β-内酰胺类抗原的制备
首先，对头孢菌素盐(CFR、CFO和CFT)进行酸化处理，得到相应的羧酸。反应容易进行，产率高(约90%)。酸化BLC的纯度较高(见“补充信息”中的NMR谱)。抗原的产生依赖于酸化的BLC(CFR、CFO、CFT、MRP和AZT)与载体蛋白的结合。36,37。本研究采用人血清白蛋白和组蛋白H1，两组蛋白均显示约60个游离赖氨酸残基，以探讨两种不同的结合途径，以获得每种β-内酰胺类抗生素相应的主要和次要决定因素。HSA和H1的初始摩尔比(β-内酰胺/载体蛋白)分别为1000/1和240/1，以保证抗生素的结合。对于决定因素的特征，未采用阐明的方法。然而，根据MS-MALDI-TOF结果(见在线补充MS-MALDI-TOF谱)，HSA抗原的摩尔比为1~8。特别是氨曲南和头孢三嗪的主要抗原和次要抗原的摩尔比相似，而美罗培南抗原的摩尔比分别为1和8。HSA抗原的结合率一般很低(<0.8%)。这可能是由于无保护群产生的-llanyl抗原。所研究的BLCs在其R取代基中含有一个伯胺基，可与赖氨酸中的氨基竞争，通过酰胺化反应生成β-内酰胺的低聚物。
抗原评价
以CFT、MRP和AZT血清中的-loyl和-llanyl两种抗原为基础，首次将这些抗原作为概念的证明。如附图所示。S2–S4免疫兔血清经lloyl基因决定簇特异性识别出相应抗原。相反，-llanyl的决定因素则不是这样，没有显示出具体的认识。例如，如在线补充图所示。S4用-lloyl决定簇免疫兔获得的AZT血清在稀释倍数为1/100(v/v)时特异性识别-lloyl和-llanyl决定抗原，而在稀释因子为1/500(v/v)时才能识别AZT-lloyl抗原。然而，用-llanyl行列式获得的AZT血清在任何一种研究的血清稀释液中都不识别任何决定因素。
为评价接合物对检测灵敏度的影响，采用直接多重免疫法，对CFT、MRP和AZT免疫血清中的-lloyl抗原和-llanyl抗原进行了筛选。血清稀释度分别为1/250、1/1000、1/4000和1/16，以PBS-T为空白。所得结果在图中绘制。6和7分别用于-lloyl和-llanyl决定因素。这些数值代表了在每次测定中得到的信号的平均值(n=3)，以及以误差条表示的标准差(SD)。如图所示，与阳性对照(RIGG)相对应的信号约为15,000 A.U。(±8%)HSA(<500 A.U)阴性。不同血清的稀释度使免疫灵敏度得以估计。正如我们在图中所看到的。7B用α-IgG-MRP(MRP)血清检测美罗培南-伊兰尼抗原1/16，稀释倍数为1/16，信号值为1500 A.U，符合检测限。
图6多克隆兔IgG获得的-lloyl决定簇信号。稀释系数：1/1000，1/4000和1/16,000。(a)HSA决定因素；(bH1决定因素。
图7多克隆兔IgG获得的-llanyl决定簇信号。稀释系数：1/1000，1/4000和1/16,000。(a)HSA决定因素；(bH1决定因素。
当聚焦于1/1000稀释度时，比较了不同兔血清决定因素之间的反应和交叉反应性。正如我们在图中所看到的。6头孢菌素(CFR)、CFO(CFO)、CFT(CFT)的-lloyl决定簇(CFR、CFO、CFT)主要由CFT血清特异性鉴定，AZT和MRP无交叉反应性。在使用AZT决定簇和血清时，也发现了类似的模式。事实上，正如预期的那样，没有其他产生的决定因素得到承认，这表明承认是针对单半胱氨酸的。相反，MRP的决定簇主要由相应的血清识别，但其值与头孢菌素抗原的值相似，表明兔血清的选择性不高。
就交叉反应性而言，有证据表明病例-llanyl的决定因素有不同的模式(图1)。7)，取决于所使用的载体蛋白。可见，CFT血清主要检测CFO产生的抗原，与AZT和MRP无交叉反应。然而，CFR的结果正好相反，因为在任何研究的免疫血清中对这些决定因素的认识都很差。用CFT检测血清中HSA-抗原和与其他血清的交叉反应性。一般情况下，MRP和AZT的血清分别检测到-llanyl MRP和AZT抗原，与其他BLCs无交叉反应，但AZT反应高于MRP。
