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IgE介导药物对抗生素过敏反应的新抗原头孢菌素、碳青霉烯和莫巴坦的血清学诊断

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发表时间:2020-09-30 09:20作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

β-内酰胺类抗生素头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松、美罗培南和氨曲南分别产生了来自-lloyl和-llanyl的新抗原。以人血清白蛋白和组蛋白H1为载体蛋白,制备了20种β-内酰胺类抗原.用体外多重免疫法检测抗原,检测血清中特异性IgG和IgE。在免疫兔血清中,主要和次要决定因素都是检测特异性抗β-内酰胺IgG的合适抗原.在37例变态反应患者中,我们观察到只有小的决定因素(-llanyl抗原)才适合于检测特异性抗β-内酰胺IgE抗体,其敏感性(<0.01IU/mL;24 ng/L)和特异性(100%)。这些发现表明,β-内酰胺类抗生素的半张化不仅在4位成员的β-内酰胺环仍未修饰时,使分子识别事件得到改善,而且还可能有助于开发适合于检测特异性IgE介导的过敏反应的有前途的小抗原。这将促进敏感和选择性复接体外试验的药物过敏诊断抗生素头孢菌素,碳青霉烯和单抗。

导言

2000年至2015年期间,以限定日剂量(DDD)表示的抗生素消费量增加了65%(211亿至348亿DDDs),其发病率上升了39%(每1000名居民每天有11.3至15.7个DDDs)。这一增长是由中低收入国家推动的,在这些国家,消费增长与人均国内生产总值(GDP)增长相关。1。事实上,β-内酰胺类抗生素是治疗细菌感染最广泛使用的抗生素,因此也是引起过敏反应最常见的原因。2,3,4,5。它们是世界上主要的生物技术市场之一,年销售额约为150亿美元,约占抗生素市场总额的65%(全球抗生素销售额为3×10)7总计5×10公斤/年7(世界范围内生产的公斤/年)6。多年来,最常用的处方和研究的BLCs是青霉素。4,7,8如青霉素(PG)、阿莫西林(AMX)或氨苄西林(AMP)。由于与青霉素有关的过敏反应增加,抗生素研究迅速导致发现和使用了其他几个blc家族。9。的确,2016年至2018年期间,头孢菌素、碳青霉烯类和单胺类抗生素的全球抗生素消耗量分别为135.45、11.26和6.23个DDDs。10。事实上,2018年所有这些BLCs的消费量为每1000名居民每天2.0份DDDs,约占欧洲总摄入量的11%。11.

BLC抗生素的化学结构差异促进了对广泛免疫系统特异性的过敏原识别,因此可能有助于引发不良反应。在生理条件下,β-内酰胺环打开后,BLCs产生-lloyl决定簇.根据参考书目,这个lloyl决定因子被认为是青霉素的主要决定因素,因为它对青霉素的过敏反应几乎有95%是由它引起的。12。其他决定因素被归类为“次要”或-lanyl决定因素,并在95%的病例中与引起即时免疫球蛋白E(IgE)介导的反应过敏有关。13,14,但直接参与这些决定因素引发即刻过敏反应的解释仍不清楚。15。到目前为止,许多研究集中在主要决定因素上。16。然而,由微小决定因素引起的blc过敏反应在青霉素过敏中被认为是极其重要的,例如在诊断β-内酰胺过敏的皮肤试验中。17,并与特定的全身过敏反应有关。18。因此,有必要系统地和临床地研究这些-llanyl衍生物作为β-内酰胺过敏的一个新的“次要”决定因素的相关性和相对重要性。13。在评价头孢菌素的使用的文献中发现了一些前瞻性的研究。4,5,19,20、碳青霉烯类21在有记录的青霉素过敏患者中,他们特别需要blc治疗,但很少有体外试验可用于这些研究。3。在任何情况下,许多被认为对blc过敏的病人,或者至少对他们有过敏反应的患者,通常被归类为对药物过敏,没有进一步的调查。22或者不接受BLCS治疗,因为患者可能会受到它们的影响,并有发生过敏反应的风险。使用其他抗生素可能会导致多重耐药细菌的产生,其他潜在的危险副作用的出现,以及导致更高的医疗费用。2。无论发生什么情况,那些自报青霉素过敏的患者都可以安全地检测是否存在真正的过敏,通常是通过过敏诊断测试。

