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骨形态发生蛋白9缺乏所致眼淋巴缺损对眼压无功能性影响

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发表时间:2020-09-30 10:17作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

房水引流对调节眼压(IOP)至关重要,眼压是青光眼的主要危险因素。Schlemm‘s管和非常规的葡萄膜巩膜通路是众所周知的从眼睛前房排出房水。最近有报道说,淋巴管参与了这一过程,Schlemm管对某些淋巴调节物作出反应。我们以前已经证明了骨形态发生蛋白9(BMP 9)在淋巴管成熟和瓣膜形成中的关键作用,对引流效率有影响。在这里,我们对眼睛淋巴管进行了成像,并分析了BMP 9 (Gdf 2)基因失效。在角膜和结膜中观察到淋巴管透明质酸受体1(Lyve-1)阳性淋巴管网络。相比之下,睫状体中存在的Lyve-1阳性细胞属于巨噬细胞系.虽然结膜淋巴管增大,瓣膜数目减少,但在BMP 9-KO小鼠,与野生型动物相比,Schlemm‘s管内无形态学差异。此外,无论是在基础控制条件下还是在激光诱导的高眼压状态下,对眼压均无功能性影响。因此,BMP 9激活的信号通路并不是新的青光眼治疗策略的明智靶点。

导言

青光眼是一组与视网膜神经节细胞和视神经变性相关的神经病,可导致严重的视力丧失。原发性开角型青光眼(Poag)是这些疾病的流行形式.眼压升高是POAG的主要危险因素,是目前治疗POAG的主要治疗目标。1。高眼压可能是由于引流缺陷和/或增加对房水流出的阻力从前房的眼睛。Schlemm管连接前房和静脉血管系统,是主要的房水引流途径。1。在这个叫做常规的途径中,房水通过小梁网流入Schlemm‘s管的腔内,通过集束通道的中间流进外巩膜血管。房水也可以通过睫状肌间质间隙从前房排出至睫状体上和脉络膜上间隙,然后返回静脉循环。2,3。这种称为非常规的途径被认为也涉及淋巴管网络,表明存在葡萄膜淋巴引流通路。4,5。除了免疫细胞的重要功能外,淋巴管在维持间质组织液的平衡方面起着至关重要的作用。6.

淋巴管存在于眼角膜和浅结膜内。7,8。一些研究也假设在更多的眼部内部存在淋巴管,如睫状体和/或脉络膜,但这些说法仍有争议,需要进一步证实。9,10,11。眼前段淋巴管可能参与房水引流。Pr McMenamin小组的先驱者报告说,在预先将荧光抗原植入眼前房后,荧光抗原聚集到颈部淋巴结中。12。Guignier博士团队最近的研究13来自Pr Yücel‘s组14,15,16,17为葡萄膜巩膜淋巴通路成分流出房水提供了更多的证据。这些作者表明,腔内注射示踪剂可以扩散和积累到下颌和/或颈部淋巴结,支持一个假定的淋巴房水引流路线。与这一假设相一致的是,拉坦前列素能提高小鼠眼淋巴引流,导致眼压下降。16。前列腺素F2α类似物,如Latanoprost,是治疗青光眼的有效抗高血压药物,主要通过非常规葡萄膜巩膜途径增加房水流出,也部分通过常规流出设施。18,19,20。与前列腺素FP受体结合后,其作用主要与睫状肌细胞和小梁细胞的快速舒张和金属蛋白酶合成后的细胞外基质重塑有关。最近的另一项工作还提到,拉坦前列素降低了颈淋巴结手术患者的眼压降低效果。21。总的来说,这些观察支持了淋巴成分参与房水流出调节的假设。

Schlemm‘s管是常规房水流出途径的主要组成部分22。它起源于出生后发育阶段的血管。23。有几项研究证实,施莱曼运河与淋巴管有着共同的特性23,24,25,26。事实上,Schlemm的管内皮细胞表达多个淋巴标记物,一些调节淋巴管系统的分子信号通路对淋巴系统的形成至关重要。其中,血管生成素/Tie 2(ANGPT/TIE 2)信号通路(在人类称为ANGPT/TEK)是血管发育的主要调节因子之一。对转基因突变小鼠进行的几项研究证实了其在眼淋巴管和Schlemm管发育和维持中的重要性,并对眼压有很强的影响。27,28,29。通过发现ANGPT/TEK信号的某些突变是原发性先天性青光眼的病因,进一步证实了这一途径在患者中的重要作用。28,30。另一方面,血管内皮生长因子C/血管内皮生长因子受体3(VEGF-C/VEGFR 3)配体/受体系统是促进淋巴管发育和淋巴管生成的主要调节途径。25.

