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端粒功能障碍激活YAP 1驱动组织炎症

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发表时间:2020-09-25 10:17作者:武汉新启迪Xinqidibio

生殖细胞端粒维持缺陷与人类炎症疾病的发病率增加有关,但端粒功能障碍是否和如何引起炎症尚不清楚。在这里,我们表明端粒功能障碍驱动pATM/c-ABL介导的YAP 1转录因子的激活,上调主要的促炎因子,亲IL-18。结肠微生物群刺激胞浆受体激活caspase-1,将亲IL-18切割成成熟的IL-18,导致分泌干扰素(IFN)-γ的T细胞和肠道炎症的发生。与此相对应的是,生殖细胞端粒维持缺陷患者的DNA损伤(γH2AX)信号伴随YAP 1和IL-18的表达升高。在端粒功能不全的小鼠中,肠上皮细胞端粒酶的重新激活或对ATM、YAP 1或caspase-1的药物抑制以及抗生素的治疗,可显著降低小肠炎症和IL-18的发生。因此,端粒功能障碍诱导的ATM-YAP1-proIL-18通路在上皮细胞中的激活是组织炎症的关键诱因之一。

导言

端粒是一种重复的核酸和染色质结构,它盖住染色体末端,由端粒酶维持,端粒酶由催化的端粒酶逆转录酶(TERT)和RNA组分(TERC)1,2。端粒维持缺陷与人类患慢性炎症的风险增加有关。3,4,5端粒功能障碍是否直接导致炎症或炎症相关的ROS的结果仍未得到解答。在……里面MTerc在CCl 4诱导的肝损伤中,端粒功能障碍促进肝脏炎症和肝硬化。6。相应地,具有生殖系突变的人类TERCTERT可发展为特发性肺纤维化;慢性肝细胞转换伴病毒性肝炎可导致肝脏炎症和肝硬化。4,7,8。端粒酶组分的生殖细胞突变表现为进行性绒毛萎缩、小肠结肠炎和上皮内淋巴细胞增生症。7。炎症性肠病(IBD)患者(溃疡性结肠炎和克罗恩病是两个主要实体)肠上皮细胞端粒磨损增加,甚至可能导致结肠癌的发病率增加。9,10,11。对于端粒功能障碍如何直接导致肠道炎症,从而为与端粒妥协相关的其他炎症状态的发生率增加提供线索的机制理解仍不清楚。Karlseder和他的同事最近的开创性工作表明,细胞危机中的端粒极短,可以激活cGAS/SING通路介导的反应,从而导致通过自噬介导的大规模细胞死亡,表明端粒功能障碍可能在引发炎症中发挥作用。12.

在这里,我们发现有端粒功能障碍的小鼠肠道炎症表型,主要涉及结肠的节段型。这些病理促使我们探索端粒功能障碍本身是否可以作为炎症的主要引发者和驱动者,揭示了在小鼠和人类中先前未发现的一种促炎症途径。

结果

肠道上皮端粒功能障碍引发炎症

为了研究肠道端粒生物学,我们产生了一种由lgr5启动子(lgr5-gfp-ires-creer)驱动的三苯氧胺(tamoxifen,TAM)诱导的cre等位基因的小鼠。T2)指导GFP和Creer的T2在Lgr5+上皮中的表达及(II)anMTert该等位基因可被CRE介导的由LSL-mTert位点(LSL-mTert)侧侧的转录停止盒缺失激活的等位基因激活。纯合子lsl-mTert小鼠代际杂交导致第3代(G3)和第4代(G4)出现DNA损伤信号,导致组织干细胞耗竭、器官萎缩和过早衰老。13.

对G4小鼠和端粒酶活性对照组(G0)进行肠组织学系列分析。在3个月大的时候(称为幼仔),大约40%的G4小鼠出现轻度结肠变性(附图)。1A,c;补充表1组织学评分定义见“方法”),显示隐窝和隐窝脓肿、轻微炎症和DNA损伤(补充表)。1;补充图。1A2GG4末端回肠表现为轻度隐窝病变较轻(附图)。1D)。在8个月大的时候,G0肠子继续表现出微小的病理改变,而所有的G4结肠都有多种糜烂和溃疡,同时伴有明显的隐窝炎和隐窝脓肿,并伴有慢性炎症(图一)。1A;补充表1;补充图。1F),增加了肠上皮细胞DNA的损伤(如图所示)。1B,c,补充图。2D,e)和显着的体重下降(如图所示。1D)。G4末端回肠呈中度病理改变,十二指肠和空肠均正常(附图)。1E)。8月龄G4肠子的免疫谱显示有丰富的CD4。+和CD8+T细胞,B细胞,巨噬细胞和树突状细胞。1F-I;补充图。2H-k)。这种相当大的T细胞浸润在以前的研究中具有重要意义,认为T细胞是炎症病理的关键驱动因子。14,15。健康完整肠的年轻G4小鼠的病理分析(低组织学评分)已经显示CD4增多。+和CD8+T细胞在固有层,尽管整体较低的淋巴细胞计数(CD 45+细胞)相对于年龄匹配的G0小鼠的正常免疫谱(补充图。2L-o)。因此,我们假设,从G4上皮发出的固有DNA损伤信号可能会分泌因子,吸收T细胞来引发组织炎症。

