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酪蛋白激酶1.2过度表达恢复抗逆性杜氏利什曼原虫HSP 23突变体

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发表时间:2020-09-30 09:49作者:武汉新启迪Xxinqidibio

摘要

杜氏利什曼原虫它是一种锥虫寄生虫,可引起致命的卡拉扎热,这是一种被忽视的热带疾病。锥虫缺乏转录基因调控,依赖于基因拷贝数的变化和翻译控制来适应环境的变化。为了在哺乳动物的组织温度下生存,多诺瓦尼它依赖于小分子的热休克蛋白HSP 23,热休克蛋白的丢失使寄生虫对应激敏感,并影响其增殖。在这里,我们分析了一个野生型体外生长的自发逃逸突变体.这种逃逸菌株的进一步选择导致了表型的完全逆转。全基因组测序显示耐受性与35号染色体上的6个基因簇的大量扩增有关,进一步的分析表明酪蛋白激酶1.2基因的过度表达是相关的。体外磷酸化实验建立了HSP 23和相关的p23共伴侣作为酪蛋白激酶1.2的底物和调节因子,为蛋白激酶信号转导蛋白激酶在真核生物早期分支中的另一个重要联系提供了证据。

导言

原生动物属寄生虫利什曼原虫每年造成100多万已知的人类感染1,无症状携带者的数量不详。由此产生的免疫疾病,简称利什曼病,是世界卫生组织定义的最重要的被忽视的热带疾病之一。2。此外,利什曼目与其他锥虫类有许多重要的分子特征,即克鲁兹锥虫布氏锥虫、NTDS查加斯病和人非洲锥虫病(HAT)的致病因素。最严重的利什曼病,内脏利什曼病,是由密切相关的。多诺瓦尼幼铁线蕨结果导致持续发热,脾脏和肝脏肿大,抗原提呈细胞减少,贫血,同时增加继发性感染的易感性。如果没有有效的化疗,这种疾病是致命的。目前尚无有效的疫苗或预防措施,而针对利什曼病的化疗药物存在毒副作用、致畸性、成本高、疗效不一致和(或)存在或发展耐药性等缺点。3,4.

从生物学角度看,锥虫原生动物最突出的特点是其完全缺乏规范的、基因特异性的转录调控。利什曼原虫染色体由功能非相关基因的长、多顺反子转录单元组成。5,6,7被转录成多顺反子前体RNA。然后,前体RNA通过反式剪接与多腺嘌呤化反应来获得成熟的单顺反子mRNAs。8,9。这反映在寄生虫基因组中缺乏转录调节蛋白同源体的基因。而差异RNA降解和/或加工则可能导致mRNA水平的波动。9,10,11,基因表达的短期调控可能依赖于调控翻译。12,13,14,15.

另一个遗传特征利什曼原虫是一种天然的非整倍体16,17,18,也可以通过基因或基因簇的染色体内或表观扩增来产生和维持数量上的遗传多样性。Sider家族框架的反转和非反转重复序列,并促进了这类基因的扩增。19,20,导致基因拷贝数的变化。21在寄生虫种群中,可以在药物压力等不利条件下选择最适合的变异体。22,23,24,25。这也可能发生在实验室的人工基因改变之后。描述了LPG2的自发表型逆转。−/−-和HSP 100−/−-零突变体L.主要26,27。这样的表型反转甚至可以通过功能克隆来模仿。利什曼原虫基因组DNA28,29.

利什曼原虫寄生虫以鞭毛,细长的原虫附着在感染的木虱的中肠壁上,从那里传播给哺乳动物,包括人类。它们被宿主抗原提呈细胞所占据,它们经历了形态阶段的转变,转变为以巨噬细胞为主的吞噬小体内的无鞭毛、不活动、卵圆形的散体。30,31。沙蝇期的特征也是快速的对数增长,而散逸期的增殖率较低,甚至可以进入静止期。32,33,34.从节肢动物到哺乳动物宿主的另一个结果是哺乳动物组织温度的双重触发和巨噬细胞吞噬体内的酸化环境。事实上,在两种温度下(33-37°C,取决于利什曼原虫微酸性生长介质(pH5-5.5)可以触发细胞的形态和代谢向变形体样细胞转变。35,36,37.

同时,温度变化也会引起典型的细胞应激反应,增加几个热休克蛋白家族的合成,包括HSP 100/ClpB。38,39、HSP 90和HSP 7012,一种60 kDa的伴侣(CPN 60.2)40及其可能的伴侣CPN 1041.

另一种伴蛋白,小热休克蛋白23(HSP 23)也有温度依赖性的表达,hsp 23空突变体(HSP 23)。−/−)在哺乳动物组织温度下(37℃),确实遭受严重的生存能力丧失,化学应激耐受性受损,在允许的温度下生长减少。42。Hsp 23属于相当多样的小hsp家族,其主要特征是所谓的α-结晶素结构域,但与其他小的hsp相比,它具有独特的整体结构,并且与p23的共同伴侣关系更为密切。利什曼原虫调节HSP 90抑制剂主要伴侣HSP 90 ATP酶结构域的可达性。43.