骨形态发生蛋白9(Bmp 9),又称生长分化因子2(Gdf 2),是一种循环蛋白,与活化素受体样激酶1(Alk 1)具有高度亲和力,是转化生长因子β受体家族的Ⅰ型受体,对血管的发育具有重要意义。31。BMP 9,最早在小鼠胚胎中检测到E10。32,在出生后早期到成年阶段都有很高的表达。33,被证明是由肝脏分泌的,被认为是细胞因子的主要来源。33,34。此外,还发现血液中存在活性浓度。33,并可在远靶点进行生理过程调控。在其作用中,BMP 9/ALK 1信号通路是淋巴管发育和成熟的关键通路。事实上,在新生小鼠体内靶向BMP 9或其I型受体ALK 1,会导致包括皮肤、肠系膜和膈肌在内的多个器官的淋巴重塑异常。35,36,37。BMP 9也被认为是淋巴管形成的关键。37。有趣的是BMP 9在成体小鼠皮肤和膈肌中仍可观察到基因失效,同时肢体淋巴引流效率降低。37.

在此背景下,我们想知道BMP 9/ALK 1信号通路是否也参与了眼淋巴管和Schlemm管的发育,进一步显示了对眼压的影响。为了回答这些问题,我们的主要目标是:(1)描述淋巴管在小鼠眼睛中的分布;(2)确定BMP 9Schlemm‘s管和眼淋巴管结构的基因失效;(3)在没有BMP 9的情况下,是否观察到IOP的功能后果。这些信息可能是相关的,以了解靶向BMP 9/ALK 1信号通路是否有助于开发新的青光眼治疗策略。

结果

眼表面淋巴管网络的可视化与表征。

在本研究中,我们首先旨在进一步描述小鼠成年眼淋巴网络的分布和组织。应用光片荧光显微镜(LSFM)技术对眼底血管网的全地形进行了成像。采用淋巴管透明质酸受体1(Lyve-1)作为淋巴管内皮细胞的抗原标记,CD 31为全内皮细胞抗原标记物,表达于淋巴管和血内皮细胞上,观察到眼外表面存在丰富的淋巴管血管网络。如所料,在角膜和结膜中发现了Lyve-1阳性淋巴管(见图)。1)。Corneolimbal淋巴管呈分支状,在无血管角膜的边缘周围有一些小的延伸。这些Lyve-1阳性的角膜管淋巴管似乎是相连的,并流入位于球结膜整个表面的淋巴结膜网络。有趣的是,多视角成像强调了眼球周围结膜淋巴管的异质性但特征性分布。眼球背部或腹部的两个主要网络通过半透明缝隙膜两侧的两个大淋巴干流出(也称为半透明膜)。半月皱襞在哺乳动物中)在眼睛的鼻部(如图所示)。1)。这两个网络的位置与老鼠鼻子的位置有关。对于右眼,位于眼球背侧的淋巴网络引流到位于裂孔膜右侧的主干中,而引流结膜下腹部的密度更大、更分散的网络则从裂口膜的左侧流出。此外,较薄的淋巴管似乎位于颞侧的缝隙膜的对面(如图所示)。1)。当考虑左眼时,这个血管分布是对称相反的(补充图)。沙一)。LSFM图像还显示,结膜的Lyve-1阳性淋巴管有一些盲端肢体,其中含有几个红色的腔内瓣,因为形成瓣膜的细胞是Lyve-1阴性和CD 31-阳性。结膜下淋巴管网络连接的角膜管淋巴管也存在异质性。另一方面,他们的单个CD 31显示了周围血管。-红色标记阳性,因为它们缺乏Lyve-1的表达。

