入细胞核(ΔnLS)能力方面的表达，我们观察到类似的IL-33介导的小胶质细胞激活以及单核细胞和NK细胞的募集，与缺乏核定位的肿瘤相比，IL-33的表达增加了2.1倍和4.6倍(如图所示)。9C)。此外，在检测Ly6C和CCR 2表达的平均荧光强度时，在单核细胞上表达的标记物，而不是小胶质细胞上的标记物，在CD11b上的表达也明显增高。+CD 45高细胞与CD11b+CD 45低层细胞(图1.9C)。与此相一致的是，用n计数器小鼠v2炎症板进行的NanoString n计数器分析显示，cdr 2在IL-33中的表达显著增加。+异种移植物(附图)7b)。此外，当我们在cx3cr1的PDGFA或PDGFB驱动的肿瘤中检测cdr 2表达的单核细胞时，我们发现绿色荧光蛋白/CCR 2RFP小胶质细胞报告小鼠(CX3CR1)很高，CCR 2−绿色与单核巨噬细胞(Cx3cr1)不同。+CCR 2+(绿色和红色)，我们再次发现白细胞介素-33中单核细胞增多。+PDGFB驱动的肿瘤(附图)7C).

由于上述结果与表达IL-33的gbm细胞生长外周免疫细胞的结果一致，我们扩展了CD 45的特性。+免疫细胞采用单细胞RNA测序(ScRNAseq)。为了保持对先天免疫细胞的关注，我们选择在IL-33中进行这些研究。+和IL-33−异种移植，一种评估肿瘤免疫库中激活状态的差异的模型，以及被招募的天然免疫细胞，如单核细胞和NK细胞，据报道在胶质瘤肿瘤环境中富集。91,92,93,94,95。脑白细胞如上文所述从白细胞介素33中分离出来。+和IL-33−荷瘤半球，按CD 45分类，用10×铬平台进行RNA序列测定。经过质量控制和预处理后，从三个对照组(20,308个细胞)和3个表达IL-33的细胞(18,163个细胞)共回收38,471个细胞进行分析(补充数据)。1)。所有细胞的无监督聚类用均匀流形近似和投影(UMAP)在图中描述了14个不同的簇。10A。为了确定这些类群的身份，我们使用了一组定义谱系的基因，并发布了免疫细胞标记。92,93,96,97,98,99,100,101,102,103(无花果)10b和补充表1)。三组(即第7、9和13组)代表正常情况下在脑实质内不存在的细胞。93，因此，意味着细胞浸润胶质瘤承载的脑组织。其中，单核细胞团7(单核细胞)和NK细胞(NK细胞)主要存在于IL-33表达的异种移植物中(图1)。10C)，与图中所示的流式细胞术研究相一致。9。单核细胞和白细胞介素-33中NK细胞顶端激活或抑制的典型途径综述+异种移植物如附图所示。7D。这些外周髓样细胞存在于IL-33表达的肿瘤中，支持胶质瘤来源的IL-33与促进细胞从血液循环进入大脑的中介物的关联。

最近的研究表明，小胶质细胞表现出明显的异质性和不同的功能表型，这些表现形式与年龄、性别、空间分布和神经系统疾病状态有关。104。与此相一致，我们勾勒出7个可识别和可识别的小胶质细胞群体(小胶质细胞1-7)(图1-7)。10b)。我们使用GO富集技术研究了这些种群的多样性(图一)。10d)以及每个簇内差异表达基因的排列，特别是在七个小胶质细胞群体之间进行比较时，以及以单细胞分辨率定义的基因标记。105,106,107(补充图。8a，b和补充表2)。7个小胶质细胞群体差异基因表达的比较(附图)。8A)表明，小胶质细胞1(簇0)是小胶质细胞中最大的一群，具有较高的稳态小胶质细胞基因表达。98,104,107，包括P2ry12, GPR 34, 塞尔普, Cst 3, Tmem119，和P2ry13(无花果)10E和补充图。8B，c)，一个由大量来自IL-33的细胞组成的簇。−异种移植物10C)。在展示一些差异的同时，小胶质细胞7(第10组)也显示了一个稳态信号(例如，P2ry12, GPR 34, CX3CR1, 塞尔普，和P2ry13)；然而，这些人口的存在与IL-33状态无关(见图)。10C)。相比较而言，小胶质细胞3(第4组)含有一个循环和增殖细胞的群体，其特征是参与细胞周期调控和dna复制的基因的高表达。106,108，在这些生物过程中丰富了相应的GO术语(图1)。10d和补充图。8a，b，d)。此外，我们还观察到一群胶质瘤相关的小胶质细胞，这与脑胶质瘤微环境中新出现的激活髓细胞信号的描述一致。107,109,110(小胶质细胞2(第2组))CCL 2, CCL 12, IFITM 3，和IL1β(无花果)10E和补充图。8a，b，e)与其他小胶质细胞相比，促炎细胞因子骨桥蛋白富集，Spp1脂质代谢基因，APOE(无花果)10E或补充图。8a，b，e)。令人感兴趣的是，我们发现这些胶质瘤相关的小胶质细胞在表达IL-33的异种移植物中几乎是对照组的三倍(见图)。10C)，一种支持IL-33作为激活胶质瘤微环境驱动者的观察。这些小胶质细胞对单核细胞趋化因子基因也有明显的上调作用。CCL 2, Ccl 3，和CCL 12，将它们与浸润性免疫细胞的招募联系起来(附图)。8a，b)。为了阐明IL-33在小胶质细胞中的特异性作用，我们比较了IL-33基因的表达情况。+和IL-33−小胶质细胞2(附图)8F)，并发现对稳态基因的抑制作用(P2ry12, GPR 34, Tmem119，和塞尔普)以及增强Spp1, IFITM 3，和CCL 2在IL-33中+肿瘤。小胶质细胞5(第6组)也有类似的胶质瘤相关信号(例如，Ccl 3, APOE，和LPL)补充图。8a，b)，在这两个小胶质细胞簇中，我们观察到了与细胞因子分泌相关的GO术语的类似富集。107蛋白质翻译110(无花果)10d)。此外，我们还发现，小胶质细胞6(簇8)在IL-33中有独特的富集。−肿瘤(如图所示)。10C)和参与抗原表达的基因的表达106,108(例如，CD 74, H2-AA，和H2-AB1(补充图。8a，b，g)。GO分析也显示了与T细胞功能相关的术语的丰富(如图所示)。10d)因此，小胶质细胞6被确定为MHC高小胶质细胞群。108(无花果)10E和补充图。8g)。在白细胞介素-33中没有这种小胶质细胞。+肿瘤进一步表明，IL-33可能部分地通过免疫抑制来推动一个有利肿瘤形成的环境.最后，小胶质细胞4(第5组)并不像任何已发表的签名(补充图5)。8a，b)，还有待定义，但并不是IL-33所独有的。+环境。