图1:肠道上皮端粒功能障碍导致炎症。
figure1

a8月龄G0和G4小鼠结肠组织苏木精和伊红染色n标度为100米。箭头表示隐窝炎、隐窝脓肿和粘膜下炎症。bγH2AX(箭头)在8月龄G0和G4小鼠结肠组织中的免疫组织化学染色n=3),标尺50米。c他莫昔芬对G0和G4小鼠结肠隐窝γH2AX染色细胞的定量研究n=3)。P值是用双面计算的。tG0与G4之间的测试(p < 0.0002), between G4 and G4 + TAM (p < 0.0003). d端粒熟练的G0和端粒缺失的G4小鼠死亡时体重(G)的变化n=18,G4,n=15,G0=TAM,n=16,G4+TAM,n=17)。P数值计算采用G0和G4之间的双边t检验(p=<0.0001),介于G4和G4+TAM之间(p < 0.0003). e三苯氧胺和他莫昔芬对不同基因型小鼠生存曲线的影响。虚线显示G4小鼠(54.6周)和G4+TAM小鼠(75周)(G0小鼠)的存活率为50%。n=15;G4,n=24;G0+TAM,n=15;G4+TAM,n=15)。P数值计算采用Mantel-Cox检验,在G0和G4之间(p < 0.0001) and between G4 and G4 + TAM (p < 0.0001). fi三苯氧胺或他莫昔芬对小鼠结肠固有层和肠上皮免疫细胞的影响n=6)。P值是用双面计算的。tG0和G4,G4和G4+TAM之间的测试。fCD 45,pG0和G4之间的值,p=0.0008,在G4至G4之间=TAM,p=0.0451。gCD3,pG0和G4之间的值,p=0.0097,介于G4与G4+TAM之间,p=0.0079。hCD4,pG0和G4之间的值,p=0.0022,介于G4与G4+TAM之间,p=0.0551。iCD8,pG0和G4之间的值,p < 0.0001, between G4 and G4 + TAM, p=0.0045。jTIN 2中TERT或蛋白质突变患者结肠活检的苏木精和伊红染色n=3)。两例患者的结肠活检显示隐窝炎,凋亡增加,固有层慢性炎症增加,隐窝轻度扭曲。k健康儿童/(对照组)和端粒病患者结肠上皮免疫组化γH2AX(对照组,n10;端粒功能失调患者,n=3)。l直方图显示正常人(对照组)和端粒功能失调患者结肠上皮中γH2AX染色强度的定量。γH2AX,p=0.0001。P计算值采用Fisher‘s精确检验。*具有统计学意义,p < 0.05 by unpaired Student’s t测试,两尾。n研究中使用的小鼠或病人活检的数量。数据用平均±扫描电镜表示。实验至少进行了两次独立的实验。也请参阅附图。1,补充图。2,以及附图。3和补充表12.

考虑到端粒功能障碍对所有器官系统的影响,我们试图确定端粒功能障碍,特别是肠上皮细胞的端粒功能障碍,是否在维持炎症病理过程中起着直接作用。为此,TERT基因表达仅在Lgr5中重新激活。+TAM作用于1月龄和6月龄G4小鼠(G4+TAM).端粒功能正常的G0+TAM小鼠作为TAM治疗对照组。经TAM治疗后,cre介导的lsl切除激活。TERTγH2AX在肠上皮中的表达和抑制,与端粒酶的重新激活和端粒的恢复一致。1B,c老老鼠;补充图。2B,f,g幼鼠)。年龄较大的G4+TAM小鼠病理呈梯度挽救,50%的小鼠经他莫昔芬治疗后30d后见隐窝炎、隐窝脓肿和炎症的部分挽救(附图)。1g,我),并对G4+TAM老年小鼠60天后的严重病理进行了明显的抢救,其中只有33%的小鼠表现为上皮增生、隐窝炎、隐窝脓肿和中到重度炎症(图一)。1A;补充图。1g-i;补充表1)。此时,对端粒酶重新激活的小鼠肠道的分析显示,Lgr5-EGFP+隐窝有明显的克隆性扩展(补充图)。2A-C)肠道再生的指示。对隐窝DNA损伤的分析表明,γH2AX阳性Lgr5-EGFP+细胞数量明显减少,提示干细胞室损伤有所改善(补充图)。2D,e)。与疾病解决办法一致(补充表格)1年龄较大的G4+TAM小鼠与G4对照组相比,体重恢复正常,总体存活率提高(G4+TAM小鼠中位生存期增加20.4周)(图二)。1D,e)。流式细胞术分析“老”和“年轻”G4+TAM肠显示T细胞显著减少(图1)。1F-I;补充图。2L-o)以及B细胞、巨噬细胞和树突状细胞的减少(附图)。2i-k)。我们的结论是,肠上皮端粒功能障碍引发并维持了一种炎症状态,这种炎症状态可以通过恢复端粒功能来逆转。

为了证实端粒-炎症在人类中的联系,我们分析了一组来自德克萨斯州儿童医院的21名患者,他们在儿童时期出现端粒功能障碍(中位年龄12岁,最后随访或死亡),其中8名有胃肠道症状的患者可进行肠活检。这些观察结果与霍普金端粒登记处胃肠症状增加的报告一致。7。8例患者中有5例出现肠道炎症征象(图5)。1J;补充表2),包括伴有嗜酸性粒细胞的急性肠炎/结肠炎和固有层慢性炎症的证据、增加的隐窝凋亡、隐窝炎、局灶性腺体损伤、轻度淋巴浆细胞性炎症、轻度再生性隐窝和明显的上皮内T细胞浸润(见图)。1J)。与年龄匹配的正常对照组相比,在这些患者样本中检测到了DNA损伤信号增强(γH2AX)。1K,l)。这些数据与端粒功能障碍在炎症中的驱动作用是一致的。

YAP 1作为免疫途径的关键调节因子的鉴定伊-18

对3月龄(幼龄)G0、G4和G4+TAM小鼠分离的结肠上皮细胞进行无偏RNA-seq转录分析,以鉴定可能导致炎症的纯化上皮中的基因网络。基因集富集分析(GSEA)显示端粒功能障碍与先天免疫途径(如干扰素、α、γ通路和补体通路)的过度表达有关。2A,b; p富集分数=0.62)。干扰素γ反应通路在该基因组中也显著上调(补充图)。三维空间)。(1)幼龄G0与G4隐窝差异表达基因的交集;(2)幼龄G4与G0和G4+TAM隐窝差异表达基因的交叉,提示先天免疫通路基因通过消除端粒功能障碍而发生急性逆转,G0水平趋于正常(附图)。3A)。同样,检测基因表达的变化,特别是在分离的Lgr5 GFP中。+来源于幼龄G0和G4小鼠结肠的干细胞/祖细胞(附图)。3B),确定炎症通路为顶级类别(补充图)。3C),以炎症小体通路为最高差异调节通路(图1)。2C,d).

