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VAV 2信号通路促进皮肤及头颈部鳞状细胞癌再生增殖

二维码

发表时间：2020-09-25 10:38作者：武汉新启迪Xinqidibio

再生增殖能力和分化不良是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)预后不良的组织学特征。然而，调节它们的途径仍然是病态的。在此，我们发现这些特征是由Rho GTPase激活剂VAV 2在皮肤和口腔黏膜中的角质形成细胞中触发的。VAV 2也需要在HNSCC患者来源细胞中维持这些特性。这种催化和Rho GTPase依赖的功能分别由c-Myc-和Yap/TAZ依赖的转录程序介导，与再生增殖和细胞未分化有关。高水平VAV 2转录本和VAV 2调控的基因信号均与HNSCC患者预后不良有关.这些结果揭示了一个与特定SCC亚型恶性程度相关的可药物途径。

导言

皮肤(CSCC)和HNSCCs分别由皮肤分层上皮和上消化道粘膜衬里形成。这些肿瘤代表了当今的一个临床挑战，因为世界范围内发病率的增加，侵袭性，不良的预后，和有限的有效的治疗手段。这些肿瘤的危险因素包括紫外线照射(Cscc)、饮酒、吸烟和人类乳头瘤病毒(Hpv)感染(Hnscc)。1,2。这些SCCs具有与健康上皮最未分化的基底层相似的组织学特征。然而，它们可以显示不同数量的细胞，这些细胞既经历了终末分化，也经历了生长停滞。这种变异性在临床上是相关的，因为分化程度较低的肿瘤通常表现出更糟糕的疾病结局。1。这些数据表明，调节再生增殖和延迟分化的病理生物学程序推动了这类肿瘤的发生和恶性。与此相一致，有人提出，诱导癌细胞终末分化的疗法在HNSCC中可能有很高的应用价值。1。然而，到目前为止，我们仍然对调控这些恶性特性的分子和信号程序缺乏了解。最近在这方面的工作表明，诸如ap1和e2f家族成员、c-MYC、Yap/TAZ复合体、tp 63和ACTL6A等核因素可以触发这些过程。3,4,5,6,7,8。这些蛋白质似乎以协调一致的方式起作用，如复合材料的存在所表明的那样。顺式-靶基因中许多基因的基因DNA调控元件5,6.

最近的肿瘤分子分类学研究表明，rho gtp酶调节的生物过程的激活是大多数scc的共同信号特征。9。与此相一致的是，rac 1 gtp酶基因在cscc和hnscc中都有低频率的突变。10。在许多HNSCCs中也发现活性较高的RAC 1。11,12。这种激活与患者的化疗和放射抗药性的发展有关。12。目前尚不清楚该gtp酶的作用是否与其规范细胞骨架相关功能的调节有关。13,14和/或这些肿瘤的再生增殖。然而，RAC 1活性的消除降低了HNSCC细胞的克隆原性，提示这种gtp酶可能参与后一种病理生物学程序的调控。12,15。不幸的是，阻断肿瘤中RAC 1信号通路的努力到目前为止已经失败了，原因是rho gtp酶的内在不可药物性和下游元件(如丝氨酸/苏氨酸激酶的pak家族)抑制剂的不良副作用。10.

另一种靶向这些途径的方法是抑制Rho鸟苷核苷酸交换因子(GEFs)的催化活性，这是促进细胞Rho蛋白刺激步骤的一种酶。10。支持这一观点的基因分析表明，某些rho基因的单一(Tiam 1)或化合物(vv 2+vv 3)的耗竭都可以减少致癌物引起的皮肤肿瘤的形成，同时维持小鼠皮肤的动态平衡。16,17。催化亚纯Vav2使用上述实验方案，敲入小鼠也显示皮肤肿瘤发生受损。18。然而，对于在人类肿瘤中被解除管制的特定的Rho GEF以及它们所参与的通路，知之甚少。10。解决这些问题并非易事，因为Rho全球环境基金大家庭由70多个人类成员组成。10.

在这项工作中，我们报告Rho全球环境基金VAV 2经常在CSCC和HNSCC病例中过度表达。我们还证明，这一全环基金与与皮肤、头颈部上皮细胞的干细胞样再生增殖相关的病理生物学计划有关。相反，我们发现高水平的内源性VAV 2是维持HNSCC患者来源细胞的致瘤活性所必需的。沿着这些思路，我们发现VAV 2HNSCC患者的mRNA和VAV 2调控基因信号与疾病结局相关。

结果

VAV 2HNSCC患者预后不良与mRNA水平的关系

先前的数据表明，在人类体内存在的70个Rho交换因子中，全球环境基金VAV 2可能同时参与HNSCC和CSCC的肿瘤发生。该环境基金属于VAV家族，是一组GEFs(Vav1，VAV 2，VAV 3)，其交换活性受直接酪氨酸磷酸化事件的调节。19,20。为了支持VAV 2与这类肿瘤的联系，对人类HNSCC细胞株的研究表明，这种全球环境基金经常被酪氨酸磷酸化，并参与刺激大量询问细胞的表皮生长因子受体(EGFR)下游的RAC 1。11。此外，使用催化缺陷Vav2敲入小鼠已证明，抑制vv 2的酶活性会损害典型的致癌物7，12-二甲基苯(A)蒽(Dmba)单独或与肿瘤促进剂12-O-十四烷基佛波-13-乙酸酯(Tpa)联合使用时引起的乳头状瘤和cscc的形成。11。为了探讨这种可能性，我们首先分析了在硅技术中的表达。VAV 2CSCC和HNSCC患者的转录本。为此，我们查询了来自CSCC(GEO GSE 13355和GSE 45216)或HNSCC(GEO GSE 30784和TCGA)的四个独立基因表达数据集；详情请参阅两个补充表。1和“方法”部分)病人。在HNSCC病例中，TCGA采集的样本中含有(21%的病例)，而且没有关于HPV状况的信息。GEO GSE 30784缺乏关于HPV状况的信息，尽管HPV的百分比–样品估计在75%的范围内。21(补充表)1)。选择这些数据集是因为：(I)它们包含健康和肿瘤样本的表达数据。(2)它们至少包括100个样本(以便于生成统计上可靠的数据)。(3)它们包括有临床资料的样本(如不典型增生、肿瘤进展阶段等)。使用这种方法，我们发现VAV 2MRNA在人CSCC中持续上调(如图所示)。1A，左面板)和HNSCC(图1.1A，第二和第三面板从左)时，比较健康的组织样本。在hnscc中，hpv表达较高。−比人乳头瘤病毒+肿瘤(如图所示)。1A，左起第三个面板)。中度过度表达水平VAV 2转录本也发现在癌前条件，如皮肤光角化病(图一)。1A，左面板)和口腔表皮发育不良(图1。1A，左起第二个面板)。然而，VAV 2在银屑病患者的皮肤样本中，转录本不那么明显(如图所示)。1A，左面板)。老鼠Vav2MRNA也显示，随着cSCCs的进展，表达逐渐增加(如图所示)。1A当在现有的GSE 21264基因表达微阵列数据集中询问时(补充表)1)，表明这种基因在不同物种的SCCs中是保守的。我们没有观察到任何有统计学意义的上升Vav1，一种编码vAV家族成员的mrna，显示造血特异性表达模式。19,20,22，在任何一个前和肿瘤的阶段(补充图)。1A)。相反，Vav1在银屑病患者的样本中，mRNA确实显示了少量的，尽管在统计学上有显著的富集(补充图)。1A，左面板)。这些数据表明VAV 2MRNA水平可能是肿瘤细胞固有的，而不是询问样本中存在不同数量的浸润造血细胞的间接结果。综上所述，这些观察表明，VAV 2Mrna在cscc和hpv中经常过度表达。–HNSCCS.这是scc类型特有的，因为我们找不到VAV 2肺和子宫颈SCCs转录本(附图)1B，补充表1).