脑胶质瘤微环境中残留的免疫细胞为外周髓样细胞(BMDM)，它们分别与小胶质细胞聚集在一起，表现出相似的异质性(图1~4)。10b和补充图。9A-c)。虽然bmdm的不同种群显然存在，但它们似乎与单元类型算法导出的经典签名不一致。93,97(例如，bmdm 1表达核心小胶质细胞基因，包括塞尔普, P2yry12，和Tmem119尽管处于较低的水平(如图所示)。10b)，这是一种可以反映这些细胞所居住的大脑独特环境的观察。93。然而，在这些BMDM群体中，注意到以下几点：(1)BMDM 2(第3组)与小胶质细胞2相似，高表达Spp1和APOE基因107,109，因此被定性为胶质瘤相关的BMDM。10F和补充图。9a，b，d)；(2)BMDM 4(第12组)，显示与干扰素信号有关的基因的大量表达，包括Ieft 2, Ifit 3，和IRF 7(参考文献。105,106,108；图1.10F和补充图。9A，b，e)，因此表示干扰素响应的bmdm，以及(3)bmdm 3(集群11)，它被选择性地富集在IL-33中。+异种移植物，表达具有浸润单核细胞和胶质瘤相关bmdm特征的基因信号。111(补充数据)1)。此外，BMDM 3表达的基因参与蛋白翻译，意味着一个活跃的分化细胞群体。111。由于我们对IL-33的能力特别感兴趣，而单核细胞在大脑中分化为巨噬细胞，所以我们订购单核细胞，分化bmdm 3(Bmdm 3)和胶质瘤相关bmdm 2(Bmdm 2)。+异种移植物在一个伪时间轨迹，以了解这一转变(图)。10g)。正如我们所预测的，我们观察到一种从IL-33富集的炎症单核细胞的转变。100(以…的表达为标志)CCR 2, IFitm.2，和IFITM 3)将bmdm与胶质瘤相关的bmdm区分开来。107,110,111(以…的表达为标志)APOE, 六角，和CD 81)与肿瘤发生前的环境一致。此外，核糖体基因(例如，RPL和RPS)，这是Athanasiadis和他的同事观察到的类似于髓系分化模式的特征。112与最近的一项研究一致，该研究绘制了非实质脑巨噬细胞的多样性图。111.

讨论

我们的研究强调了胶质瘤来源的IL-33作为促进胶质瘤进展的脑肿瘤微环境的一个重要的调节因子，并建立在先前的研究基础上，为进一步了解IL-33在胶质瘤生物学中的作用提供了更多的机制。60,61,62,113。首先，我们发现在GBM的一个子集中存在核和可溶性IL-33，IL-33的表达与TAM浸润增加有关，并降低了GBM患者的整体生存率。其次，我们发现IL-33的表达促进了颅内移植瘤的生长和TAM的浸润，而IL-33对其增强肿瘤生长的作用是必不可少的。第三，我们确定核白细胞介素33介导胶质瘤细胞分泌大量炎性细胞因子。总体来说，这种由IL-33驱动的肿瘤环境既促进了小胶质细胞的激活，也促进了骨髓来源细胞的合成，共同促进了胶质瘤的生长和发展。本研究提供的数据突出了胶质瘤细胞调节脑肿瘤环境以促进肿瘤进展的一个主要机制，并且很可能导致肿瘤的耐药。

在过去的几年里，IL-33调节先天免疫系统和适应性免疫系统的能力，包括其对组织稳态和环境应激反应的贡献，受到了广泛的关注。64。这一系列的影响被认为归因于IL-33作为ST2的核抑制剂和细胞外配体的内在能力(参考文献2)。114,115)。此外，在胃癌患者血清和肿瘤组织中检测到IL-33水平升高的一些癌症中也观察到了IL-33。116肝细胞癌117，子宫肌瘤118、肺癌119、结直肠癌120,121、乳腺癌122子宫内膜癌123，最近在胶质瘤中，IL-33的表达与胶质瘤的分级、Panofsky表现评分和生存率有关。61.

在本研究中，我们证明胶质瘤来源的IL-33通过改变肿瘤微环境的细胞状态，在体内对胶质瘤的生长有显著的影响。体内胶质瘤分泌体初步特征显示IL-33是炎症表型的主要成分。同时挖掘tcga数据库和我们自己的胶质瘤rna-seq数据库。65,124为白细胞介素33在约50%的高级别胶质瘤中的表达提供了补充证据，而在低级别胶质瘤、星形细胞瘤或其他脑肿瘤中很少或没有表达(Www.cBioportal.org)。IL-33的存在并不局限于人脑胶质瘤，因为在包括同基因nfl在内的GBM小鼠模型中观察到了IL-33的存在。−/+/Trp53−/+模型79,125,126和PDGFB驱动的肿瘤，具有更多的间质间质样表型。80。无论是人类还是小鼠的白细胞介素-33+胶质瘤模型与高巨噬细胞/小胶质细胞浸润与促瘤能力有关。我们发现在不表达的胶质瘤细胞中仅表达IL-33就足以促进肿瘤的快速生长，并显著降低肿瘤的整体存活率。此外，我们还观察到IL-33对骨髓来源细胞、T细胞、NK细胞和驻留小胶质细胞的募集和激活具有直接和间接的调节作用。我们还观察到胶质瘤来源的IL-33使胶质瘤细胞和iba 1细胞的p-STAT 3增加。+基质细胞，随后在缺乏核白细胞介素33(Δnls)的胶质瘤细胞内失去p-STAT 3。这一观察结果与胶质瘤细胞与iba 1之间的双向信号相一致。+小胶质细胞/巨噬细胞，一种可能由环境中IL-6和LIF的存在所介导的通讯。