图2:鉴定YAP 1是包括IL-18在内的免疫途径的关键调节因子.
figure2

aG0和G4小鼠结肠隐窝的RNA-seq分析和路径分析确定了几种与炎症有关的途径(n=2)。b基因组rna-seq分析的基因集富集分析曲线(a)描述了先天免疫系统的重要途径。p值0.02。(n=2)。c基因集富集分析曲线描述了gfp的rna-seq确定为最顶端的炎症小体通路。+G0和G4小鼠结肠上皮细胞分类n=3)。d谷胱甘肽分析从绿色荧光蛋白中鉴定的顶层细胞过程途径+G0和G4小鼠结肠分选细胞。(n=2)。e用所述基因型小鼠的结肠裂解液进行IL-18的ELISA检测(n=5)。P值是用双面计算的。tG0和G4,G4和G4+TAM之间的测试。PG0和G4之间的值,p < 0.0001, between G4 and G4 + TAM, p=0.0031。f他莫昔芬对G0和G4小鼠结肠上皮裂解物caspase-1和IL 18抗体的免疫印迹n=2)。g三苯氧胺对G0和G4小鼠肠道溶解物免疫印迹的研究(n=2)。hG0和G4小鼠经他莫昔芬、亲IL-18治疗后肠道炎症通路基因的qRT-PCR分析(英文)n=3)。P在G0与G4、G4和G4+TAM之间进行双边t检验。PG0和G4之间的值,p=0.0067,介于G4与G4+TAM之间,p=0.0063。iGSEA图显示YAP 1G4上皮与G0上皮的基因标记p=0.006)。j用YAP 1抗体鉴定的G0和G3隐窝上皮基因重叠。kYAP 1对G3上皮中差异结合基因的富集分析n=4)。l芯片-seq数据显示,与G0端粒熟练上皮相比,G3端粒功能失调上皮中的YAP 1在启动子和炎症体通路基因中的占用率增加。m用他莫昔芬或不加他莫昔芬治疗G0和G3肠类中YAP 1或IgG的染色质免疫共沉淀。用针对红色包被的特异位点和YAP 1结合位点以外的非特异性位点1Kb的引物,对所指示的基因进行qRT-PCR检测。(n=3)。P在G0与G4、G4和G4+TAM之间进行双边t检验。PG0和G4之间的值,p=0.0013,介于G4与G4+TAM之间,p=0.0003。*具有统计学意义,p < 0.05 by unpaired Student’s t测试,双尾和费舍尔的精确测试。n,研究中使用的小鼠数量。数据用平均±扫描电镜表示。实验至少进行了两次独立的实验。也请参阅附图。2.

鉴于炎症小体通路在本模型中的突出地位及其在肠道炎症性疾病发病机制中的作用。16,17,我们评估了该通路在上皮细胞中激活的下游后果,即caspase-1裂解、IL-1β和IL-18的成熟和分泌。18,19,20,21,22,23。结肠上皮细胞裂解物的细胞因子阵列和肠类RNA的定量检测表明,幼龄G4细胞中IL-1α、IL-1Ra、TNF-α和IFN-γ表达增加(补充图)。3E-g)。由于细胞因子阵列不包括IL-18,进行了ELISA和确认性免疫组织化学检查,证明G4结肠裂解液和组织切片中IL-18水平升高;反之,G4+TAM结肠裂解液和组织切片端粒酶重新激活后,IL-18水平下降(见图)。2E;补充图。3H)。由于caspase-1将亲IL-18切割成其成熟的分泌形式,我们对端粒功能失调小鼠上皮中活化的caspase-1(裂解p20)和成熟形式的IL-18进行了鉴定和记录,其表达在端粒酶重新激活后降低,与炎症小体途径激活相一致(见图)。2F).

进一步证实肠上皮细胞是IL-18的主要来源,IL-18是溃疡性结肠炎等炎症性疾病中已知的T细胞聚集因子。24,25,26我们检测了幼龄G4小鼠纯肠上皮样细胞培养中IL-18的水平(附图)。3I证实γH2AX信号消失后,端粒功能障碍的肠类上皮细胞中亲IL-18蛋白表达增高,端粒酶活性降低(如图1所示)。2G,h;补充图。3J)没有任何变化。亲IL-1β(补充图3K)...我们观察到亲IL 18对成熟IL 18的体外切割是可以忽略的。2G).

为了鉴定促IL-18的转录因子以及Nlrp1b、NLRC4和NLRP 6等炎症受体,我们对TRANSFAC启动子进行了分析,并鉴定了几个进化上保守的一致结合基序,包括NFATc 1、HNF4a、NKKX2.3、IRF 4/9和TEF。这个TEF有约束力的元素成为我们进一步调查的首要任务,因为它的合作伙伴,YAP 1,是已知的转录共激活剂,在y 357被经典的dna损伤信号分子atm和c-abl磷酸化。27,28,导致YAP 1的稳定和核定位。而急性DNA损伤诱导的YAP 1激活则可诱导细胞死亡。27YAP 1在端粒功能障碍引起的慢性DNA损伤信号下的激活,尤其是在衰老和炎症性疾病的背景下,其作用尚未得到探讨。为了探讨yap 1是否驱动了端粒功能失调小鼠的表型,我们比较了rna-seq在比较g0和g4上皮时发现的上调基因集。YAP 1基因标记29,显示激活YAP 1G4上皮的特征(标准化富集评分,NES=1.36和p=0.006)(图1。2I).

为了进一步研究YAP 1在调节免疫通路方面的作用,我们对G0(端粒完整)和G3(端粒功能失调)结肠隐窝组织进行了无偏的芯片-seq分析。通过对YAP 1结合基因的分析,发现G3上皮共有10,589个基因,而G0上皮中则有7627个。其中只有344个基因重叠,而在G0和G3隐窝上皮中分别有7283和10245个基因与YAP 1唯一结合。2J)。这与端粒功能失调上皮中基因启动子的YAP 1占用率较高相一致,与端粒功能障碍时YAP 1的高表达和稳定性呈正相关。谷胱甘肽的通路分析显示,肿瘤坏死因子-α通过NF-κB信号通路是G3上皮中最顶端的通路,而其他与p53和凋亡有关的途径也存在于前10条通路中(图1)。2K)。相比之下,与增殖相关的几条途径在G0中排在前10位(补充图1)。3L)。值得注意的是,我们确认在NLRP1B,NLRP 6,NLRC4,以及伊-18基因启动子在G3和G0上皮中的表达2L)。最后,抗YAP 1芯片验证了YAP 1与亲IL-18启动子区的结合,与G0对照相比,G3肠系膜上的结合增高,而G3+TAM则相反,YAP 1与G3+TAM的结合减少(图二)。2M)。这些不偏不倚的分析支持了YAP 1在端粒功能障碍背景下引起炎症的显著作用。