接下来我们调查了VAV 2转录本与疾病结局相关。我们将这些分析集中在HNSCC上，因为由于这些患者的生存率很高，所以没有关于CSCC的数据。23。为此，我们使用三个独立的基因表达数据集(TCGA、GEO GSE 41613和GEO GSE 42743，补充表)进行了硅分析。1)。之所以选择这些数据集是因为：(I)它们包含至少90例独立临床病例的信息。(Ii)他们有有关病人长期生存、HPV状况及其他临床标准的资料.这些分析表明，VAV 2MRNA与人乳头瘤病毒缺失直接相关−患者预后在这三个独立的数据集(图)。1B和S1c)。“公约”赋予的分层权力VAV 2在统计意义上，mRNA水平实际上要好于使用EGFR转录本的表达水平(如图所示)。1B一种酪氨酸激酶受体，由HNSCC中经常扩增的基因编码。1D)2。它也比被授予的级别更好。ACTL6A(补充图。1E(左面板)，一种编码hnscc原癌因子的转录本，在hpv之间的类似水平上被上调。+和HPV–肿瘤(附图)1F)8。不像ACTL6A(补充图。1E，两个左面板)，诊断能力VAV 2和EGFR当使用未按HPV状态分类的患者队列时，mRNA水平就会丢失(补充图)。1E，左起第三和第四面板)。进一步的多变量分析表明VAV 2MRNA水平与肿瘤分期、吸烟状况或治疗反应无统计学意义。

升华VAV 2MRNA与基因扩增事件无关(补充图)。1D)。它也是特定于VAV 2位点，因为两个基因的侧翼VAV 2基因(SARDH, BRD 3)在本研究中询问的人和小鼠肿瘤数据集中，未显示出任何一致的表达变异(补充图)。1g)。对泛癌数据的分析也表明：VAV 2在HNSCC病例中很少发生突变24,25,26(补充图。1D)。然而，值得注意的是，在这项工作中，这个位点被发现在口腔鳞状细胞癌的遗传性病例中以较高的变异率发生。27。在这些肿瘤中发现的反复功能增益突变(Vall)872Ile)的目标是位于最C端VAV 2 SH3(C-SH3)结构域的一个残基，这一区域曾被证明参与了分子内相互作用的形成，这些相互作用在没有酪氨酸磷酸化的情况下维持了所有Vav家族成员的抑制结构。28。这些结果表明VAV 2在特定SCC亚型中普遍上调。他们还指出，在HPV病例中，这种上调与预后不良有关。–HNSCC患者。

野生型vav2在hnscc中过表达

接下来，我们进行免疫沉淀分析，以监测83人乳头瘤病毒细胞提取物中VAV 2的水平。–HNSCC患者样本。作为对照，我们包括从同一患者的肿瘤附近的健康组织中提取的裂解物。我们发现VAV 2在肿瘤组织中的表达水平明显高于健康组织(如图所示)。2A，b)。进一步的Westernblot分析表明，内源性VAV 2在这些样品中也是酪氨酸磷酸化的(如图1所示)。2A，c)。除了用Bradford方法估算组织提取物中的蛋白质含量外，还用SDS-PAGE凝胶对用于免疫沉淀分析的组织裂解物中的总蛋白含量进行了重新检测，并在转到硝化棉滤膜后用Ponceau S溶液对分离的蛋白质进行染色(图1)。2A)。我们还发现，在232例独立病例中，有41.8%和14.7%的人乳头瘤病毒阳性(96.55%)。–在接受调查的HNSCC样本中，VAV 2的表达水平分别为中等到高水平(如图所示)。二维空间)。这种表达集中在癌细胞中，而不是周围的基质成分中(如图所示)。二维空间)，进一步证明VAV 2的上调是癌细胞内的一种现象。VAV 2染色与患者组的分化程度无明显相关性(P < 0.86). Nevertheless, it is worth mentioning that VAV2 staining was consistently absent in all terminal differentiation areas of the samples (e.g., keratin pearls) even in the case of VAV2-positive tumors (Fig. 2E、星号)。

上述免疫组织化学研究还显示，VAV 2在正常口腔上皮的基底层而非分化层中检测到(图1)。2F，左面板)。然而，我们发现VAV 2的免疫反应在显示异型增生组织学征象的标本中扩展到基底上细胞层(见图)。2F，右面板)。在上述病例中发现的免疫反应水平低于在肿瘤中检测到的免疫反应水平(如图所示)。2D，e)。优先表达VAV 2在皮肤中观察到角质形成细胞前体的mRNA及其在更成熟的衍生物中的下调。2G)。相比之下，分化相关的转录本显示预期的上调，因为这些细胞前体逐渐产生一个更成熟的后代(图一)。2G)。这些结果进一步表明，与正常和异型增生组织相比，相当数量的HNSCC患者VAV 2水平明显升高。

VAV 2在小鼠表皮中促进肿瘤发生的小生境

为了研究上调VAV 2信号在原代上皮细胞中的作用，我们首先使用了前面描述的Vav2ONC/ONC表达该蛋白突变版本的功能增益敲入菌株(Δ1-186，以下称为vve 2)。ONC)。这种蛋白表现出全环基金的活性，因为去除了N端抑制区，这些抑制区与c-sh3在没有酪氨酸磷酸化的情况下保持Vav家族蛋白的非活性状态。28,29。因此，此活动版本的活动必须反映vv 2的输出。威汤哥在最佳酪氨酸磷酸化条件下，根据Vav家族蛋白的当前调控模型19,20,30。重要的是，Vav2ONC从内源位点表达，因此，表现出与内源野生型(WT)对应物相同的表达模式和表达水平。29。对这些小鼠的分析表明，皮肤、腭和舌的表皮层存在广泛的增生(图一)。3A，b)。这种表型与未成熟和高度增殖的角朊细胞前体(角蛋白5和6阳性)构成的细胞层的增加有关。3C)。所有病例均观察到角质层。3A，c)，表示Vav2ONC延迟但不减弱角质形成细胞的终末分化。在皮肤的情况下，我们也观察到频繁的皮肤发育不良病例(图一)。3A，顶板)。

我们没有发现肿瘤发生在Vav2的皮肤或头颈部。ONC/ONC小鼠即使经过长时间(12个月)。然而，我们确实观察到，这些小鼠生长的皮肤肿瘤具有更快的动力学(图一)。三维空间)，具有较高的多重性(图1.3E)，而且尺寸更大(如图所示)。3F)在新生儿阶段接受单一主题DMBA管理的对照。这些肿瘤的恶性进展也加快了，从发现的cscc的百分比增加推断。Vav2ONC/ONC老鼠(图1.第三代和补充图。2)。这些结果表明，上调的Vav2信号创造了一个前再生利基，有利于完全的表皮转化时，结合额外的遗传损伤。

Vav2在表皮中的作用是角质形成细胞自主的。

由于增生是由上皮细胞内、外因素共同作用的结果，因此我们进一步研究了上调Vve 2信号在原代小鼠和人角质形成细胞中的直接作用。为此，我们比较了从新生儿皮肤中获得角质形成细胞的能力。Vav2ONC/ONC在有机三维培养中形成表皮样结构的小鼠。4A)。与小鼠实验结果相似，我们发现新生的角质形成细胞Vav2ONC/ONC与WT细胞相比，小鼠的表皮厚度更厚，增殖能力更强(如图所示)。4A，b和补充图。3A)。为了评估这种表型的系统发育保守性，我们接下来用永生化的人角质形成细胞进行了类似的有机实验。ONC。与对照组相比，这些细胞也形成了更厚、更多的增殖层。4C，d和补充图。3A，b)。与小鼠原代角质形成细胞一样，表皮是由人角质形成细胞体外表达Vav2而形成的。ONC其特征是高度未分化的角质形成细胞层的扩张，当到达上皮的最外层时，这些细胞仍然保持最终分化的能力(如图所示)。4C、底部面板)。这种表型在Vav2的催化死版中丢失。ONCE200A突变体(E200A突变体)在人角质形成细胞(补充图)中是异位表达的。3B还有无花果。4C，d)，表明Vav2通过一种催化依赖性机制触发上皮增生。

