您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!
本企业通过iso9001质量体系认证

多平台基因组谱和磁共振成像识别脑膜瘤瘤内异质性的机制

 二维码
发表时间:2020-09-25 10:24作者:武汉新启迪Xinqidibio

脑膜瘤是最常见的颅内原发性肿瘤,但脑膜瘤发生的分子驱动因素尚不清楚。我们假设,研究脑膜瘤瘤内异质性将阐明生物学驱动因素,并为分子治疗提供新的靶点。为了验证这一假设,我们在这里对13个人脑膜瘤的86个空间上不同的样本进行了多平台分子图谱分析。我们的数据显示,在脑膜瘤中,染色体结构的区域改变是克隆性转录、表观基因组和组织病理学特征的基础。术前磁共振图像的样品坐标立体定向配准进一步表明,高表观扩散系数(ADC)可区分脑膜瘤区域,其增殖细胞丰富,可用于发育基因表达程序。为了了解这些基因在脑膜瘤中的作用,我们建立了脑膜瘤的人脑器官模型,并验证了高ADC标记基因。CdH 2PTPRZ 1利用活体成像、单细胞RNA测序、CRISPR干扰和药理学作为脑膜瘤治疗的潜在靶点。

导言

脑膜瘤起源于中枢神经系统的内层,是最常见的原发性颅内肿瘤。1。脑膜瘤被认为是由神经嵴的衍生物形成的。2,一种由保守基因调控网络介导的具有显著遗传和功能多样性的多能胚胎细胞群体。世界卫生组织(WHO)根据有丝分裂活动和其他不良的组织病理学特征对脑膜瘤进行分类。3。根据世卫组织的标准,大多数脑膜瘤都是一级脑膜瘤,通常通过手术和放射治疗得到很好的控制。4,5。相比之下,高级别脑膜瘤被定义为世卫组织II级(非典型)和Ⅲ级(间变性),约占病例的三分之一,尽管管理优化,但经常复发。4,5。对脑膜瘤患者的系统和分子治疗仍处于研究阶段,新的治疗方法由于缺乏相关的模型系统和对脑膜瘤生物学的了解有限而受到阻碍。6.

脑膜瘤是一种常见于2型神经纤维瘤病患者的遗传病,是一种由生殖细胞杂合子突变引起的复杂常染色体疾病。NF27。当NF2突变在散发性脑膜瘤中也很常见。8,9,脑膜瘤临床上可操作的体细胞变异是罕见的,通常与不良结果无关。10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,除了罕见的例外20,21。基于DNA甲基化的脑膜瘤分类比体细胞变异或组织学分级预测预后更好15,19,22,23但DNA甲基化图谱尚未阐明分子治疗脑膜瘤的生物学驱动因素或靶点。我们先前发现了激活FOXM 1/Wnt信号轴和控制高级别肿瘤脑膜瘤细胞增殖的基因组和表观遗传机制。19。FOXM 1是细胞增殖所必需的Forkhead盒转录因子。24,25,26,27,Forkhead盒转录因子是脑膜发育的关键因子。28。FOXM 1的表达进一步区分脑膜瘤有复发的危险。19但导致这一过程的分子机制尚不清楚,转录因子(如FOXM 1)并不是可治疗的药物靶点。

因此,为了阐明脑膜瘤治疗的生物学驱动因素和寻找新的治疗靶点,我们研究了肿瘤内异质性,肿瘤内异质性是肿瘤治疗耐药的重要来源。29。高级别脑膜瘤的特征是基因组不稳定。12,19表明染色体结构的区域变化可能是处理抗性的基础。为了支持这一假设,基因组结构的区域差异30,31,32,细胞增殖和体细胞变异的频率33,34存在于单个脑膜瘤中。为了了解这些差异的分子机制,我们立体地收集了13例脑膜瘤的86例空间上不同的标本,并利用RNA测序、DNA甲基化分析、拷贝数变异(CNV)鉴定、肿瘤系统发生、定量磁共振(MR)成像和组织病理学等方法分析了肿瘤内的异质性。我们利用活体成像、单细胞RNA测序、CRISPR干扰(CRISPRi)和药理学等方法,从不同的空间样本中进一步推导出脑膜瘤细胞株,并与人脑器官进行三维(3D)共培养。我们的数据显示,在脑膜瘤中,染色体结构的区域改变是转录、表观基因组和组织病理学特征的基础。此外,我们还证明,MR成像的高表观扩散系数(ADC)可用于术前识别脑膜瘤中与发育基因表达相关的细胞增殖富集区。通过将我们的生物信息、组织病理学和放射学表现与脑膜瘤的人脑器官模型相结合,我们确定了CdH 2PTPRZ 1作为在高ADC区富集的基因,它驱动脑膜瘤的发生,是治疗脑膜瘤患者分子治疗的新靶点。总之,我们的数据揭示了脑膜瘤在分子和影像学水平上的空间异质性,并进一步证明了脑膜瘤细胞增殖的影像学特征的分子相关性。

结果

收集空间上不同的脑膜瘤样本

参与这项研究的病人以女性居多,诊断年龄中位数为65岁(补充表)1)。7例脑膜瘤为WHOⅠ级(54%,46例),3例为WHOⅡ级(23%,22例),3例为WHOⅢ级(23%,18例)。7例脑膜瘤在抢救手术前复发(54%,48例),6例在手术时进行初步诊断(46%,38例)(补充表)1)。所有脑膜瘤均位于中线上(这是我们研究结果推广到其他部位的一个潜在限制),并根据术前立体定向MR图像建立模型,在三维模型上绘制每个空间上不同的样本的坐标(图1)。1A)。从每个脑膜瘤中采集7个样本(范围5~8),中位数14 mm(范围2.5~177 mm)。

图1:脑膜瘤的转录、表观基因组和基因组瘤内异质性。
figure1

a7个样本三维立体定位脑膜瘤取样图(af)来自WHOⅠ级脑膜瘤(M1),术前MRI重建。病人定位由右下角的模型表示。刻度棒,5厘米。bRNA测序主成分(PC)分析表明,从本研究获得的13个脑膜瘤标本中,大约31%的变异是由前两个主成分解释的。WHOⅠ级脑膜瘤与成骨细胞增殖相关基因的表达及Wnt信号的表达是一致的。WHOⅡ级脑膜瘤和Ⅲ级脑膜瘤是通过FOXM 1靶基因和细胞周期效应基因的表达而统一的,而在第二次PC中则通过神经元系统或免疫基因的表达来区分。c肿瘤内RNA测序PC分离显示世卫组织Ⅱ级和Ⅲ级脑膜瘤的异质性高于世卫组织一级脑膜瘤。dDNA甲基化PC分析表明,从本研究获得的脑膜瘤标本中大约50%的变异是由前两个主成分解释的。e瘤内DNA甲基化PC分离证实世卫组织II级和III级脑膜瘤内部的异质性大于世卫组织一级脑膜瘤内的异质性。fDNA甲基化分析得到的拷贝数变异显示,世卫组织II级和III级脑膜瘤的基因组不稳定性高于世卫组织一级脑膜瘤。水平线c, f代表手段。*P≤0.05,双尾学生未配对t测试一下。从空间上不同的脑膜瘤样本的颜色协调由肿瘤的起源。