为了研究不同β-内酰胺家族血清中结构决定因素的亲和力，对其结合值进行了分析。结果在在线补充图中提供。S5, S6。亲和力值(如K)dAPP和决定系数，R2)对于所有的兔IgG抗体，每个抗原决定簇的抗体都显示在在线补充表中。S2, S3。KdAPP数值从10个不等–4至10–2(稀释系数为~1/1000至~1/20)，而R2-lloyl和-llanyl决定因素的范围分别为0.9605和0.9994，0.6111和0.9984。
结果表明，hsa-lloyl决定簇对抗CFT和AZT的血清亲和力最强(稀释度较高)。dAPP分别对应于稀释倍数1/1011和1/5587的数值。而CFT和CFO的H1-lloyl决定簇对抗头孢曲松血清的识别率分别为1/1157和1/2271。
对于hsa-llanyl的决定因素，AZT显示出最好的亲和力。dAPP相当于稀释倍数1/2228的数值。然而，h1-llanyl cft和mrp的决定因素表明，对抗K抗体血清的识别效果最好。dAPP稀释系数分别为1/2168和1/1437。
尽管某些决定因素与血清有亲缘关系，但这并不一定意味着它们作出了良好的反应。38例如，h-1-llanyl抗原CFT和CFO对抗AZT的血清就是这种情况。一般认为，制备的主要决定因素和次要决定因素对公认的特定的Iggs具有选择性，所使用的载体蛋白之间存在显著差异。
人血清样本结构决定因素的评价
对74名受试者进行了研究，其中37人对BLC发生了即时反应。根据对过敏患者的临床资料，10岁和80岁的男性14人，女性23人。最常见的罪魁祸首是Augentin，即AMX和克拉维酸钾(12例受试者)的联合用药，其次是CFR(9例)、AMX(7例)、CFT(2例)和PG(1例)(表)。1).
点刺试验和多重免疫测定的结果见表。2。值得一提的是，所有的-lloyl和HSA-llanyl决定因素都没有产生任何积极的结果，其数值低于LOD(<0.01 IU/mL)。表中只包括H1-llanyl行列式给出的值。2.
表2活体(点刺试验)和体外(多重DVD法)分析人血清样品的结果。 首先，重要的是要强调缺乏可用的临床信息，可用于皮肤点刺试验的大多数研究抗生素。皮肤试验仅用于CFR，有时用于CFT。为了评估试验的临床敏感性和选择性，需要一种金标准，即可以鉴别对BLCs过敏的患者和不对BLCs过敏的患者的诊断方法。很难计算皮肤试验的敏感性，因为药物激发试验不能作为金本位标准来划分过敏或不过敏的对象，因为它们具有很高的风险。39.
皮肤试验结果显示，33例CFR阳性6例(18%)，CFT 19例(29%)3例，CFO 2例0例。在MRP和AZT方面，7例和3例患者中只有2例和1例进行了皮肤检查，分别为29%和33%。值得注意的是，接受皮肤测试的CFO、mrp和azt患者获得了较低的百分比值(对皮肤试验呈阳性)。对决所有的皮肤测试患者)，这不能被认为是一个一般性的陈述。
为了测定LOD和BLC特异性IgE水平，采用夹心免疫法测定血清总IgE，作为校准方案。多重免疫分析的LOD为0.01IU/mL(在线辅助)。无花果。S2)，对应于24 ng/L的特异性IgE，我们选择这个LOD作为评价的截止阈值。37例患者中，CFR 13例(35%)，CFT 6例(16%)，CFO 19例(51%)，MRP 18例(49%)，AZT 1例(3%)。对CFR、CFT、CFO、MRP和AZT的平均IgE值分别为0.27±0.77、0.02±0.01、0.05±0.05、0.23±0.46和0.05±0 IU/mL。本研究招募的37名对照组患者均为阴性。最后，患者总IgE水平与BLC特异性IgE水平无相关性.