端粒功能障碍激活YAP 1

在我们的模型系统中,在端粒功能失调的肠类中检测到更高水平的磷酸化ATM、Chk 2和YAP 1(Y 357),这些信号在端粒酶重新激活时被降低。3A)。虽然NF-κB是许多炎症基因的主要转录调控因子,但我们记录到在这些样本中,关键的NF-κB通路成分(pNF-κB,IκB和PIκB)的磷酸化没有改变(图1)。3A)。在G4肠道,在结肠隐窝(干细胞和祖细胞)中检测到较高水平的YAP 1核定位。3B)类似于IL-18的分泌模式(补充图)。第三代而YAP 1的核信号在端粒酶重新激活后减弱(如图所示)。3B)。重要的是,德克萨斯州儿童端粒登记处的患者活检显示YAP 1的稳定和结肠上皮中IL-18水平的上调(图一)。3C,d;补充图。4A),进一步支持端粒功能障碍激活这一途径来驱动炎症的模型。

图3:端粒功能障碍激活YAP 1。
figure3

a用他莫昔芬或不加他莫昔芬治疗G0和G4小鼠肠道肠溶物的免疫印迹n=2)。b三苯氧胺和他莫昔芬对G0和G4小鼠结肠隐窝YAP 1免疫组织化学的影响n=3)。标度棒,50m.inets表明YAP 1在G4小鼠中的核定位高于其他小鼠。c健康儿童(对照组)和端粒病患者结肠上皮免疫组织化学检测YAP 1和IL-18。(控制,n10;端粒功能失调患者,n=3)d直方图描述健康(对照组)和端粒功能失调患者结肠上皮YAP 1和IL-18染色强度的定量。YAP 1,p=0.0035 IL-18,p=0.0001。(控制,n10;端粒功能失调患者,n=3)。e从YAP 1(S127A)转基因小鼠中分离出的肠道指示基因经多西环素处理或不加多西环素处理后,qRT-PCR可抑制降解,提高稳定性和核定位。n=3)。P用双侧t检验计算未处理的DOX和DOX处理的有机物的值。以下是p-亲18岁的价值观,p < .0001, Vgll3, p=0.0067,Cyr 61,p < 0.0001. f传送或控制载体上肠系膜的显微图像YAP 1ShRNAs介导的肠类物质(n=2)。标尺,30米。gQrt-pcr对g4肠系膜上的指示基因进行qrt-pcr检测。YAP 1ShRNAs(n=2)。每个样本的柱状图用单个条形图显示。h用普罗霉素在CRL-1831细胞中表达TRF 2、ΔB、ΔM质粒或对照载体1d后进行Westernblot分析。i用高表达TRF 2、ΔB、ΔM质粒的CRL-1831细胞或对照载体进行分离。jYAP 1在照射后或对照G0结肠隐窝中的免疫组化染色显示,照射后YAP 1呈较高的核阳性染色。标尺,50μm。k辐照或对照G0结肠隐窝中YAP 1和pYAPY 357磷酸化蛋白的westernblot显示,照射后磷酸化水平较高(n=3)。l用qRT-PCR技术检测正常人和照射后结肠G0细胞前IL-18细胞RNA的定量PCR(QRT-PCR)(英文)n=3)。P值是用双面计算的。t测试,p=0.0122。*具有统计学意义,p < 0.05 by unpaired Student’s t测试,双尾和费舍尔的精确测试。n表示研究中使用的老鼠数量。“Ab”表示抗体,“I”表示输入样本。每个实验至少进行两次。数据用平均±扫描电镜表示。也请参阅附图。3.

从多西环素诱导的r26-yap 1转基因小鼠中提取的肠类物质证实了yap 1的作用。30表明高水平的转基因表达YAP 1(补充图。4B)与未诱导的肠类动物相比,pIL-18和Vgll 3、Ankrd 1和Cyr 61(直接YAP 1靶标)的表达水平较高(如图1所示)。3E)。相反,shRNA介导的YAP 1缺失在端粒功能失调的肠类中表达减少。亲IL-18与矢量控制相比(图1)。3F,g;补充图。4D-f;补充表4).

炎症小体激活是诱导caspase-1与caspase-1发生断裂的关键协同因子,而caspase-1又能切割亲IL-18到成熟的IL-18。31。此外,雅普芯片-seq数据来自我们的研究以及Gregorieff等人。学习29还证明了伊-18, NLRC4,Nlrp1bNLRP 6与其他几个炎症基因一起是YAP 1的靶点,其中许多基因在我们的rna-seq数据集中也有差异表达。因此,我们研究了能够组装炎症体的关键微生物受体的表达。在我们的模型中,我们观察到关键的炎症体蛋白(Nlrp1b,Nlrp 3,NLRC4和NLRP 6)在端粒功能失调的肠类中的表达增加,端粒酶活性下降(补充图1)。4G-j)。此外,微生物受体在YAP 1ShRNA治疗G4肠类物质(附图)。4F)和增加微生物受体和炎症途径基因的表达Nlrp1b, NLRP 3, NLRC 4NLRP 6也观察到YAP 1激活的肠类物质(补充图)。4C).

为了获得端粒功能障碍驱动的YAP 1激活的额外遗传学证据,强制表达显性阴性TRF 2(ΔBΔM)的CRL 1831结肠细胞株CRL 1831伴随着pγH2AX、pATM、pYAP 1(Y 357)和亲IL-18水平的升高(图五)。3H)。细胞分馏研究进一步证实了pYAP 1(Y 357)核定位的增加。3I)。此外,中等电离辐射(2Gy/d×5d)显示,YAP 1在结肠隐窝上皮中的定位增强,与以前的报道一致。3J),YAP 1在Y 357时磷酸化增强(图1)。3K)。在这些暴露在红外辐射下的地穴中,我们记录了高举。亲IL-18MRNA水平(图1.3L)和更高的水平Nlrp1b、Nlrp 3、NLRC4和NLRP 6MRNA(附图)4K-n)。我们认为来自端粒的DNA损伤信号可以稳定和激活YAP 1,而YAP 1又直接促进关键炎症基因和亲IL-18的转录。

抑制ATM和YAP 1减少IL-18分泌,减轻炎症反应

为了验证ATM-YAP 1信号在调节亲IL-18表达中的功能和翻译相关性,我们用Am(0.1μM×24 h)或YAP 1抑制剂(4μM×24 h)治疗G4肠类动物,并评估其亲IL-18水平。虽然这种短暂的治疗并没有损害细胞的活力(由切割的caspase-3决定),但在pYAP 1(Y 357)水平和亲IL-18水平上观察到明显的下降,表明ATM和YAP 1在G4肠类细胞中具有端粒功能障碍,并能驱动亲IL-18的转录(如图所示)。4A,b).