脑膜瘤的分子内异质性

我们假设在空间上不同的脑膜瘤样本将显示基因表达程序的差异。为了检验这一假设,我们对75个样本进行了RNA测序,并利用主成分分析来表征基因表达变异(图)。1B)。每个脑膜瘤的标本主要集中在主成分间隙,但有明显的瘤内异质性,这是最明显的高级别脑膜瘤(图一)。1C)。基因本体论与染色质富集分析35,36,37结果显示,WHOⅠ级脑膜瘤标本由成骨细胞增殖和非典型Wnt基因表达程序确定。1B和补充图。1A)。相比之下,高级别脑膜瘤标本沿第一主成分富集fxm 1靶基因,并通过神经元或免疫基因的表达沿第二主成分进一步描述,后者包括pd-1信号增强和外胚层发育的调节因子,如CTNNB 1, 雷拉, EED,和STAT 6目标(图1.1B和补充图。1A)。一致地,当我们比较WHOⅠ级和WHOⅢ级脑膜瘤差异表达基因时,我们发现WHOⅢ级脑膜瘤细胞周期、免疫调节剂和FOXM 1目标基因丰富(补充图)。1B)。表达FOXM 1与WHOⅠ级肿瘤相比,高级别脑膜瘤标本中其自身含量有所增加,但也存在较大的异质性。FOXM 1高级别脑膜瘤与Ⅰ级脑膜瘤在空间上的不同表达(附图)。1C).

为了确定肿瘤内异质性是否存在于不同空间的脑膜瘤标本的DNA甲基化模式中,我们对86份标本进行了850 K的DNA甲基化分析。与我们的转录分析相一致,来自每个脑膜瘤的样本主要集中在主成分空间中(如图所示)。1D),但类似于我们使用RNA测序的结果,在高级别脑膜瘤标本的DNA甲基化谱中存在显著的瘤内异质性(图一)。1E)。此外,与我们先前的调查结果一致19高级别脑膜瘤标本与Homeobox结构域基因高甲基化和H3K27三甲基化标记有关(附图)。2A),并且与WHOⅠ级肿瘤相比,DNA甲基化值增加(补充图)。2B,c)。因此,与WHOⅠ级脑膜瘤相比,高级别脑膜瘤具有显著的转录和表观基因组异质性。

脑膜瘤瘤内异质性与CNV的关系

为了确定在空间上不同的脑膜瘤标本的CNV谱中是否存在异质性,我们从所有86份标本的DNA甲基化谱中鉴定了CNVS。最常见的变异是染色体22q在77%的样本中丢失,其中含有抑癌基因。NF2(补充图。二维空间)。当我们比较WHOⅠ级脑膜瘤和高级别脑膜瘤时,我们发现高级别脑膜瘤中CNV的数量增加了,而且每个样本CNV的方差也增加了(图一)。1F).

为了了解脑膜瘤的肿瘤发生,我们根据CNV在空间上不同的样本中的分布,为每个脑膜瘤构建了系统发育树(图1)。2和补充图。3A)。对每个肿瘤进行三维建模,以识别立体定向空间中的样本位置(如图所示)。2A、d、g和j),并与CNV的系统发生进行了比较。2B,e,h,k和补充图。3A),RNA测序。2C,F,I和L)和DNA甲基化谱(补充图)。3B)。我们发现单个WHOⅠ级脑膜瘤的CNV分布在空间上是不同的(补充图)。3A但高级别脑膜瘤的CNV系统发育表现出明显的瘤内异质性(如图所示)。2B、e、h和k)。WHOⅠ级脑膜瘤和高级别脑膜瘤在肿瘤演化早期均表现为克隆性CNV,提示染色体结构改变是脑膜瘤发生的早期事件(图一)。2B,e,h,k和补充图。3A)。虽然我们发现了影响脑膜瘤染色体1、14、17、22和其他染色体的cnv。38CNV的特征、大小或空间上不同样本的分布之间没有明显的关系。然而,22q、14q和1p丢失是脑膜瘤演化中的早期共同事件,CNV不稳定性随着肿瘤分级的不同而增加。

图2:高级别脑膜瘤瘤内异质性的染色体结构改变。
figure2

WHOⅡ级和III级脑膜瘤M6的克隆进化ac,M7df,M12gi,以及M13jl. A,d,g,j术前MRI重建三维立体定向脑膜瘤取样图。病人的方位由每个面板右下角的模型表示。刻度棒,5厘米。b, e, h, k根据甲基化分析得到的拷贝数变异的克隆顺序,肿瘤内系统发育表明,染色体结构的改变是脑膜瘤生长过程中的早期事件。克隆变异以黑色显示,共享变异以蓝色显示,私有变异以灰色显示。c, f, i, lRNA测序主成分(PC)分析表明,前两个主成分解释了单个肿瘤组织中约50-78%的基因表达变异。免疫、GPCR和激素信号传导以及间充质基因的差异可以勾勒出单个脑膜瘤的标本。从空间上不同的脑膜瘤样本的颜色协调由肿瘤的起源。

为了确定单个脑膜瘤CNV异质性是否与不同空间上不同样本的表观或转录差异有关,我们对单个肿瘤的RNA测序和DNA甲基化谱数据进行了主成分分析(图1)。2C,f,I,L,以及附图。3B)。单个肿瘤标本的基因本体论分析确定了鉴别高级别脑膜瘤的分子途径,如免疫、炎症和神经元基因表达程序(补充图)。3C)。这些数据与我们对所有肿瘤样本的综合分析是一致的。1B,d),提示高级别脑膜瘤染色体结构的改变是克隆性转录和表观基因信号的基础。

