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供体和患者血液中的SARS-CoV-2血清阳性和中和活性

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发表时间:2020-09-18 15:11作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

供体和患者血液中的SARS-CoV-2血清阳性和中和活性

鉴于迄今为止血清学检测的可用性有限,在不同人群中SARS-CoV-2特异性抗体的血清阳性率仍不清楚。在这里,我们报告了旧金山湾区的两个人群中SARS-CoV-2血清阳性率很低。到2020年4月上旬,接受非呼吸道适应症的387例住院患者的血清反应性为0.26%,1,000名献血者的血清反应性为0.1%。我们还描述了免疫球蛋白G(IgG),免疫球蛋白M(IgM)和体外的纵向动力学中和抗体滴度的COVID-19患者。这三种测定的血清转化时间中位数为10.3-11.0天。症状发作后,中和抗体与免疫球蛋白滴度同时上升,IgG检测和中和滴度之间的阳性一致性百分比> 93%。

介绍

冠状病毒病2019(COVID-19)是由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)1引起的新型呼吸道疾病COVID-19范围的从无症状感染到急性呼吸窘迫综合征和死亡,并且COVID-19大流行的症状也导致大量的负担全球医疗系统23准确而大规模的血清学检测,包括中和抗体的检测,对于评估社区感染的蔓延,告知公共卫生遏制工作以及确定恢复性血浆疗法试验的捐献者至关重要。鉴于诊断测试的当前状态主要依赖于分子技术,因此尚不清楚在不同人群中SARS-CoV-2特异性抗体(先前感染的替代物)的血清阳性率。

在这里,我们提供的数据验证了2020年3月使用EUA授权的雅培建筑师SARS-CoV-2 IgG测试在两个人群中进行的抗体检测,这是旧金山一家三级医院的COVID-19住院患者队列,以及来自旧金山湾区的献血者。我们还研究了随时间推移住院的COVID-19患者中IgG,IgM和体外中和抗体滴度的纵向动态。这些研究表明,旧金山湾区的SARS-CoV-2血清阳性率非常低,表明截至3月初该病毒在社区中的传播有限,而且IgG和IgM滴度可预测中和活性,阳性率较高协议。

结果

雅培建筑师SARS-CoV-2 IgG和IgM检测的性能特征

在评估SARS-CoV-2抗体在旧金山湾地区人群中的血清阳性率之前,我们验证了雅培建筑师SARS-CoV-2 IgG(FDA紧急使用授权(EUA))和IgM(原型)测定的性能。这些测定是分别靶向核衣壳和刺突蛋白的化学发光微粒免疫测定。核衣壳蛋白在建筑师的IgG测定靶向因为发现相比于刺突蛋白具有增加的灵敏度456为了评估测定的敏感性,我们在加州大学旧金山分校(UCSF)医疗中心和旧金山退伍军人事务(SFVA)卫生保健系统中收集了38名住院患者和5名门诊患者的队列,所有这些患者均在成人住院单元接受护理鼻咽和/或口咽拭子测试中SARS-CoV-2的实时聚合酶链反应(RT-PCR)阳性(图   1a和补充表   1)。在报告的症状发作后每周一次的时间间隔内,IgG血清转换的患者百分比在≥22天时达到94.4%(图   1b)。, 剩下)。相应地,所有423个样品的IgG分析灵敏度在≥22天时每周增加,达到96.9%,而当排除7个免疫功能低下患者的样品(见下文)时,IgG灵敏度为99%(图   1b,右和表   1)。≥22天时,血清学转换为IgM的患者百分比也为94.4%(图   1c,左),对346个样品的分析得出的IgM测定灵敏度为97.9%(排除免疫功能低下的患者为98.9%)(图   1c,右和表   1)。为了评估测定的特异性,在雅培(COVID-19)大流行之前,由雅培(Abbott Laboratories)从美国佛罗里达州迈阿密的献血者那里采集的血清和血浆样品进行了IgG(n = 1013)和IgM(n  = 1492)抗体血清反应活性。1013个样本中有两个样本通过IgG检测呈阳性,产生的IgG特异性为99.8%(95%CI:99.3–100%)(图   1d,顶部),与大学独立研究报告的99.9%特异性一致华盛顿78通过IgM测试,从美国献血者中提取了1492个样本中的六个样本,它们的IgM特异性为99.6%(95%CI:99.2-99.9%)(图   1d,底部)。因此,建筑师SARS-CoV-2 IgG和IgM分析显示出高敏感性(在主要住院的患者队列中,≥22天为96.9%)和特异性(在COVID之前的献血者中为99.6–99.8%)。