如前所述，IL-33已被证明通过调节细胞因子参与组织内环境平衡；然而，这一调控的确切机制仍然是未知的。此外，虽然人们充分认识到IL-33在多种细胞类型中具有明显的核定位，但其确切的生物学功能仍不清楚，可能存在疑问。127。初步研究表明IL-33在人内皮细胞中的核定位。115，其中显示IL-33与染色质有关联。49,50并通过与转录抑制因子组蛋白甲基转移酶(SUV 39H1)结合，作为转录因子发挥作用。49。此外，IL-33还通过与p65亚基启动子结合来调控NF-kβ信号。128)，或通过物理交互和隔离NF-kβ(参考文献)。129)。IL-33含有N-端染色质结合基序(氨基酸40-58)。50和预测的二部核定位信号(氨基酸61-78)115并利用一个使这两个结构域瘫痪的突变体，揭示了胶质细胞瘤发生过程中对核白细胞介素33的功能需求。白细胞介素-33的核能力驱动了许多细胞因子的分泌，而当核定位功能受损时，这一观察还未见。事实上，随着时间的推移，在没有核仁IL-33的情况下，几乎没有任何肿瘤负担的证据。这与分泌型和细胞核型IL-33的存在形成鲜明对比，后者驱动胶质细胞发育不全，这与人类基因表达分析、bt IC/胶质瘤细胞异种移植或PDGFΒ驱动的小鼠胶质瘤模型的评估无关。这种快速的生长是由巨噬细胞与人白细胞介素-33形成成瘤表型的巨噬细胞所推动的。+GBM手术标本与M2巨噬细胞和T调节细胞呈正相关，与M 1巨噬细胞和细胞毒性T细胞呈负相关，后者与整体生存能力较差有关。因此，基因表达的巨大变化支持IL-33在调节染色质结构变化和重组中发挥更全球性的作用。49,50值得进一步调查的观察结果。IL-33悖论的概念130至于它是否能促进或抑制肿瘤的发生，至少可以部分地解释为核与分泌的相对功能，这是一个应该追求的概念。

关于细胞分泌白细胞介素-33的机制仍有相当大的争论，部分原因是缺乏通过高尔基体和内质网分泌途径靶向蛋白质的常规领导肽。127。相反，将白细胞介素33鉴定为从受损细胞中释放出来的一种alarmin，导致越来越多的人一致认为，IL-33的释放是从坏死或组织损伤区域释放出来的。131,132,133。这一点得到了这样的观察的支持，即完整长度的IL-33通过炎症蛋白酶切割成成熟的生物活性形式(hil-33)而具有生物活性(hil-33)。112-270)，其生物活性比全长IL-33高出30倍(参考文献).76,77)。此外，当细胞被像柔霉素B这样的核出口抑制剂处理时，分泌减少，这意味着白细胞介素33的核池的参与(参考文献)。134)。虽然胶质瘤细胞体外释放的IL-33很少，但体内间质分泌中检测到大量的IL-33。虽然人脑胶质瘤可以有坏死区，白细胞介素-33可以释放，但在本研究中使用的许多体内模型显示很少有坏死的证据。相反，我们假设其他机制用于从活细胞分泌IL-33，这是有支持数据的。135,136.

综合起来，这些数据支持类似于IL-1α和HMGB 1(参考文献)的数据.71IL-33在胶质瘤中具有双重功能，它既是一种促炎细胞因子，又是一种细胞内核因子，是促进胶质瘤进展所必需的功能。提示胶质瘤细胞缺乏ST2受体，rl-33对体外胶质瘤生长无影响。这一结果与表达ST2并对外源性IL-33(参考文献)反应的大肠癌细胞形成对比。137)。相反，我们的数据与胶质瘤来源的IL-33调节肿瘤环境的数据是一致的，它通过诱导胶质瘤来源和基质来源的细胞因子的分泌来激活小胶质细胞，还可以招募和激活促肿瘤的M2样巨噬细胞，类似于分泌周围素的gbm。138。然而，对TCGA和我们的RNA-seq数据的评估表明，IL-33和膜蛋白之间没有直接的联系，因此提出了另一种独立的机制。相反，我们的观察结果与最近的一项研究相一致，该研究表明，大多数加入PDGFB驱动的GBM的TAMS都是骨髓来源。89因此，提供至少一种方法来诱导这种环境诱导细胞的招募。

我们提出了以下可能具有重要治疗意义的模型。胶质瘤细胞分泌的IL-33可以从循环中吸收单核细胞，从而促进脑肿瘤环境中的细胞组成。最初被招募到肿瘤的细胞具有一种与m1类抗肿瘤状态相一致的表型，然而，当胶质瘤细胞内存在核IL-33时，会产生一个有利于TAMS和潜在的驻留小胶质细胞重新编程的环境，使其成为亲肿瘤的M2样表型，从而促进胶质瘤的快速生长。在这里，我们发现在IL-33中存在bmdm。+胶质瘤与小胶质细胞一起，有许多不同的转录网络(图一)。7同时表达亲炎症(M1)和交替激活(M2)基因。这与研究表明IL-33直接作用于小胶质细胞并导致其表型改变是一致的。58,139，而人脑胶质瘤标本中含有多种状态的巨噬细胞。140。从本文所提供的数据可以清楚地看出，IL-33环境可以教育TAMS来推动胶质瘤的进展，并且需要IL-33的核功能。乔伊斯和他的同事们的研究进一步支持了这个观点，这些研究表明csf-1的阻断可以防止白细胞的循环吸收，因此可能有治疗作用。141。虽然这是一种很有吸引力的策略，但系统性的CSF-1阻断在对宿主免疫反应的影响方面存在障碍。相反，我们假设在胶质瘤环境中调节巨噬细胞的表型可能需要一种更精确的方法，这一策略与我们使用两性霉素B重新规划脑肿瘤环境的研究相一致。39。虽然使用可溶性st2受体来隔离分泌IL-33有一些治疗策略。142我们的数据提供了一种挑衅性的观点，即靶向IL-33的核蓄积可能通过维持肿瘤抑制型TAMS的肿瘤环境而具有治疗作用。此外，正如Quail和Joyce所建议的，肿瘤微环境在治疗过程中可以进一步改善，因此，在检查某一特定治疗方案的应答者和无效者时，应该考虑到这一点。16。因此，在免疫治疗和肿瘤病毒治疗的时代，人们可能会推测IL-33组织的肿瘤环境是否有益，或抑制这些治疗和基于IL-33或TAM状态的患者分层可能需要考虑设计信息的临床试验。此外，我们假设由IL-33组织的细胞因子风暴可以绕过或克服小分子抑制剂(如酪氨酸激酶抑制剂)的治疗效果，这将导致他们在临床上失败的经验。