过敏诊断必须包括详细的临床病史、体格检查和体内试验(皮肤和/或药物激发试验)。然而,这些测试构成危及生命的危险,并可能导致假阳性的皮肤测试结果。23。目前,金标体外试验是以免疫CAP技术为基础的,但仅适用于五种BLCs:PG、苯氧基甲基青霉素、AMP、AMX、头孢克洛。因此,缺乏良好的抗原决定因素,无法建立准确的免疫检测方法,有可能对其他BLCs进行特异性IgE检测,从而覆盖其他BLCs亚家族,以提高临床诊断水平。一个好的诊断依赖于体内和体外的测试,可以对所报告的blc过敏进行明显的延迟标记,并且大多数患者容忍BLCs而不发生意外事件。24。此外,过敏诊断的有效免疫分析依赖于选择合适的半抗原和代谢物来激发免疫应答。对血清中blc-反应性IgE抗体的特异性的研究揭示了一组不同的致敏决定因素,这可能是因为作者没有考虑到整个blc的过敏原决定因素的精细结构异质性。25。在设计决定因素时,重要的是保留半抗原特有的功能群。26.

本研究的主要目的是设计和制备头孢呋辛(CFR)、头孢噻肟(CFO)、头孢曲松(CFT)、美罗培南(MRP)和氨曲南(AZT)的主要和次要的lloyl和-llanyl衍生抗原。利用免疫兔、变态反应患者和对照组的血清,在数字多功能磁盘(DVD)上开发了一种多重直接微量免疫分析方法对化合物进行了评价。据我们所知,这是这些抗生素的主要和次要的lloyl和-llanyl抗原的第一次报告,这项工作证明了改进IgE介导的药物过敏反应的血清学诊断的潜力。

实验段

化学品、免疫反应剂和缓冲液

青霉素钠盐,三水美罗培南,氨曲南,头孢呋辛钠盐,头孢噻肟钠盐,头孢曲松二钠盐(七水化合物),N,N‘-二环己基碳二亚胺(DCC),N-羟琥珀酰亚胺(NHS)、吐温20、人血清白蛋白(HSA)、小牛胸腺组蛋白(H1)、小腿血蓝蛋白(KLH)来自Sigma-Aldrich(西班牙马德里)。所研究的BLCs的化学结构如图所示。1。二氯甲烷(DCM)、二甲基甲酰胺(DMF)、盐酸37%(盐酸)和缓冲盐是从Scharlau(西班牙Sentmenat)购买的,无需进一步纯化。氘代二甲基亚砜(DMSO-d)6(美国新泽西州)。抗人IgE单克隆抗体是从西班牙马德里的Ingenasa,S.A.购买的。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(gar-HRP)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体(GAM-HRP)均由英国剑桥大学的ABCAM公司提供。IGE人血清(世卫组织第三项国际标准)是从英国国家生物标准与控制研究所(NIBSC,英国赫特福德郡)购买的。四甲基联苯胺(TMB)底物来自SDT GmbH(德国贝斯韦勒),Coomassie艳蓝R-250染色液来自Bio-Rad(西班牙马德里)。Am图标Ultra 0.5预浓度10K MWCO过滤器和葡聚糖脱盐柱,5K MWCO,5mL来自Fisher科学公司(西班牙马德里)。

图1
figure1

研究的β-内酰胺类抗生素的化学结构。ChemDraw Professional版,17.0.0.206(121)Https://www.perkinelmer.com/es/product/chemdraw-professional-chemdrawpro.