图1
figure1

右眼淋巴管网络的光片荧光显微成像(LSFM)。(A)查看鼠标眼睛的枢轴。(B)用于图像采集的多视角角度序列和所示图像位置的示意图表示。镍化膜(N)用黄色绘制。(C用Lyve-1(绿色)和CD 31(红色)抗体对眼进行全程免疫荧光染色。用Hoechst 33258(蓝色)进行细胞核反染色。获取多角度LSFM图像,对眼球的整个表面进行可视化。在4个不同的投影点(0°、90°、180°和270°)依次对眼进行成像。角膜基质(CL)在角膜无血管(Co)的基础上,既呈Lyve-1阳性淋巴管(LV),又有CD 31阳性血管(BV).球结膜下(CJ)可见丰富的结膜淋巴管网络(CLV)。白色箭头指向与阀门位置对应的CD 31阳性/RIV-1阴性区域.N氧化膜。白色星号显示角膜主要淋巴管与淋巴结膜网的某些连接点,而黄色星号则指向眼球腹侧部(淋巴管左到裂片膜;90°投影图像)或背部(淋巴管右侧至裂片膜;270°投影图像)的两个淋巴管的位置。一些较薄的淋巴管位于缝隙膜的对侧(180°投影图像)被白色箭头所指向。标尺:500米。

为了更深入地了解眼睛淋巴管的分布,我们还考虑了解剖眼前节的全身免疫染色(图1)。2)。这些实验的结果与我们以前的观察结果是一致的。2A、B)。Corneolimbal和结膜淋巴管均呈Lyve-1阳性表达.由构成瓣膜区的细胞的Lyve-1阴性和高CD 31表达显示淋巴管的位置(图)。2(b-D)另一方面,在角膜缘和结膜中检测到大量的单个Lyve-1阳性细胞。2c,D)。这些细胞可能与先前描述的Lyve-1阳性巨噬细胞相对应。38,根据眼球表面的组织层排列不同。他们发现,无论是在纵向线平行于角膜管和结膜淋巴管(图)。2C,D),或排列在更多垂直线,垂直于角膜管血管,在更深的细胞层(补充图)。S2)。虹膜视网膜区的成像可以显示位于角膜管下的Schlemm管。虽然Schlemm‘s管有多种淋巴特性,但它不表达Lyve-1抗原,因此CD 31阳性染色显示。从眼角膜管区的高放大率观察到,Schlemm‘s管是一个大通道,位于主要的角膜管淋巴管和血管环下面(图)。2e)。特别对应于施莱曼运河的图像的z叠投影显示了它的大而扁平的特征结构,形状不规则,并且有洞的存在(如图所示)。2f)。可以看到几条连接Schlemm管与静脉血管的集电极通道(图)。2g)。有趣的是,他们没有显示出任何证据证明阀门的存在阻止了血液回流到施莱曼运河。事实上,没有任何瓣膜显示CD 31染色的传单,其核心基质为层粘连蛋白α5,如经典淋巴管中所描述的那样。39,可以在收集通道与Schlemm运河的连接处看到(见图)。2h)。虽然眼淋巴表面网络易于成像,但C57BL/6小鼠的黑色素上皮细胞和黑素细胞的存在与信号穿透深度组织的限制有关,妨碍了对眼内葡萄膜淋巴管的存在和分布的信息的获取。

图2
figure2

完整的Live-1和CD 31免疫染色的解剖眼前节。(A)平面安装后眼睛四个象限的成像。绿色Lyve-1免疫染色(箭头)显示角膜管和结膜淋巴管网致密。一些CD 31阳性血管(红色)显示低染色强度也被发现在虹膜视网膜区域(箭头)。(B)眼表面血管在象限上的形态。佩里姆巴尔1)和外巩膜(2)与眼外肌血管进一步相关的血管(3)CD 31免疫染色显示。利维-1染色主要角膜淋巴管(4)在角膜(Co)的边缘有一些延伸,结膜淋巴管丰富的网络(5)。RIV-1阴性CD 31阳性区域对应于淋巴管(6). (C,D)角膜基质区的高放大率(C),以及结膜的代表部分(D)。一些与淋巴管平行排列的单个Lyve-1阳性细胞是由白色箭头指向的。白色箭头表示阀门的位置。协和、角膜。(E)观察角膜角区CD 31免疫染色的全貌。Schlemm‘s管(Sc)出现在血液(BV)和淋巴(LV)角膜管血管下面。人们可以注意到,一个结膜淋巴管(CLV)显示瓣膜在图像的左边。协和、角膜。(FCD 31免疫染色显示Schlemm管形态。Z堆栈对应于Schemm运河深度的投影图像。(G,H)CD 31的详情(G)、CD 31和层粘连蛋白α5(H)连接施莱曼管和血管的集电极通道的免疫染色。收集器通道用星号表示。