图4:抑制ATM和YAP 1可减少IL-18的分泌,减轻炎症反应.
figure4

a用或不加ATM或YAP 1抑制剂治疗G4肠类肠溶物的免疫印迹抗体(n=2)。bQRT-PCR检测单用DMSO或ATM或YAP 1抑制剂处理的肠道RNA所指示的基因(n=4)。P值是用双面计算的。t测试一下。以下是p-价值观,亲IL18,p=0.0030,Nlrp1b,p=0.0018,Nlrp 6,p=0.0015,Nlrc 4,p=0.0010。c代表端粒功能障碍介导的炎症小体通路的模型,以及YAP 1、caspase-1或抗生素抑制剂抑制该途径导致caspase-1分泌减少和结肠上皮分泌IL-18减少的节点。dG4小鼠结肠组织苏木精和伊红染色。(控制,n=5;经处理的抑制剂,n=6)。标尺,50μm。eG4小鼠肠道表型的病理组织学评分(对照组、对照组):用或不加椎卟啉(YAPI)治疗的G4小鼠肠道表型评分。n=5;经处理的抑制剂,n=6)。P数值计算采用双边t检验,p=0.0048。f免疫酶联免疫吸附法检测G4小鼠结肠上皮中成熟IL-18的表达n=5;经处理的抑制剂,n=6)。P值是用双面计算的。t测试,p < 0.0001. gG4小鼠结肠上皮中溶菌物的Westernblot分析n=3)。*具有统计学意义,p < 0.05 by unpaired Student’s t测试,双尾。n表示研究中使用的老鼠数量。数据用平均±扫描电镜表示。实验至少进行了两次独立的实验。

由于IL-18在结肠上皮中的分泌增强被认为是一种损伤性和可能的炎症诱导剂,我们认为通过抑制其上游诱导剂降低IL-18的可能性可以作为一种潜在的治疗策略(图一)。4C)。因此,除了上述基因验证外,我们还从药理学上抑制了yap 1与vpf或caspase-1抑制剂ac-yvad-cmk的关系。32在三个月大的G4小鼠中,与年龄匹配的对照组相比,炎症减少(如图所示)。4D,e;补充图。5C,d),减少上皮细胞IL-18的表达(如图所示)。4F,g;补充图。5E,f)和低表达的干扰素-γ(补充图)。5A,g)。治疗后小鼠YAP 1和pYAP 1(Y 357)水平降低,亲IL-18和成熟IL-18水平降低(图二)。4G;补充图。5F)。值得注意的是,在治疗组中也观察到Proaspase-1切割减少,这加强了YAP 1通过转录调控参与炎症体组装和proaspase-1切割的关键微生物受体而促进炎症体激活的作用(如图1所示)。4G)。因此,维甲酸治疗导致参与炎症小体组装的几个炎症通路基因的表达减少(补充图)。5B).

肠道微生物体通过与上皮和免疫细胞的相互作用和诱导caspase-1的断裂而在肠道炎症的诱导中发挥重要作用。此外,G4结肠相对于小肠的疾病严重程度与小肠相对于结肠的微生物负荷减少是一致的(补充图1)。6A)33,34G0和G4小鼠的微生物组分略有差异(附图)。6B)。为了探讨肠道微生物群在IBD诱导中与端粒功能障碍的潜在协同作用,我们在饮水中用广谱抗生素(甲氧苄啶-磺胺甲恶唑)治疗小鼠,以减少肠道微生物负荷(附图)。6C)。经结肠镜检查,G4小鼠出现上皮性溃疡,用抗生素治疗1个月。与未治疗的对照组相比,治疗组在疾病病理学方面表现出明显的减少(补充图)。6d,e),亲IL-18和成熟IL-18水平(补充图.)6f,g),caspase-1切割(附图)。6g)和干扰素-γ分泌(补充图。六小时)。这些数据共同支持一个模型,端粒功能障碍介导的YAP 1磷酸化和转录激活,以及肠道微生物介导的caspase-1切割聚合在成熟的IL-18的高产量,导致招募干扰素-γ分泌T细胞启动和维持炎症。

讨论

在这项研究中,人类和小鼠的分析确定了端粒缺陷维持与炎症疾病之间神秘联系的机制基础。我们发现端粒功能障碍激活ATM/YAP 1,上调上皮细胞中的亲IL-18。这一途径与caspase-1协同作用,导致成熟的IL-18分泌升高,诱导驻留T细胞分泌IFN-γ,使组织炎症和损伤长期存在。体外抑制ATM的药理作用,体外抑制YAP 1的药理和遗传抑制作用,体内抑制YAP 1或Caspase-1的药理作用,抑制IL-18分泌,减轻炎症反应。由于端粒功能失调小鼠的肠道炎症表型可以通过抑制YAP 1或caspase-1而得到改善,这些策略也可能为其他炎症性疾病的治疗提供潜在的机会。

本文的研究结果挑战了当前的教条,即端粒损伤仅仅是炎症的结果,相反,端粒功能障碍是炎症过程的主要致病驱动因素。沿着这些思路,我们自己关于端粒相关蛋白的生殖细胞突变患者的数据,以及最近一项关于年轻的突变患者胃肠表现的研究。TERT, TIN 2,TRF 2,TR基因显示最常见的下消化道表现为薄橄榄炎、绒毛萎缩、隐窝脱落和上皮内淋巴细胞增生症。7。最后,有几项研究表明溃疡性结肠炎患者肠上皮中的短端粒与疾病严重程度呈正相关,增加了前馈环加速端粒功能障碍和增加炎症的可能性。10,35。因此,我们的机械和小鼠遗传学研究,以及这些相关的临床观察,强烈地将端粒功能障碍作为慢性肠道炎症性疾病的主要致病因素。在Lgr5-CreERT2模型中,该等位基因表现为马赛克基因的表达,从而对肠道退变表型进行局部挽救。肠的部分恢复,再加上所有其他器官系统的持续退化表型,与我们先前关于广泛的端粒酶重新激活的研究相比,可能是存活略有增加的原因。13。此外,虽然我们观察到肠上皮特异性端粒酶重新激活对肠道炎症有很强的逆转作用,但考虑到肠内持续存在衰老间质,更广泛的系统激活端粒酶将具有更大的抗炎治疗效益。我们的救援行动的稳健性,再加上衰老的基质已知能释放促炎细胞因子的事实。36,37,强调肠上皮在模型中的中心地位。未来的研究应考虑使用cre表达模型,在所有肠道上皮细胞中显示出普遍的活性,以使更完整的上皮端粒酶重新激活(例如,LSL-mTert x Olfm4-IRES-eGFPCreERT 2维林-克里埃特2)以及评估基质中端粒酶活性的杂交(例如,LSL-mTERT xαSMA-CreERT 2).