缓冲液为:(1)碳酸钾0.5M,pH11.0;(Ii)磷酸盐缓冲液(PBS 1×,0.008 M磷酸二次碱,0.002 M磷酸钠一元,0.137 M氯化钠,0.003 M氯化钾,pH7.4);(3)PBS-T(PBS 1×含0.05%吐温20),(Iv)碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液0.1M,pH 9.6。在使用之前,所有的缓冲液都经过热费舍尔科学公司(西班牙马德里)的0.45-μm孔径硝化棉膜过滤。

头孢菌素盐酸化

首先,将头孢菌素盐酸化为:将相应的BLC盐溶于水中的溶液灌入圆底瓶中。然后用HCl6M酸化,然后在真空中过滤。该化合物用酸化水洗两次,然后在高真空中干燥以获得所需的酸。所有酸化头孢菌素的详细步骤和数据特征见在线补充信息(SI)。

结构抗原的制备

用KLH制备免疫原抗原(-lloyl和-llanyl),免疫新西兰白兔,作为头孢菌素、MRP和AZT模型,提高CFT特异性IgG水平。用HSA和H1两种载体蛋白制备抗原。筹备工作如下:

β-内酰胺-lloyl决定簇是通过β-内酰胺环打开连接载体蛋白赖氨酸残基,通过β-内酰胺环的羰基碳与赖氨酸残基氨基之间的酰胺化连接起来的。27稍作修改(图1)。2)。总之,在室温下,将载体蛋白(2.0mg)溶于碳酸钾0.5M,pH 11.0,与相应的BLC盐(22~30μ,视所用蛋白质而定)在室温下反应。

图2
figure2

蛋白质CFT-lloyl决定簇的共轭。Https://www.microsoft.com/es-es/microsoft-365/powerpoint.

在碳二酰亚胺化学的基础上,进行了β-内酰胺-llanyl决定簇的结合。28(无花果)3)。为达到此目的,以相应的BLC的22~30μ(取决于所用载体蛋白)作为其游离酸,在室温下与55μ的NHS和DCC在DMF(5 0 0μL)中反应4h。然后,以12,000 rpm离心去除酰基尿素沉淀。最后,在pH7.4的PBS 1×pH7.4中加入2.2 5mL的载体蛋白溶液(2.0mg),室温下加入2.2 5μL的上清。

图3
figure3

蛋白质cft-llanyl决定簇的结合。

取代了具有游离羧酸的β的化学结构,它有一个附加在-内酰胺环上的磺酸盐结构(如图所示)。1)。为此,用侧链中的游离羧酸制备了AZT-llanyl行列式,其过程与描述的-llanyl行列式相同。

HSA和H1-lloyl和-llanyl的决定簇均采用凝胶过滤层析法,以Amconutra 0.5预浓缩的10 K滤池和PBS 1x,pH7.4作为洗脱缓冲液。以PBS 1×,pH7.4为洗脱缓冲液,在葡聚糖脱盐柱上用尺寸排阻色谱法纯化KLH-lloyl和-llanyl决定簇。

所有决定因素均稀释至1.0mg/mL,并保存在-20°C,直至使用为止。通过Bradford蛋白分析确定了决定因素的浓度。29。用MS-MALDI-TOF法建立了β-内酰胺/载体蛋白的摩尔比。30。组蛋白H1是一个独立的富含赖氨酸的组分,主要是亚组分F1,其他亚组分仍然存在。MS-MALDI-TOF不能分析H1抗原。然而,HSA和H1抗原是按照相同的实验程序和根据主要或次要决定因素的形成而制备的。由于这两种蛋白都有大约60个游离赖氨酸残基,因此估计抗原H1的摩尔比与各自的HSA抗原的摩尔比相同。KLH的决定因素由于蛋白质分子量大而难以表征。用斑点杂交技术检测了提高的兔iggs在免疫过程中的选择性。31当免疫兔的血清特异性识别相应的抗原时,结合被认为是阳性的。

抗原鉴定规程

试验包括特异性IgG的检测(图1)。4A,检测I)和IgE(图1)。4标准DVD(CD Rohling-up GmbH,Saarbrücken,德国)为此,在打印缓冲液中制备的决定簇(40μg/mL)和对照组(阴性和阳性)通过使用非接触式印刷装置(AD 1500 Biodt,Inc.,Irvine,CA,USA)分配25 nl,每盘5×4个点,以微阵列格式发现。斑点直径为500μm,中心至中心距离为1.0mm.在每个微阵列中。5)将所产生的决定簇(2个重复,第2~9位)和阴性(HSA,第1位)和阳性(兔IgG或人IgE,第10位)的对照点包括在内。打印后,将DVD在37℃下孵育16h。