在本文中,我们描述了温敏(TS)表型的自发逆转。多诺瓦尼HSP 23−/−在允许和非允许温度下进行体外选择的突变体。由于酪蛋白激酶1.2(CK1.2)基因的大量扩增,逃逸变体表现出野生型的温度耐受性、体外增殖率和化学抗药性。我们进一步证明HSP 23,同时也是P23,是CK1.2的底物,又建立了另一个连接。44,45蛋白激酶介导的信号与伴侣机制之间的关系利什曼原虫.

结果

HSP 23逃逸变体的出现−/−

以前曾显示,HSP 23的损失使杜氏利什曼原虫在哺乳动物组织温度(以下简称高温(HT))下,不能存活的原鞭虫对乙醇和酸性pH等几种应激因素更敏感。此外,在25℃下(以下简称低温(LT))的体外增殖也受到影响。42。然而,在lt大约25个体外传代周期之后,出现了一个野生型生长表型的逃逸群体,我们将其命名为hsp 23。−/−ES 0。我们还生产了新的HSP 23−/−空突变体,遵循与ES 0亲本菌株相同的重组策略42。克隆2被测试,仍然显示原始的,生长受损的表型(图)。1a)。如预期,HSP 23−/−Cl.2通过HSP 23转基因(HSP 23)的非染色体表达可以恢复生长−/−/+,但不是仅通过表达载体(HSP 23)−/−/PCLS).

图1
figure1

HSP 23的表型比较−/−和HSP 23−/−在不同培养条件下逃避突变体。1✕106细胞接种于7ml的M 199+培养基中。接种后第4天细胞密度恢复正常为野生型(HSP 23)。+/+)细胞密度(设定为100%)。寄生虫在LT(25°C)生长(A),2%Etoh在LT(B)或400海里2O2在LT(C)。使用Kruskal-Wallis检验方法检验差异的显着性:*p < 0.05, **p < 0.01 (n = 4) (D)HSP 23的热选择−/−ESC 0:5✕105细胞/ml接种于10 ml M 199+培养基中,在HT(37°C)下孵育4天。将培养物转移回LT,生长至中原木期7天。(E)两种热选择的生长分析(D)HSP 23−/−HT突变群体,非选择HSP 23−/−人口和HSP 23+/+野生型细胞(100%)。细胞每周稀释两次,至5✕10。5单元格/毫升。误差条表示平均值(SEM)的标准误差。

在2%乙醇的挑战下,得到了非常相似的结果。在这里,HSP 23的生长−/−CL.2和HSP 23−/−/PCLS几乎完全被压制了。相反,HSP 23−/−ESC 0和HSP 23−/−/+与野生型相比无明显损害(HSP 23)。+/+)(图1.1b)。

我们还测试了野生型(HSP 23)的氧化应激敏感性。+/+)和突变株在H条件下的体外生长监测2O2挑战(400海里)1c)。再说一遍,HSP 23−/−Esc 0与野生型没有区别,而HSP 23则难以区分。−/−CL.2和HSP 23−/−/PCLS与标准培养条件下的生长缺陷相似(25℃,A板)。令人惊讶的是,补体菌株HSP 23−/−/+,在H下没有恢复增长2O2阻力也是如此,这意味着加法和逃逸应变之间的差异.

早期工作42表明HSP 23的暴露−/−对突变体是致命的。评估HSP 23小组的生存情况−/−在高温下,我们将野生型和零突变型克隆暴露于HT中4天,每天监测细胞密度。1d)。为了与早期的实验保持一致,只有野生型(HSP 23)+/+)在HT上生长。把培养转移到LT,所有的HSP 23−/−除HSP 23外的克隆−/−Esc 0没有生长,表明ht暴露4天对hsp 23确实是致命的。−/−克隆2和3.HSP 23−/−仅EST 0在降温后2天就开始生长,表明有相当数量的原鞭毛虫在预选中存活下来。

基于这一假设,我们将两个种群与原始的HSP 23进行了比较。−/−EST 0菌株和野生型菌株在HT条件下维持21天生长的能力。实验结果如图所示。1突变体的生长表现为野生型生长的[%]。而原始的,而不是预选的菌株(ES 0)只显示边际增长,两个种群(ESc1,ESc2)来自图中所示的预选。1D在实验过程中显示出较强的活力,近几天达到了野生型细胞的相对生长。显然,HT的预选择和LT的无阻碍生长导致了两个耐高温菌株的自发出现,而亲本ESC 0在37°C下不能生长。这表明,与其它HSP 23-/-克隆相比,37°C下ES 0的存活率提高,但需要一个恢复时间才能完全表达耐高温性。

HSP 23的遗传适应性−/−突变体

代替转录控制利什曼原虫基因表达通常通过染色体非整倍体受到基因剂量的调控。18,46,基因拷贝数变异20,47或选择圆形和线性放大器19,48,49。特别是,在充满压力的条件下,如药物压力或环境变化后,利什曼菌中经常会出现这种基因组改变。50,51.

为了找出在允许温度和非允许温度下弥补hsp 23缺乏的基因组改变,我们进行了全基因组测序。多诺瓦尼1S野生型选择在LT(n=2)和HT(n=2),HSP 23−/−克隆2(n=1)和克隆3(n=1)选自LT,HSP 23−/−ECE 0在LT(n=2)和HSP 23上选定−/−HT选择ESc1(n=1)和ESc2(n=1)。序列读取数据可在Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA633969.