为了鉴定Rho GTPase下游参与这一过程，我们进行了G-ELISA检测GTP负载(活性)状态的内源性rac1，RhoA和Cdc 42在小鼠和人角质形成细胞以上使用。作为阳性对照，我们使用稳定表达Rac 1(F28L突变体)、RhoA(F30L突变体)和Cdc 42(F28L突变体)突变体的人角质形成细胞衍生物。3C)。在没有上游刺激的情况下，由于gdp/gtp交换的内在速率高，这些突变蛋白表现出本构活性。31。我们观察到两者的内源性(图)。4E，左面板)和外生表达(图1)。4E(右面板)Vav2ONC蛋白质分别在小鼠和人角质形成细胞中触发Rac 1和RhoA的刺激。然而，我们并没有发现内源性Ccd 42的GTP水平有统计学意义的升高(图二)。4E，右面板)。作为对照，表达GTPase突变蛋白的细胞系表现出较高的GTP活性。4E，右面板)。与此一致，我们观察到人角质形成细胞表达racc 1。F28L并且，在较小程度上，其他构成性激活的Rho GTPases在3D培养中测试时会引起一种增殖反应(图1)。4F，g)。这种反应在角朊细胞共同表达racc 1时更明显。F28L和罗亚F30L(无花果)4F，g和补充图。三维空间)。与Vav2的情况一样ONC-表达细胞(图1.4A，c)，这种表型与角质形成细胞增殖和未分化层的数量增加有关(如图所示)。4H)。根据Rac 1和RhoA在这一过程中的含义，我们发现由体外表达的Vav2引起的上皮增生。ONC可以被著名的Rac 1(PAK激酶)和RhoA(岩石激酶)通路下游元件的抑制剂阻断(补充图)。3E，f)10。这些结果表明，Vav2引发的生物效应ONC表皮具有角质形成细胞的自主性和催化依赖性。

Vav2控制角质形成细胞的原癌和干细胞样程序。

接下来，我们使用WT和Wt的表皮样本进行微阵列分析。Vav2ONC/ONC小鼠获取与表皮中Vav2信号上调相关的生物程序的信息。我们共发现了2,153个探针集(1,881个基因)，它们的表达在Vav2ONC/ONC小鼠(补充数据)1)。有趣的是，≈37.4%和40.5%的上调和下调亚组(以下称为“冗余转录组”)显示出与前面描述的皮肤反应中的调节相反的调节。Vav2–/–;Vav3–/–小鼠对肿瘤启动子12-O-十四烷基佛波-13-乙酸酯(TPA)的影响17(补充图。4，补充表2)。这表明，在皮肤肿瘤发生的促进阶段，tpa诱导的转录组的很大一部分也可以由vve 2触发。ONC以信号自主的方式。功能注释分析显示，这些基因表达变化与Vav2ONC/ONC老鼠，包括解除与增殖和表皮分化相关的基因的管制(图)。5A)。基因集富集分析(GSEA)的使用证实了上述程序，此外，进一步强调了Vav2信号增强对角质形成细胞整体分化程序的影响。这些效应包括表皮分化后期的基因信号的下调和上调，以及表皮细胞祖细胞相关程序(图1)。5B，分别为上面板)。也许更重要的是，我们在Vav2中发现了与cscc肿瘤起始细胞和胚胎干细胞相关的基因信号的富集。ONC-诱导转录组。5B、底部面板)。未发现与正常毛囊干细胞转录相关的显著重叠，表明Vav2ONC引发异常脱分化过程更类似于一般的干细胞，而不是那些在最未分化的皮肤前驱物中发现的。在诱导增殖和干细胞样程序结合的过程中，我们发现表皮Vav2ONC/ONC与对照动物的皮肤相比，小鼠对单一剂量的TPA有更快和更广泛的增殖反应(图1)。5C)。我们还观察到新生儿的原始角质形成细胞瓦夫2ONC/ONC小鼠转染Yamanaka‘s鸡尾酒后，产生的诱导多能干细胞(IPS)细胞集落数高于WT相应的细胞集落(如图所示)。5D)。这些观察表明，Vav2信号的上调会导致干细胞样的再生增殖和角质形成细胞分化的延迟，这可能是导致表皮增生的原因之一。Vav2ONC/ONC老鼠。

与表皮的成瘤状态一致Vav2ONC/ONC小鼠，生物信息学分析显示Vav2ONC-相关转录组与小鼠乳头状瘤和CSCC中的基因表达程序有很大程度的重叠(如图所示)。5E，左面板)，人CSCC(图1.5E，中面板)，人HNSCCs(图1.5E，右面板)，人口腔表皮发育不良(图1)。5E，右面板)。相反，GSEAs证实转移性HNSCC患者源性细胞和小鼠cSCCs的基因特征富集。5F)。综上所述，这些结果表明Vav2信号的上调与表皮前驱未分化再生的形成有关，表皮前驱具有许多生物学和转录特征，鳞状上皮肿瘤起源于皮肤、头颈部。

Vav2的监管要素ONC转录组

接下来，我们进一步进行了硅分析，以获得有关调控Vav2的远端转录因子的线索。ONC-依赖基因表达程序。我们发现该转录组的上调基因在AP1家族、c-Myc、E2F、Nfy和tead的结合位点中富集。6a，b)。相比之下，下调的基因似乎受到不同转录因子的调控，如MITF、MEF 2、FoxO和RXRα(图1)。6a，b)。与这些数据一致的是，GSEAs证明了vve 2中先前与这些因素相关的基因签名的存在。ONC-依赖型转录体(附图)5A).

鉴于在生物学和治疗系统中，上调基因比下调基因更容易被篡改，我们决定将验证研究的重点放在Vav2的上调基因子集相关的转录因子上。ONC-依赖转录体。通过免疫组织化学分析，我们证实c-fos(ap1家族成员)、c-myc、cyclin d1(作为e2f家族蛋白活性的代用品)和yap在表皮中均有上调和核定位。Vav2ONC/ONC老鼠(图1.6C，左边的两列面板)。用免疫组织化学方法对两只小鼠的组织培养物进行了表皮切片的免疫组织化学实验，获得了类似的结果。Vav2ONC/ONC(无花果)6C，左边的第三组和第四组列板)和Vav2ONC-表达人类(如图所示)。6C，其余的面板)角质形成细胞。我们还发现角质形成细胞形成的表皮中有较高水平的c-Fos、c-Myc和yap，这些表皮细胞外生共同表达Rac 1和RhoA的活性版本(图1)。6d)。这些免疫组织化学实验的定量显示在补充图中。5B.

每种抗体所获得的免疫反应信号在Vv 2中总是表现出更高的强度。ONC在对照组中的样本，表明它们不仅仅是增殖细胞层扩张的结果，这些细胞层已经包含了非常高水平的这些转录因子的激活。与此相一致，我们还观察到c-Fos、c-Myc和YAP的免疫反应在有机型培养的上层检测到，而Cyclin D1则为阴性。6C)和Ki 67(无花果)。4C)。进一步证实这些因素的刺激是Vav2直接下游信号转导的结果。ONC我们用荧光素酶报告试验研究了该基因激活版的瞬时表达是否能促进这些转录因子在二维角质形成细胞培养中的刺激。与有机型数据一致，我们发现了Vav2的瞬时表达。ONC导致刺激转录活性的内源性AP1因子(图一)。6E)，c-MYC(图1.6f)，E2F蛋白。6g)，以及YAP/TAZ/TEAD复合体(图1.六小时)。当使用催化死汽时，这些效应会严重减少。ONC+E200A蛋白质(图1.6E至h)。免疫印迹分析证实了在这些实验中使用的异位表达蛋白的正确表达(图)。6I)。这些数据表明Vav2ONC以一种依赖催化和信号传递的方式刺激所有这些转录因子.

进一步将Vav2与这些因素的刺激联系起来，我们在硅分析中观察到众所周知的c-MYC-(图1)的表达。6J)和YAP/TAZ/tead-Regulated(图1.6K)基因签名与基因的丰度成正比。VAV 2人CSCC和HPV的转录本–HNSCC患者样本。相互关系VAV 2转录水平和c-MYC-。6J，右下角面板)和YAP/TAZ-调节(如图所示。6K(右下角)在大多数情况下，当hnscc样本不按HPV状态分层时，基因标记就会丢失，进一步将此vv 2连接起来。ONC-人类乳头瘤病毒驱动的病理生物学程序–肿瘤病例。