睫状体淋巴管存在情况分析。

为了进一步显示淋巴管在眼内结构中的作用,并且自从房水中有淋巴管存在后,引流就被假定进入睫状体。14,我们用CD 31和Lyve-1免疫染色技术进行了眼冷冻。这使得血管,Schlemm‘s管和淋巴管在虹膜角的可视化(图1)。3a)。除角膜的Lyve-1阳性血管外,冷冻眼前节段还发现睫状突表面有一些小的Lyve-1阳性斑点(如图所示)。3a)。观察到的标记与通过分散的细胞体的切片的图像基本一致(图)。3b)。为了更好地了解这种染色,我们进行了全身免疫荧光染色,并进一步用H染色。202治疗40。解剖的睫状体的影像显示有许多单个的Lyve-1阳性细胞(图1)。3c)。这些细胞呈阿米巴样和/或小胶质/巨噬细胞样形态,主要分布在睫状突表面,未显示任何可诱发淋巴管结构的证据(图一)。3(d-G)进一步分析M1和M2巨噬细胞亚型差异表达的三种巨噬细胞抗原标记物,证实这些细胞属于髓系/巨噬细胞系,是非内皮细胞。事实上,睫状突中存在RIV-1阳性细胞,F4/80和CD11b阳性,CD 206低表达或阴性。3(e-J)此外,如上文所述,在角膜缘和结膜中也可看到大量呈巨噬细胞样形态的单个Lyve-1阳性细胞,其中一些细胞是在靠近血管的情况下观察到的。与睫状突相比,大部分睫状突CD 206和CD11b阳性,F4/80则无阳性(附图)。S3).

图3
figure3

眼内葡萄膜内淋巴管的存在分析。(A用虹膜角CD 31(红色)和Lyve-1(绿色)抗体进行冷冻免疫染色。箭头指向睫状体表面的一些利维-1阳性点。SCSchlemm运河;左室淋巴管;BV、血管。(B)与睫状突冷冻切片的染色相对应的高放大率。箭头表示一个阳性细胞。(CJ)黑色素褪色后睫状突的全身免疫染色。2O2治疗。(C,D)Live-1在睫状突中的表达。箭头指向一些单一的Lyve-1阳性细胞。(EJ)用Lyve-1阳性细胞在睫状突中表达抗原巨噬细胞标志F4/80、CD 206和CD11b。所有的图像都是从z叠中投射出来的,它们都是用AxioImager荧光显微镜获得的,并配备了一个小体.

产生的后果BMP 9Schlemm管和眼淋巴管的基因失效。

正如我们先前报道的,BMP 9参与了多个器官淋巴管的发育和成熟。37,然后我们调查了BMP 9小鼠的基因失效对Schlemm管的形态发生和(或)眼淋巴管的形成有影响。我们优先考虑老年小鼠的研究,因为青光眼和房水引流缺陷主要发生在老年人类患者身上。1。我们发现BMP 9-KO小鼠与WT小鼠相比,表现出正常的Schlemm管形态发生。4(a-C)在早期发育时间点(P7和P19)和2-3个月的年轻人(补充图)也观察到类似的结果。S4)。这些观察表明BMP 9对Schlemm运河的开发和维护并不重要。

图4
figure4

眼Schlemm‘s管的对比分析BMP 9-KO小鼠。(A,BSchlemm运河形态在WT和BMP 9-CD 31免疫染色后的KO小鼠。(C)Wt与Wt之间Schlemm运河面积的定量分析BMP 9-KO小鼠。CD 31阳性区域的测量用图像J软件在至少3张图像上进行,每只眼睛放大×20倍。平均值为:6只小鼠11只眼,8只眼15只眼。BMP 9-KO小鼠。纳什没有意义。

关于淋巴管,由于没有任何证据证明睫状体中存在常规淋巴管,我们将注意力集中在淋巴角膜管和结膜网的形态上。再次,我们检查了老年成年小鼠的分析。两种基因型角膜缘淋巴管的形态学表现相似(图1)。5A、B)。因此,在Live-1免疫染色图像上进行的血管切片测量提供了类似的结果,没有显示出任何明显的差异(图1)。5c)。当考虑结膜淋巴管时,会注意到收集干的增大,引流了背结膜网。BMP 9-KO小鼠(图1.6a)。相比较而言,形态计量学分析显示,位于缝隙膜对面的较薄淋巴管和引流结膜腹侧淋巴管的淋巴管没有显着性差异(图1)。6b、c)。同时,我们仍然在BMP 9-KO小鼠组,扩大的淋巴管显示气管内血管直径增加,作为控制持续存在的一种方法。BMP 9-KO表型(附图)S5).