方法

细胞株

人U 87、U 251胶质瘤细胞株和U 937细胞株来源于美国型培养物，小鼠K 1491和K 1492胶质瘤细胞系分别来源于C57BL/6J。Trp53+/−/NF1+/−小鼠79,125。U87、U 251、K 1491和K 1492在加10%热灭活胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素、2mm L-谷氨酰胺和1 mm丙酮酸钠(37°C加湿5%CO)的完全培养基(Dulbecco‘s改良Eagle’s培养基(DMEM)中)。2孵化器。当细胞达到80~90%的汇合时，用Puck‘s EDTA进行传代.稳定转染U87或U 251细胞后，加入400μg/mlG 418，在同一培养基中不加抗生素。K 1492细胞稳定转染在同一培养基中，不加抗生素，加入1μg/ml普罗霉素。U 937细胞在含10%FBS和10μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640中培养。用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA；50 ng/ml)处理U 937细胞。经PMA处理2天后，U 937细胞粘附并获得巨噬细胞特性。143当时细胞被使用。在卡尔加里大学的脑肿瘤干细胞核心内建立了BTIC。12,47。Bt 25和147细胞在含DMEM/Ham‘s F12(1：1)的无血清培养基中，加入5 mm HEPES缓冲液、0.6%葡萄糖、3 mm碳酸氢钠、2mm谷氨酰胺、25μg/ml胰岛素、100μg/ml转铁蛋白、20 NM孕酮、10μM腐胺、30 NM亚硒酸盐(添加表皮生长因子20 ng/ml)、成纤维细胞生长因子2(FGF 2)(20 ng/ml)和硫酸乙酰肝素(2μg/ml)，在37°C下加湿5%CO。2孵化器。BT 53和73细胞保持在相同的SFM中，不含EGF和FGF 2。在一定尺寸(~100~200μm)的条件下，通过生长的方法制备了BTS微球，并进行了传代。然后用Accumax在适当的培养基中重新悬浮，将球体解离成单细胞悬浮液.从C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓中分离出小鼠BMDM。144。BMDM在添加1%非必需氨基酸(NEAA；Invitrogen)和10%L 929细胞CM(L 929培养基)的完整培养基中分化7d。第5天和第7天更换新鲜培养基，分化7d后用F4/80抗体进行流式细胞仪鉴定。本研究使用的BMDM均在95%以上F4/80阳性。成人或胎儿小胶质细胞(>95%纯度)分别来自切除的脑标本和胎儿组织。简单地说，成人小胶质细胞(Ham)是从外科手术切除的成人脑组织中提取出来的，用于治疗难治性癫痫。39,145。在先前的工作中，我们确定为本研究获得的人类小胶质细胞与其他神经疾病或正常大脑中的小胶质细胞相似。146。从14~18周人胎儿脑组织中分离出人胎儿小胶质细胞。143。脑组织切成1mm，用0.25%胰蛋白酶孵育，200μg/ml DNaseⅠ在37°C磷酸盐缓冲液中作用15 min，组织悬液用130μm孔滤池冲洗，200×10×离心。g10分钟。小球在PBS中洗两次，然后用10μg/ml聚鸟氨酸包埋在T-75瓶中，加入10%氟脲嘧啶、20μ/ml庆大霉素、0.1%葡萄糖、1×NEAA、10μM谷氨酰胺和1mm丙酮酸钠。培养1周后，收集漂浮细胞，以小胶质细胞为主(纯度>95%，用CD 14和Iba 1免疫组织化学检测)。在密度为1.5×10的96孔板中镀有小胶质细胞。4每井都有细胞。通过Calgary实验室服务公司(CLS)进行的短串联重复序列分析，验证了本研究中所建立的所有细胞系的同一性。按厂家指示，dF1细胞维持在39°C，用于早期传代，检测支原体。

人体组织样本

GBM、TMA和GBM原始标本取自卡尔加里大学克拉克·H·史密斯神经学和儿科肿瘤库。由手术切除的、福尔马林固定的、石蜡包埋的胶质瘤和TMAS核组成的含三份0.6mm核的TMA代表64例GBM标本。应用手术切除的人脑组织治疗药物性难治性癫痫，获得HAM。人胎儿经治疗性流产后，获得人胎儿小胶质细胞。使用大脑材料进行研究的知情同意是从患者那里获得的。所有人类组织的使用都得到了批准，并与CLS和卡尔加里大学联合健康研究伦理委员会的政策相一致。HREBA.CC-16-0762号学习协议由省伦理委员会审查和批准(以前被卡尔加里大学CHREB委员会批准为第2975号议定书)。未鉴定样品的培养和分子特征的相关具体伦理批准是在HREBA.CC-16-0763和HREBA.CC-16-0154协议下批准的。

动物

6~8周龄雌性SCID或C57BL/6J小鼠分为3~5组，按12 h的光照/黑暗时间，温度为22°C±1°C，相对湿度为50±5%。食物和水是可用的。所有程序均经卡尔加里大学动物护理委员会(动物议定书#AC 18-0073)审查和批准。PDGFA-、PDGFB-和shNF-1+CRE诱导的小鼠胶质瘤N/TV-a；Cdkna−/−；Ptenfl/fl使用RCAS/TV系统的老鼠147,148。这些动物实验是根据FHCRC的动物保护和使用委员会批准的协议进行的，并遵循了NIH动物福利指南(动物协议#50842)。CX3CR1GFP/WT; CCR 2RFP/WT; Nestin-TV-a; PTENfl/fl小鼠通过杂交产生。CX3CR1GFP/GFP; CCR 2RFP/RFP小鼠89进Nestin-TVA; PTENfl/fl小鼠90. CX3CR1GFP/WT; CCR 2RFP/WT; Nestin-TV-a; PTENfl/fl小鼠处于C57BL/6J背景。CX3CR1GFP/WT; CCR 2RFP/WT; Nestin-TV-a; PTENfl/fl老鼠被安置在埃默里大学动物资源部。实验程序得到埃默里大学动物照料和使用机构委员会的批准(动物议定书#2013-1029)。