图4
figure4

基于直接比色检测格式的多路微免疫检测方案I和II。

图5
figure5

(a)多路复用微阵列的布局。位置1:HSA,阴性对照,C(−);位置10:RIGG或HIGG,阳性对照,C(+);(b)dvd上用α-IgG检测cft后的阵列图像,稀释因子1/1,(p1:hsa,阴性对照;P2:cft-hsa-llanyl决定簇;P3:cft-hsa-lloyl决定簇;p4:cft-h1-lloyl决定因素;p5:cfr-hsa-llanyl决定因素;p6:cfo-h1-llanyl决定因素;p7:cfr-H1-lloyl决定因素;p8:cfr-H1-llanyl决定因素;p9:cft-h1-llanyl决定因素;p10:rigg);(c)具有特定决定因素和控制点的阵列的代表性结果b),除了P10:HIGE)。

为了检测抗CFT、MRP和AZT的特异性IgG,将不同稀释度(1/250~1/16,000)的兔血清和对照(PBS-T)(每样25 L)加入到每个阵列中,孵育15 min。然后用PBS-T和水冲洗DVD,然后在PBS-T缓冲液(稀释1/400)中加入25L的多克隆抗体gar-HRP,洗涤15 min。为检测特异性IgE,在每个阵列中加入25 L(过敏患者和对照组),孵育30 min。洗涤后,在PBS-T缓冲液(1g/mL)中加入25 L mAb-IgE,孵育15 min。洗涤后加入GAM-HRP 1/100稀释液25L,共15 min。最后,通过在整个椎间盘表面均匀地分配1.0mL的TMB,在两种免疫检测中都进行了免疫反应。15 min后用水冲洗盘,停止反应。信号由修改后的dvd驱动器读取,并按前面描述的方式对数据进行分析。32,33。所有实验均重复3次。

通过测定表观亲和力常数(K),计算特异性Iggs与CFT、MRP和AZT抗原的亲和力。dAPP)在饱和试验中。钾dAPP代表特异性IgG与相应抗原决定物之间的表观平衡解离常数,与特异性IgG抗体的体外浓度(以稀释因子表示)有关,达到饱和试验中最大信号的一半。结合曲线用SigmaPlot 11软件进行拟合。

以特异性IgE单位(IU/mL)表达的BLC特异性IgE水平,采用WHO血清总IgE测定标准,采用异源内插作为校准方案。采用夹心免疫分析法建立校准曲线,以世卫组织第三国际标准为校准标准,奥马利单抗为校准剂。34作为捕获抗体。所有其他免疫反应物均与测定特异性IgE的试剂相同(试验II)。标准数据点,信号与半对数浓度,是在不同的日子在不同的圆盘上进行的10个曲线的平均值。拟合四参数Logistic(4PL)曲线(SUPP)。无花果。沙一)使用SigmaPlot 11软件。根据总IgE的校准曲线计算特异性IgE浓度。

血清样本

对过敏患者血清准备好的决定因素的反应性研究包括:(1)经点刺试验诊断为对BLC有即刻过敏反应的患者;(Ii)其罪魁祸首为一种BLC的患者(如抗生素阿莫西林、奥美丁、青霉素、头孢呋辛和头孢曲松);(3)总IgE(Tige)值在100至400 IU/mL之间(临床认为健康人群总IgE的正常范围)。35)。本研究所列37例患者的临床特征见表。1。以37例BLCs皮肤试验阴性、耐受性较好的受试者作为对照。他们的临床特征见表。沙一。所有的血清样本都是由西班牙巴伦西亚的I PolitèNic La Fe医院提供的。所有参与者在根据La Fe大学医院道德审查委员会批准的协议(登记号)给予书面知情同意后登记。(COBIOPHAD)。所遵循的程序符合2008年修订的1975年“赫尔辛基宣言”。根据欧洲药物过敏网络(ENDA)协议中所描述的程序,在必要时根据皮肤试验、体外试验或药物激发试验对患者进行诊断。