图5
figure5

眼角膜管淋巴管与眼内淋巴管的对比分析BMP 9-KO小鼠。(A,BRIV-1(绿色)和CD 31(红色)免疫染色在WT(A)和BMP 9-KO(B)老鼠。黄色箭头指向环绕无血管角膜(Co)的主要角膜淋巴管。(CLIV-1染色图像上平均淋巴管切片的定量分析。平均值分别为8只小鼠13只眼和11只小鼠20只眼的平均值±扫描电镜。BMP 9-KO小鼠。纳什没有意义。

图6
figure6

眼结膜淋巴管与眼结膜淋巴管的对比分析BMP 9-KO小鼠。左面板:右眼结膜淋巴管(Lyve-1(绿色)和CD 31(红色)免疫染色)的代表图像。BMP 9-KO小鼠。面向背侧的图像(A),时间(B)或腹侧(C)眼睛的一侧,如图形左边相应的图画所示。右面板:在结膜不同区域的图像上定量分析平均淋巴管单位长度单位的淋巴管面积。值为5只眼的均数±扫描电镜值。BMP 9-KO小鼠。**p<0.01,与Mann-Whitney的WT有显着性差异U测试一下。标尺:500米。

淋巴管是保证单向流动和防止回流的重要方法。41。结膜淋巴管的瓣膜数目较少。BMP 9-KO与WT小鼠比较(图1)。7(a-G)虽然只有减少阀门数量的趋势BMP 9-KO小鼠在考虑缝隙膜腹侧存在的淋巴网络时,位于缝隙膜背侧的淋巴管数目有显着性差异。此外,当瓣膜形成时,它们的成熟水平相似。事实上,典型的漏斗状和V形瓣膜显示层粘连蛋白α5的核心矩阵在两组患者中均见(图1)。7H,i)。

图7
figure7

眼结膜淋巴管瓣的对比分析BMP 9-KO小鼠. (AD)右眼结膜淋巴管CD 31免疫染色的典型LSFM图像。A,B)和BMP 9-KO(C,D)老鼠。N标志着有缝隙的膜。请注意,如所示,图像分别对应于腹侧和背侧淋巴管网络,分别面向左、右侧缝隙膜。箭头突出了一些瓣膜的位置,它们的高CD 31免疫染色可以显示这些瓣膜的位置。(EG)眼结膜淋巴管密度的定量分析BMP 9-KO小鼠,如每张直方图纵坐标中所提到的,关于图像图的朝向。每单位淋巴管长度测量瓣膜数目。每种基因型6只眼的平均值为±SEM。**p<0.01,*p<0.05,与mann-Whitney的WT有显着性差异。U测试一下。(H,I)层粘连蛋白α5/Lyve-1在WT或在一个阀门区域的免疫染色BMP 9-KO结膜淋巴管。

的功能后果BMP 9基因缺陷对眼压的影响

然后,我们确定是否检测到结膜淋巴管缺损。BMP 9-KO小鼠对眼压有影响。虽然前房和结膜淋巴管之间没有直接联系,但人们可以怀疑淋巴管缺乏和(或)集流管增大对房水流出是否存在任何间接影响,因为淋巴管网络现在被假定至少部分构成一种新的房水引流途径。5。眼压测量结果显示两者之间没有任何显著差异。BMP 9-KO和WT小鼠(图1.8(A):两种基因型小鼠的眼压基本值均在同一范围内,与此前报道的C57BL/6小鼠眼压值一致。23,25,42。我们还研究了BMP 9缺乏对实验性青光眼模型眼压调节的可能影响。为此,我们跟踪了激光光凝周围血管区引起的可逆性高张力后,眼压恢复到平均控制基线的时间过程。时间线如图所示。8B.如预期43,44在第1天,激光治疗与未治疗的小鼠眼压在第1天达到三倍以上,相当于激光治疗后的24小时(如图1所示)。8c)。然后,在wt和wt中观察到IOP值基线返回的相似和可叠加的时间过程。BMP 9-KO小鼠。从第14天起,两种基因型的眼压值与对照组非激光治疗眼的眼压值无显著差异(图1)。8c)。我们还进行了相同系列的实验,重复局部应用拉坦前列素0.005%,一种已知的房水流出途径激活剂。45。事实上,我们可以预料到BMP 9-KO小鼠可能会产生更明显的差异拉坦前列素效应,因为它至少部分地被认为是通过葡萄膜淋巴途径增加房水引流的。16。在WT和BMP 9-KO小鼠(图1.8d、E)。可以看到一种轻微降低眼压效果的趋势,就像以前的一项工作中对啮齿类动物所描述的那样。16,主要用于对照非激光治疗眼。然而,这些差异在调查的大部分时间点没有显着性。