图1:抗SARS-CoV-2抗体的血清阳性率。
图1

一个的示意性执行的测试和种群的位置评估。(左)一张带有旧金山湾区放大图的加利福尼亚地图。对于献血者,血库收集中心的位置用黑点表示;对于加利福尼亚大学旧金山分校(UCSF)医院和诊所的患者,大约与邮政编码对应的地理区域用粉红色表示。(右)表显示了患者,捐赠者和样本的数量,以及进行的测试(b)(左)症状发作后指定的每周时间表内SARS-CoV-2 PCR阳性患者样品的IgG S / C比(如果每个患者收集了多个样品,则每个样品中S / C值最高的样品时间范围)。在每个时间范围内测得的抗体阳性反应患者的百分比显示在图表下方。(右)在指定的每周时间范围内,来自SARS-CoV-2 PCR阳性患者的所有样品的IgG滴度的受体工作特性(ROC)曲线。的AUC为0.537(第1-7天),0.827(第8-14天),0.946(第15-21天),0.990(第22+天)。1.4处的虚线表示IgG阳性截止。c IgM效价的IgM S / C比和ROC曲线,如b; AUC为0.720(第0-7天),0.955(第8-14天),0.970(第15-21天),0.999(第22天以上)。0.6处的虚线表示IgG阳性截止。黑色和红色的数据点分别在指示的临界值之上和之下。d(顶部)在COVID前样品中测得的IgG S / C比; 样品的特异性和数量在图(+)上显示。1.4处的虚线表示IgG阳性截止。d(底部)在COVID前样品中测得的IgM S / C比; 样品的特异性和数量在图上显示。0.6的虚线表示IgM阳性的临界值。SARS-CoV-2 PCR阳性患者的e IgG S / C比(n  = 43位患者的286个样本)和f IgM S / C比(n 从症状发作的第二天开始,对来自43位患者的249份样本作图。具有免疫功能的患者显示为灰色,免疫受损的患者显示为蓝色。对于具有多个当日样本的患者,将绘制具有最高S / C值的样本。对于ef,方框轮廓表示IQR,方框中的实线表示中间S / C比,方框外的晶须延伸到最小和最大S / C比。

表1雅培建筑师SARS-CoV-2 IgG和IgM的临床敏感性以及体外中和测定。

COVID-19患者的IgG和IgM滴度的纵向动态

考虑到我们队列中43名SARS-CoV-2 PCR阳性患者的纵向样本的可用性,我们接下来分析了住院期间血浆IgG(286样本)和IgM(249样本)滴度的纵向动态(图   1e, f)。观察到抗核衣壳IgG和抗加标IgM抗体滴度大约串联上升,分别与血清转化的中位数时间相近,分别为11.0天和10.8天。这些结果与先前的研究报告IgG和IgM抗体刺突蛋白,或在某些情况下,伴随检测,早期发现IgG抗体IgM抗体比的COVID-19例一致的91011因此,可能有序的IgM继之以IgG的产生可能不是针对SARS-CoV-2的免疫反应的一般特征,就像许多病毒感染一样。另外,血清转化时间的差异可能与患者之间的生物学差异有关。观察到的某些变异性和早期血清转换也可能是最初的轻度疾病症状导致患者自我报告症状发作日期延迟的结果。