表1变态反应患者队列的临床特征。

结果和讨论

β-内酰胺类抗原的制备

首先,对头孢菌素盐(CFR、CFO和CFT)进行酸化处理,得到相应的羧酸。反应容易进行,产率高(约90%)。酸化BLC的纯度较高(见“补充信息”中的NMR谱)。抗原的产生依赖于酸化的BLC(CFR、CFO、CFT、MRP和AZT)与载体蛋白的结合。36,37。本研究采用人血清白蛋白和组蛋白H1,两组蛋白均显示约60个游离赖氨酸残基,以探讨两种不同的结合途径,以获得每种β-内酰胺类抗生素相应的主要和次要决定因素。HSA和H1的初始摩尔比(β-内酰胺/载体蛋白)分别为1000/1和240/1,以保证抗生素的结合。对于决定因素的特征,未采用阐明的方法。然而,根据MS-MALDI-TOF结果(见在线补充MS-MALDI-TOF谱),HSA抗原的摩尔比为1~8。特别是氨曲南和头孢三嗪的主要抗原和次要抗原的摩尔比相似,而美罗培南抗原的摩尔比分别为1和8。HSA抗原的结合率一般很低(<0.8%)。这可能是由于无保护群产生的-llanyl抗原。所研究的BLCs在其R取代基中含有一个伯胺基,可与赖氨酸中的氨基竞争,通过酰胺化反应生成β-内酰胺的低聚物。

抗原评价

以CFT、MRP和AZT血清中的-loyl和-llanyl两种抗原为基础,首次将这些抗原作为概念的证明。如附图所示。S2S4免疫兔血清经lloyl基因决定簇特异性识别出相应抗原。相反,-llanyl的决定因素则不是这样,没有显示出具体的认识。例如,如在线补充图所示。S4用-lloyl决定簇免疫兔获得的AZT血清在稀释倍数为1/100(v/v)时特异性识别-lloyl和-llanyl决定抗原,而在稀释因子为1/500(v/v)时才能识别AZT-lloyl抗原。然而,用-llanyl行列式获得的AZT血清在任何一种研究的血清稀释液中都不识别任何决定因素。

为评价接合物对检测灵敏度的影响,采用直接多重免疫法,对CFT、MRP和AZT免疫血清中的-lloyl抗原和-llanyl抗原进行了筛选。血清稀释度分别为1/250、1/1000、1/4000和1/16,以PBS-T为空白。所得结果在图中绘制。67分别用于-lloyl和-llanyl决定因素。这些数值代表了在每次测定中得到的信号的平均值(n=3),以及以误差条表示的标准差(SD)。如图所示,与阳性对照(RIGG)相对应的信号约为15,000 A.U。(±8%)HSA(<500 A.U)阴性。不同血清的稀释度使免疫灵敏度得以估计。正如我们在图中所看到的。7B用α-IgG-MRP(MRP)血清检测美罗培南-伊兰尼抗原1/16,稀释倍数为1/16,信号值为1500 A.U,符合检测限。

图6
figure6

多克隆兔IgG获得的-lloyl决定簇信号。稀释系数:1/1000,1/4000和1/16,000。(a)HSA决定因素;(bH1决定因素。

图7
figure7

多克隆兔IgG获得的-llanyl决定簇信号。稀释系数:1/1000,1/4000和1/16,000。(a)HSA决定因素;(bH1决定因素。

当聚焦于1/1000稀释度时,比较了不同兔血清决定因素之间的反应和交叉反应性。正如我们在图中所看到的。6头孢菌素(CFR)、CFO(CFO)、CFT(CFT)的-lloyl决定簇(CFR、CFO、CFT)主要由CFT血清特异性鉴定,AZT和MRP无交叉反应性。在使用AZT决定簇和血清时,也发现了类似的模式。事实上,正如预期的那样,没有其他产生的决定因素得到承认,这表明承认是针对单半胱氨酸的。相反,MRP的决定簇主要由相应的血清识别,但其值与头孢菌素抗原的值相似,表明兔血清的选择性不高。