首先,我们验证了该方法的准确性。HSP 23HSP 23的基因替换−/−Cl.2,HSP 23−/−CL.3和HSP 23−/−ESC突变体(附图)沙一, S2),发现同源重组完全正常工作。

利用NGS序列读取覆盖数据,对非整倍体模式进行了分析。S3S2)。HSP 23的核型差异+/+和HSP 23−/−观察克隆和逃逸变异。在HSP 23的第8和35染色体上发现了完整的或花叶状的非整倍体。−/−第0,第2和第3类在LT。第12和23号染色体显示所有HSP 23都有大量减少。−/−第14号染色体显示四种HSP 23中的三体−/−逃逸样本。

接下来,我们对接受全基因组测序的所有菌株的单个基因拷贝数的变化进行了全基因组分析。在大多数情况下,CNV的变化与观察到的许多变化相关(表)S2)。然而,对35号染色体的读深度分析却显示出明显的差异。如前所述,HSP 23−/−在LT上保持的克隆2和3对35号染色体是三体的,与野生型样本相比,基因拷贝数总体上增加了50%。2(a-D)两种HSP 23的样品−/−我们在LT上观察到35号染色体在2.26和2.36处有轻微的马赛克现象(表)沙一)。基因拷贝数分析表明,在35号染色体的5‘端,样本1和样本2的核苷酸位置分别为4500 bp~554 500 bp和~4500 bp~557 500 bp。观察到的扩增分别包含124个和126个基因,导致这些区域的基因拷贝数增加1.5到两倍(图1)。2e、f)。

图2
figure2

允许温度下35号染色体上特定菌株基因拷贝数的变化。第35号染色体上的每个基因(#1-#530)的正常拷贝数为(A, B)HSP 23+/+, (C, D)HSP 23−/−,和(E, F)HSP 23−/−ES 0。所有菌株均在25°C(LT)培养。

HSP 23分析−/−ESc1和-ESc2菌株,都是4天HT挑战的幸存者,并能够在HT中生长(见图)。1D,E),表现出更具体和极端的放大。与HT筛选的野生型细胞相比较(见图)。3A,B),ESc1和ESc2都显示出染色体35上的6个基因簇的基因拷贝数增加了43到73倍(如图所示)。3c,D)。这个49 kb区域(位置430,500-479,500)由SIDER 2元素分隔。19并编码酪蛋白激酶1.2(CK1.2)(LdBPK_351030)、两个CCCH型锌指蛋白(LdBPK_351040和LdBPK_351060)、一个含铜蛋白(LdBPK_351050)、一个未定义的推定蛋白激酶(LdBPK_351070)和一个假想蛋白(LdBPK_351080)。3e、f)。

图3
figure3

非允许温度下35号染色体特异基因拷贝数的变异。第35号染色体上指示基因(LdBPK_35 Xxx)的正常拷贝数为A, B)HSP 23+/+-HT,(C, D)HSP 23−/−ESc1/2-HT,(E, F第35染色体上扩增区在420,000和490,000位之间扩大。排序读取覆盖范围显示为HSP 23。+/+(黑色),HSP 23−/−ESc1/2(HT,蓝色)和HSP 23−/−CL。2/3(LT,灰色)。开放阅读框和相应的基因ID以灰色表示为非扩增,蓝色表示为扩增的CDS;SIDER 2重复序列的位置以红色表示。温度:25°C,HT:37°C。

以前已经证明,核型变异与转录本丰度的调节有关。23。因此,我们质疑第35号染色体上的六基因簇是否在耐热HSP 23中被观察到的扩增。−/−ESc1/2也能改变RNA和蛋白质的丰度。事实上,qrt-PCR分析证实了hsp 23基因簇的扩增。−/−ESc1/2突变体使共扩增基因的mrna增加10至41倍(表)1)。抗CK1.2(LdBPK_351030)抗体52,进行westernblot分析。事实上,我们在HSP 23中观察到CK1.2蛋白水平有2到3倍的上调。−/−ESc1/2突变体,证实了DNA拷贝数、RNA水平与蛋白质丰度之间的相关性。4A、B)。

表1第35号染色体(LdBPK_351030-351080)扩增候选基因的基因拷贝数和相应的RNA水平。
图4
figure4

CK1.2在HSP 23中的丰度−/−ESc1/2突变体(A)Westernblot分析CK1.2在HSP 23中的表达+/+和HSP 23−/−ESc1/2用兔抗CK1.2抗体(SY3535)(1:250)。以鸡抗HSP 70(1:5000)抗体作为负载对照.(B)用ImageJ斐济软件(版本2.0.0)量化CK1.2蛋白水平,并首先将其标准化为Coomassie装载控制,然后再标准化为HSP 23。+/+(37°C)样品。统计检验采用Kruskal-Wallis检验;*p < 0.05, **p < 0.01; (n = 6).