脑膜瘤的影像学瘤内异质性

我们假设脑膜瘤的分子异质性可以用MRI来描述。为了检验这一假设,我们对所有86个空间上不同的脑膜瘤标本与术前MR图像进行了立体定向坐标的联合登记,并在每个位置量化了ADC和CBF(图1)。3A和补充图。4A)。与WHOⅠ级肿瘤相比,高级别脑膜瘤的全肿瘤ADC值差异更大(附图)。4B)。在高级别脑膜瘤中,与Ⅰ级肿瘤的空间上不同的标本相比,高级别脑膜瘤间的ADC异质性也更大(如图所示)。3B),提示世卫组织Ⅱ级和Ⅲ级脑膜瘤细胞结构特征具有较大的可变性,如细胞性和细胞外基质组成。CBF在空间上也不均匀,但低级别脑膜瘤和高级别脑膜瘤之间灌注的总体大小和异质性没有差异(附图)。4C)。因此,我们利用RNA测序数据对来自高级别脑膜瘤的低ADC和高ADC样本进行了差异基因表达分析。3C)。我们共鉴定出179个在高ADC值样品中富集的基因,273个在低ADC值样本中富集的基因(补充数据)。1)。基因本体论分析显示,高级别脑膜瘤的高ADC标本在Wnt、外胚层、多能性和神经嵴基因表达程序中富集。三维空间),包括FOXM 1(补充图。4D和补充数据1)。在这些基因集合中,在高ADC值的样本中富集的显著基因包括CdH 2,编码N-cadherin,是非正则Wnt信号和神经元发育的调节因子。39,40,和PTPRZ 1,这是神经元发育所必需的。41,我们和其他人已经证明,它参与了胶质母细胞瘤细胞的侵袭和自我更新。42,43,44。此外,我们先前发现高ADC是高级别脑膜瘤和不良临床结果的标志。45,46提示ADC升高区的分子相关性可能是脑膜瘤发生的驱动因素。总之,这些数据表明,脑膜瘤的放射图像内异质性与区域转录差异有关,高ADC可区分发育性基因表达程序丰富的区域,这些区域可能是脑膜瘤细胞增殖和肿瘤复发的基础。

图3:MR ADC升高可区分高级别脑膜瘤的发育基因表达程序。
figure3

a术前T1、对比后和表观扩散系数(ADC)对脑膜瘤M7和M11内空间不同区域的磁共振成像显示,高级别脑膜瘤具有显着的放射学异质性。黑圈和红圈分别表示ADC的低和高采样位置。b与WHOⅠ级脑膜瘤相比,WHOⅡ级和III级脑膜瘤ADC值具有更大的异质性。*表示世卫组织一级及二级及三级脑膜瘤的总ADC值之间的统计意义,后者已合并作分析。cRNA序列分析显示,WHOⅡ级和III级脑膜瘤ADC低区和ADC高区之间有452个差异表达基因。d, eRna测序的基因本体论分析表明,世界卫生组织II级和Ⅲ级脑膜瘤ADC值高的区域富含Wnt通路和神经元发育基因,例如CdH 2PTPRZ 1. *P≤0.05,双尾学生未配对t测试一下。均值的平均±标准差(如误差条所示)表示为(b, e)。从空间上不同的脑膜瘤样本的颜色协调由肿瘤的起源。

脑膜瘤的组织学瘤内异质性

我们推测肿瘤内组织病理学异质性可能受脑膜瘤分子特征或细胞过程的空间差异,如细胞增殖等的影响。为了验证这一假设,我们对5个脑膜瘤分级的13例肿瘤标本进行了FOXM 1和Ki-67细胞增殖标记物的H&E染色和免疫荧光检测(图一)。4A和补充数据2)。肿瘤之间有组织病理学上的差异(见图)。4B),以及来自单个脑膜瘤的空间定义样本(如图所示)。4C)。特别是,我们确定了脑膜瘤细胞大小、胶原沉积量以及单个脑膜瘤中束状和坏死的存在和范围的定性区域差异(图1)。4C)。值得注意的是,区域组织病理学差异不足以改变世卫组织脑膜瘤样本的级别。3。我们进一步确定了KI-67标记指数和FOXM 1免疫荧光与肿瘤分级相关的区域变异,在空间定义的WHOⅡ级和III级脑膜瘤样本之间具有较高的异质性(图一)。4D,e)。KI-67标记指数和FOXM 1免疫荧光与每个样本的CNV数呈正相关(图1)。4F此外,区域ADC、Ki-67标记指数与FOXM 1免疫荧光呈正相关(图1)。4G)。因此,虽然高级别脑膜瘤的整体ADC值可能较低,反映了高细胞性(补充图)。4B)45我们的数据表明,脑膜瘤ADC升高的区域可能存在侵袭性脑膜瘤克隆。为了解决这样的可能性,在我们的研究中,M13是最具临床和组织病理学侵袭性的肿瘤,在空间上不同的样本可能会使我们的蛋白表达分析从有限的样本中过度偏倚(如图所示)。4D-g),我们比较了FOXM 1本研究中所有不同空间脑膜瘤(不包括M13样本)的ADC值的转录表达,并验证了两者之间的正向异质性关联。FOXM 1表达式与区域ADC(附图)4E)。此外,我们还发现Ki-67标记指数与FOXM 1免疫荧光之间的联系在没有M13(补充图)的情况下仍然存在。4FFOXM 1免疫荧光与区域性CNV的正相关(补充图)。4G)。相反,Ki-67标记指数、FOXM 1免疫荧光与区域ADC之间的联系在缺乏M13的空间差异样本的情况下不太强(补充图1)。4H)。总之,这些数据表明脑膜瘤的MR成像特征可能受到区域基因组不稳定性和驱动脑膜瘤细胞增殖的基因表达程序的影响,但需要对更多患者进行进一步的图像引导研究,以更准确地确定宏观MR成像特征与脑膜瘤生物学的潜在复杂性之间的空间联系。

图4:肿瘤内CNV和影像学异质性与脑膜瘤组织学改变有关。
figure4

a术前MRI重建三维立体定向脑膜瘤取样图。病人的方位由每个面板右下角的模型表示。刻度棒,5厘米。b, c比较永久性手术组织学和冷冻立体定向组织学显示脑膜瘤的肿瘤内和肿瘤间异质性。标尺,100μm。d, e定量免疫荧光法检测Ki-67(绿色)和FOXM 1(红色)在高级别脑膜瘤中表现出较强的阳性相关性和细胞增殖能力,且在不同空间的肿瘤标本间具有异质性。DNA标记为DAPI(蓝色)。标尺,100μm。f, gKI-67和FOXM 1免疫荧光显示与CNV的数目和每个空间上不同的脑膜瘤样本的ADC值呈正相关。每个散点图都表示平均值的平均±标准误差(如误差条所示)(eg)。从空间上不同的脑膜瘤样本的颜色协调由肿瘤的起源。

Cdh 2和PTPRZ 1在细胞器脑膜瘤形成中的作用

基因工程小鼠模型被非脑膜瘤的优势所干扰,其目的是对脑膜瘤生物学进行重述。47,48,免疫缺陷患者源性脑膜瘤异种移植是研究肿瘤微环境中癌细胞相互作用的次优方法。相比之下,来自人类细胞的细胞器可以在三个维度上模拟癌细胞的行为,以阐明不同的细胞群体在单个细胞的水平上是如何相互作用的。49。事实上,我们和其他人已经证明,胶质母细胞瘤细胞可以侵入和生长在人脑的细胞器中,并能产生器官内肿瘤,这些肿瘤与原发性肿瘤细胞的行为密切相关。42,50,51。因此,我们假设脑膜瘤细胞与人脑器官的共培养将有助于实时研究肿瘤细胞在生理微环境中的相互作用,并揭示对脑膜瘤肿瘤发生具有重要意义的基因表达程序。为了验证这一假设,我们从空间定义的脑膜瘤M10G和M13C中提取了细胞株,并验证了这些细胞的CNV谱与其原始样本相一致(补充图)。5)。我们用红色荧光蛋白标记M10G和M13C脑膜瘤细胞,观察到两种细胞在二维培养中均呈多角形生长,但在三维培养条件下形成肿瘤球。5A,b).