我们工作的一个重要发现是YAP 1在控制亲IL-18基因表达考虑到SNP的存在,YAP 1作为肠道炎症的驱动因素的功能是很有趣的。TEF在IBD患者中,TEF是YAP 1的转录辅助因子。38。Karin实验室最近的工作也加强了这一点,该研究确认了yap在ibd患者活检中的过度表达。39。因此,我们推测我们的模型可以提供一个系统来测试这种顽固性疾病的预防和治疗策略,并确定YAP或IL-18抑制是可行的肠道炎症治疗靶点。总之,我们的比较小鼠和人类的分析揭示了端粒功能障碍在炎症中的直接作用,在端粒维持基因突变个体的炎症疾病发病率增加的基础上,揭示了端粒功能障碍的直接作用。

方法

人类主体

根据“赫尔辛基原则宣言”,对端粒生物学障碍患者进行了调查。根据贝勒医学院及其附属医院机构审查委员会批准的H-17698遗传和生物决定因素,参与者在被纳入研究之前接受了知情同意。为本研究目的而被调查的对象包括:n(21)已知的端粒生物学紊乱。

小鼠

这个Lsl-mTert等位基因和Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2 13,40在其他地方也有描述。这个Teto-Yap(S127A)30论文中使用的是哈佛大学的费尔南多·卡马戈(Fernando Camargo)。在50%湿度下,环境氧条件下,12小时光/12小时暗循环中,将小鼠安置在屏障设施中,室温25°C。

动物实验

所有的小鼠操作都经过MD安德森癌症中心动物保护和使用委员会(IACUC)的审查和批准。所有动物都保持在无病原体的条件下,并按照国际实验动物保护评估和认证协会(AAALAC International)的政策和认证予以照顾。2月龄或6月龄端粒功能失调小鼠,每日腹腔注射10μl 10 mg/ml他莫昔芬(Sigma),连续5天激活端粒酶活性。对于抗生素治疗,在4-5月龄时对端粒功能失调的小鼠进行了结肠镜检查,以监测炎症情况。对YAP 1抑制剂治疗,用YAP 1抑制剂维甲酸(Selleckchem,100 mg/kg,PBS)或载体分别腹腔注射14天。14天后,将治疗组和未治疗组小鼠进行安乐死,取肠,立即用福尔马林固定。用caspase-1抑制剂ac-YVAD-CMK 1.25mg/kg处理G4端粒功能失调小鼠2周。两周后处死小鼠,取肠。用或不加TMS(甲氧苄啶、西格玛、甲氧苄啶0.13 mg/ml、磺胺0.67 mg/ml)治疗G4小鼠结肠炎症。一个月后,对小鼠进行安乐死,并收集其肠道。

组织学分析和免疫组织化学及免疫荧光

以瑞士卷的形式制备小鼠肠,以便于对整个肠段进行组织学评估。将肠组织固定在10%中性福尔马林中,石蜡包埋,切成5m切片,用苏木精和伊红染色。根据隐窝炎、隐窝脓肿、糜烂、溃疡、杯状细胞耗竭、固有层慢性炎症加重、基底浆细胞增生症、黏膜下炎症、Paneth细胞上皮化生和隐窝变形等标准,对2名独立病理学家进行盲组织学评估。根据每只动物的评分计算平均值。这些平均值用GraphPad棱镜V8绘制,并生成直方图。免疫组织化学是通过一个既定的协议进行的。41。具体来说,在60℃下烘烤1小时,并通过二甲苯和乙醇梯度进行离聚和再水化。在pH为6.0的柠檬酸缓冲液中,在凹槽中进行抗原解掩蔽。在0.1%TritonX-100中用3%BSA、10%山羊血清阻断非特异性信号。肠组织标本用以下抗体染色:GFP(D5.1,细胞信号技术,1:200,#2956,ABCAM,1:500,ab 13970),γH2AX(Ser139)(Milli孔隙,1:500,05-636),YAP(NOVUS生物制品,1:200,NB 110-58358),IL-18(ABCAM,1:200,ab71495)和(Sigma 1:200,HPA 003980),IFN-γ(AbCAM,1:1000,ab183685),caspase-1(ABCAM,1:200,ab108362)。

病人活检的组织病理学评价

从德州儿童端粒登记处的Alison Bertuch博士那里采集3例儿童端粒病患者的活检标本,免疫组织化学以1(弱染色=低表达)、2(中度染色=中表达)和3(强染色=高表达)的比例记录上皮细胞。每个病人的活检在检查了每一次活检的三个不同的显微镜区域后进行评估,评分由两个独立的董事会认证的病理学家以盲目的方式分配。

γH2AX定量

γH_2AX(S_(139))在小肠干细胞和祖细胞群中均有阳性信号,并从3只小鼠不同肠段的平均100个隐窝中检测。

GFP阳性隐窝定量

对5只8月龄小鼠经他莫昔芬治疗和不加他莫昔芬治疗的8月龄小鼠的隐窝中是否存在GFP阳性细胞进行了检测。计算百分比。对8月龄的5只8月龄小鼠G0和G4的γH2AX表达情况进行了检测,并对其进行了检测,无论他莫昔芬是否作用于G0和G4。

流式细胞术

从端粒缺乏或熟练的小鼠中分离出结肠固有层淋巴细胞,用他莫昔芬治疗或不使用他莫昔芬,根据既定的治疗方案。42。取肠组织除去脂肪和肠系膜,在37°C下用2mm EDTA浸泡30 min,去除隐窝上皮。将组织切成块,用0.2mg/ml胶原酶VIII型(Sigma)和DNaseⅠ(Sigma)消化,37℃摇动10 min。细胞经100 m过滤后,在黑暗中用CD 45(APC-Cy7)、CD3(BV 510)、CD4(PECy 7)、CD8(AF 700)、CD11b(BV 605)、B 220(PE)、F4/80(PerCP)染色30 min。用FlowJoV 10对数据进行分析。