图8
figure8

控制条件下和激光光凝后眼压的测定。(A)WT和WT中眼压值的比较BMP 9-11个月以上的KO小鼠。数据为10(WT)或9(BMP 9-左眼。(B)不同时间点的激光光凝方案的时间线,用于拉坦前列素的应用和眼压的测量。(C)激光引起的眼压在WT和WT中都增加后,眼压恢复到基线的时间过程。BMP 9-KO小鼠。每组5只动物的平均值为±SEM。**p<0.01,*p<0.05,激光治疗的右眼值与对照组的左眼值比较有显着性差异(P<0.01)。U测试一下。(D,E)眼压在没有控制的情况下或在WT中接受Latanoprost治疗后恢复到基线的时间(D)和BMP 9-KO(E)老鼠。数据为n=5(WT)或n=4至5(BMP 9-KO)眼睛。*p<0.05,拉坦前列素治疗眼与对照眼比较有显着性差异(P<0.05)。U测试一下。

讨论

的潜在后果BMP 9基因失效对眼淋巴管和房水引流及眼压的影响,我们首先描述了小鼠眼淋巴管的分布。利用LSFM,我们为眼表淋巴网络的全地形可视化带来了新的见解。我们的结果与眼角膜和结膜表面淋巴管密集网络的存在是一致的。7,11。此外,我们在本研究中还发现,该网络在眼球周围具有空间组织的分布特征,在鼻内眼角有大量的集线器排出。

另一方面,我们的结果是一致的,在更多的内部葡萄膜结构,如睫状体缺乏淋巴管。事实上,使用Lyve-1作为淋巴管内皮细胞的标记物,并使用几种成像策略,这种组织中没有检测到常规淋巴管。虽然在睫状体过程中观察到大量的单个Lyve-1阳性细胞,但其淋巴管内皮性质未得到证实。事实上,巨噬细胞抗原标记的表达分析表明,它们属于这一家族。与这些分散的单个细胞的巨噬细胞表型相一致,睫状体过程中眼冷冻反应的Lyve-1免疫反应不对应于流明化的血管结构。巨噬细胞在输卵管周区和结膜中也有表达。因此,我们的数据证实了最初的观察,指出正常小鼠眼组织中存在大量巨噬细胞系。38,46。根据它们的CD 206抗原表达模式,它们的表达谱符合经典m1和备选M2巨噬细胞亚型的存在。47。在睫状体中检测到的绝大多数Lyve-1阳性细胞高度表达F4/80抗原,CD 206阴性或CD 206低表达,可能代表经典的M1型巨噬细胞。相反,角膜基质淋巴管和结膜淋巴管之间的Lyve-1阳性细胞与M2型巨噬细胞更一致,因为它们是CD 206-阳性和F4/80-阴性。剩下的一个问题是,在需要淋巴管生成反应的病理情况下,这些巨噬细胞是否构成一个可以动员起来的细胞库,以容纳和/或产生新的淋巴管。虽然这一假说是在与眼角膜炎症相关的淋巴管生成过程中假设的,但它必须得到充分的证明。48。它还有待于进一步确定眼睛淋巴管最初是如何发展的,以及髓系/巨噬细胞系细胞对这一过程的可能贡献。的确,某些存在于边缘的单个Lyve-1阳性细胞可能与潜在的髓源性淋巴祖细胞相匹配.尽管如此,由于先前的数据有利于人和绵羊的睫状体中存在真正的淋巴管。14我们不能排除物种间的进化差异,这可以解释它们在其他哺乳动物物种中的存在,而不是老鼠。此外,我们也不能排除潜在的存在于小鼠体内,一种Lyve-1阴性器官特异性毛细血管型淋巴管亚型。

随着腔内注射示踪剂的扩散,在眼前房和颈淋巴结之间存在淋巴血管的引流连接被认为是存在的。13,14,16。这使得我们可以假设淋巴管至少在一定程度上是通过非常规途径排出房水的。5。此外,结膜淋巴管还可以参与流经结膜下间隙从虹膜角流出的液体的过程。4。小梁切除术后人结膜血管内注射台盼蓝的快速引流49。尽管如此,青光眼滤过手术后房水引流的这一途径的发生还没有得到充分的证实。