就交叉反应性而言,有证据表明病例-llanyl的决定因素有不同的模式(图1)。7),取决于所使用的载体蛋白。可见,CFT血清主要检测CFO产生的抗原,与AZT和MRP无交叉反应。然而,CFR的结果正好相反,因为在任何研究的免疫血清中对这些决定因素的认识都很差。用CFT检测血清中HSA-抗原和与其他血清的交叉反应性。一般情况下,MRP和AZT的血清分别检测到-llanyl MRP和AZT抗原,与其他BLCs无交叉反应,但AZT反应高于MRP。

为了研究不同β-内酰胺家族血清中结构决定因素的亲和力,对其结合值进行了分析。结果在在线补充图中提供。S5, S6。亲和力值(如K)dAPP和决定系数,R2)对于所有的兔IgG抗体,每个抗原决定簇的抗体都显示在在线补充表中。S2, S3。KdAPP数值从10个不等–4至10–2(稀释系数为~1/1000至~1/20),而R2-lloyl和-llanyl决定因素的范围分别为0.9605和0.9994,0.6111和0.9984。

结果表明,hsa-lloyl决定簇对抗CFT和AZT的血清亲和力最强(稀释度较高)。dAPP分别对应于稀释倍数1/1011和1/5587的数值。而CFT和CFO的H1-lloyl决定簇对抗头孢曲松血清的识别率分别为1/1157和1/2271。

对于hsa-llanyl的决定因素,AZT显示出最好的亲和力。dAPP相当于稀释倍数1/2228的数值。然而,h1-llanyl cft和mrp的决定因素表明,对抗K抗体血清的识别效果最好。dAPP稀释系数分别为1/2168和1/1437。

尽管某些决定因素与血清有亲缘关系,但这并不一定意味着它们作出了良好的反应。38例如,h-1-llanyl抗原CFT和CFO对抗AZT的血清就是这种情况。一般认为,制备的主要决定因素和次要决定因素对公认的特定的Iggs具有选择性,所使用的载体蛋白之间存在显著差异。

人血清样本结构决定因素的评价

对74名受试者进行了研究,其中37人对BLC发生了即时反应。根据对过敏患者的临床资料,10岁和80岁的男性14人,女性23人。最常见的罪魁祸首是Augentin,即AMX和克拉维酸钾(12例受试者)的联合用药,其次是CFR(9例)、AMX(7例)、CFT(2例)和PG(1例)(表)。1).

点刺试验和多重免疫测定的结果见表。2。值得一提的是,所有的-lloyl和HSA-llanyl决定因素都没有产生任何积极的结果,其数值低于LOD(<0.01 IU/mL)。表中只包括H1-llanyl行列式给出的值。2.

表2活体(点刺试验)和体外(多重DVD法)分析人血清样品的结果。

首先,重要的是要强调缺乏可用的临床信息,可用于皮肤点刺试验的大多数研究抗生素。皮肤试验仅用于CFR,有时用于CFT。为了评估试验的临床敏感性和选择性,需要一种金标准,即可以鉴别对BLCs过敏的患者和不对BLCs过敏的患者的诊断方法。很难计算皮肤试验的敏感性,因为药物激发试验不能作为金本位标准来划分过敏或不过敏的对象,因为它们具有很高的风险。39.

皮肤试验结果显示,33例CFR阳性6例(18%),CFT 19例(29%)3例,CFO 2例0例。在MRP和AZT方面,7例和3例患者中只有2例和1例进行了皮肤检查,分别为29%和33%。值得注意的是,接受皮肤测试的CFO、mrp和azt患者获得了较低的百分比值(对皮肤试验呈阳性)。对决所有的皮肤测试患者),这不能被认为是一个一般性的陈述。

为了测定LOD和BLC特异性IgE水平,采用夹心免疫法测定血清总IgE,作为校准方案。多重免疫分析的LOD为0.01IU/mL(在线辅助)。无花果。S2),对应于24 ng/L的特异性IgE,我们选择这个LOD作为评价的截止阈值。37例患者中,CFR 13例(35%),CFT 6例(16%),CFO 19例(51%),MRP 18例(49%),AZT 1例(3%)。对CFR、CFT、CFO、MRP和AZT的平均IgE值分别为0.27±0.77、0.02±0.01、0.05±0.05、0.23±0.46和0.05±0 IU/mL。本研究招募的37名对照组患者均为阴性。最后,患者总IgE水平与BLC特异性IgE水平无相关性.