原位胶质瘤发生

新诊断(BT 73、BT 63、BT 67、BT 127、BT 140和BT 53)、复发(Bt 25、BT 119、BT 143和BT 147)、U87和U25人胶质瘤细胞(5×10)的患者源性BTIC4细胞/小鼠)和K 1492小鼠胶质瘤细胞(1×10)5采用氯胺酮(85 mg/kg)加西拉津(15 mg/kg；MTC制药，剑桥，加拿大)的腹腔注射法，将细胞/小鼠植入SCID或C57BL/6小鼠的脑内。经头皮切口在3mm深度注入右侧壳核，中线右侧0.5 mm毛刺孔，冠状缝后方0.5~1mm。立体定向注射是用5-升型注射器(Hamilton Co.)进行的。Www.hamiltoncompany.com)安装在Kopf立体定向装置上的30毫米针(考普夫仪器，图甘加，加利福尼亚州)。取针后，缝合切口，每周对小鼠进行监测。12,47,72,74。各组动物全脑组织切片在指定时间点进行免疫组织化学(IHC)检测。评估动物的生存状态，直到他们失去20%的体重，或在行走、喂食或梳理方面有困难，或直到实验结束。

世代PDGFA-, PDGFB-和ShNF-1-诱导的小鼠胶质瘤

制备PDGFA-、PDGFB-和shNF-1诱导的双转基因新生儿胶质瘤电视a; CDKN2A−/−; Ptenfl/fl小鼠(Xfm)注射DF1鸡成纤维细胞，产生表达人PDGFB、人PDGFA或shNF 1+cre的rCAS逆转录病毒。80。观察小鼠肿瘤发展的症状(脑积水、嗜睡)。

小鼠胶质瘤的发生CX3CR1GFP/WT; CCR 2RFP/WT; Nestin-TV-a; PTENfl/fl小鼠

除df 1细胞被注射到小鼠外，上述同样的程序也被用于生成这些小鼠。CX3CR1GFP/WT; CCR 2RFP/WT; Nestin-TV-a; PTENfl/fl转基因小鼠。同样注射df1鸡成纤维细胞，产生表达抗小鼠p5 3(rcas-shp5 3)短发夹的rCAS逆转录病毒和人PDGFB或pdgfa，产生小鼠胶质瘤。CX3CR1GFP/WT; CCR 2RFP/WT; Nestin-TV-a; PTENfl/fl老鼠。对小鼠进行了仔细的监测，如果由于肿瘤负担而表现出嗜睡状态，则将其处死。所有实验均采用出生后0~3天的小鼠。

免疫组织化学和免疫荧光染色

在室温下用抗IL-33(1/100)、h-核蛋白(1/500)、Iba 1(1/500)、Olig-2(1/500)、Arg 1(1/100)、CD 163(1/200)、CD4(1/500)、FOXP 3(1/200)、pSTAT 3(1/50)、RFP(1/500)和GFP(1/500)对脑组织切片进行IHC和IF染色。对于IHC，使用了DAKO远景和系统-HRP工具包(Agilent Technologies)。用苏木精(Sigma-Aldrich)对玻片进行染色，安装后用蔡司倒置显微镜(Axiovert 200 M)和照相机(AxioCAM MRC)成像，或用Aperio ScanScope XT(Aperio Inc.)扫描。用显像管12.2.2.5015软件获取了20×或40×分辨率的幻灯片扫描仪和图像。为了量化大脑中巨噬细胞的水平，Iba 1的总数+在Iba 1染色脑组织切片上，用5个随机视野对细胞进行量化。对脑组织切片中CD4或FOXP 3阳性细胞的数量进行量化，计算CD4阳性细胞总数。+或FOXP 3+用Qpath软件对整个脑组织切片进行细胞计数。在GBM、TMA和GBM原发标本中，IL-33、CD 163和Iba 1染色评分为0~3级，由3名独立观察者进行评分。用荧光结合二次抗体(Invitrogen)在RT孵育1h，用5μg/ml的DAPI对细胞核进行染色。多功能组织荧光染色采用蛋白石染色系统(PerkinElmer)。如果使用细胞分析系统(GE Healthcare)获取图像，并使用IncellDeveloperToolbox1.9.1软件拼接全脑图像。抗体列于“试剂和资源表”(补充表)6).

细胞因子测定

采用人64-Plex细胞因子/趋化因子板和小鼠31-Plex细胞因子/趋化因子板(EVE技术，加拿大卡尔加里)检测颅内移植物和细胞培养液中的细胞因子水平。TIF制备149取下含瘤半球，用乙醇浸泡，切成小块(3mm)。3)，用PBS冲洗，放入每250毫克组织含有1.0毫升PBS的10毫升锥形塑料管中。样品在37℃加湿CO中孵育1h。2孵化器。然后，样品在150×g培养3 min，取上清液，2300×离心。g在冷冻离心机(4°C)中待20 min。收集最后上清液，在−80°C保存，再进行多重分析。为检测胶质瘤细胞和BTIC细胞培养液中细胞因子的水平，将细胞在1×10的浓度下镀膜。6细胞/10 ml分别在全培养基或BTIC培养基中孵育48h，收集培养基并送Luminex分析。为测定rl-33处理后人胎儿小胶质细胞或bmdm细胞培养液中细胞因子的水平，将细胞在1×10的浓度下进行培养。4细胞/井在96井板中。24h后，用rl-33培养基代替培养基。24小时后采集CM，用Luminex法测定细胞因子水平。

Westernblot分析与免疫细胞化学

等效数量的细胞被镀在一个六孔组织培养板上。48小时后，将2×十二烷基硫酸钠(Sds)样品缓冲液100μ1直接加入细胞内，在95℃下煮15 min，制备浓缩无血清CM，将相同数量的细胞在6孔板中培养12h，用无血清培养基代替培养基。4 8h后，用3K阿米康浓缩4ml CM至2 0 0μ1，用相同体积的2×sds样品缓冲液混合50μ1，在95°C下煮沸15 min，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质，并用合适的初级抗体和次级抗体进行westernblot分析。免疫细胞化学方面，细胞生长于细胞表面，固定于4%多聚甲醛，免疫染色前用0.25%TritonX-100渗透。原代小鼠单克隆抗人IL-33(1/100)或山羊多克隆抗小鼠IL-33(1：100)和继发性Alexa Fluor 488结合山羊抗小鼠LGG。用DAPI和贴装在玻璃玻片上的眼镜片对细胞核进行染色。在蔡司LSM 880共焦显微镜上，采用63×/1.40NA计划-Apochromat油DIC M27物镜(蔡司显微成像)获得图像。抗体列于补充表6.