由于Schlemm‘s管和淋巴管的改变可能对眼压调节产生功能性影响,我们想知道这些血管是否在BMP 9-KO小鼠。我们在比较成人的眼睛时,没有观察到Schlemm管的任何明显的形态学差异。BMP 9-KO对WT小鼠。这可能是由Schlemm‘s管所显示的混合血液和淋巴表型的结果,它对应于一种特殊的混合血管。事实上,与淋巴管不同的是,在唯一BMP 9基因缺乏之后,没有证据显示血管有缺陷。37,50。关于淋巴管,我们的结果指出器官特异性的BMP 9敏感性差异。事实上,与我们之前在皮肤上的数据形成对比37在本研究中,在气管中,成人淋巴管的扩张。BMP 9-KO突变小鼠未在眼小口径淋巴管中发现。然而,以前在其他淋巴管位置发现的瓣膜和收集血管表型似乎是保守的。事实上,我们仍然观察到BMP 9-KO小鼠,瓣膜数目减少,结膜淋巴管增大。这一结果提示了由于BMP 9激活信号通路的不同参与而导致的血管区和淋巴管口径及功能的具体调控机制。事实上,bmp 9已知能够同时动员smad依赖和smad独立的监管过程。31。另一种可能是在眼部小淋巴管中激活的BMP 9偶联机制可能被局部替代。BMP 10是ALK 1的另一个被描述的配体,已被证明与BMP 9一起作用于视网膜血管的发育,并可能补偿BMP 9眼小口径淋巴管的基因缺失50.

另一方面,BMP 9/ALK 1通路与其他信号通路交叉的证据已经被报道。31。然后,人们会想知道对施莱曼运河至关重要的信号通路是否会被过度激活。BMP 9基因失效可能存在,从而掩盖其基因缺失的后果。最近报道了ANGPT 1/TIE 2信号通路在Schlemm运河开发和维护中的关键作用。28,29。此外,ANGPT 1/ANGPT 2的联合缺失导致严重的眼淋巴管发育缺陷。27。BMP 9对ANGPT 2的表达和(或)下游信号的调控最近已被证实。51,52。因此,BMP 9和ANGPT 1在眼部淋巴管中可能存在另一串扰,应在今后的研究中加以研究。

然而,眼压的测量并没有显示出wt和wt之间的显著差异。BMP 9-KO小鼠,不同基因型小鼠在青光眼实验模型中无明显差异。事实上,在激光光凝治疗引起的瞬时眼压升高后,WT和Wt的眼压恢复到基线的动力学相似。BMP 9-KO小鼠。正如以前关于啮齿类动物的报道,拉坦前列斯特治疗与眼压下降的趋势有关,但它似乎更有效。BMP 9-KO小鼠,因为有略高的基线眼压。尽管如此,除了一个时间点外,差异仍然不显著,如果有的话,对房水流出的潜在影响是微妙的。我们的结果也提出了一个问题,以了解单一减少瓣膜数目与收集主干扩大是否会导致显着的影响淋巴和/或房水引流,或是否需要更严重的合并淋巴缺陷是必要的,在这些过程中出现功能缺陷。需要进一步调查以回答这些问题,并阐明差异有机和船只口径BMP 9的要求。

因此,与ANGPT/TIE 2和VEGFC/VEGFR 3信号通路不同,这两条信号通路是Schlemm管和眼淋巴发育所必需的。25,27,28,29,我们的数据并不支持bmp 9在这些过程中所起的关键作用,并且表明BMP 9基因缺陷不足以对眼压产生明显的功能影响。

材料和方法

小鼠

BMP 9-KO小鼠的发生和基因分型50。小鼠以C57BL6/J亚株为背景。成人WT和BMP 9-KOC57BL/6小鼠,年龄11-22个月。所有方法都是按照Arvo(视力和眼科学研究协会)的声明进行的,用于眼科和视力研究的动物使用指南。项目和议定书还遵循了欧洲关于在实验中使用动物的第2010/63/UE号指令。所有实验议定书都得到法国研究和教育部的批准和道德上的同意(协议号)。APAFIS#13689-2018022110 v2和NO。APAFIS#13623-2018021914515907 v1)。虽然没有关于性别的显着性差异的报告,但这两种情况的后果BMP 9基因效率或眼压值而言,不同动物群均由雄性和雌性组成。