图5:cdh 2和PTPRZ 1构成脑膜瘤与人脑器官共培养发生脑膜瘤的基础。
figure5

a2D培养M10G、WHOⅠ级和M13C WHOⅢ级脑膜瘤细胞共聚焦显微镜观察。标尺,100μm。b共聚焦显微镜显示M10G和M13C脑膜瘤细胞在三维培养中形成肿瘤球。标尺,100μm。c脑膜瘤细胞(RED)三维共聚焦显微镜观察显示,M10G细胞与人脑细胞器(绿色)共培养30h,M10G细胞形成与细胞器相邻的肿瘤球,M13C细胞形成侵袭细胞器的肿瘤球。标尺,200μm。dWHOⅢ级脑膜瘤细胞2D培养、12h和14d培养、14天脑组织培养、12天和14d共培养的单细胞RNA序列分析显示,在UMAP空间绘制并以样本为阴影的脑细胞器与12、14天共培养显示出明显的以样本分离为主的聚类。e二维脑膜瘤细胞的UMAP表现为细胞外基质组织和整合素相互作用基因(C0)的富集、细胞增殖和FOXM 1靶基因(C1)、代谢(C2)的富集,以及以ADC高基因表达为特征的罕见亚群体。CdH 2PTPRZ 1(C4)。f三维脑膜瘤细胞12h和12h的UMAP研究g第14天显示细胞外基质的持续存在和脑膜瘤细胞的增殖,但表达adc高基因的脑膜瘤细胞丢失。CdH 2PTPRZ 1. h脑膜瘤细胞与人脑细胞器共培养12h和12h的UMAP研究i14天显示CdH 2PTPRZ 1在这两个细胞群体中,这增加了AS的表达PTPRZ 1随着时间的推移,如在j12小时和k14天

为了研究脑膜瘤的发生和脑膜瘤细胞与肿瘤微环境的相互作用,我们将M10G和M13C脑膜瘤细胞与含有前分化人多能干细胞来源星形胶质细胞的绿色荧光蛋白标记的人脑器官共同培养。该模型由结构复杂的人脑星形胶质细胞组成,构成成人大脑中的大多数细胞类型,能够在高密度的类细胞器共培养中产生突触。52。通过活体成像,我们发现从WHOⅠ级脑膜瘤中提取的M10G细胞在脑器官表面形成肿瘤球(图1)。5C和补充电影1)。相比之下,M13C细胞来源于世界卫生组织Ⅲ级脑侵袭性脑膜瘤,形成侵袭脑器官的肿瘤球(图1)。5C和补充电影2).

我们的数据表明,脑膜瘤细胞与人脑器官的三维培养可以用来模拟脑膜瘤的发生,并为确定脑膜瘤形成的基因表达程序提供了一个框架。为此,我们在WHOⅢ级肿瘤的脑膜瘤细胞上进行了单细胞RNA测序(Ⅰ)在2D培养中,在(Ii)12h和(Iii)14d后在3D培养中,在(Iv)12h和(V)14d后与人脑组织进行三维共培养,以及(Vi)人脑器官。我们用批次修正的降维方法进行了汇总分析,共减少了6817个单元,涵盖了所有六种情况(补充图)。6a,b)。在评估均匀流形近似和投影(UMAP)簇是如何分布在样本之间时,我们发现这些簇主要是根据培养条件而分离的(图)。5D)。三个主要由2D脑膜瘤细胞组成的簇,它们主要用于代谢途径、细胞周期和FOXM 1靶基因,以及通过基因本体分析参与细胞外基质组织和整合素相互作用的基因(补充图)。6C)。我们进一步鉴定了一个由人脑细胞器样本组成的簇,随后将区分该簇的基因用于在共培养条件下区分脑膜瘤细胞和类细胞器细胞(附图)。6C和补充数据3)。最后,我们发现早期三维脑膜瘤细胞(12小时)、晚期培养脑膜瘤细胞(14天)和脑膜瘤细胞与人脑细胞器官共培养(图1)。5D和补充图。6C).

这些数据表明,培养条件是建立脑膜瘤细胞转录特性的关键。因此,我们对我们的单细胞RNA测序数据进行了差异表达分析,以评估2D、3D和共培养脑膜瘤细胞之间的差异(补充数据)。4)。为了在我们的模型系统中识别脑膜瘤细胞增殖或肿瘤发生的机制,我们将单个细胞的差异表达基因与具有低和高ADC值的空间上不同样本的差异表达基因进行了交叉参照(补充数据)。1)。值得注意的是,与人脑细胞器官共培养的脑膜瘤细胞在体内与高ADC区表达最多的重叠基因,表明肿瘤微环境在确定脑膜瘤细胞结局中起着重要作用(补充数据)。4)。为了研究模型系统中adc增高区域的基因表达情况,我们对每个单细胞rna测序样本分别进行了分析,并进行了基因本体论分析以识别脑膜瘤细胞状态(补充数据)。5)。将2维脑膜瘤细胞分为5组,包括表达FOXM 1靶基因的增殖细胞。CCNB 1TOP2A,细胞为代谢途径富集,细胞富集为细胞外基质组织和整合素相互作用途径(图一)。5E)。2D培养中少数脑膜瘤细胞在ADC升高的区域表达丰富的基因,如CdH 2PTPRZ 1(无花果)5E和补充图。6d)。同样,两种方法的降维分析(图1)。5F)和迟到(图1.5G三维脑膜瘤细胞分别鉴定出与脑膜瘤细胞增殖和细胞外基质组织相对应的共有簇。此外,还有一个脑膜瘤细胞团CdH 2PTPRZ 1这是在12小时后的三维单细胞培养,但不是在14天后(补充图。6d),表明无论是2D还是3D培养条件都不能准确再现脑膜瘤细胞体内分子异质性。对比分析脑膜瘤细胞与人脑细胞器共培养12h后的变化。5H)和14天(如图所示)。5I)表明,细胞器衍生的星形胶质细胞也表达。CdH 2PTPRZ 1(无花果)5J,i),与单一培养条件相比,共培养标本中的脑膜瘤细胞保持不变。CdH 2表达式(附图)6E)和增加PTPRZ 1随时间变化的表达(附图)。6f)。在共培养标本中,星形胶质细胞和脑膜瘤细胞均增加了PTPRZ 1配体的表达。PTN随时间推移(附图)6g),激活PTPRZ 1促进胶质母细胞瘤干细胞再生和肿瘤生长44。相反,PTN在三维单细胞培养条件下,脑膜瘤细胞的表达随着时间的推移而下降(附图)。6g),也许可以解释PTPRZ 1脑膜瘤细胞在没有肿瘤微环境的情况下的表达。5H,i)。事实上,在单一培养条件下,肿瘤微环境的缺乏也可能有助于脑膜瘤细胞团簇的形成,这些细胞团簇是由代谢和细胞外基质组织途径区分的(图一)。5E-g),未在共培养样品中鉴定(见图)。5H,i)。尽管如此,这些数据表明,我们的新的脑膜瘤肿瘤发生的人脑器官模型重述了在空间上不同的原发性脑膜瘤标本中作为放射学异质性的基础的基因表达程序(图1)。3),提示该系统可用于脑膜瘤细胞增殖和肿瘤发生的机械性询问。