耐胁迫标记的功能克隆

接下来,我们测试了逃逸突变表型是否可以归因于观察到的第35号染色体上六个基因簇的扩增。因此,我们将六种不同的过表达质粒共转染到TS hsp 23中,其中含有扩增出的簇(ldbpk_351030-ldbpk_351080)的基因。−/−台词。这些转染的细胞系要么在LT进行抗生素筛选,要么在HT时不使用抗生素,在这里被命名为HSP 23。−/−[Mix]-LT和HSP 23−/−[Mix]-HT,分别(图1)。5a)。空载体转染的细胞在非允许的温度下不能存活,两个独立的TS hsp 23。−/−转染质粒混合物的克隆恢复正常,证实扩增出的簇中基因的过度表达导致了逃逸突变体表型的产生。

图5
figure5

HSP 23候选基因的筛选−/−在非允许温度下的背景(A)转基因选择程序的示意图。将Ldbpk_351030与ldbpk_351080共转染hsp 23,共转染6个过表达质粒。−/−空突变体,选择在LT和选择性抗生素,或在HT,产生HSP 23。−/−[Mix]-LT或HSP 23−/−[混合]-HT细胞群。选择后,从利什曼原虫酚-氯仿萃取的种群。(B)用基因特异性引物分析PCR检测重组质粒中是否存在候选转基因。以转基因质粒DNA为阳性对照((+)ctrl)。用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色对PCR产物进行分析,在右侧显示相应的DNA大小标记带的位置。左侧面板显示LT选择后的PCR产物,右侧面板显示HT选择后的结果。

为了准确定位介导HT生存的基因,从存活群体中再分离质粒DNA,用转基因特异性引物进行PCR。5b)。当一套完整的质粒还能从HSP 23中找到的时候−/−[Mix]-LT选择后(LTS),HT(HTS)几乎完全选择CK1.2转基因,证实CK1.2在逆转HSP 23的TS表型中的作用−/−。经qRT-PCR分析证实,HT选择后CK1.2 RNA丰度仅增加,而其他转基因未见明显增加(图5)。S4).

CK1.2基因在温度选择下的扩增

为了进一步验证这些发现,我们测试了仅转染CK1.2编码的过表达质粒是否能恢复hsp 23的耐温性。−/−。事实上,仅CK1.2的异位过度表达就能消除典型的热诱导缺陷,如正常长时间的原肥大细胞的聚集和聚集,如抗α-微管蛋白染色所显示的那样(如图1所示)。6),但也恢复了对Etoh和H的容忍2O2-LT诱导的蛋白质折叠应激(图1.S5).

图6
figure6

转基因特征多诺瓦尼菌株。(A)转基因寄生虫细胞系的检测列表。在营养百菌清的作用下选择的;临时的。赛尔。=温度选择方案。(B)5✕105细胞/ml接种M 199+培养基7ml,在34°C或37°C下孵育4d,第4天用小鼠抗α微管蛋白MAb(1:4000)、抗鼠IgG AlexaFluor 594(1:500)和DAPI染色。图像是使用ImageJ斐济软件(2.0.0版)处理和合并的。标尺:10米(C, D)转基因的生长行为多诺瓦尼34°C(n=8)或37°C(n=4)菌株。细胞接种于5✕10。5/ml,生长4天。测量细胞密度并将其归一化为野生型(HSP 23)。+/+)细胞密度。使用Kruskal-Wallis检验:*p < 0.001, ****p < 0.0001. (E, F)用基因特异性引物qRT-PCR检测CK1.2的表达水平。E)和Westernblotting用抗CK1.2抗体(F)。数据正常到HSP 23+/+样本。

此外,在所有被测试的菌株中。6(A)CK1.2的异位表达强烈依赖于预先选择的条件:HT选择的细胞系在34°C和37°C下均能生长,并达到与HSP 23相似的细胞密度。−/−ESC突变体(图1.6c,D)。相反,在lt-选择的HSP 23中只观察到TS表型的部分逆转。−/−[CK1.2]以34°C生长较慢,37°C生长不佳为判断(图一)。6c,D)。

根据这些结果,我们推断HSP 23丢失的补偿可能与CK1.2的表达水平有关。为了验证这一假设,我们分析了CK1.2编码的mRNA和蛋白水平,选择的高表达系在允许和不允许的条件下。与LTS相比,HTS的RNA和CK1.2蛋白水平分别提高了10~15倍和2.5倍。6e、f)。更有甚者,HSP 23的变化−/−[Mix]-LT和HSP 23−/−[CK1.2]-LT系在较高温度下,CK1.2 mRNA水平增加10~19倍,蛋白质水平增加2.6~3.9倍。HSP 23的连续培养+/+野生型细胞在不允许的温度下转染HSP 23+/+带有CK1.2过表达质粒和随后的HTS的寄生虫不会导致CK1.2mRNA或蛋白水平的相应增加(数据未显示)。此外,热选择HSP 23的mRNA和蛋白质丰度也有所增加。−/−ESc1/2菌群一旦被转移回LT,则是可逆的(见图)。S6).

总之,我们的数据表明:(1)HSP 23中CK1.2蛋白水平的增加有很强的选择性压力。−/−空突变体和(Ii)观察到的基因剂量的变化是在严格的,温度依赖的选择.