在第3周中有4名尚未进行IgG血清转换的患者中(图   1b,左,第15-21天),其中2名是接受他克莫司和霉酚酸酯(MMF)免疫抑制治疗的肾移植受者;一位年龄超过90岁;一名无症状患者接受了急性精神病护理,病史不可靠。观察到两个肾移植接受者最终血清转化为IgG和IgM。值得注意的是,在免疫抑制患者中,IgG和IgM的延迟血清转化并不普遍。他克莫司和MMF的另外三个实体器官移植(SOT)接受者,以及甲氨蝶呤和英夫利昔单抗的一名类风湿性关节炎患者,均在2周内发生了血清转化(图   1e,f),而从症状发作后第17天起,最早的可用血清样本中的另一名SOT接受者IgG和IgM呈阳性。对于剩下的两名未受到免疫抑制的患者,我们在第18天后没有样品。但是,由于在症状发作后的三周内才观察到血清转化(图   1e,f),因此对较晚样品的分析可能已证明其血清中可检测到抗体。第29天的血浆样本中,在22天以上的时间范围内仍为IgG阴性的一名患者(图   1b,左)仅具有轻度症状,并且通过IgM和中和抗体测试呈阳性(如下所述)。相反,在22天以上的时间范围内,唯一的IgM阴性病例(图   1c(左)在50天血浆样品中IgM阴性,但IgG阳性,这可能是由于在此后一个时间点IgM抗体效价逐渐下降至无法检测的水平。

为了进一步评估测定的特异性,我们对2020年3月下旬至2020年4月初收集的163例SARS-CoV-2 PCR阴性UCSF患者的235份血浆样品进行了检测。该检测结果仅检测到一个反应性样品,特异性为99.6%。 (95%CI:97.7–100%)(图   2a,第二栏)。IgG反应性样品来自一名因晕厥而入院但报告咳嗽持续1个月的患者,这表明之前可能来自SARS-CoV-2或另一种人冠状病毒的潜在感染可能引起交叉反应性抗体反应。我们还对39例SARS-CoV-2 PCR阴性UCSF患者的IgM抗体进行了测试,这些患者均无阳性(图   2b)。,第二列)。因此,SARS-CoV-2 PCR阴性UCSF患者的99.6-100%特异性结果与从COVID-19之前样品计算出的Architect CoV-2 IgG和IgM检测的99.6-99.8%特异性相当(图。   1d)。

图2:针对SARS-CoV-2的抗体的纵向动力学和体外中和活性。
图2

确定了SARS-CoV-2 PCR检测阳性或阴性或未进行住院治疗的患者,门诊病人和献血者 IgG S / C比值。血清反应性和测试个体总数显示在图表下方的表格中。圈出的数据点还通过VITROS和中和试验进行了测试,并且在两种试验中均为阴性。对于具有多个样本的患者,将绘制单个最高S / C值。b IgM S / C比,如a中所示C(左)SARS-CoV-2 PCR阳性匹配患者样品的IgG和IgM滴度。显示了每个象限中数据点的百分比以及IgG和IgM之间的正百分比协议(PPA),负百分比协议(NPA)和总百分比协议(OPA)。(中)相对于IgG S / C值绘制80%中和效价(NT80)。(右)80%NT80与IgM S / C值作图。NT80的临界值是> 40的效价水平;阴性结果(<40)是非数字的,为了便于观察,将其绘制在35处。d针对SARS-CoV-2 PCR阳性患者的NT80滴度与症状发作后的天数作图。免疫受损的患者以蓝色显示。Ë对于在连续采样期间捕获到IgM,IgG和NT80血清转化事件的6例SARS-CoV-2 PCR阳性患者,比较了症状发作后血清转化事件的天数。f在出现症状后的指定时间范围内评估每位患者的NT80活性。图表下方显示了在每个时间范围内测得的具有可检测的NT80活性的患者百分比。如果每个患者收集了多个样本,则使用每个时间范围内NT80值最高的样本。G根据症状发作后的天数(左)绘制平均NT80活性(右轴)和IgG和IgM(左轴)效价;3×3网格(右)中显示了各个患者的对应图。如果每个患者收集了多个样本,则使用每个时间范围内最高S / C或NT80值的样本。对于f,方框轮廓表示IQR,方框中的实线表示中和中和抗体效价,方框外的晶须延伸到最小和最大中和抗体效价。