Cdh 2和PTPRZ 1驱动脑膜瘤发生

复发性脑膜瘤抢救手术和放射治疗的固有发病率53,54,55,我们迫切需要新的治疗方法来治疗高级别或复发的肿瘤。4,5。我们已经证明,ADC升高的脑膜瘤有高级别和复发的危险。45,46,并确定了与体内高ADC值相关的分子特征(图1)。4)和体外(图1)。5)。为了确定高adc值下的基因是否对脑膜瘤细胞增殖很重要,我们从空间上不同的样本m10g中获得稳定表达crispri组分dCas9-krab的脑膜瘤细胞。56,被压抑CdH 2PTPRZ 1通过将携带sgRNAs的慢病毒传递给这些基因(如图所示)。6A)。我们对Ki-67进行了免疫荧光,发现抑制CdH 2PTPRZ 1与转染非靶向sgRNAs(SgNTC)的细胞相比,每一种抑制脑膜瘤细胞的增殖(如图所示)。6B,c).

图6:Cdh 2和PTPRZ 1驱动脑膜瘤细胞增殖和肿瘤发生。
figure6

aQRT-PCR评价CdH 2PTPRZ 1在M10G中的表达DCas9-KRAB针对这些基因的sgRNAs转导后的脑膜瘤细胞显示,与非靶向对照sgRNAs(SgNTC)转导的细胞相比,每个基因都受到抑制。b, cKi-67(绿色)在M10G中的免疫荧光DCas9-KRAB转移后的脑膜瘤细胞sgRNAs显示,抑制CdH 2PTPRZ 1阻止脑膜瘤细胞增殖。DNA标记为Hoeschst(蓝色)。标尺,100μm。d顺铂对M10G细胞的治疗作用CdH 2拮抗剂ADH-10.2mg/ml,48h可阻断脑膜瘤细胞增殖。eM10G的活体共聚焦显微镜DCas9-KRAB脑膜瘤细胞与人脑细胞器共培养,显示了sg的转导。CdH 2与sgNTC的转导相比,脑膜瘤的发生受到阻断。f, gM10G定量DCas9-KRAB(红色)与人脑组织(绿色)共培养10天后的强度显示sg的转导。CdH 2ADH-10.2mg/ml可阻断脑膜瘤的发生。标尺,100μm。hKi 67在M10G、Benmen和MSC 1脑膜瘤细胞中的免疫荧光检测结果表明,Ki 67对M10G、Benmen和MSCCdH 2ADH-10.2mg/ml可阻断脑膜瘤细胞增殖。i应用ADH-1.0.2mg/ml治疗脑膜瘤,10天后与人脑组织培养共培养的Benmen、MSC1和MSC5信号强度的定量结果表明,ADH-10.2mg/ml可阻断脑膜瘤的发生。*P≤0.05,双尾学生未配对t测试一下。平均值的平均±标准误差(如a, b, d, g, h,和i)表示。

CdH 2编码N-钙粘素(N-cadherin),这是一种跨膜糖蛋白,介导细胞与细胞的粘附和粘附连接处的非典型性Wnt信号。39。Wnt信号异常与脑膜瘤的关系19,57,58,以及CdH 2小分子拮抗剂ADH-1对阻断N-钙粘素依赖性肿瘤生长既安全又有效。59,60,61。一致地,我们发现ADH-1阻止M10G脑膜瘤细胞的增殖。6d)。以确定是否抑制CdH 2阻断脑膜瘤发生,共培养M10GDCas9-KRAB由sgntc或sg转导的细胞CdH 2,利用人脑组织器官,利用活体成像监测脑膜瘤细胞在肿瘤微环境中的相互作用。我们发现CdH 2阻止脑膜瘤的发生(图。6E)的遗传和药物抑制作用。CdH 2ADH-1抑制脑膜瘤细胞增殖,与人脑细胞器官共培养(图1)。6f,g).

为了验证CDH-2的药物抑制对脑膜瘤细胞生长的抑制作用,我们用ADH-1和2D单眼免疫荧光技术对来自非包括在我们的空间清晰脑膜瘤样本中的原发性脑膜瘤细胞进行了治疗(如图1所示)。六小时),以及与人脑器官共培养的脑膜瘤发生的定量(图一)。6I)。这些细胞系包括Benmen WHO一级脑膜瘤细胞,这是以前报道过的原发性脑膜瘤细胞系。62,MSC1 WHOⅡ级和MSC5 WHOⅠ级脑膜瘤细胞,我们重新提取这些细胞,并证实这些细胞的CNV谱与其原始样本相一致(附图)。7)。与使用M10G细胞的结果一致,我们发现ADH-1阻止了细胞的增殖。六小时)和肿瘤发生。6I)所有原发性脑膜瘤细胞分别在单眼和与人脑组织共培养中检测。总之,通过将我们的生物信息、组织病理学和放射学表现与脑膜瘤的人脑器官模型相结合,我们确定了CdH 2PTPRZ 1作为高ADC区丰富的促进脑膜瘤细胞增殖和肿瘤发生的基因,为脑膜瘤患者的分子治疗提供了新的靶点。

讨论

我们已经确定了肿瘤内异质性的基因组和放射学决定因素,阐明了脑膜瘤细胞增殖和肿瘤发生的分子机制。我们发现高级别脑膜瘤的定义是由转录和表观基因组异质性、克隆CNVS和ADC升高的区域来区分发育基因表达程序。在这些基因中,我们发现FOXM 1, CdH 2,和PTPRZ 1在单个脑膜瘤中均有不同程度的表达。FOXM 1对高级别脑膜瘤生长的重要性。19,但是我们发现了空间上不同的模式FOXM 1, CdH 2,和PTPRZ 1表达为理解脑膜瘤为什么不对称生长提供了基础。此外,我们的数据表明,区域脑膜瘤基因的表达程序可能是由划分的基因组重排驱动的。