眼部解剖

处死小鼠后,用摘除或解剖的方法收集眼睛,并注意收集整个眼球和结膜及其结缔组织。用4%多聚甲醛在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中过夜。在PBS中进行广泛洗涤后,将样品保存在4°C,待进一步使用。前段解剖用Vannas剪刀在眼后部进行小圆切,注意保留虹膜巩膜区和大部分结膜完整。然后,眼睛保持完整或晶状体被摘除,其余的组织被切成象限,视需要而定。

免疫荧光染色

用4%多聚甲醛固定,0.5%TritonX-100在PBS中渗透,按标准程序对冷冻眼切片进行间接免疫荧光实验。53。他们用Hoechst 33258抗衡。整装免疫染色基本上按照前面所描述的那样进行。37。首先在含2%牛血清白蛋白和0.3%TritonX-100的PBS中过夜,进行封闭和渗透步骤。样品在4°C下与原抗体共同孵育一夜。以鼠CD 31单克隆抗体(克隆MEC13.3)为杂交瘤,从美国加利福尼亚州圣何塞市购买纯化后的大鼠CD 31单克隆抗体。从美国明尼苏达州明尼阿波利斯市的生物技术公司获得山羊抗小鼠Lyve-1(AF 2125)和大鼠抗小鼠CD11b(MAB 1124)抗体。大鼠抗小鼠CD 206(MCA2235T)来源于美国加州大力神实验室.大鼠抗小鼠F4/80(BM8)是来自热费舍尔科学(Waltham,MA,美国)。兔抗小鼠层粘连蛋白α5抗血清是由德国Münster大学L.Sorokin博士赠送的.对非特异性染色进行对照,用相应的物种相关非免疫免疫球蛋白进行一次抗体替代。

用PBS清洗几次后,样品与Alexa Fluor 488、氰素-3或蓝蛋白-5结合的次级抗体共同孵育,显示最低的交叉反应性(美国宾夕法尼亚州西格罗夫杰克逊免疫研究实验室)。样品用PBS洗涤,安装前用4%多聚甲醛固定。对睫状体进行整体免疫染色后,进行黑色素去除,以获得更好的眼内各部位的显示效果。用H进行眼脱毛202根据Kim和Assawachanont所述程序进行的治疗,2016年40。在观察前,将睫状体轻轻解剖,并在氟保存试剂(德国达姆施塔特,默克·米利波尔)中放置。

荧光成像

LSFM和3D成像用1%琼脂糖凝胶填充1mL注射器,用ZEISS光片Z.1显微镜和Zen Black软件进一步观察。所显示的LSFM图像是一系列获得的Z-栈图像的二维重建(最大强度投影).根据每个样本,对它们之间的区段数和间隔进行了优化。对于前视杯的全贴装成像,在小鼠眼前段进行向心瓣切割,使其放松成四个象限,然后用氟保护剂将其平装在幻灯片上。然后用蔡司Axio观察者Z1倒置荧光显微镜和Axiovision4.8软件或装有Apotome和Zen软件的Zeiss Axio Imager M2荧光显微镜观察幻灯片。所有图像用AdobePhotoshop CS5软件进行处理。

对眼淋巴管平均截面的量化,将5条水平线的网格图像与Lyve-1染色图像合并,用图像J软件测量垂直交叉的淋巴管直径。

眼压测量

在体内实验中,动物在特定的无病原体、温度(22±1°C)、湿度(55~60%)和光(50 LX-光)的条件下(上午07:00~晚上07:00)。用托诺拉眼压计(Icare,VANTA,芬兰)用反弹眼压计对清醒动物进行眼压测量,如前所述。54。简单地说,在同一只眼睛上记录了8到10次连续测量,平均值被认为是一次测量。为避免昼夜变化的影响,在上午09:00至11:00之间的同一时段进行了测量。

采用皮下注射氯胺酮(70 mg/kg体重,IMALGENE 1000;Merial,Lyon,法国)和西拉津(14 mg/kg体重,Rompun 2%;拜耳保健,加拿大多伦多)诱导实验性青光眼。如上文所述,使用532 nm绿色激光(30点,200 mw,0.3秒,Vitra,全泰尔医疗,克莱蒙特-费兰德)进行激光光凝。43,44,54。以对照左眼为对照,非激光治疗眼。羟甲基纤维素(HUMIGEL;Virbus,Carros,法国)局部应用于角膜,以避免术中和术后干燥和损伤。拉坦前列(Xalatan 50 g/mL,辉瑞PFE,巴黎,法国)用0.005%拉坦前列滴眼液20L滴眼液,20μL人工泪液作对照。用药后2h进行眼压测量。


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