旧金山湾区献血者和患者中SARS-CoV-2的血清阳性率

为了调查旧金山湾区的SARS-CoV-2血清阳性率,我们对来自两个怀疑感染COVID-19的人群的血浆和血清样本进行了抗核衣壳IgG测试。一个队列包括2020年3月在整个海湾地区的血库中心献血的1000个人(图   1a和补充表   2)。进行常规献血者筛查,以排除那些具有自我报告的急性疾病症状和异常生命体征的患者。我们在该队列中检测了四个IgG阳性样品,血清反应率为0.40%(图   2a)。,第4栏)。该队列未进行IgM抗体测试。然后,我们使用两项正交测试,VITROS抗SARS-CoV-2总抗体测定法(Ortho Clinical Diagnostics EUA)和SARS-CoV-2伪病毒中和测定法(如下所述)分析了四个IgG阳性样品。在四个样品中,三个(在图2a中圈出   )在VITROS和中和试验中均为阴性,因此在Architect IgG试验中被指定为可能的假反应物。因此,经过验证性正交试验后,2020年3月湾区献血者的血清阳性率是0.1%(95%CI:0.00-0.56%)。在该人群中的错误反应率为0.3%,与报告的99.6%的Architect SARS-CoV-IgG测试的特异性一致(图   1d7

我们还评估了在UCSF医学中心的成人住院单元或诊所接受过护理的患者中,是否存在COVID-19呼吸系统疾病(非COVID-19,未曾通过SARS-CoV-2进行过检测)的血清阳性率RT-PCR)(2020年3月下旬至4月初(补充表   3)。从UCSF临床实验室获得了387例患者的残留样品(图   2a)。,第3列)。只有一名患者具有IgG血清反应。该患者的胸部影像学表现出呼吸衰竭和毛玻璃样混浊,但从未进行过RT-PCR的SARS-2-CoV检测。因此,该人群中的IgG血清阳性率很低,仅为0.26%(95%CI:0-0.76%),与1000个经过测试的湾区献血者的0.1%血清阳性率相当。尽管仅23个残留样品能够随后进行IgM抗体测试,但重要且符合预期,但没有一个阳性(图   2b,第3栏)。

接下来,我们寻求直接比较43名SARS-CoV-2 PCR阳性患者中有22名剩余纵向样本的54种可用血浆样品中具有SARS-CoV-2体外中和活性的IgG和IgM抗体滴度(图。   2c)。以前已证明使用SARS-CoV-2假病毒测得的中和抗体活性与使用培养的SARS-CoV-2分离株测得的抗体活性具有良好的相关性12使用萤光素酶测定法测量使用SARS-CoV-2假病毒(表达SARS-CoV-2穗蛋白的水疱性口炎病毒(VSV)假型)达到80%的感染力中和(NT80)的血浆滴度(参见“方法”) 。IgG和IgM阳性之间的阳性百分比一致性(PPA)和阴性百分比一致性(NPA)分别为92.5%和93.7%;NT80和IgG阳性之间分别为93.8%和75.0%; 在NT80和IgM阳性之间分别为84.8%和78.6%(图   2c,从左到右)。所有成对比较均与rho线性相关IgG和IgM阳性,NT80和IgG阳性,NT80和IgM阳性之间的相关性分别为0.65、0.79和0.77。中和抗体滴度与IgG和IgM抗体滴度同时上升,血清转化的中位时间稍早一些,为10.3天(IgG / IgM抗体滴度为10.8-11.0天)(图   2d-g)。在中值IgG,IgM和中和抗体滴度与疾病严重程度之间未发现显着相关性(补充表   4)。