这些数据可以根据肿瘤形成的克隆模型或肿瘤干细胞假说来解释。63。克隆模型假设,在肿瘤发生的早期,单个细胞转化为获得无限生长的潜力,并且随着时间的推移,其死者可能会积累更多的有利突变。我们发现脑膜瘤早期以克隆CNV为特征,提示染色体结构的改变,特别是染色体22q的丢失,是脑膜瘤生长的早期事件。重要的是,这些数据验证了从遗传性病例中有关脑膜瘤肿瘤发生的长期假设。此外,虽然我们知道高级别脑膜瘤增加了基因组的不稳定性12,19我们发现在单个肿瘤中,这一过程在空间上是不均匀的。因此,染色体22q的丢失可能只是许多基因组驱动因素中的一个,当这些基因在各种排列中结合在一起时,可能会引起大量的组织学亚组和脑膜瘤的临床表现。3.

相反,癌症干细胞假说提出,促进肿瘤生长的细胞是罕见的,具有通过不对称分裂表现出来的多能潜能。起源于原始胚胎干细胞的癌症起源和发展的概念已经被确立,尤其是在组织学、增殖、分化和基因表达相似于胎儿组织和癌细胞的儿童恶性肿瘤中。我们发现了驱动脑膜瘤发生和细胞增殖的Wnt和神经嵴基因,这支持了一种假设,即在发育过程中活跃的保守分子过程也是脑膜转化的基础。一致地,我们在脑膜瘤中通过MR成像-分层体RNA测序和脑膜瘤细胞与人脑组织共培养的单细胞RNA测序来确定重叠的发育基因表达程序。我们所观察到的实验条件下基因表达程序的部分一致性,以及这些基因在发育和癌症中所起的不同作用,表明脑膜瘤基因表达的同一性和时间依赖于高度的背景和培养条件。事实上,我们还在脑膜瘤三维培养和共培养条件下发现了明显的早期基因反应,表明基因的上下文激活仅在特定的环境中发生,以响应重要的细胞信号事件。另外,考虑到直接早期基因反应的范围,脑膜瘤可能更广泛地由上游信号事件(如受体酪氨酸激酶、骨形态发生蛋白或Wnt激动剂)驱动的发育基因表达程序部分失活所致,类似于Hedgehog通路在基底细胞癌、髓母细胞瘤和其他遗传性和散发性恶性肿瘤中的失活。64。在其他脑器官模型背景下对脑膜瘤肿瘤发生的进一步研究可能会进一步阐明这些争议,但在此期间,这里提供的数据表明,细胞器代表了一种技术创新,以了解脑膜瘤的生物学,这是一个几乎没有可处理的模型系统的肿瘤。

许多预后模型已经被开发出来,以确定脑膜瘤复发的风险,包括那些基于组织学特征的模型。3、临床和人口特征65,成像变量45、转录19,66,67,以及DNA甲基化15,22,23。其中,DNA甲基化谱已成为一个强有力的诊断和预后指标,以分类脑膜瘤和估计复发的风险。然而,临床DNA甲基化谱是脑膜瘤已经建立在每个肿瘤的单一样本,增加了抽样偏差可能会影响基于甲基化的分类或预测的准确性。虽然在我们的研究中,DNA甲基化图谱的分层聚类根据它们的起源将空间上不同的样本聚在一起(补充图)。2),甲基化谱的随机森林分类显示了对来自单个肿瘤的空间上不同样本的广泛诊断确定性(补充数据)6),与已发表的研究结果一致,即细胞类型异质性的区域差异会影响基于dna甲基化的中枢神经系统肿瘤分类的准确性。68。相反,令人欣慰的是,在世界卫生组织的分级标准上,区域组织病理学差异在每个脑膜瘤的不同空间上是一致的。3。虽然这一发现可能会在更大的数据集中发生变化,但这里提供的数据证实了已知的脑膜瘤组织病理学特征和基因组结构的区域差异模式。30,31,32。我们的小样本数量和我们的第四纪医疗机构的转诊模式的局限性也带来了一种可能性,即我们报告的生物学可能反映了脑膜瘤患者更多人群中的异常值。虽然在我们的研究中,像M13这样的肿瘤在我们的机构中很常见,但是像这样的高度侵袭性脑膜瘤肯定不能代表平均脑膜瘤患者。

总之,我们的发现支持大量的文献证实现有的脑膜瘤预后的组织病理学标准,并指出在将新技术纳入临床决策中时,不应低估现有的、可靠的预后模型。相反,我们的结果表明,新的和旧的模型可以集成到优化患者的临床分层,就像我们以前使用脑膜瘤患者的临床、人口学和影像学特征以及肿瘤分级所做的那样。45,65。特别是,我们建议神经外科医生考虑在图像引导下对ADC升高的区域进行组织病理学评估,以确定它们是否包含可能预测侵袭性临床行为的特征,否则这些特征将无法被发现。将脑膜瘤DNA甲基化分类限制在ADC高区也可能降低诊断和预后的异质性。在此期间,我们的数据表明,高级别脑膜瘤ADC升高的分子方案是脑膜瘤治疗的潜在新靶点,人脑器官是研究脑膜瘤生物学和建立脑膜瘤临床试验生物学基础的有用模型。

方法

病人和样本

接受肿瘤取样进行研究的接受脑膜瘤切除的患者包括在该研究中,该研究得到了UCSF机构审查委员会的批准(10-01318和17-23196)。如果脑膜瘤(I)大到足以获得多个样本,(Ii)位于有利于安全的肿瘤内取样的区域,(Iii)未进行术前栓塞,则选择纳入病例。

受试者被带到手术室,用全麻镇静,并在固定的头部支架内进行脑膜瘤切除。术前立体定向MR图像使用立体定向神经导航系统(BrainLab AG)注册到三维物理空间。®德国慕尼黑)。使用解剖标志来确定配准的准确性。颅骨切除术按常规方式进行,一旦硬脑膜打开,在每次脑膜瘤切除前确认神经导航的准确性。外科医生选择立体定向的多平台分子图谱样本,目的是将标本均匀分布于整个肿瘤。然而,只有当外科医生认为停止切除、准确记录每个样本的立体定向坐标和收集组织以供研究时,才会收集样本。为此,使用一个微型垂体探针从每个地点采集100至200毫克样本。随后将神经导航探头放置在采集样本的地点,记录样本的数字成像和医学通信(DICOM)文件坐标,并拍摄截图以证实探针位置。脑膜瘤标本立即从手术现场取出,置于液氮或细胞培养介质中。