脑免疫细胞CD11b的分离及特性研究+GR-1−细胞

通过70μm滤器和40μm滤器机械分离，从荷瘤大脑右半球分离出脑免疫细胞。用溶血缓冲液(1 min，4°C)溶解肿瘤匀浆中的红细胞，用Fc受体阻滞剂(30 min，22°C)孵育分离细胞，阻断非特异性抗体的结合。为了鉴定髓系细胞，用以下抗体稀释1：100：Pe抗小鼠CD11b和AlexaFluor 647抗小鼠GR-1。ZombieViolet™可固定活性试剂盒用于排除死亡细胞。然后，细胞通过一个额外的40μm过滤器，以去除任何大的聚集前运行的流式细胞仪。将感兴趣的人口量化为流式细胞仪记录的事件总数，最终数量为每1×10的人口数量。6事件。使CD11b的金额正常化+GR-1−从所有样本到事件的细胞，首先记录未被激活的事件的数量(例如，IL-33脑1=2×10)。6事件)，然后计算一个归一化因子(NF)。NF=1×106/(未处理事件的数目)。在这种情况下，NF=0.5，用于规范2000年CD11b+GR-1−白细胞介素-33脑1中的细胞与记录的许多事件有关，例如NF×2000=1000 CD11b+GR-1−每1×10细胞6事件。

脑免疫细胞的流式细胞术分离及鉴定

从荷瘤的右半球分离细胞。150如上文所述。获得免疫细胞的单细胞悬液后，用PBS/1%FBS洗涤细胞。用CD 16/CD 32抗体(22°C，10 min)孵育FC受体。表面标记物染色用100μL PBS/FBS(22°C，15 min)进行所有抗体孵育。采用以下抗体组合鉴定不同的免疫细胞群：CD 45(BV 786)、CD11b(AF 700)、CCR 2(APC)、Ly6C(PerCP)、Ly6G(BV 510)、CD3(BV 421)、NK1.1(APC)、NKp 46(BV 421)和CD 19(PeCy7)。为了确定活细胞与死亡细胞的比例，在流式细胞仪上运行前，在细胞悬液中加入碘化丙啶(5μL)。用于CD 45的分类+细胞：分离来自荷瘤右半球的细胞，用CD 45(BV 786)抗体标记。细胞用BD FACSARIA III分类器进行分类。对样品进行了CD 45的检测。+在排除双打之后。分类CD 45+在含1ml PBS/1%FBS的试管内收集细胞。细胞悬液保存在冰上，直至装在铬单细胞控制器芯片(10×基因组)上。

诱变和转染

人(NM_033439；HIL-33pCMV_6-XL5)IL-33cDNA来源于Origene。将人IL-33 cDNA克隆到pcDNA 3.1载体中，构建pcDNA3.1HIL-33质粒。以pCMV 6-XL5人IL-33 cDNA为模板，PCR扩增人IL-33ΔNLS缺失突变体，正义引物含有Noti位点和ATG起始密码子，反义引物含有终止密码子和Noti位点。用于产生IL-33ΔNLS缺失突变体的引物序列为F5‘-GCGGCGGCCGCCGCATGATAGCGGCCGCCCACTGAAAACA-3’(正向)和R5‘-CGCGGCCCAATCAATGAGTCGAGT-3’(反向)。将获得的PCR片段克隆到质粒pcDNA3.1(Invitrogen)中。所有表达质粒的序列均在稳定转染前得到验证。用脂质体2000(Invitrogen)稳定转染胶质瘤细胞pcDNA3.1(载体)或pcDNA3.1人IL-33。在含400μg/mlG 418的培养基中筛选稳定的转染细胞(Invitrogen，按细胞毒性曲线确定浓度)。用慢病毒载体系统构建稳定的小鼠胶质瘤细胞系(K 1492)，表达小鼠IL-33(NM_001164724；mil-33 Plenti-giii-ef1α)。47。在含1μg/ml普罗霉素的培养基中筛选稳定感染的K 1492-IL-33胶质瘤细胞。RCAS PDGFA、PDGFB或shNF 1+Cre1的转换(参考文献。80,89,90,151使用Fugene 6转染试剂盒(Roche，11814443001)，按照制造商的程序进行。

RNA测序

用RNEasy提取试剂盒从BTIC及其亲本GBM肿瘤中分离RNA。用Illumina hiseq 2000和2500进行了高通量rna测序，并用jaguar对rna-seq进行了分析。152包括与外显子连接序列数据库的比对和随后在基因组基准上的重新定位。用RPKM检测归一化基因表达水平，采用GSC‘sWTSS管道覆盖分析(v0.4.6.9)。原始数据集存放在欧洲基因组档案(EGA)中.