至于引起过敏反应的罪魁祸首，只有五名经点刺试验呈阳性的病人，两名为阴性，两名未作测试(见表)。2)。H1 CFR-llanyl检测出5例CFR阳性患者，其值为0.03~2.80IU/mL。有趣的是，这种抗原检测到了病人006，经针刺试验检测为阴性。CFR的IgE值分别为002和014，分别为0.37和2.80IU/mL。幸运的是，患者014对CFR、CFO、CFT、MRP或AZT无交叉反应.然而，患者002通过皮肤试验检测CFT和MRP呈阳性。由于皮肤试验和BLC特异性IgE定量的结果不同，由于CFR的高健康风险和交叉反应性的可能性，对这些患者给予了特别的关注。对于那些cft引起过敏反应的009和025患者，我们的决定因素没有足够的选择性来检测，但两位患者的皮肤测试结果都呈阳性。
对于CFO、MRP和AZT，没有一例患者有过敏反应。在17例MRP特异性IgE值中，4例特异性IgE>0.35 IU/mL(患者006、012、016和017)，2个在0.10~0.20 IU/mL(患者018和019)。CFO检测15例阳性患者中，4例特异性IgE值在0.10~0.20IU/mL之间(患者004,005,006和011)。值得强调的是，这些患者中没有一人做过MRP或CFO的皮肤检查。这一事实可能有潜在的影响，因为病人可能会受到他们的影响，或处于过敏的危险之中。
本研究的目的是建立CFR、CFO、CFT、MRP和AZT的主要和次要决定因素，建立多重体外检测法检测这些BLCs的特异性IgE。我们不仅产生了一组决定因素，而且还致力于利用不同的载体蛋白开发一组可能的表位。首先，我们对患者的研究结果表明，在所选受试者中没有发现主要的(-lloyl)决定因素，也没有在基于HSA的决定因素中检测到。这些结果说明了结合途径的重要性和合适载体蛋白的选择。但是，它不能排除HSA作为具有免疫原性的载体蛋白候选物，也不能排除-lloyl决定簇作为抗原决定簇用于进一步的研究，因为本研究遵循特定的结合方法。此外，CFR的体外免疫反应阳性与皮肤试验结果也有很好的相关性，表明产生的决定物具有特异性，可用于体外诊断，特别是考虑到两种检测方法(特异性IgE定量和点刺试验)均证实5例阳性患者。此外，用适当抗原的多重试验能够检测出一例点刺试验结果为阴性的患者(患者006)和两名没有进行点刺试验的患者(患者002和014)的CFR特异性IgE值。因此，IgE检测可能适用于未做皮肤试验、使用不溶性BLCs、反应严重或高危患者。事实上，对于未进行皮肤试验的MRP，4例患者根据测定的特异性IgE值呈阳性，其值大于0.35IU/mL(患者006、012、016和017)。这证实了复式试验在药物过敏诊断中的应用。
使用体内和体外试验来诊断对BLCs过敏的患者需要适应当前的情况，在这种情况下，这些抗生素的消费模式发生了变化，青霉素正在逐步被其他抗生素所取代，如头孢菌素、碳青霉烯类、单胞苷类、喹诺酮类和四环素类。40。一些作者认为，皮试中含有青霉素抗原决定因素的皮肤试验已不足以评估患者的blc过敏反应和青霉素与头孢菌素的交叉反应性。41或碳青霉烯类12可以存在。例如，对于被认为对氨苄西林有选择性过敏的患者，应避免使用R侧链相同的头孢菌素(例如头孢曲嗪和头孢唑西林用于阿莫西林，头孢克洛用于氨苄西林)。42。然而，这些病人可能会服用其他头孢菌素，这些头孢菌素也会引起过敏反应。43，采用多重体外分析方法，可避免上述情况的发生。
在我们的研究中，观察到对CFT和MRP的特异性IgE水平在患者的罪魁祸首是增强剂或AMX。例如，012、016和017例患者的特异性MRP IgE值为0.35至1.91 IU/mL。在患者006中发现CFR与MRP的交叉反应性，其罪魁祸首为CFR，MRP阳性(IgE=0.64IU/mL)。有关头孢菌素与碳青霉烯类化合物交叉反应性的数据还不充分，但一些作者认为碳青霉烯类物质与头孢菌素有潜在的交叉反应，因为它与β-内酰胺环有相似之处。44。在病人006中，IgE抗体可能是针对β-内酰胺环的，这是所有BLCs共有的一个常见的核决定簇，但没有发现对CFT的识别。头孢噻肟R‘侧链和头孢呋辛R’侧链的乙酰基和卡巴酰基易于水解。45当产生抗原的时候。然而，CFT的硫代三嗪二酮结构是稳定的，可能参与了抗原的表位，这可能是CFT阴性反应的原因。
因此，有必要使用一组BLCS，因为没有临床认可的有效试剂。本文采用一种建立良好的多重体外方法来评价IgE抗体在明确的过敏人群中的存在，这些人群中最常引起即刻反应的药物是aum entin、cfr和amx。正如一些作者所认为的那样，过敏是皮肤状况的主要因素。46(作为荨麻疹)在对BLCs的过敏反应中，采用多重体外试验是一种很好的替代方法，可以在短时间内检测阳性患者，并在此多重容量的情况下同时研究BLCs的联合作用。假阴性的问题也是值得注意的。例如，Demoly和Romano表示有8-17%的皮试阴性患者对青霉素进行了阳性激发试验。22。因此，在皮肤和(或)药物激发试验显示阴性的患者中，体内试验和体外试验相结合是检测所有潜在过敏患者的有效方法。