HSP 23是酪蛋白激酶1.2的体外底物

酪蛋白激酶1.2参与了小鼠的热休克反应利什曼原虫作为HSP 90上游蛋白激酶45。此外,HSP 23和密切相关的hsp 90-调节共同伴侣p23。43包含可能的CK1磷酸化位点。7一个,S7)。为了阐明CK1.2与HSP 23以及p23之间可能的酶-底物相互作用,我们进行了重组表达的体外磷酸化试验。多诺瓦尼CK1.2以髓鞘碱性蛋白(MBP)、HSP 23和P23为底物和(或)调节伴侣。蛋白与[[]]共孵育30 min。γ-32P]-ATP在LT和HT时,用SDS-PAGE分离,用放射自显影显示.

图7
figure7

体外激酶检测γ-32P]-ATP(A)推测存在于HSP 23和P23中的CK1磷酸化位点的原理图。(B, C0.25g重组酪蛋白激酶1.2与3g髓鞘碱性蛋白(MBP)、1.57g重组HSP 23(B)或1.3gP23(C)在10 mD 4476抑制剂或同等浓度的DMSO存在下。反应在LT(25°C)或HT(37°C)中孵育30 min,加入负载缓冲液后停止。不含激酶的反应包括检测底物的可能的自磷酸化。在12.5%SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质,再用Westernblot进行蛋白质印迹。成立[γ-32P]-ATP由放射自显影(上板)监测。A=1周曝光,b=24 h曝光,c=12 h X线片曝光.印迹用抗CK1.2(SY3535)、HSP 23和P23抗体检测,或用考马斯兰染色(下板)评价负荷。图中显示了一系列(n=4)实验中具有代表性的西方印迹。

图形7B显示CK1.2在含有激酶、MPB和HSP 23的反应混合物中的活性。CK1.2在LT和HT容易磷酸化MBP,HT时活性略有下降。在混合物中添加HSP 23有三方面的效果:(1)CK1.2的自磷酸化增加,(2)HSP 23变成放射标记,(3)MPB在较高温度下磷酸化降低。我们的结论是CK1.2的自磷酸化和伴随的活性降低是由HSP 23进一步促进的。反过来,HSP 23是CK1.2的底物。后一种活性被CK1特异性抑制剂D 4476的HSP 23磷酸化缺失所证实。

我们还测试了共同伴侣P23对CK1.2活性的影响。如图所示。7C,P23与HSP 23有非常相似的作用,促进CK1.2的自磷酸化,降低MBP磷酸化。与HSP 23一样,P23是CK1.2介导的磷酸化的底物,在CK1.2客户名单中增加了伴侣蛋白家族的第三个成员。

我们的结论是,CK1.2过度表达可能会影响磷酸化状态,可能还会影响伴侣蛋白的活性。利什曼原虫它通过基因扩增的过度表达可能会影响寄生虫蛋白质折叠的动态平衡。

讨论

热休克蛋白23丢失的遗传补偿利什曼原虫

双等位基因替换HSP 23在……里面多诺瓦尼结果在25°C时生长减弱,温度通常与原体期有关,但在温度>30℃时也会丧失活力。42。我们的结果表明,所有的HSP 23−/−我们获得的缺失突变体携带了35号染色体的部分或完全扩增,要么作为三体,要么作为该染色体5‘端第三端的重复。HSP 23在37°C的通道−/−ES 0克隆克服了25°C生长下降,甚至从35号染色体5‘端大量扩增出6个基因区。如前所述16,23在35号染色体上观察到的6个基因簇的DNA拷贝数的变化与mRNA水平的增加有很好的相关性。然而,在去除HTS后,mRNA恢复到基础水平,表明在没有温度选择的情况下,gDNA扩增从选定的群体中丢失,尽管这还有待于实验验证。

我们的观察结果与与耐药相关的基因组变化相匹配,即选择性染色体Somy变化在耐药性发展初期出现,在更严格的选择之后,出现通常在选择被移除后从群体中丢失的染色体外扩增物。18,19,20,53,54,55.

近年来,在理解高塑性的机制方面取得了显著进展。利什曼原虫基因组。圆形或线形的染色体外小体通常是通过在直接或倒置重复序列水平上的重排而形成的。56,57。此外,广泛分布于整个系统的短间隔退化反转子(人)利什曼原虫基因组在转录后(SIDER 2)或翻译(SIDER 1)水平上都参与了基因表达的调控。58,59也能诱导DNA重排19.

事实上,一个全基因组的生物信息学分析利什曼原虫基因组19描述了在热选择HSP 23中扩增的35号染色体识别的dna区域中的几个sider序列。−/−ESC突变体更重要的是,NGS在HSP 23中确认的扩增−/−ESC 1,2突变体与预测的假定产物相匹配,从而突出了基于Sider元件的DNA重排预测的能力及其在对变化的胁迫条件下的响应中的重要性。