术前立体定向MR图像导入3D Slicer V4.869。脑和脑膜瘤分别用编辑模块进行分割,肿瘤体积用标记统计模块量化。将立体定向神经导航系统中的DICOM坐标输入标记模块,生成每个脑膜瘤的三维模型。

核酸提取

用All-Prep通用试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)从肿瘤标本中分离RNA和DNA.简单地说,将闪光冷冻肿瘤标本用β-巯基乙醇在RLT Plus缓冲液中解冻,然后用30 Hz不锈钢珠的QIAGEN(QIAGEN)进行机械分解,90 s后,按照制造商的方案(QIAGEN)进行标准化的自动化核酸提取。RNA质量通过芯片电泳(Agilent Technologies,WaldBronn,德国)进行评估,并根据需要使用RNeasekit(QIAGEN)进行清理。用分光光度法对DNA质量进行评价,并根据需要用DNA沉淀进行清理。

大量RNA序列分析

用TruSeq RNA文库预试剂盒v2(RS-122-2001,Illumina,San Diego,CA)对75例具有足够质量的脑膜瘤标本进行了文库制备,并在Illumina HiSeq 2500上进行了50 bp的单端阅读序列测定。FASTQ文件质量控制用FastQC进行,在调整适配器序列后,在四个基座的滑动窗口内,对读取进行过滤以删除基,而没有平均质量分数为20分。Http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)。使用带有默认参数的HISAT 2执行到人类参考基因组hg 19的映射。70。转录本以百万转录本(Tpm)计算,差异表达分析的显着性水平为q < 0.1 was performed using DESeq271。R中的集群Cons软件包用于分层聚类,使用前2000多个可变基因来确定所有样本的最佳组数。72。主成分分析是在统计环境RVersion3.4.3中使用基命令‘prcomp’进行的,参数‘Center=true,Scale。=false‘on log 2转换后的tpm值,伪计数为1。根据主成分分析空间前三个主成分中最大基因加载分数的绝对值对基因进行排序,这是根据主成分4及以上解释的方差递减来确定的,在比较簇或临床组时,对每个pc轴上的前250个基因或DESeq 2中全部差异表达的基因进行基因本体分析。35,36,37.

DNA甲基化阵列及其分析

甲基化分析是根据Illumina甲基化史诗BeadChip按照制造商的指示进行的。只有探测和检测P < 0.05 in all samples were included for further analysis. The minfi Bioconductor73R中的包用于预处理,并使用函数归一化进行规范化。74。根据以下标准对探针进行过滤:(I)去除针对X和Y染色体的探针(n=11,551),(Ii)去除含有常见单核苷酸多态性的探针(n=24,536)和(Iii)除去与hg 19人类参考基因组并非唯一映射的探针(n=9993)。共保留815,630个探针进行进一步分析。主成分分析使用RVersion3.4.3使用基本命令‘prcomp’进行,参数‘Center=true,Scale=false’使用β值(β=甲基化/[甲基化+未甲基化])。在探针水平差异甲基化分析中,使用了lima生物导体封装来拟合线性模型,该模型解释了数据的配对性质(fdr<0.001)。75. β值(甲基化/[甲基化+非甲基化])被用来分析甲基化水平和M数值用于统计分析(M=log 2[甲基/未甲基化])76。CNV配置文件是使用康梅包装68.

系统发育分析

使用曼哈顿距离度量法建立了一个使用二进制CNV调用的距离矩阵,与所有CNV都不存在的正常组织样本进行比较。一般最小二乘最小进化方法猿猴R软件包用于生成系统发育树。77。对归属于每个分支的CNV总数作了说明。

定量MR成像

在3.0Tesla扫描仪(DiscoveryMR 750;GE Healthcare,Waukesha,WI)上,采用神经导航技术,包括三维体解剖学序列、轴向扩散张量成像(DTI)和轴向动脉自旋标记(ASL)灌注成像。将术前MR图像导入3D Slicer v4.8.0中,输入立体定向神经导航系统中的DICOM坐标,生成具有样点的肿瘤三维模型。

对于空间上不同的样品的放射学特征,在每个点周围创建感兴趣区域,并用于下游图像分析。使用FMRIB的线性图像配准工具,DTI和ASL图像与3D T1后图像对齐。Http://fsl.fmrib.ox.ac.uk)。由dti成像数据集生成体素-体素adc图,在平均adc值(阈值0.8×10)处,通过双分割样本定义adc高和adc低区域。−3)。对于ASL灌注计算,脑血流量(CBF)图是在体素-体素基础上建立的.总共100毫米3在每个立体定向取样点划定了感兴趣的球状区域,以便收集定量扩散和灌注测量,允许组织移位和取样误差。

组织学、活体显微镜和免疫荧光

本文回顾了福尔马林固定石蜡包埋,4μ厚,苏木精和伊红染色切片的永久性组织病理学记录,并与一名神经病理学家对标本位置、ADC值、CNV、RNA测序和DNA谱甲基化进行了比较。

对脑膜瘤细胞进行免疫荧光检测。细胞固定在4%多聚甲醛中,用2.5%胎牛血清(FBS)、200 mm甘氨酸和0.1%TritonX-100在室温下用磷酸盐缓冲溶液固定30 min(Thermo Fisher Science,Waltham,MA),标记为抗Ki-67(AbCAM,剑桥,英国,ab15580);用Alexa Fluor二次抗体和Hoescht标记DNA(LifeTechnologies,Carlsbad,CA,H 3570),在室温下标记1 h,并安装在延长钻石抗结扎剂(Thermo Fisher Science)中。用MIB 1(Ventana Medical Systems,CA圣克拉拉,SantaClara,CA,790-4286)和抗FOXM 1(AbCAM,ab207298)对10μm脑膜瘤切片进行免疫荧光标记,室温下用人结肠癌和结肠癌组织标记32 min,再用Alexa Fluor二级抗体和DAPI标记DNA(LifeTechnologies),室温标记20 min。免疫荧光显微镜在Zeiss LSM 800共焦激光扫描显微镜上进行了平面Apo 20×空气物镜。使用ImageJ对图像进行了处理和量化,每个COVERLIP至少有三个不同的区域。观察者对条件视而不见,KI-67或FOXM 1标记被量化,并以每个视场中的核数目为标准。第一抗体的稀释度为1:100,次级抗体的稀释度为1:500。

一台装有温度和二氧化碳控制室的蔡司细胞观察盘共焦显微镜(卡尔蔡司AG,Oberkochen,德国)被用来记录脑膜瘤细胞与脑器官的实时相互作用。每5 min一次,共培养36h,共培养时用10×客观,0.4Na。