RNA的提取与qRT-PCR

用2mM EDTA在4℃下培养30 min,分离出结肠上皮细胞。将RNeaseMini试剂盒的RLT缓冲液直接添加到含有100个肠类物质的井中,提取RNA。用DNase从试剂盒(奇根)中去除DNA。用RNAquous-microtalRNA提取试剂盒(Invitrogen)从GFP分离的干细胞/祖细胞中分离RNA。用Invitrogen上标试剂盒获得cDNA。用1x SYBR绿色PCR主混合物(应用生物系统)进行qRT-PCR,引物对其熔融曲线进行了优化(见补充表)。3)。以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表达为阳性对照。

RNA-seq

RNA是按上述情况分离出来的。RNA-seq由MD Anderson的测序和微阵列设施(SMF)核心进行.库使用Illumina的TruSeq工具包生成,并使用Illumina HiSeq 2000 Sequencer进行排序。原始测序数据(bcl格式)使用Illumina casava软件(v1.8.2)转换为FASTQ文件,并使用STAR软件与小鼠参考基因组(MM 10)对齐。Htseq计数程序用于生成每个基因的原始读取计数。采用R软件包Edger进行数据归一化和差异表达分析,采用对数2倍变化≥0.5或≤−0.5和p值≤0.1的标准。基于上述差异表达分析的p值,用GSEA软件进行路径富集分析,并利用R包热图进行聚类可视化。为了分析YAP标记基因,获得了YAP签名基因29的列表,并将其格式化为与GSEA兼容的通路数据库(GRP格式)。用Illumina HiSeq 2000测序仪对小鼠结肠上皮细胞RNA进行分离和测序。此外,我们还获得了92个IBD基因标记面板(溃疡性结肠炎和克罗恩病患者之间常见的)。

肠类培养及治疗

根据Sato和Clevers的既定程序培养肠类物质。43。取回肠纵行切开,用2mm EDTA冷冻PBS孵育30 min,用手进行短暂摇动,分离出隐窝。然后,这些地窖通过70m过滤器过滤,并嵌入Matrigel中。Matrigel采用高级DMEM/F12培养基,添加2mM GlutaMax(Invitrogen)、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉菌素(Invitrogen)、N2补充剂(Invitrogen)、B-27补充剂(Invitrogen)、小鼠重组EGF(R&D系统)、100 ng/ml小鼠重组Noggin(PeproTech)、500 ng/ml人RSP 1(R&D系统)。用或不加他莫昔芬(0.2mg/ml)培养5天,检测端粒酶诱导和γH2AX水平。对同一代G0和G4肠胃进行比较,试验均先于第10代进行。在24孔板的每口井中,均在30×10孔的Matrigel的每孔内镀相同数量的G0和G4肠系膜,与不加他莫昔芬处理的G0和G4肠系膜相同。对于慢病毒shRNA转导,在含WNT的高浓度培养基中培养48h,分别与CHIR 99021(1m,干细胞技术)和烟酰胺(10M,Sigma)共同培养48h。采用超离心法分离病毒颗粒,溶于含Jagged-1肽(1M,AnaSpec)、烟酰胺(10 M,Sigma)、N-乙酰半胱氨酸(1m,Sigma)、CHIR 99021(1M,干细胞技术)、Y-27632(1M,干细胞技术)和聚丁烯(1:1000,M)的培养基中。用TrypLE(吉布科)消化肠类物质,并在600×病毒下进行刺切。g在48井板中,在32°C下工作45 min.肠类病毒混合液在37℃下孵育3h,接种于带刺细胞培养基的Matrigel圆顶中2天。在整个实验过程中,用2 g/ml普罗霉素进行肠类物质的筛选。将肠类物质分别用ATm抑制剂(KU-60019,0.1μM,24 h)和YAP 1抑制剂(维甲酸,4 M,24 h)处理,第2/3天取同一代肠类肠类动物,将Matrigel溶于冰冷介质中。用蛋白酶鸡尾酒和磷酸酶抑制剂在RIPA缓冲液中消化蛋白质。

Westernblotting和抗体

肠类动物用冷PBS清洗去除Matrigel。球粒在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中溶解,在冰中孵育30 min。裂解物以13,000×离心g在4°C下,用DC蛋白分析试剂盒(Bio-Rad)测定蛋白质浓度。采用SDS-PAGE和免疫印迹法对4-20%梯度凝胶和3-8%三乙酸酯梯度凝胶(Invitrogen)进行免疫印迹.抗磷脂组蛋白H2AX(Ser 139)(Milli孔隙,克隆JBW 301,05-636,1:1000),ATM(Novus生物制剂,NB 100-104,1:500),pATM(Ser1981;Novus生物制剂,NB 100-306,1:500),c-abl(细胞信号传递,#2862,1:1000),Chk 2(细胞信号技术,目录#2662,1:1000),pCHK 2(Thr 68),(细胞信号技术,2661,1:1000),总YAP 1(Novus生物制剂,NB 110-58358,1:1000),pYAP 1(Y 357)(ABCAM,ab 62751,1:1000),NF-kB(细胞信号,#9936,1:1000),pNF-kB(细胞信号,#9936,1:1000),IKB(信号传递,9242,1000)1:1000,pIkB(细胞信号传递,#9246,1:1000),IL-18(AbCAM,1:1000,ab 71495),亲IL-18(Proteintech,10663-1-AP,1:1000),成熟IL-18(MBL国际公司,克隆39-3F,1:1000),裂解caspase 3(细胞信号,#9661,1:1000),caspase-1(P20)(Adipogen,AG-20B-0042-c100H3,1:1000),H3(Sigma,1:1000,H0164),h2A.X(Proteintech,1:1000,1000)。10856-1-AP),微管蛋白(Sigma,1:1000,T 9026)和肌动蛋白(Sigma,1:5000).原始的未裁剪的图像为westernblot数据提供在源数据文件中。

细胞和质粒

CRL 1831细胞系从ATCC购买,并按照制造商的指示进行培养。将TRF 2ΔBΔM克隆到pLPC载体上,从Add基因(质粒号18008,质粒12540)中获得载体对照质粒。用pVSV-G和pHIT 60将逆转录病毒包装在293 T细胞中。将所用的慢病毒shRNA质粒克隆到pLKO载体上,从Sigma Aldrich获得载体对照。采用第二代包装载体psPAX 2(Addgene质粒12260)和pMD2.G(Addgene质粒12259)将慢病毒包装在293 T细胞中。本研究中使用的慢病毒shRNAs列于补充表中。4.