酪蛋白激酶1.2在HSP 23中的高表达拯救耐温性−/−

以酪蛋白激酶1.2的扩增作为恢复HSP 23耐温机制的两条证据线−/−变种人。首先,在hts后扩增出的基因簇上发现6个基因,并将其作为转基因基因转染到HSP 23中。−/−克隆2和3,只有LdBPK_351030-CK1.2被保留在混合群体的HTS下,而LTS产生了全部6个转基因。其次,在CK1.2中-过表达HSP 23−/−HT-S下的寄生虫、存活和生长与CK1.2mRNA和蛋白质丰度相关,导致HT选择群体的CK1.2丰度增加了6倍,几乎达到野生型的耐温能力。将LT选择的菌株转化为HT很快就会导致表达的增加。以类似的方式,HT-选择HSP 23−/−转回LT的ESC株CK1.2mRNA和蛋白均有减少,提示所观察到的基因扩增是可逆的。我们的结论是HSP 23的存活和生长−/−突变体在与哺乳动物组织温度相匹配的温度下是CK1.2表达的一个函数。相反,环境温度下的栽培导致过度表达迅速减少,表明在没有温度胁迫的情况下CK1.2丰度增加会产生不利影响。

酪蛋白激酶1家族成员是高度保守的嗜酸丝氨酸/苏氨酸激酶,在细胞周期中有报道的作用。60、昼夜节律61,62,63、细胞信号和膜贩运64。这个利什曼原虫基因组中含有6种不同的酪蛋白激酶亚型,CK1.2是表达水平最高、含量最高的一种65,66,67。CK1.2显示了一个无处不在的定位,发现于细胞质、细胞核、基底体和鞭毛袋中。多诺瓦尼68,寄生虫与环境的主要界面和外胚体的起源。众所周知,CK1.2是免疫调节的外小体蛋白质负荷的一部分。利什曼原虫寄主细胞内胞内散逸期内寄生物的温度依赖性69,70。这一事实,以及特异性抑制剂D 4476对CK1.2的抑制作用,对无菌散光细胞具有细胞毒性作用,并能在体外降低感染巨噬细胞的寄生虫载量。52,强调了该蛋白激酶在细胞分化和细胞内存活中的重要作用。

正如以前报道的人类CK1酶71,已知的底物利什曼原虫CK1.2包括主要的伴侣HSP 70和HSP 90,后者对快速生长的原体至关重要,在生命周期控制中起着关键作用。杜氏利什曼原虫45,68,72,73.

CK1.2磷酸化HSP 23和P23在体外的研究

我们的结果表明,另外两个伴侣蛋白HSP 23和P23可能是CK1.2的底物。事实上,这两种蛋白都含有几个典型的CK1蛋白激酶的一致序列(pSer/THR-X-X-(X)-Ser/THR)。7a)。据报道,p23在其他生物中被CK2磷酸化。74,75。此外,利什曼原虫HSP 23和P23依次调节CK1.2的活性和特异性。7B,C),提高自磷酸化活性,降低MBP磷酸化。在其他系统中,CK1的一个已知特征是自磷酸化与底物特异性活性之间的负相关关系。76,77,78.

P23是已知的HSP 90的共同伴侣,与HSP 90的中间结构域结合,与ATP结合态的亲和力较高。这种相互作用暂时稳定了HSP 90的闭合构象,同时也减慢了ATP酶的周期。79,80,81,82,83,84。这种对HSP 90 ATP酶活性的抑制作用也被描述为对p23,在较小程度上对hsp 23的抑制作用。巴西利什曼原虫85。Trypanosomatida(V.Adaui,C.Kr ber-Boncardo,未发表)中HSP 23的强大结构和功能守恒表明,它具有类似的调节作用。多诺瓦尼HSP 23蛋白对HSP 90功能的影响

HSP 90特异性抑制剂格尔德那霉素(GA)和激元醇可抑制p23与HSP 90的相互作用,从而使HSP 90功能周期消失。86,87。P23的损失利什曼原虫但在其他生物中,也会导致对HSP 90抑制剂的过敏反应。HSP 23过度表达多诺瓦尼能补偿GA或激元醇诱导的HSP 90抑制作用下P23的丢失43进一步支持证明HSP 23在HSP 90上具有内在协同伴侣活性的数据。HSP 23生长抑制表型的观察−/−因此,空突变体可能部分是由于HSP 90放松管制所致。因为HSP 90也是已知的CK1.2的体外底物45,CK1.2在HSP 23中的过表达−/−逃逸变体可能是通过改变HSP 90本身的磷酸化状态来抵消解除管制的方法之一,或者是改变HSP 90本身的磷酸化状态,或者改变它的辅助伴侣(如p23)的磷酸化状态。Hsp 90的翻译后修饰对伴侣周期的微调非常重要,并影响其构象、ATP酶活性、与伴侣的相互作用、各种客户蛋白的合成和激活、细胞的生长和活力。45,71,88.

一个令人惊讶的结果是在hsp 23的基因加回系中得到的。−/−在37℃和2%乙醇胁迫下恢复体外生长,但在H下不能增殖。2O2,而与CK1.2的互补则减轻了H。2O2-介导生长抑制。我们怀疑HSP 23的作用−/−论H下的生长2O2在25°C标准培养条件下,基因加成也有一定的效果。这说明在热应激诱导条件下,即HT或2%乙醇条件下,生长缺陷较强,LT和氧化胁迫下的生长缺陷可能是不同的细胞途径所致。

总之,我们的数据表明,一个由CK1.2、HSP 23、P23和HSP 90组成的监管网络。这得到以下结果的支持:(1)HSP 23、P23和HSP 90是CK1.2的体外底物;Ⅱ)HSP 23和P23影响CK1.2活性,但HSP 90也影响CK1.2活性。85.