原发性脑膜瘤细胞与脑组织培养

从新鲜脑膜瘤切除标本中提取原代人脑膜瘤细胞系,机械切取约100 mg肿瘤组织,然后用1:1的DMEM/F12(生命技术,#10565)和神经基础培养基(生命技术,#21103)电镀,辅以5%FBS(生命技术,#16141),B-27补充剂(无维生素A,#12587),N-2补充剂(生命技术,#17502),1x GlutaMAX(生命技术,#35050),1 mm NEAA(生命技术,#11140),100 U/mL抗肿瘤(生命技术,#15240),20纳克/毫升表皮生长因子(研发系统,明尼阿波利斯,MN,#236-EG),20纳克/mL GF 2(PeproTech,Rocky Hill,NJ,#100-18C)。培养细胞融合,用DNA甲基化谱分析CNV与切除标本的一致性,转染tdTomato(M10G)或m血红(M13C,Benmen,MSC 1,MSC 5)红色荧光蛋白。人脑膜瘤本门细胞原代来源于脑膜瘤,转染hTERT以实现永生化。62。本门细胞在含10%FBS和1×GlutaMAX的DMEM(LifeTechnologies,#10313021)培养基中培养。

人脑器官是从人多能干细胞诱导的星形胶质细胞中产生的。52,78,79。简单地说,SB 431542和DMH-1(分别为2M,TUCRIS,#HY-10431和#4126)双重抑制诱导了WTC 11细胞的游离漂浮性神经上皮聚集物。第5天,在100 ng/mL Matrigel(Corning,Corning,NY,#356231)包衣板上播种集料,在DMEM/F12中培养,添加2 g/mL肝素(Sigma,St.Louis,MO,#H 3149),B-27补充剂,不添加维生素A,氮-2和100 U mL。−1反反,简称NPC媒体。在附着后5~7天,用机械分离的方法将玫瑰花转移到培养瓶中,并在NPC培养基中保存7天。因此,用10 ng/ml EGF和10 ng/mlFGF 2进一步培养花环聚集物,在大约12个月的时间内诱导星形胶质细胞分化。在细胞器形成之前,用mGFP(Addgene,Watertown,MA,#22479)转染细胞。

将早期星形胶质细胞与StemPro酰化酶(Thermo Fisher Science,A 1110501)分离,在原始表面超低附着V形96孔板(S-Bio,Hudson,NH,#MS-9096VZ)的每口井中播种7000个细胞。第5天,在加入脑膜瘤细胞之前,单个细胞器被转移到球状微板(Corning,#4515)上。将脑膜瘤细胞与StemPro酰化酶分离,在添加10 ng/mL EGF和10 ng/mL FGF 2的NPC培养基中,将2 0 0 0个脑膜瘤细胞分别加入单组分培养14天。

单细胞RNA测序

单细胞悬液用Accuase(Thermo Fisher Science)产生,用铬单细胞3‘库和Gel Bead Kit V3在10×铬控制器(10×基因组学)上加工成单细胞RNA-seq,目标细胞回收率为每样4000个细胞。在加州大学旧金山高级技术中心的IlluminaNovaSeq上,对100个碱基对的末端读取进行了测序,并使用CellRanger分析套件处理了由此产生的FASTQ文件(Https://github.com/10XGenomics/cellranger)对hg 38参考基因组进行比对,识别空液滴,并确定计数阈值,以便进一步分析。一个细胞质量过滤器,超过500个特征,但少于10000个特征,每个细胞,以及不到10%的读取计数归因于线粒体基因,被使用。在Suerat3.0中对单细胞UMI计数数据进行了对数归一化、前2000可变基因鉴定、UMI计数回归的基因定标和每个细胞线粒体基因的读取百分比的预处理。80。利用主成分分析进行降维,利用前10个主成分生成K-最近邻图。采用分辨率为0.3的方法进行聚类分析。对最小距离度量为0.2的约简数据进行了均匀流形近似和投影(UMAP)。使用Seurat3.0中的默认设置执行标记选择80.

CRISPR干扰与药理学

含有pMH 0001的慢病毒颗粒(UCOE-SFFV-dCas9-BFP-KRAB,Addgene#85969)81用标准包装载体转染HEK293T细胞反式IT-Lenti转染试剂(Mirus Bio,Madison,WI,MIR 6605).用这些慢病毒颗粒稳定地转染M10G细胞产生M10G。DCas9-KRAB细胞。利用SonySH 800的荧光激活细胞分选技术,成功地分离了BFP表达细胞。

单引导rna(Sgrna)原生质体序列分别克隆到bstxi和blpi位点之间的pcrispria v2载体(Addgene质粒#84832)中。82。每种载体均经原生质体Sanger测序验证。克隆了两种不同原代细胞的sgRNA表达载体(gCTGCATGGGGCGCGAATCA和GTGCACCCGGTAGGAGGGGGgggggggggggggggg)和CdH 2(GGGGCCGAGCGAAGAGGG和GGAGGGCCGACGAGGC),并汇总分析结果。一个原起搏器被克隆到目标PTPRZ 1(GAGCCGAGGCGCATGTCCTC)每个sgRNA表达载体和M10G都产生了上述慢病毒。DCas9-KRAB将每个sgRNA表达载体中的慢病毒单独导入细胞,用20g/mL的普罗霉素在7天内分离纯化细胞。

脑膜瘤细胞增殖试验,2D,M10GDCas9-KRAB细胞计数和每井25,000个细胞被镀在24孔板上,有玻璃盖板.用0.2mg/mL的ADH-1三氟乙酸酯(MonmouthJons,NJ,HY-13541A,经质谱验证)或同等体积的DMSO处理细胞。ADH-1作用72h后进行细胞检测和免疫荧光检测.在三维脑膜瘤细胞和器官共培养实验中,每3天更换一次含有ADH-1或DMSO的培养基。

定量逆转录聚合酶链反应

从脑膜瘤细胞株中分离出RNA,并根据生产工艺用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA)合成cDNA。利用PowerUp SYBR绿色主混合器和QuantStudio 6热循环器(ThermoFisher Science)扩增目标基因。用ΔΔCT方法计算基因表达,并将其归一化为GAPDH(义:5‘-CTTCACCATGAGAAGGC-3’,反义:5‘-GCATGACTTGGTCATGAG-3’)。目标基因引物CdH 2(意义:5‘-TCAGCGTCTGTAGGCTT-3’,反义:5‘-ATGCACCTCCTTCGATAGACTG-3’)和PTPRZ 15‘-GCTTTGATGCGGACCGATTTT-3’,反义:5‘-ACGATA CTTTCGACTCCA-3’)。

统计与重现性

所有实验至少进行了三次与相似的结果,包括不少于三个器官/脑膜瘤细胞共培养为每种情况。直方图和散点图显示平均±标准误差,或平均±95%置信区间。双尾学生未配对t使用测试和单向方差分析来比较所示的各组,具有统计学意义,如图*所示,定义为P≤0.05。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297