Vav2诱导的增生具有c-myc-和yap-依赖性。

鉴于上述结果，我们接下来研究了c-myc和yap/taz在vve 2诱发的增生中的潜在意义。ONC和Rac 1F28L+RhoAF30L用药理学的方法。为此，我们选择了c-MYC(10058-F4)和YAP(脊椎动物鳍)的抑制剂浓度，这些抑制剂在三维培养中不会对对照细胞的生长和分化造成明显的干扰(图一)。7A，顶板；图1.7b)。通过这一策略，我们期望发现与VAV2-GTPase信号轴在这些细胞中激发的功能增益事件特别相关的漏洞。我们发现c-myc的抑制作用阻断了vav2诱导的表皮增生。ONC-和Rac 1F28L+RhoAF30L-表达角质形成细胞(图1.7A，比较面板的左列和中列；如图所示。7b)。这种效果类似于这些有机培养物与Pak和Rock抑制剂孵育所产生的效果(见上文，补充图)。3E，f)。我们没有发现任何组织学迹象的细胞分化(图)。7A)，提示c-MYC的抑制作用优先影响这些细胞的增殖。因此，由Vav2形成的表皮。ONC-和Rac 1F28L+RhoAF30L-在这些条件下表达的角质形成细胞与正常的、模拟的细胞产生的非常相似(如图所示)。7a，b)。Yap抑制剂的加入并不能阻断Vav2所显示的增生。ONC-表达细胞。然而，它确实促进了所有未成熟的角质形成细胞层的分化，但却是最基础的一层。7A，从左边比较面板的第一列和第三列；如图所示。7b)。说明YAP/TAZ/TEAD复合物主要参与维持基底上细胞层的未分化表型。为了证明上述抑制剂对预期靶点的抑制作用，我们评估了c-myc和yap/taz/tead在人角质形成细胞2D培养物中的转录活性。ONC版本加荧光素酶报告质粒，分别含有c-MYC或tead反应启动子.我们观察到，10058-F4的加入使基底和Vav2都有阻滞。ONC-驱动这些细胞内的MYC活性(见图)。7C，左面板)。另一方面，Verterporfin减少了基础和Vv 2。ONC-在这些培养条件下触发TEAD的转录活性(如图所示)。7C，右面板)。以前曾发现，Yap/TAZ/tead的激活和失活分别促进和阻断上皮增生。3,4,5。然而，依赖于所使用的实验环境，c-myc与角质形成细胞的再生增殖或终末分化有关。7。我们发现c-MYC在人角质形成细胞中的稳定异位表达与后一种作用机制和我们目前工作中的数据一致(图1)。7D)引发Vav2ONC-三维有机培养中的类表型(图1)。7E)。这些结果表明c-MYC和YAP/TAZ/TEAD复合物是VAV 2通路中促进上皮细胞获得SCC样分子特征的关键远端元件。

野生型VAV 2触发角质形成细胞增生

考虑到VAV 2的过表达威汤哥是hnscc中最常见的事件，接下来我们将研究该蛋白的全长版本的过度表达是否会引发vve 2。ONC-非转化角质形成细胞的类表型。为此，我们产生了两个独立的人类角质形成细胞池，表达高水平的异位表达的Vav2。威汤哥(无花果)8A)。免疫沉淀实验表明该蛋白是酪氨酸磷酸化的。8B它与这些细胞中的一个大分子量酪氨酸磷酸化蛋白共沉淀(如图所示)。8B、星号)。根据先前的研究结果，该蛋白很可能与自磷酸化的EGFR相对应。32,33。作为对照，我们在这些实验中包括了先前描述的表达vv 2的人类角质形成细胞池。ONC或者催化死亡的Vav2ONC+E200A突变蛋白8A)。我们观察到角质形成细胞在体外表达Vav2。威汤哥当在有机培养中测试时，会产生比对照细胞更厚的上皮层(图)。8C，d)。然而，这种表型比Vav2所显示的要温和。ONC-表达细胞(图1.8C，d)。与以前的数据一致(如图所示)。4B，d)，表达Vav2的角质形成细胞ONC+E200A生成类似于对照组的上皮结构(图)。8C，d)。这些结果表明，在CSCC和HNSCCs中普遍发现的蛋白版本--全长Vav2的过度表达(见上图，图2)。1和2，补充图。1)，当人角质形成细胞过度表达时，也会促进上皮增生。

内源性VAV 2威汤哥用于HNSCC的维护

在证明Vav2活性与正常角质形成细胞的再生增殖和细胞未分化状态有关的基础上，我们进一步研究了VAV 2在已经转化的HNSCC细胞中是否也是维持这些特性的重要因素。为此，我们击倒了内生性VAV 2在广泛应用的HNSCC细胞系(SSC-25)中使用几个独立的shRNAs的转录本34两人乳头状瘤病毒–两例独立口腔鳞状细胞癌(vdH 01，vdH 15)35。不同于SCC-25细胞以前的特点(补充图.)6A-c)36，VdH 01和VdH 15细胞的基因组改变尚不清楚。正因如此，我们通过下一代测序(补充说明)对两个患者来源细胞的全基因组进行了表征。1，补充图。6和补充参考资料)。在有机型培养中，我们观察到所有带有空慢病毒载体(称为pLKO细胞)的对照细胞在所有情况下都形成由高度增殖(Ki 67)组成的非结构肿瘤团。+)和未分化(角蛋白14+、雪莲–)细胞层根据免疫组织化学染色。9A)。相反，VAV 2击倒细胞(附图)7)在同样的条件下产生更薄更多的上皮样结构。9A和补充图。8A在某些情况下(例如，VHd 15细胞)甚至可以形成角质层(图1)。9A)。然而，与正常的角质形成细胞不同，在后一层细胞形成过程中，敲除细胞不能正常地去核(如图所示)。9A)。有机文化VAV 2击倒细胞也显示Ki 67减少。+由分化的雪莲组成的上层细胞层的水平和存在+细胞(图1.9A和补充图。8B)。分析VAV 2在体内击倒患者来源的细胞，我们将它们移植到Vav1–/–;Vav2–/–;Vav3–/–老鼠。因为这些老鼠是淋巴管减少症37,38在我们自己的动物设施中产生的，它们代表了一种廉价的替代使用商业免疫缺陷小鼠品系，通常用于这种类型的实验。使用这个模型，我们发现hnscc患者来源的细胞具有VAV 2ShRNA显示两种肿瘤的发生都减少了(如图所示)。9B，c)和转移。9d)与控制相比较时的潜力。有趣的是，我们还观察到VAV 2敲除细胞经历角质化和分化的过程，没有适当的去核，类似于在有机型培养中发现的那样(如图所示)。9E)。这些结果表明，内源性的消除VAV 2在HNSCC细胞中，VAV 2信号在原代、非转化角质形成细胞中的作用与VAV 2信号上调的作用相反。与此相一致，我们观察到内源性c-myc、yap/taz/tead、ap1和e2f转录因子的转录活性在VAV 2将患者来源的细胞和SSC-25细胞与相应的对照组进行比较(图1)。9F)。同样，这些细胞产生的三维结构显示出较低的c-MYC(补充图).8C，上面板)，YAP(附图)。8C，中间面板)和c-fos(补充图.)8C，底部面板)免疫反应比对照组。这三种转录因子在异种移植瘤中的表达也得到了类似的结果(如图所示)。9g，h和补充图。8D)。进一步证明了vav2催化依赖于hnscc致瘤性的途径的重要性，我们观察到加入化学抑制剂的RAC 1(1a116)。39、c-MYC和YAP促进VAV 2在VdH 15细胞的有机型培养中加入类似敲除的表型(附图)。9)。连同为Vav2所发现的守恒ONC-HNSCC患者的调控基因标记(图1)。5E，f表明内源性VAV 2在维持HNSCC细胞增殖和分化状态中起重要作用。