HSP 23蛋白组的比较分析−/−ESC突变体和CK1.2在允许温度和非允许温度下都可能对这些伴侣的功能网络和CK1.2的调控提供新的见解。此外,这些研究还可以识别CK1.2的新客户端和下游信号通路,从而阐明CK1.2在HSP 23中过度表达的作用。−/−零突变体,并最终阐明了它在利什曼原虫耐温性此外,可能的CK1.2磷酸化位点(S)的HSP 23也可以突变,以评估所产生的表型在体外生长,温度和耐化学性。

对目标药物开发的影响

我们的数据表明,尽管HSP 23对寄生虫的耐温性很重要,但由于能够克服HSP 23功能丧失的基因变异的普遍存在,HSP 23可能是治疗干预的一个很差的靶点。可塑性利什曼原虫无论是在实验室还是在野外,基因组都提供了大量可供选择的基因变体,使它们能够克服单一蛋白质功能的丧失或丧失。因此,我们的数据也强调了使用转基因,活衰减的风险。利什曼原虫寄生虫89,90,91为了疫苗的目的,因为被认为是减毒的基因修饰很容易被逆转或补偿,方法是从先前存在的、有益的基因扩增变体中进行选择。利什曼原虫人口。

材料和方法

试剂和化学品

除另有说明外,所有试剂均从德国默克、达姆施塔特或其Sigma-Aldrich子公司购买。

利什曼原虫培养条件

杜氏利什曼原虫菌株1s36突变体在M 199+培养基中培养。73每隔3~4d传代一次。

电转染利什曼原虫寄生虫

电转染和筛选按所述进行。92。为从转基因寄生虫种群中分离出单个无性系,将0.5个细胞接种于96孔板中,接种于200 lM 199+培养基中,附加抗生素G 418(50 g/ml,Roth,Karlsruhe,德国),普罗霉素(25g/ml)和克隆Nat(150 g/ml,德国耶拿)和1×青霉素/Streptomycin。经过10-14天的筛选,将新出现的无性系转移到培养瓶中,并在抗生素筛选下进一步传代。

重组DNA的构建与制备

LdBPK_340230(HSP 23),LdBPK_351030(CK1.2)、LdBPK_351040、LdBPK_351050、LdBPK_351060、LdBPK_351070和LdBPK_351080编码序列。多诺瓦尼使用特定引物对的1S基因组DNA(表)沙一)如所示,引入限制位点。片段随后被连接到pCL2S载体上。93在匹配的限制点简化。质粒大肠杆菌DH5α经CSCL密度梯度超速离心纯化94.

CK1.2蛋白表达质粒pJC 45的构建40通过引入一个KPN利用引物Link-pJC 65+和Link-pJC 65-构建pJC 65质粒。开放阅读框架杜氏利什曼原虫CK1.2从pCL2S_LdBPK_351030质粒中分离得到KPN我和BAMHi限制性位点连接在pJC 65中的匹配位点之间。PJC 65的地图如图所示。S8.

质粒纯化利什曼原虫寄生虫

2-4✕109将转染过表达质粒的原生质体用1250✕g离心,4°C离心8 min,用1✕pbs洗涤三步后,用碱性裂解法纯化质粒DNA。94。苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)提取后,加入0.1M醋酸铵和2.5体积100%乙醇沉淀质粒DNA。用Tris/EDTA缓冲液(pH8.0)在4°C下溶解24 h。然后,将10 ng1(约100 ng)的分离质粒dna电穿孔入。E.coliXL一蓝色电穿孔细胞(Agilent Technologies,Santa Clara,美国)使用0.1cm GAP基因Pulser Cuvettes的细胞(Bio Rad,德国慕尼黑)。根据制造商的指示,使用NucleoBond pc 20试剂盒(Machery-Nagel,Düren)分离扩增出的dna,并在20 l超纯DDH中洗脱。2O.

下一代测序

DNA库是根据制造商的指示使用NextEra XT库工具包(Illumina,San Diego,USA)和NextEra XT索引工具包(Illumina,San Diego,USA)创建的。利什曼原虫GDNA是根据制造商的协议使用生物碱分离物2基因组DNA试剂盒分离的,并使用Qubit(3.0)-系统将其最终浓度设置为0.5 ng/l(Thermo Fisher Science,Waltham,美国)。在转座酶介导的标记步骤中,用1ng的gDNA进行标记。利用Agencourt AMPure XP试剂盒(美国Fullerton贝克曼库尔特)纯化DNA文库,用生物分析仪(美国圣克拉拉Agilent Technologies)和高灵敏度DNA分析试剂盒(美国圣克拉拉Agilent Technologies)测定DNA片段的大小分布。每个样品进一步稀释到4nm,考虑到平均片段大小和DNA浓度。制备了一个DNA文库池,将每个稀释样品中的5升混合在一个1.5 mL的试管中(Eppendorf,汉堡,德国)。为了变性DNA文库,将DNA库中的5l与新制备的0.2N NaOH的5μl混合在一起。在RT下孵育5 min后,加入990℃的HT1预冷缓冲液,得到20 pm的DNA文库。用HT1缓冲液将DNA文库进一步稀释至10 pm,最终加入6 0 0μm l的变性PhyX参考文库。在加载测序盒MiSeq试剂试剂盒V3(600周期)之前,将文库进行热变性(95°C,2 min),并在冰上孵育5 min。在MiSeq测序仪上进行了测序(Illumina,San Diego,USA)。