基因表达分析

为了对U87pcDNA、IL-33和ΔNLS细胞进行微阵列分析，采用MIVIANA miRNA分离试剂盒(Ambion)，按制造商的程序从50万个细胞中提取RNA。用RNeasePlus微型试剂盒(Chiagen)纯化总RNA，用Agilent公司2100生物分析仪(Agilent Technologies)上的Agilent RNA 6000纳米芯片测定RNA完整性(RIN)。用NanoDrop 1000(NanoDrop Technologies，Inc.)和RIN大于9的RNA 100 ng用3‘IVT速成试剂盒(Ambion)标记，在45°C下与人基因芯片PrimeView阵列杂交16h，芯片芯片Fluidics_450按制造商的程序进行染色，并使用Affymetrix Genetrix芯片Scaner 3000 7G系统进行扫描。用于数组比较的原始数据集存放在基因表达式总括(GEO)网站(Http://www.ncbi.nlm.nih.gov.geo/加入号)。利用基因芯片命令控制台软件(AGCC)生成基因芯片阵列数据文件，并用Partek基因组组学套件6.0(Partek Instituted)进行统计分析。在阵列上所代表的20,000个基因中，计算了与对照相比的折叠变化。用DESeq 2软件进行差异表达分析，其倍频变化大于或等于2.0，FDR为0.01。为了分类与异位IL-33表达改变基因表达相关的生物功能，将折叠改变文件上传到David生物信息学资源6.7(国家过敏和传染病研究所，NIH，贝塞斯达，MD)。关于PDGFA-、PDGFB-和shNF-1诱导的小鼠胶质瘤的基因表达数据，从Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45874(参考文献。80,153)。探针识别用R/生物导体封装，照明aMousev1p1.db定位到基因符号。154.

纳米链基因表达分析

从移植瘤后1周的U87pcDNA、IL-33和ΔNLS细胞中提取总RNA。肿瘤组织分离保存在−80°C的RNAlater溶液中。RNA的分离是根据制造商的协议使用MirVana miRNA分离试剂盒(Ambion)进行的。用RNeasePlus公司的奇根试剂盒按照制造商的程序进行了总RNA纯化以去除基因组DNA。在Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies)上用RNA 6000纳米芯片对RIN进行了检测。选择RIN 8或以上的RNA样品进行基因表达分析。RNA的定量采用纳米滴ND 1000分光光度计(ThermoFisher Science)。在NanoString基因表达平台(NanoString Technologies)上进行基因表达分析。本实验采用了一组非处方炎症面板(小鼠v2)，由一个与凋亡、EGF、白细胞介素信号传导、RAS、T细胞受体和Toll样受体信号有关的254个基因组成。每样10 0ng总RNA，终量为5μ1，与3‘生物素化捕获探针和5’报告探针混合，荧光条形码标记来自非计数器炎症面板(小鼠v2)基因表达密码集。探针和靶转录本在65°C下隔夜杂交16h。用高灵敏度的方法在NanoString nCounter Prep工作站上纯化杂交样品，去除多余的捕获和报告探针，并将转录特异的三元配合物固定在链霉亲和素包被的墨盒上。样品以最大扫描分辨率在n计数器数字分析仪上进行扫描。数据分析用nSolver软件(NanoString Technologies)进行。通过qc的样本进一步分析其折叠变化和规范化表达水平。NSolver分析软件将每个基因的表达水平归一化为阳性对照探针和每个探针中内置的管家基因。

GBM与正常脑组织及患者生存的IL-33基因表达谱比较

Oncomine数据库(Www.oncomine.org)和国家癌症研究所分子脑瘤数据库(伦勃朗)Http://www.betastasis.com/)分析IL-33 mRNA在胶质瘤中的表达及其对预后的影响。用R.TCGA gbm表达的phatmap软件包制作了IL-33高表达胶质瘤细胞与对照胶质瘤细胞差异表达基因的热图，并从大口径GDAC下载了临床数据。Gdac.broadinstitute.org)。应用ssGSEA对M2标记物(MSR1、VEGFA TLR 8、CD 163、TGF B1、IL-10和TLR 1)、M1标记(CSF 2、IL 23A、TNF和IFNG)、细胞毒性T细胞标记(CD8A、CD3E、CD8B和IFNG)、T调节细胞标记(FOXP 3、CD3E和CD4)的表达进行了综述。155。用R.中的gcorrketPackage构建IL-33表达与免疫细胞可视化关联的相关矩阵，用单因素Kaplan-Meier分析和logrank检验评估IL-33表达与生存期的相关性。SSGSEA评分总结IL-33相关基因(IL-33过表达上调的基因)在TCGA患者中的表达。用Wilcoxon秩和检验来评估盒样地观测到的相关性的显着性。

质谱样品制备

磷蛋白组样本采集和分析是由加拿大多伦多儿童医院SPARC生物中心(分子分析)进行的，该协议是根据Rush和他的同事开发的。156。快速冷冻异种移植物在尿素溶解缓冲液(20 mm HEPES pH8.0，8M尿素，1mm正戊酸钠，2.5mm焦磷酸钠，1mmβ-甘油磷酸盐)中经超声溶解。然后，以60,000×分离心机清除溶菌物。g用Bradford法测定培养上清中蛋白质浓度15 min，并将所有样品的蛋白质量归一化为4.5mg。共添加4.5mm DTT，溶菌物放置于55°C下20 min，然后加入10 mm碘乙酰胺，再在RT黑暗中孵育15 min。裂解液用胰蛋白酶消化，用HEPES缓冲液稀释4次至2mm尿素，最后加入胰蛋白酶-TPCK溶液(Worthington生化)10μg/ml，将裂解液留置RT过夜。用SEP-Pak C18柱(Waters Corp.)除去盐，冻干2天，免疫亲和纯化(IAP)缓冲液(50 mm MOPS pH 7.2，10 mm磷酸钠，50 mm NaCl)悬浮。加入40μ1的Py抗体标记树脂(细胞信号传递技术)，在4℃下孵育2h，用IAP缓冲液洗涤3次，用0.15%三氟乙酸洗脱肽。用ZipTips C18(Milli孔隙公司)进一步纯化。

质谱法

采用线性离子阱-OrbitrapElite混合分析仪(LTQ-OrbitRAP，HeatFisher)和简易NLC无分离纳米LC系统(热Fisher)对样品进行了分析。冻干肽溶于甲酸(0.1%)，置于75μm×2cm PepMap 100易喷雾预柱上，填充3μm C18微球。预柱后为在线75μm×50 cm PepMax RSLC简易喷雾柱(600 bar压力)，填充2μm C18珠(热费舍尔SAN)。肽的洗脱速率为250 nL/min，洗脱时间为60 min，甲酸浓度为0.1%，乙腈梯度为0~35%。采用纳米电喷雾技术将多肽引入LTQ-OrbitRAP杂化质谱仪。仪器方法包括MS全扫描(400-1500)。m/z)利用轨道饶舌质量分析仪，自动增益控制目标1e6，最大离子注入120 ms，微扫描，分辨率24万。在线性离子阱中进行了10次依赖于数据的MS/MS扫描，其中10个最强烈的离子具有35%的归一化碰撞能量。MS和MS/MS并行扫描。当采用MS/MS模式时，自动增益控制目标为1e5，最大离子注入时间为50 ms，最小离子强度为5000。将标准化的碰撞能量设置为35，最大排除列表为500，重复计数为30s，排除时间为8s，使用标准工作流处理原始MS文件。157使用MaxQuant软件(1.5.3.30版)。利用MaxQuant中内置的Andromeda搜索引擎，在人类UniProt数据库中搜索MS/MS光谱。158错误发现率为0.01。生物信息学分析是在MaxQuant内部使用Perseus工具完成的。