Vav2的预后价值ONC-受调控的基因签名

上述数据，再加上由以下级别所显示的预测能力VAV 2HNSCC患者的mRNA转录本1B)，建议Vav2ONC-调控基因表达前景可用于为这种肿瘤类型开发更好的预后工具。与这一假设相一致，我们发现利用生物信息学技术，整个Vav2的表达水平。ONC-依赖转录组(补充数据)1)与人类乳头瘤病毒(HPV)不良有关–HNSCC患者预后(图一)10A)。这是在三个独立的数据集中观察到的，这些数据集被选择用于硅的研究(GSE 41613[P=0.0092，图1。10A]、TCGA[P=0.0068]和GSE 42743[P=0.0361]。基于这些观察，我们的目的是确定一个最小的基因标志，可以预测这些病人的长期生存。作为朝这个方向迈出的第一步，我们开发了第一代Vav2。ONC基因标记(Vav2)ONC-Sig)，由减少的数目(187)的人性化探测装置组成(图1)。10b暗红色区域3)符合以下先验标准：(1)Vav2在统计上意义重大的放松管制ONC-表达小鼠表皮，并与WT小鼠的表皮进行比较。(Ii)规例的相反模式Vav2ONC表皮和TPA刺激的皮肤Vav2–/–;Vav3–/–动物(附图)4、图1.10b，及补充表2以确保它们以完全自主的方式被内源性Vav2蛋白所调控)。(3)在使用人类肿瘤与健康组织样本时，类似的放松管制模式(图五)。5E、F和10b以确保这种放松管制在不同物种之间得到保护)。与其与VAV 2通路的关系相一致，Vv 2的表达水平也是一致的。ONC-Sig与VAV 2HPV转录本–HNSCC样本(图1.10C)。我们还通过主成分分析证明了Vav2的表达式。ONC-这些肿瘤中的Sig并不是由大多数肿瘤过程中常见的程序间接引起的。9,40。因此，这一特征显示，在人类CSCC，HNSCC，光化角化病病例中有一种特殊的富集(如图所示)。10d，面积浅红色)和数量非常有限的非小细胞肺癌(图一。10d，蓝点)。相反，在银屑病样本中没有发现它。10d，面积呈浅棕色)，大部分非小细胞肺癌患者样本(图一)。10d、浅蓝色区域)，与T细胞急性淋巴细胞白血病等无关的肿瘤(图一)。10d，阴影为浅绿色)。在使用GSE 41613基因表达数据集进行预测测试时，我们观察到Vav2ONC-Sig可以将HPV分层–根据长期生存标准，HNSCC患者具有更好的分辨力(图)。10E, P=2.4×10–4)比富饶的VAV 2MRNA(图1.1B, P=0.0079)和整个Vav2ONC-调控转录组(图1.10A, P=0.0092)。人类乳头瘤病毒(Hpv)的队列也发现了类似的结果。–TCGA的HNSCC患者(P=0.0068)和GSE 42743(P=0.036)数据集。根据这些信息，我们接下来生成了第二代，最小Vv 2。ONCVav2基因标记(MVGS)ONC-SIG采用Cox比例风险回归模型。这个MVGS，只包含47个探针集(对应于41个独立的Vav2)。ONC-调控基因，补充表4)，比前面的基因标记更能预测hpv的长期存活。–患者包含在GSE 41613(图)。10F，左面板)，TCGA(图1.10F，第二个面板从左)和在GSE 42743(图4。10F，左边的第三个面板)数据集。在这种情况下，这一特征也可以分层的TCGA患者的整个队列，而不是细分为HPV状态(图一)。10F，右面板)。然而，在后一种情况下，高、低风险人群的中位生存期的差异要比hpv小得多。–病人队列(图)。10F，将右面板与其他图形进行比较)。这一结果进一步表明，VAV 2依赖的病理生物学程序主要与hpv有关。–肿瘤恶性。

讨论

临床和泛癌数据支持这样的观点，即干细胞样再生增殖和细胞分化的延迟会导致SCCs的恶性，可能还会导致其他类型的癌症。1,41,42,43,44。这些特征可以通过肿瘤内干细胞数量的扩大和/或肿瘤细胞的去分化来激发。在CSCC和HNSCC中，由于起源于这些肿瘤的细胞类型的固有生物学特性，这一过程可能更具有可塑性。例如，据目前所知，在特定的生理条件下，毛囊干细胞与分化程度较高的上皮细胞之间以及基底角朊细胞与上基底层角质形成细胞之间存在双向转换。45,46。不幸的是，我们仍然对这些恶性特征产生的分子和信号事件有很浅的了解，因此，我们还对如何在治疗层面上有效地处理这些特性有着很深的了解。在这项工作中，我们已经证明Rho全球环境基金VAV 2是来自不同解剖位置的角质形成细胞这些过程的共同驱动因素。与此相一致，我们已经证明，VAV 2催化活性的上调促进了一种增殖表型的发展，这种表型与额外的遗传损伤结合在一起，促进肿瘤的发展和进展。也许更重要的是，我们观察到，在这两种HPV中，维持这些恶性特征需要内源性VAV 2。–HNSCC患者来源的细胞和建立的HNSCC细胞株。这些作用与刺激许多转录因子(ap1，c-myc，e2f，nfy，tead)有关，这些转录因子协同作用于协调这类肿瘤中与干细胞样再生增殖和细胞分化延迟相关的基因表达变化。1,2,43,44,47,48。我们的得失功能实验证实了VAV 2活性与这些转录因子在增生上皮和患者源性细胞中的表达之间的功能相关性。他们还证明他们的刺激是Vav2的直接下游效应。ONC与催化有关的信号。这些发现以及最近的观察表明，RAC 1的缺失恢复了对HNSCC细胞的化疗和放射敏感性。12表明抑制该全环基金的酶活性可能是一种潜在的治疗途径，在很大比例的SCCs。在同意这种可能性的情况下，我们最近使用了Vav2一种催化亚纯Vv 2突变体(L332A)的表达对dmba和dmba+tpa诱导的皮肤肿瘤发展的影响18.

进一步支持它对CSCC和HNSCC肿瘤发生的贡献，我们观察到VAV 2和HNSCC的丰度。VAV 2其中一些肿瘤的转录本变得更加严重。水平VAV 2成绩单和Vav2ONC-驱动的基因标记也与HPV的不良预后相关。–HNSCC患者。这些结果表明，大约30%的癌症患者可以根据这些分子特征进行不同的分层。这一比例与真正的hnscc基因改变患者的比例相当，甚至高于其他患者，如EGFR、kras、act l6a和c-myc。1,2。然而，与这些情况不同的是，VAV 2通路的解除与基因位点特异性的改变无关。这些肿瘤中VAV 2异常上调的分子基础仍有待解决。可能的解释包括超增强子的扩增和转录因子的假激活。49。与mRNA翻译增加相关的过程也可能参与VAV 2信号的上调。这种可能性与在3‘未翻译的区域的存在是一致的。VAV 2两种细胞质多腺苷化元件的mRNA表达通常与提高翻译效率有关50。最后，它可能是一种积极反馈机制的产物，在这种机制中，VAV 2在正常基底上皮细胞中的正常表达随着转化过程的进行而进一步放大。在任何情况下，这种失调似乎是相当具体的，因为基因的表达位于VAV 2在本工作中分析的肿瘤表达数据集中，不显示任何异常调控。VAV 2根据cBioPortal存档的癌症基因组数据，hnscc很少发生突变。24,25,26表明WT蛋白的过度表达将是该途径在该肿瘤类型中发现的最相关的解除管制类型。与此相一致，我们发现人类角质形成细胞在体外表达vv 2。威汤哥当在有机培养中测试时，也能产生增生上皮。相反，消除高表达的内源性VAV 2蛋白对HPV的转化潜力有负面影响。–HNSCC患者源性细胞。值得注意的是，最近的一项研究发现，VAV 2家族性口腔鳞癌27。得到的结果Vav2ONC/ONC在本研究中，小鼠品系提示这一功能的增益。VAV 2突变，再加上其他基因的改变，应该有助于这种类型的遗传性癌症的病因。此外，他们提供了一个病理生物学框架，以了解突变VAV 2对这种罕见的遗传性癌症的贡献。

虽然CSCC和HNSCC与其他SCC有许多共同的分子生物学和病理生物学特征。1,2,9,40,51，我们没有发现任何公开解除管制的VAV 2在其他地方的SCCs中的表达。同样，Vav2ONC本工作中描述的由基因驱动的诊断基因标记仅在一小部分非小细胞肺癌患者中保守(图1)。10d)。这种特殊性的原因可能有几个方面。它可能代表了一种机制来优化地刺激yap/taz/tead复合体，因为这种转录复合体的激活是以一种与河马无关的方式在这种类型的上皮细胞中发生的。3。另外，它可能是一种适应性的解决方案，以促进jnk的慢性、rac 1依赖性激活，有助于克服在这些细胞中特异运作的基于终末分化的抑癌机制。52,53。支持此视图，则表示Vav2ONC并不能诱导上皮细胞的终末分化，这是以前在磷脂酰肌醇3-激酶α的表达中发现的。52。然而，其他SCCs也有可能利用多余的病理生物学程序，从而使VAV 2信号的上调变得不必要。需要进一步研究这些可能性。