RNA提取、cDNA合成和定量实时PCR(qRT-PCR)

从5✕10中分离出细胞总RNA。7对数相位多诺瓦尼寄生虫使用InviTrap自旋细胞RNA迷你试剂盒(战略,比雷肯菲尔德,德国)根据制造商的指示。用QuantiTect(R)反转录试剂盒(QuantiTect,Venlo,荷兰)按照制造商的程序从800 ng RNA中进行第一链cDNA合成。

对于qRT-PCR,使用Biozym Blue S‘Green qPCR试剂盒(Biozym Science GmbH,Oldendorf,德国),将1 1的cDNA插入终量为20μl的cDNA中。在一个转子基因实时PCR周期仪(RG 6000,Corbett Research,澳大利亚悉尼)上进行反应并进行分析。95。基因表达水平正常至HSP 23。+/+-LT样本。QPCR引物序列列于表中沙一.

WESTERNBLOTTING

对于每个样本,1✕107将疟原虫溶于样品缓冲液中,用sds-PAGE法分离,再用半干Westernblot法分离。94。抗CK1.2兔(SY3535)(1:250)52或多克隆抗HSP 70 IgY(1:500)38,抗P23 IgY(1:500)43和抗HSP 23 IgY(1:250)42阻断液结合抗兔-IgG:-AP(山羊,1:1000)或抗鸡-IgY::AP(兔,1:5000)次级抗体(德国汉堡),用硝基蓝四唑氯化铵和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)研制。39.

免疫荧光法

1✕107在10 min,1000✕g,4°C的条件下,用PBS冲洗一次,悬浮在100 mg/L的PBS中。在玻璃镜片上涂片,风干,用冰冷甲醇固定3分钟。幻灯片轻轻冲洗三次(0.1%TritonX-100在PBS中),然后在0.1%TritonX-100,50 mm NH中渗透15分钟。4PBS中的Cl。在阻断液(2%BSA,0.1%TritonX-100在PBS中孵育1h)中加入多克隆抗微管蛋白IgG(1:4000),RT孵育1h。细胞清洗至少15 min,然后与抗小鼠Alexa Fluor(R)594 IgG(山羊,1:250)和DAPI(PBS中1:50)共同孵育。在显微观察方面,用20升Mowiol和盖片覆盖幻灯片,在4°C下放置24 h。用Evos FL自动细胞成像系统进行荧光显微镜检查(Thermo Fisher Science,Waltham,美国)。图像处理使用ImageJ,富士软件(2.0.0版)。

重组HSP 23和CK1.2蛋白的表达及纯化

PJC65-CK1.2,pJC45-HSP 2342和pJC45-P2343质粒转化菌株BL 21(DE3)(PAPlacIQ)40可溶性(他的)10-用HisBind树脂(Novagen,Madison,WI)纯化标记蛋白。96。洗脱液加入10%甘油,休克冷冻,保存于−80°C。

酪蛋白激酶测定

CK1.2激酶体外活性测试基本按所述方式进行45。在缓冲液A(pH7.5),130 mM KCl,15 mM MgCl中加入重组蛋白2,0.5毫米1,10-菲咯啉,1毫米氟苯基甲基磺酰氟,25毫米磷酸甘油,0.1毫米正戊酸钠,1毫米EGTA,1毫米二硫苏糖醇,0.05毫米ATP和10 Ci[γ-32P]-ATP(Hartmann Analytics,Braunschweg,德国),用重组蛋白和底物浓度分别为:recLdCK1.2:0.25 g(6 Pmol)、recLdHSP 23:1.57μg(60 Pmol)、recLdP 23:1.3μg(60 Pmol)、髓鞘碱性蛋白(MBP):3g(162 Pmol)。CK1.2特异性抑制剂D 4476在0.7%DMSO存在下,浓度为10M。对照组采用等效终浓度的DMSO。反应在25°C或37°C下孵育30 min,加入1 Vol.sds-PAGE样品缓冲液后停止。94。样品在95℃下加热10 min,在12.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶上运行。蛋白质印迹到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(GE保健生命科学,德国慕尼黑),32P掺入采用放射自显影法(日本东京富士超级RX-N)。

硅法

在硅克隆中,用MacVector软件17.x进行DNA和蛋白质序列分析。利用棱镜软件(GraphPad Software LLC)对数值数据进行了分析。半色调图像优化全部对比和亮度使用ImageJ斐济软件(版本2.0.0)(NIH)。合成图形使用Intaglio软件(炼狱)组装。热图是使用热映射器在线工具生成的。97.

生物信息学与NGS分析

的TriypDB版本42对齐读取多诺瓦尼BPK使用Bowtie 298。染色体倍性是通过一个内部程序的迭代方法来确定的:最初,每个染色体的覆盖率估计为2.0。计算15~85分位位数的平均覆盖率和比率覆盖率/平均值。然后根据这些组分和重复的程序更新覆盖度,直到转化。对于基因覆盖,使用了一种类似的方法,不同的是,拷贝数与先前计算的染色体倍体标准化。


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