至于引起过敏反应的罪魁祸首,只有五名经点刺试验呈阳性的病人,两名为阴性,两名未作测试(见表)。2)。H1 CFR-llanyl检测出5例CFR阳性患者,其值为0.03~2.80IU/mL。有趣的是,这种抗原检测到了病人006,经针刺试验检测为阴性。CFR的IgE值分别为002和014,分别为0.37和2.80IU/mL。幸运的是,患者014对CFR、CFO、CFT、MRP或AZT无交叉反应.然而,患者002通过皮肤试验检测CFT和MRP呈阳性。由于皮肤试验和BLC特异性IgE定量的结果不同,由于CFR的高健康风险和交叉反应性的可能性,对这些患者给予了特别的关注。对于那些cft引起过敏反应的009和025患者,我们的决定因素没有足够的选择性来检测,但两位患者的皮肤测试结果都呈阳性。

对于CFO、MRP和AZT,没有一例患者有过敏反应。在17例MRP特异性IgE值中,4例特异性IgE>0.35 IU/mL(患者006、012、016和017),2个在0.10~0.20 IU/mL(患者018和019)。CFO检测15例阳性患者中,4例特异性IgE值在0.10~0.20IU/mL之间(患者004,005,006和011)。值得强调的是,这些患者中没有一人做过MRP或CFO的皮肤检查。这一事实可能有潜在的影响,因为病人可能会受到他们的影响,或处于过敏的危险之中。

本研究的目的是建立CFR、CFO、CFT、MRP和AZT的主要和次要决定因素,建立多重体外检测法检测这些BLCs的特异性IgE。我们不仅产生了一组决定因素,而且还致力于利用不同的载体蛋白开发一组可能的表位。首先,我们对患者的研究结果表明,在所选受试者中没有发现主要的(-lloyl)决定因素,也没有在基于HSA的决定因素中检测到。这些结果说明了结合途径的重要性和合适载体蛋白的选择。但是,它不能排除HSA作为具有免疫原性的载体蛋白候选物,也不能排除-lloyl决定簇作为抗原决定簇用于进一步的研究,因为本研究遵循特定的结合方法。此外,CFR的体外免疫反应阳性与皮肤试验结果也有很好的相关性,表明产生的决定物具有特异性,可用于体外诊断,特别是考虑到两种检测方法(特异性IgE定量和点刺试验)均证实5例阳性患者。此外,用适当抗原的多重试验能够检测出一例点刺试验结果为阴性的患者(患者006)和两名没有进行点刺试验的患者(患者002和014)的CFR特异性IgE值。因此,IgE检测可能适用于未做皮肤试验、使用不溶性BLCs、反应严重或高危患者。事实上,对于未进行皮肤试验的MRP,4例患者根据测定的特异性IgE值呈阳性,其值大于0.35IU/mL(患者006、012、016和017)。这证实了复式试验在药物过敏诊断中的应用。

使用体内和体外试验来诊断对BLCs过敏的患者需要适应当前的情况,在这种情况下,这些抗生素的消费模式发生了变化,青霉素正在逐步被其他抗生素所取代,如头孢菌素、碳青霉烯类、单胞苷类、喹诺酮类和四环素类。40。一些作者认为,皮试中含有青霉素抗原决定因素的皮肤试验已不足以评估患者的blc过敏反应和青霉素与头孢菌素的交叉反应性。41或碳青霉烯类12可以存在。例如,对于被认为对氨苄西林有选择性过敏的患者,应避免使用R侧链相同的头孢菌素(例如头孢曲嗪和头孢唑西林用于阿莫西林,头孢克洛用于氨苄西林)。42。然而,这些病人可能会服用其他头孢菌素,这些头孢菌素也会引起过敏反应。43,采用多重体外分析方法,可避免上述情况的发生。