对Rho GEFs和GTPases在癌症中的作用的充分理解，在历史上一直被以细胞生物学为中心的关于它们在细胞骨架调控中的作用的观点所劫持。然而，最近从动物模型、全基因组表达分析和泛癌项目中收集到的数据开始说明这些蛋白质在肿瘤促进和抑制中的新作用，在某些情况下这是相当出乎意料的作用。10,54。这一综合方法有助于识别VAV 2依赖于本报告的程序。我们对基因表达数据的硅分析也表明，除了VAV 2之外，另外四个Rho GEFs可能在CSCC和HNSCC中都发挥着促肿瘤作用。在不久的将来，研究这些额外的Rho全球环境基金家族成员在这些肿瘤中的具体作用将是很有趣的。鉴于VAV 2单次失活的结果，我们假设这些额外的GEFs将在这些肿瘤中发挥非冗余功能。在这里使用的实验方法也可以用于精确地指出任何肿瘤类型的治疗感兴趣的Rho信号元件，并具有更合理和病人导向的先验基础。

人肿瘤基因表达数据的硅分析

本研究中使用的所有基因表达数据都在补充表中详细列出。1。主要文本描述了选择用于差异表达式分析的表达式数据集的理由。具体而言，GEO数据集GSE 45216和GSE 13355(人类CSCC，n=220个样本)58,59、GSE 30784(人类HNSCC，n=229个样本)21、GSE 21264(鼠标CSCC，n=273个样本)60和TCGA HNSCC数据集(n=573个样本)24被用来审问VAV 2MRNA表达水平(为此目的使用0到1的表达式值规范化)。其他数据集包括TCGA Cesc(n=319)61和LUSC(n=824)62，以及GEO T-所有数据集GSE 26713(n=117；用于图中。10)63。R(Version3.5.1)和Perl程序分别进行统计分析和最终文本处理。通过稳健多芯片平均(RMA)，从CEL文件中获取微阵列数据的信号强度值。差异表达的基因被用于微阵列数据的线性模型(Limma)。64。调整后P应用本雅明-霍奇伯格校正法(错误发现率，FDR)计算多重比较值.应用TCGAbiolinks R软件包对头颈部、子宫颈和肺鳞癌TCGA数据集进行分析。65。当数据被分析为多个批次(GSE 45216和GSE 13355)时，使用frma消除批处理效果。66。根据GSE 41613所示转录本的表达水平，用Kaplan-Meier估计法进行总体生存分析。n=97个样本)67、GSE 42743(n=103)67，以及TCGA(见上文)HNSCC数据集。每种转录本的表达分布中位数用于建立低表达组和高表达组，然后应用Mantel-Cox检验统计验证其生存分布之间的差异。

人肿瘤标本HPV状态的测定

HPV检测采用p16免疫组化法、高危hpv DNA原位杂交法和gp5基因分型法。+/GP6+聚合酶链反应68。在第一例中，组织微阵列被切成3μm切片，并在Flex IHC显微镜下进行干燥(DAKOCytomation)。免疫组织化学染色工作站(DAKO自动染色工作站，DAKOCytomation)，Envision系统和二氨基联苯胺显色剂为底物。主要抗体为p53(Do-7克隆，DAKO)和p16(克隆E6H4(Roche MTM实验室AG))。在第二例中，我们进行了生物素化原位杂交。人类乳头瘤病毒根据制造商的指示，针对HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68(达科细胞瘤)的DNA探针。这两种技术的结果总是由两个独立的病理学家来评估。在后一种情况下，从肿瘤标本中分离出的dna接受gp5。+/6+-用酶免疫分析法检测14种高危型HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68亚型。随后在Luminex平台上使用基于珠的阵列对感染进行基因分型。当gp 51=61 PCR阳性时，使用位于E7基因68.

免疫沉淀实验

健康的粘膜，当包括在实验中，从相同的HNSCC患者获得(因此，他们被分配相同的识别号码如图所示。2A)。肿瘤和健康组织(补充表)5在RIPA缓冲液(10 mm Tris-HCl[pH8.0]，150 mm NaCl，1%Triton X-100(Sigma-Aldrich，Catalog No.)X 100)，1毫米钠3Vo4(Sigma-Aldrich，目录编号。S 6508)，1毫米NAF(西格玛-奥尔德里奇，目录编号。和蛋白酶抑制剂(C mplete；Roche，Catalog No.11836145001)的混合物，使用温和的MACS解离器(Miltenyi Biotec，Catalog No.130-093-235)和gentleMACS M管(Myltenyi Biotec，Catalog No.130-096-335)。提取液经13,200 rpm离心，4°C离心10 min后，用Bradford反应(Bio-Rad，Catalog No.5000006)测定上清液中蛋白质浓度。4 0 0μg蛋白提取物在5 0 0μ1的RIPA缓冲液中与自制Vav2抗体(实验室编号5 80-2)的1.5μ1在4°C旋转轮中孵育2h。用Gammabind G-Sepharose微球(GE Healthcare，Catalog No.)的35μ1收集免疫复合物.在50%浓度下，在4°C的旋转轮中再放置2h。经4°C裂解缓冲液3次洗涤后，再悬浮于SDS-PAGE缓冲液中，煮沸5 min后，用iBlot干印迹系统(Thermo Fisher Science，Catalog No.)转入硝化棉滤池。IB21001)。5%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Catalog No.A 7906)在TBS-T(25 mm Tris-HCl(pH 8.0)，150 mm NaCl，0.1%吐温-20(Sigma-Aldrich，目录编号)中.(P 7949))至少1小时，然后在4°C下用Vav2抗体(1：1000稀释度，见上文)在夜间孵育。剥离后，使用相同的过滤器进行第二次westernblot分析，使用抗磷酪氨酸残基的抗体(1：1000稀释度；Santa Cruz生物技术，目录编号)。(SC-7020)。经TBS-T三次冲洗去除原抗体后，在室温下与合适的二次抗体(1：5000稀释度，GE Healthcare)孵育30 min。免疫反应带是用标准化学发光法开发的(热费舍尔科学，目录编号32106)。用ImageJ软件(NIH，Www.imagej.nih.gov).

除蛋白质定量外，在SDS-PAGE凝胶免疫沉淀实验中对各组织裂解液中的总蛋白含量进行了测定，并将其转移到硝化纤维素滤膜上，用Ponceau S溶液(Sigma-Aldrich，Catalog No.)进行染色。(P 7170)。

在角质形成细胞培养中，成倍生长的细胞用磷酸盐缓冲液冲洗，用1ml的RIPA缓冲液加C mplete溶解。将细胞提取物保存在冰上5 min，然后在4°C下以13,200 rpm离心10 min，以消除细胞碎片。蛋白定量后，将裂解液与自制抗Vav2抗体的1.5μ1孵育，按上述方法处理。

细胞总提取物的Westernblotting分析

在组织提取物的情况下，样品被转移到RIPA缓冲液和机械均化使用温和MACS解离器。在培养的角质形成细胞中，用冷冻磷酸盐缓冲液冲洗细胞，然后在4°C的RIPA缓冲液中直接溶解，提取液在4℃下离心13,200 rpm离心10 min，在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸变性，电泳分离，用iBlot干斑点系统转移到硝化棉滤池中。按上述方法阻断膜，然后在4℃下用适当的Vav2(1：1000稀释度，自制)、GFP(1：5,000稀释度；Covance，目录编号)的抗体孵育一夜。MMS-118 p，血凝素(HA)表位(1：1,000稀释；细胞信号传递，目录编号3724)，RAC 1(1：1,000稀释；BD生物科学，目录编号610651)，RhoA(1：1,000稀释；细胞信号传递，目录编号2117)，Cdc 42(1：1,000稀释；Santa Cruz生物技术，目录编号：No.SC-87，c-Myc(1：1,000稀释；Merck，目录编号06-340)和微管蛋白α(1：2,000稀释；CalBiochem，目录编号：.(CP 06)。用TBS-T三次冲洗去除原抗体后，可见上述免疫反应带。

免疫组织化学在患者标本中的应用

回顾性收集1990年至2010年在中央大学医院接受肿瘤切除的HNSCC患者的外科组织标本。将福尔马林固定的石蜡包埋组织切成3m切片，在Flex IHC显微镜片(Agilent，Catalog No.)上进行干燥。(K 8020)。切片用标准二甲苯分离，经分级醇水化而成。抗原提取采用Envision Flex靶标检索液，高pH值(达科欧姆尼斯，目录编号)。(GV 804)。在室温下，在自动染色工作站上进行染色(达科·欧姆尼斯，目录编号)。用兔抗VAV 2单克隆抗体(ABCAM，Catalog No.Ab52640；1：50稀释)。用苏木精进行染色。随机分为阴性(0)、弱至中(1)或强(2)。在这些分析中使用的所有肿瘤样本中有96.55%是人乳头瘤病毒。−.