单细胞RNA测序

CD 45+用3个pcDNA和3个IL-33异种移植细胞进行scRNAseq研究。根据铬单细胞3‘试剂试剂盒用户指南用户指南(v2化学)确定的适当体积的电池回收5000细胞，加载在铬单细胞控制器芯片上。用铬单细胞3‘v2文库和凝胶珠试剂盒制备scRNAseq文库。利用Agilent生物分析仪的高灵敏度DNA芯片，结合Agilent 2100生物分析仪，进行了cDNA后扩增、QC定量和文库构建。用Kapa库量化试剂盒对准备好的图书馆进行量化。测序时，使用NextSeq 500/550高输出v2测序试剂试剂盒在Illumina NextSeq 500系统上加载文库。用一个测序试剂盒对3个文库进行测序。用26个碱基对读1进行细胞条形码和UMI的测序，用8 bp的i7指数对样本指数进行测序，用98 bp的读2序列对转录本进行配对测序。

ScRNAseq数据分析

用细胞Ranger 3.1流水线处理10×基因组单细胞转录组序列数据。简单地说，FASTQ文件是用CellRanger计数管道处理的，该管道使用STAR将读取的数据对齐到MM 10小鼠参考基因组。运行单元聚合管道以生成包含该研究的组合库的表达式矩阵。对3个IL-33和3个pcDNA文库进行了三批测序。然后用R软件包Seurat版本3.1.5对6个样本的原始测序数据进行组合和分析(参考文献)。159,160)。所有的努力都是为了控制批处理效应，包括使用相同的协议、设备和相同的人员进行所有实验。通过比较基于(I)10×总输出的聚类结果，或(Ii)Seurat的IntegrateData函数或(Iii)协调批处理校正的批处理校正数据，评估批处理效果的程度。161。由于<0.98%的细胞在批次校正时改变了聚类分配，所以我们选择对10×聚合输出进行所有下游分析，以避免不必要的数据转换。数据筛选得到以下参数：>3个细胞中存在的基因，基因>200个的细胞，线粒体基因的百分比<5%。表达超过2500个基因的细胞被认为是双链并被排除在外(附加的质量控制指标可在补充表中找到)3–5和补充数据1)。经筛选后，共筛选出38,471个细胞和16,520个基因。使用各自的Seurat函数对数据进行日志规范化和缩放。进行了一次PCA复位，只考虑了前15个PCA维度(用肘部图确定)。第一轮聚类显示，由TTR、Enpp 2、Clu和IGFBP 2高表达组成的脉络丛上皮细胞群(Ref)。162)。由于这与CD 45抗体的分类不一致，而不是免疫细胞，因此排除了进一步的分析。通过非参数Wilcoxon排序和检验，确定一个簇(相对于其他簇中所有细胞)的差异表达基因。基于谱系特异性标记基因的表达进行聚类注释(补充表)。1)，并通过对按Bonferroni调整后排列的各组中最高差异表达基因的检查来证实。p-价值。Python包SCANPY版本1.4.7用于制作矩阵图可视化163。在基因富集分析中，采用R软件包基因-orteR来确定每个聚类的前200个标记基因，并使用聚类分析器来识别富集的GO术语。164,165。轨迹推断是使用R软件包天蝎座进行的，使用来自Seurat的规范化数据。166.

细胞增殖试验

为测定U87或U 251细胞的IL-33和ΔNLS的生长速度，将细胞接种于96孔板中，以每孔1000个细胞(培养基100μl)进行培养。3天后，在96井板的每口井中加入10升阿拉玛蓝，在5%CO中37°C下孵育4h。2。为评估bmdm细胞增殖，bmdm在密度为2×10的96孔平底培养板中镀成一式三份。4用0.2ml DMEM与CM混合培养72h，用Alamar蓝法测定细胞活力。在570 nm处用微滴定平板阅读器测量了每个井内的细胞荧光。数据从对照细胞的吸光度或培养基对照(设定为100%)中转换成相对细胞存活率(%)。

Transwell迁移试验

在24孔板和1×10孔板中放置8μm孔，1×10孔。5BMDM悬浮于2 0 0μ1无血清DMEM中，每室顶部均镀有BMDM。从胶质瘤细胞或含有IL-33或CCL 2抗体的CM(1μg/ml，1h)中，共加入5 0 0μ1。孵育4h后，用棉签将细胞从室内上部冲洗干净。迁移细胞在95%乙醇中固定，用1%结晶紫染色。在相差显微镜下统计5个典型场的迁移细胞数。

量化和统计分析

统计检验是双面的。P≤0.05被认为具有统计学意义。比较分析限于两组，双面未配对学生的t-试验采用细胞因子水平、巨噬细胞定量(IHC)和磷蛋白组学(磷蛋白组学)。为研究三组或更多组间的差异，采用单因素方差分析(Tukey‘sPosthoc试验)(流式细胞术、RCAS诱导的胶质瘤基因表达水平、U87pcDNA或IL-33迁移试验)。对于相关分析，χ2采用免疫组织化学TMA数据频度表、Pearson相关分析(BTIC细胞中IL-33表达与相应原发肿瘤的相关性)和Wilcoxon秩和检验(IL-33表达与M1巨噬细胞标记物的相关性，以及TCGA GBM患者外周血白细胞介素33(IL-33)表达与M2巨噬细胞标记物在盒样图中的相关性)。对所有Kaplan-Meier生存曲线，采用对数阶Mantel-Cox检验.

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