在我们的研究中,观察到对CFT和MRP的特异性IgE水平在患者的罪魁祸首是增强剂或AMX。例如,012、016和017例患者的特异性MRP IgE值为0.35至1.91 IU/mL。在患者006中发现CFR与MRP的交叉反应性,其罪魁祸首为CFR,MRP阳性(IgE=0.64IU/mL)。有关头孢菌素与碳青霉烯类化合物交叉反应性的数据还不充分,但一些作者认为碳青霉烯类物质与头孢菌素有潜在的交叉反应,因为它与β-内酰胺环有相似之处。44。在病人006中,IgE抗体可能是针对β-内酰胺环的,这是所有BLCs共有的一个常见的核决定簇,但没有发现对CFT的识别。头孢噻肟R‘侧链和头孢呋辛R’侧链的乙酰基和卡巴酰基易于水解。45当产生抗原的时候。然而,CFT的硫代三嗪二酮结构是稳定的,可能参与了抗原的表位,这可能是CFT阴性反应的原因。

因此,有必要使用一组BLCS,因为没有临床认可的有效试剂。本文采用一种建立良好的多重体外方法来评价IgE抗体在明确的过敏人群中的存在,这些人群中最常引起即刻反应的药物是aum entin、cfr和amx。正如一些作者所认为的那样,过敏是皮肤状况的主要因素。46(作为荨麻疹)在对BLCs的过敏反应中,采用多重体外试验是一种很好的替代方法,可以在短时间内检测阳性患者,并在此多重容量的情况下同时研究BLCs的联合作用。假阴性的问题也是值得注意的。例如,Demoly和Romano表示有8-17%的皮试阴性患者对青霉素进行了阳性激发试验。22。因此,在皮肤和(或)药物激发试验显示阴性的患者中,体内试验和体外试验相结合是检测所有潜在过敏患者的有效方法。

结语

β-内酰胺变态反应的结构决定因素的产生和评价是发展敏感和选择性体外试验以确定特异性IgE的关键,只要有可能,可补充体内试验、数据和临床病史。这两种技术的结合可以提供更好的诊断,并允许显著的延迟标记,这应该可以改善未来抗生素治疗报告的BLC过敏。与所有有关青霉素反应性的研究不同,在这些研究中,它们的抗原决定因素的化学结构已经确定,其他β-内酰胺类抗生素的化学缺乏这方面的信息。

对这些家族的过敏反应可能是通过对它们或与青霉素相似的化学链的决定因素引起的。尚未确定不同的表位。本研究建立了一种多重敏感的免疫分析法,用于β-内酰胺类抗生素,如头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松、美罗培南和氨曲南等,在体外测定特异性IgG和IgE水平。结果表明,所有产生的抗原决定簇均能选择性地检测兔血清中的特异性抗β-内酰胺IgG,但在过敏患者血清中仅能检测到特异性抗-β-内酰胺IgE,因为该方案形成的-lloyl决定簇未被识别。这项工作还表明,载体蛋白在分子识别模式术语中起着重要的作用,因为只有准备好的H1来源的决定簇是通过过敏患者样本来识别的。因此,对于有严重和潜在的IgE介导的头孢菌素反应史的患者来说,避免再次接触相同的头孢菌素,一种同侧链的头孢菌素化合物,甚至是其他同侧链的blc,如头孢他啶、头孢阿德罗西和氨曲南,都是至关重要的。

这些发现表明,β-内酰胺类抗生素的半张化,即使β-内酰胺环仍未被修饰,也会产生增强和有趣的分子识别事件。这一贡献可能会改善目前对抗生素过敏的临床诊断,如头孢菌素、碳青霉烯类和莫巴坦,以及用作金标准的药物激发试验。事实上,未来的研究需要用口腔激发试验来证实这些体外研究结果。


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