小鼠实验

Vav2ONC/ONC和Vav1–/–;Vav2–/–;Vav3–/–老鼠已经在其他地方被描述过了。17,29。在无菌环境中，在温度控制(23℃)、湿度(50%)、光照(12 h光/12 h暗周期)条件下，将动物饲养在通风室中。在新生小鼠的致癌实验中，3日龄小鼠单次应用5g DMBA(Sigma-Aldrich，Catalog No.(D 3254)在200升丙酮中。每周监测肿瘤的数量、大小和发生率。WT和Wt上皮在体反应的时程研究Vav2ONC/ONC用上皮增生法和BrdU掺入法检测小鼠对TPA的影响。17。安乐死后，采集肿瘤和组织标本进行组织学和免疫组化分析。

在原位异种移植实验中，用Accuase(CellnTec，Catalog No.)分离指数生长的HNSCC患者细胞。Cnt-酰基酶-100)，300×离心g5分钟，再悬浮于1.7×10的培养基中6细胞每毫升5×104然后在6周龄至8周龄的舌部使用一根8毫米针(bd，目录编号320927)，原位导入scc细胞。Vav1–/–;Vav2–/–;Vav3–/–小鼠先前通过腹腔注射10毫克/毫升氯胺酮(MerialCatalog No.Imalgene 1000)和2mg/ml西拉津(拜耳，目录编号)。在磷酸盐缓冲溶液中。然后在体内成像系统中使用IVIS Lumina定期显示肿瘤的生长情况(PerkinElmer，Catalog No.CLS 136334)在给D-荧光素酶(Goldbio，Catalog No.)5毫克/毫升溶液50毫升.祝老鼠好运。这一过程是与上述麻醉动物进行的。小鼠经腹腔注射1 mg/ml阿替帕唑200μg/ml(厄瓜多尔噬菌体，目录编号)后恢复活力。在磷酸盐缓冲盐水中的溶液。安乐死后，取肿瘤进行病理和免疫组化分析。

必要时取组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切2~3m厚切片，用苏木精-伊红染色。用ImageJ软件在垂直横截面上测量表皮层厚度和/或皮肤总厚度。在肿瘤切片中，由病理学家对其进行盲目分析，根据肿瘤的恶性程度和分化程度对其进行分类。

小鼠免疫组织化学研究

免疫组织化学染色用文塔纳发现超仪器(罗氏，目录编号05987750001)。石蜡包埋切片经柠檬酸缓冲液[pH6.0]或Tris EDTA(pH8.0)热诱导抗原提取，用适当的c-Fos(1：50稀释，Santa Cruz生物技术，目录编号)一抗孵育40 min。SC-166940)，c-Myc(1：50稀释，ABCAM，目录编号.YAP(1：200稀释度，Novus生物制剂，目录编号：NB 110-58358)，Cyclin D1(1：200稀释，罗氏，目录编号790-4508)，角蛋白14(1：300稀释，Biolegend，目录编号905301)，或雪莲素(1：100稀释，Sigma-Aldrich，Catalog No.I 9018)。标准染色采用DiscoveryOmniMap抗RbHRP检测系统(Roche，Catalog No.760-4311)进行检测，苏木精用于对抗染色。用ImageJ软件对免疫组化信号进行定量，将信号阈值调整到染色强度，并测量产生的颗粒面积。

细胞

原代角质形成细胞如别处所述被分离出来。17。第二天(4°C)，用2 5 0U/ml的放散酶(罗氏04942078001号)处理新生小鼠皮肤，分离表皮，在37°C下用针刺酶处理30 min，提取角质形成细胞。在CnT 07培养基上保存培养物(CellnTec，目录编号)。(cnt-07)I型胶原预涂板(BD生物科学，目录编号356400)。

永生化的，初级新生儿角质形成细胞(KerCT细胞)是从美国型培养集(目录编号)购买的。CRL-4048)，在KGM-Gold培养基(Lonza，目录编号00192060)中培养。这些细胞通过体外表达人TERT和CDK 4而永生化。从S.A.B.中获得SCC-25细胞，在KSFM培养基(热费雪科学，目录编号17005-042)中添加25 g/ml牛垂体提取物(Thermo Fisher Science，Catalog No.17005-042)和0.5 ng/ml人表皮生长因子(Thermo Fisher Science，Catalog No.17005-042)。

Hnscc(舌位)患者来源的细胞在其他地方也有描述。35。VdH 15细胞在KSFM培养基中加入25μg/ml牛垂体提取物和0.5ng/ml人表皮生长因子(Thermo Fisher Science，Catalog No.17005~042)。流式细胞术培养VdH 01细胞+培养基由DMEM的三部分组成(吉布科，目录编号21969)和火腿F12培养基的一部分(Thermo Fisher Science，目录编号11765054)，外加10%的胎牛血清(吉布科，目录编号10270106)，1.8×10–4M腺嘌呤(Sigma-Aldrich，目录编号.)A 2786-5G)，0.5克/毫升氢化可的松(Sigma-Aldrich，目录编号。H4001-1G)，5μg/ml胰岛素(热费舍尔科学，目录编号12585014)，10 ng/ml表皮生长因子(PreproTech，Catalog No.(AF-100-15)，10–10M霍乱毒素(Sigma-Aldrich，目录编号。C 8052-5mg)和2毫米L-谷氨酰胺(吉布科，目录编号25030024)。

三维有机培养

在CNT-Prime培养基中保持指数生长的角质形成细胞，用酰化酶分离，离心于300×。g室温下5 min，计数。2×105将细胞接种在聚碳酸酯插入物(ThermoFisher Science，Catalog No.140620)上，在CNT-主培养基中培养2天。汇合后，介质改为3D-势垒(CellnTec，Catalog No.CNT-PR-3D)和气举是按照制造商的指示进行的.3D培养12天，每周3次，最后进行组织学研究。当指示时，抑制剂和相应的车辆在进行空运后的第六天使用，并随着上述介质的变化而刷新。使用的抑制剂包括FRAX 597(5 NM；Selleckchem，目录编号)。S 7271)，Y-27632 2 HCl(1 M；Selleckchem，目录编号。S 1049)，1A116(500海里)39，10058-F4(500 NM；Selleckchem，目录编号：No.S 7153)和脊椎动物鳍(200 NM；Selleckchem，目录编号：No.(S 1786)。抑制剂浓度的选择是基于对控制细胞所形成的有机结构的小作用的诱导作用。

慢病毒介导的角质形成细胞蛋白表达

为获得稳定的细胞克隆，在DMEM(添加10%胎牛血清和2mm L-谷氨酰胺)中培养的HEK293T细胞中产生慢病毒颗粒，然后用LentiX浓缩试剂盒(Clontech，Catalog No.631232)浓缩。在KGM-Gold培养基中，在8g/ml聚苯存在下，用对照蛋白和编码慢病毒颗粒的蛋白感染角质形成细胞(Sigma-Aldrich，Catalog No.)。H 9268)，流式细胞仪检测耐药性或EGFP的表达。在后一种情况下，我们使用FACSAria III流式细胞仪(BD生物科学)进行细胞纯化。如其他文献所述，转移的细胞是普罗霉素。17。Westernblot检测蛋白的表达情况。

Rho GTPase活化试验

按上述方法获得细胞总裂解物，快速冷冻，解冻，定量测定总蛋白浓度，并根据制造商的说明(细胞骨架，目录编号)使用Rac 1、RhoA和Cdc42G-Lisa分析试剂盒进行分析。(BK 135)。

微阵列实验

8周龄小鼠背部表皮总RNAn=3个基因型)，用RNAeaseMini试剂盒(齐根，目录编号74104)进行分离，并按我们先前的描述，用基因芯片小鼠基因1.0ST阵列平台进行分析。17,55,69.