细胞分馏

细胞分馏按照制造商的程序进行(培养细胞的热科学亚细胞蛋白分馏试剂盒)。Westernblot检测各组蛋白质负载量。

染色质免疫沉淀和芯片-seq法

芯片是按照既定的协议执行的。41。QRT-PCR以亲-IL-18、小鼠-3880、5‘TTCAAAGCGGTCTTTGGA 3’和5‘CACTGAGACCTGGGGC 3’(反向)和非特异性−879、5‘GTAATCCACTGGGGGGGGT 3’(前进)和5‘TTGCTAGTAGAGCGGGAG 3’(反向)为特异引物序列。芯片-seq检测。44。特别是~2×107用1%(wt/vol)甲醛交联法在37°C下振荡10 min,取大鼠小肠隐窝细胞。用150 mm甘氨酸在37°C下摇动10 min后,用冰凉PBS洗涤两次,在−80°C下冷冻进一步加工。用蛋白酶抑制剂(Sigma)将交联微丸解冻并在冰上溶解30 min(12 mm Tris-Cl,1×PBS,6mm EDTA,0.5%SDS)。用Bioruptor(Diagenode)对溶出的细胞进行超声处理,获得染色质片段(~200~500 bp),并以15,000×分离心。g用15 min获得可溶性染色质组分。与细胞溶解和超声作用并行,抗体(5μg/3×10)6细胞与30μ1磁蛋白G珠结合/阻断缓冲液(PBS+0.1%吐温+0.2%BSA)在4°C旋转作用2h。用芯片稀释缓冲液(10 mm Tris-Cl,140 mm NaCl,0.1%溶解有机化合物,1%Triton X,1mm EDTA)对可溶性染色质进行5次蛋白酶抑制剂稀释,并加入抗体偶联,在4°C下旋转一夜。洗涤后,用洗脱缓冲液(10 mm Tris-Cl,pH8.0,5 mm EDTA,300 mm NaCl,0.5%SDS),RNase A,蛋白酶K处理,隔夜反转交联。芯片DNA用AMPure XP微球(Agencourt)纯化,用Qubit 2000(Invitrogen)和生物分析仪1000(Agilent)进行定量。根据新英格兰生物实验室(NEB)的下一个超DNA库准备工具包协议,建立了伊利米纳测序库。在PCR扩增过程中,共进行了10个循环,产生了所有的芯片-seq文库。用双面AMPure XP纯化扩增后的DNA片段(~200~500 bp),用Qubit 2000和生物分析仪1000进行多路复用。

芯片-seq数据处理

原始的FASTQ读取所有芯片-seq实验被处理使用FastQC(Http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/),并且使用Bowtie版本1.2.2与MM9参考基因组对齐。45有以下标准:为了直接比较g0和g3芯片-seq样本,每个标记的唯一映射读取按照每个条件的总读取进行标准化,并使用Samtools版本1.9进行排序和索引。46。基于模型的芯片分析(Macs)(1.4.2版)47用于识别YAP 1在“输入”背景下的富集。MACS 2用于鉴别YAP 1在G0和G3中的差异结合,其标准如下:bdgdiff-g 60-l 120。为了在IGV浏览器上可视化芯片-seq库,我们使用了DeepTools版本2.7.15来生成大型文件,方法是使用以下标准将bam文件缩放为每百万千字节读取(RPKM):bamCoverage-b-正常化使用RPKM-SilthLength 300-binSize 30-extendReads200o。

微生物群分析

微生物群落研究在德克萨斯州休斯敦贝勒医学院的阿尔凯克元组学中心和微生物组学研究中心进行。从粪便颗粒中提取DNA,PCR扩增16S rRNA V4区。用IlluminaMiSeq平台和2×250 bp的配对协议对产品进行测序。利用UPARSE流水线将16S rRNA基因序列划分为操作分类单元(OTUS),并以97%的序列同源性与Silva SSURef_NR 99_119数据库进行比对。利用可公开获得的软件R(R核心小组,2015年版本3.2.2)对微生物群落进行分析和可视化,利用phyloseq软件包(生物导体)导入样本数据,计算α-和β-多样性指标,以及微生物群落概况。对于16 SrRNA基因的定量,细菌DNA是按照制造商的指示使用MO生物PowerSoil DNA分离试剂盒(MO生物实验室)用先前描述的方法提取的,并使用Qubit(LifeTechnologies)进行量化。在QuantStudio 7实时PCR系统中,采用Perfecta SYBR Green FastMix进行定量PCR。QPCR引物(1369F-1492R)位于16S rRNA基因V9旁。一条标准曲线是用一个含有nt 1369到1492的连续稀释的质粒来绘制的。大肠杆菌16S rRNA基因。未知数的浓度是用C来计算的。T使用绘制标准曲线所生成的方程的值。所有样本一式三份,包括标准曲线、一组非模板对照(NTC)和抑制剂对照(已知阳性+未知DNA)。

组织裂解物和细胞因子阵列ELISA

用ELISA试剂盒(MBL International Corporation)对小鼠结肠上皮细胞裂解液进行ELISAs检测。用酶联免疫吸附法(ELISA)将含有远端肠的半个结肠固定,进行H&E染色,进一步进行病理分析,在4°C条件下用10 mm EDTA孵育分离上皮细胞,获得上皮细胞,并进行Westernblot分析。用前人描述的流式细胞仪分析方法对固有层进行酶切和免疫细胞分离。用不同动物3月龄G0和G4小鼠结肠上皮细胞裂解液进行细胞因子阵列检测。按照制造商的协议,等量的溶解物被加载到阵列上,与抗体混合在一起孵育一夜,第二天开始发育。用ImageJ软件对斑点进行量化,并对前四位上调细胞因子和三种下调的细胞因子进行标记。

统计分析

利用GraphPad Prism 8软件对所有数据进行统计分析。数据表示为平均值和扫描电镜。除另有规定外,所有实验一式三份。学生未配对t试验中,两组用两条尾作比较,p≤0.05有显着性意义。生存曲线分析采用Kaplan-Meier分析。采用Fisher‘s精确计数试验,计算患者活检免疫组化的意义。


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