小鼠表达微阵列数据的硅分析

对人类数据进行了初步数据处理(见上文)。利用David和ToppFun进行基因本体和KEGG途径富集分析。GSEA使用基因组排列(n=1000)用于评估基因排序的显着性和信噪比指标。使用的基因集包括与表皮分化相关的标记(GSE 52954)。70；CSCC干细胞(GSE 29328)71；胚胎干细胞(GSE 10423)72；CSCC细胞(GSE 5576)73转移性HNSCC细胞(GSE 72939)35。我们还使用了ap1的转录目标列表。74，c-MYC75、E2F(广义研究所分子签名数据库签名#M40)、NFY(签名#C3：TFAC：0178来自宽研究所分子签名数据库)、YAP/TAZ/TEAD(GSE 66083)5，和FOXO(签名#C3：TFAC：0256来自宽研究所分子签名数据库)。评估Vav2激活的转录程序之间的相似性ONC并以GSE 45216和GSE 13355(人CSCC)、GSE 30784(人HNSCC)和GSE 21264(小鼠CSCC)为研究对象。评估Vav2的保护ONC通过肿瘤的转录信号，使用1.5倍的变化阈值。使用heatmap 3包生成热图。评价Vav2的富集程度ONC基因标记在SCC肿瘤中使用ssGSEA。

为了在共调控基因的启动子中发现转录因子结合基序，我们使用了iRegulon软件。47。收集了9713个位置权重矩阵(PWMS)，分析了围绕转录起始点的10 kb长的DNA序列。以最大错误发现率(Fdr)为准则，对模体相似度低于0.001的情况进行了模体检测、跟踪发现、模因子映射和目标检测.Circos图是使用用UCSC基因组浏览器中的小鼠基因组数据实现的OmicCircos软件包生成的(Https://genome.ucsc.edu)，基因本体联盟的基因本体注释(Http://www.geneontology.org)，以及来自iRegulon工具的转录因子注释。

评价c-myc或yap基因信号与VAV 2在肿瘤中的mRNA水平，我们根据VAV 2表达水平(低、中、高，由分位数确定)并计算上述签名的ssGSEA富集分数。

诱导多能干细胞的产生

用编码Yamanaka因子的逆转录病毒粒子感染新生小鼠的原代角质形成细胞(8g/ml)，2天后转移到由dmem-GlutaMAX(Thermo Fisher Science，Catalog No.31966-021)、15%敲除血清替换(Thermo Fisher Science，Catalog No.10828-028)、1x非必需氨基酸(Thermo Science，Catalog No.11140-035)、100 M2-巯基乙醇(Thermo Fisher Science，Catalog No.31350-010)和1×10组成的培养基中。3U/ml LIF(微孔，目录编号)(ESG 1107)。三天后，用针刺酶收集细胞，并在其他地方所述的饲养层上播种。76。允许iPS细胞集落生长2周，每日培养基变化，最后用碱性磷酸酶检测试剂盒(Sigma-Aldrich，Catalog No.)染色。根据制造商的指示。经qrt-PCR分析，进一步证实了真伪ips细胞的生成。奈诺表情。

MRNA丰度分析

用NZYol(NZYtech，Catalog No.)提取总RNA。MB18501)和定量RT-PCR，使用PowerSYBR绿色RNA到CT 1步试剂盒(应用生物系统，目录编号4389986)和StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统，目录编号4376600)进行。使用StepOne软件(应用生物系统)对原始数据进行分析。我们利用了内源的丰富度GAPDHMRNA作为内正常对照。用于转录定量的引物包括：5‘-GAC GGG GAA CTG AAA GTC CG-3’(正向，VAV 2)，5‘-TTT TCC CGT Gagg ACT TCT TGAC-3’(反向，VAV 2)，5‘-ATG GCC TTC CGT GTC CCC ACT G-3’(前进，GAPDH)，5‘-TGA GTG TGG CAG GGA CCC A-3’(反向，GAPDH)，5‘-AAG TAC CTC AGC CTC CAG CA-3’(前进，奈诺)，5‘-GTG CTG AGC CCT TCT GAA TC-3’(反向，奈诺)，5‘-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3’(前进，GAPDH)，5‘-TCT TCT GGG TGG CAG TGA TG-3’(反向，GAPDH).

启动子激活试验

我们利用荧光素酶报告质粒评估本研究中询问的转录因子的激活状态。为此，以指数级增长的人角质形成细胞瞬时转染了40 ng的prl-sv 40载体，该载体编码雷尼拉在AP1-(pAP1-Luc)、c-Myc-(PBV-Myc-Del1-Luc)、E2F-(pGL2-Chk1-WT-Luc)和tead-(p8xGTIIC-Luc)的调控下，适宜的萤火虫报告质粒含有萤火虫荧光素酶基因2g。24h后，用被动裂解缓冲液(Promega，Cat No.用双荧光素酶分析系统(Promega，Cat No.)测定荧光素酶活性。(E 1960)。在所有情况下，每个实验点获得的萤火虫荧光素酶活性值都是标准化的，同时考虑到了萤火虫的活性。雷尼拉在同一样品中获得荧光素酶。此外，我们还用westernblot分析了同一种溶菌物的异形结构，以评估每一种情况下外胚层表达蛋白的适当表达情况。数值在图中表示为实验样本相对于控制细胞所显示的活性的n倍变化(在每种情况下给出的任意值为1)。在需要的时候，这些实验包括使用化学抑制剂，其浓度与3D有机培养中使用的浓度相同。

HNSCC患者来源细胞的基因组特征

用150 bp的配对末端阅读法，在韩国首尔的Macrogen(韩国首尔)对来自患者细胞的DNA样本进行测序。使用BWA-MEM(v0.7.17)将已测序的读序列映射到人类基因组总成GRCH 37。77使用Biobambam标记重复读取(v2.0.87)78。对于变量调用，GATK工具(v4.1.4.1)79用于检测替换和吲哚。每个样本都使用GVCF模式的单形调用器和使用CombineGVCFs、GenotypeGVCFs和VariantFil滤工具生成的连接调用队列进行调用。使用Delly的胚系实现调用了结构变体(v0.8.1)80。复制号状态是使用画布推断的(v1.40.0)81。对于变量注释，我们使用了Ensembl变量效应预测器(v100.2)。82。当符合以下标准时，替换和indels被定义为具有潜在临床意义的变异体：(1)在1 KGP、ESP或GNOMAAD人群中观察到的最高等位基因频率小于0.01或未描述。(2)根据SIFT和PolyPhen评分，预测变异体对蛋白质功能有很大的影响或有害。还选择了克林瓦尔报道的致病性变异体。(Iii)癌症基因普查中的变异体83。利用癌症热点数据库确定已知的癌症热点84。拷贝数的改变被认为是临床上相关的，如果它们涉及致癌增益或肿瘤抑制缺失。对于结构变异，包括在断点水平上影响癌症基因普查基因的变异。

ShRNA介导的转录敲除

目标是VAV 2我们用编码空号的慢病毒感染HNSCC患者和SSC-25细胞(TR1.5pLKO-1-puro；Sigma-Aldrich，Catalog No.(SHC 001)或一些独立的VAV 2ShRNA(数字中称为shRNA#1；TRCN0000436728，图中称为shRNA#2；TRCN000000048227，图中称为shRNA#3；TRCN0000418821，图中称为shRNA#4和TRCN0000419630，在数字中称为shRNA#5)。编码这些shRNAs的慢病毒载体来自Sigma-Aldrich.扁豆病毒颗粒的产生和感染就像上面提到的那样。如其他文献所述，转移的细胞是普罗霉素。17。用qRT-PCR方法检测基因敲除情况.

诊断特征的发展

开发Vav2所用的标准ONC-SIG已在结果一节中作了说明。为了评估其肿瘤特异性，我们利用图中所示的数据集进行了主成分分析。用于开发Vav2中的MVGSONC-Sig，我们利用生存R软件包建立了Cox比例风险回归模型(Https://cran.r-project.org/web/views/Survival.html)。采用GEO(GSE 41613)和TCGA(HNSCC收集)的数据进行生存分析。

统计

生物复制的数量(n)、统计测试的类型，以及每个实验的统计意义，无论是在图图中还是在主文本中。分别用Shapiro-Wilk检验和Bartlett检验分析方差的正态性和均匀度.用学生模型分析参数分布t-测试(在比较两个实验组时)或方差分析(ANOVA)，然后是Dunnett试验(当比较两个以上的实验组与一个单独的对照组)或Tukey的HSD测试(当将两个以上的实验组与其他每一组进行比较时)。非参数分布采用Mann-Whitney(两个实验组的比较)或Kruskal-Wallis后的Dunn‘s(三个或三个以上的实验组)检验进行分析。采用X-平方检验，确定期望频率与观察频率之间差异的显着性。在所有情况下，当P≤0.05。所得数据为平均值±扫描电镜。

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文章分类：生物摘要

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