讨论区

在这项研究中,我们提供的证据表明,使用Architect SARS-CoV-2抗核衣壳蛋白IgG和抗尖峰IgM分析的血清阳性结果通常可预测体外中和能力。考虑到抗核衣壳抗体不被认为直接中和,因此这些结果表明,检测抗核衣壳IgG抗体可能表明包括中和(可能是抗加标)活性的生产性和多克隆体液免疫反应。事实上,我们也发现了高正和NPA> 92%,是良好的相关性(RHO = 0.65),用于检测抗核衣壳IgG和抗峰IgM抗体。这些发现也与血清学检测有关,因为截至2020年6月FDA EUA授权的血清学检测中有44%(16个中的7个)靶向核衣壳蛋白,并且还表明IgG和IgM滴度可能在鉴定时可预测中和活性实验性恢复期血浆疗法的潜在候选捐助者。但是,体外中和活性不一定赋予保护性免疫力,恢复血浆疗法治疗COVID-19疾病的功效尚待确定。

重要的是,我们的结果还显示,从2020年3月至2020年4月在旧金山湾区一家三级医院看的献血者和非COVID-19患者的抗SARS-CoV-2 IgG抗体的血清阳性率非常低,为0.10 %(95%CI:0.00-0.56%)和0.26%(0.00-0.76%)。在旧金山湾区的两个不同人群中,这些血清阳性率接近建筑师测定法的特异性极限,并且远低于许多侧向流免疫测定法的特异性极限13这些研究结果与其他以社区为基础的研究对比的是报道血清阳性率较高加州1415,并强调了在低流行人群中使用高精度测试进行监视研究的重要性。他们还表明,在2020年3月之前,SARS-CoV-2在海湾地区广泛发生隐性循环的可能性非常低,这与通过对早期采集的呼吸道样本进行直接病毒检测的低检出率相符16

方法

学习设计与道德

研究人群包括来自加州大学旧金山分校临床实验室的残留血清和血浆标本的患者。于2020年3月至2020年4月收集了SARS-CoV-2 RT-PCR对鼻咽,口咽和/或合并的鼻咽-口咽拭子呈阳性或阴性患者的样本。从随机选择的门诊和同期在UCSF住院的患者发现COVID-19呼吸系统疾病(非COVID)以外的其他适应症。2020年3月,Vitalant Research Institute从旧金山湾区的献血者那里收集了血清样本。从电子健康记录中提取了UCSF患者的临床数据,并将其输入到HIPAA(健康保险携带和责任法案)安全的REDCap研究数据库中。收集的数据包括人口统计学,主要合并症,患者报告的症状发作日期,临床症状和COVID-19严重程度的指标,例如重症监护病房的入院和对机械通气的要求。这项研究已由UCSF的机构审查委员会(IRB)批准(UCSF IRB#10-02598),该研究为无受试者放弃同意的接触研究。

血清学检测

雅培建筑师SARS-CoV-2 IgG分析(FDA EUA)和SARS-CoV-2 IgM(原型)测试是根据制造商的说明7在Architect仪器上使用血清或血浆样品进行的这些测试是针对核衣壳蛋白(IgG测定)或刺突蛋白(IgM测定)并测量相对光单位的化学发光微粒免疫测定反应,然后将其用于计算指标值。在预定义的指数值阈值下,IgM血清阳性的信号与截止(S / C)比为0.6,IgG血清阳性的1.4 S / C为IgG,血清特异性为99.6–98.8%。IgG分析的线性范围为1.4–4.0 S / C,IgM分析的线性范围为0.6–21 S / C。

根据制造商的说明15,在Vitalant Research Institute使用血清或血浆样品进行了FDA EUA批准的VITROS抗SARS-CoV-2总抗体测定该测试是一种化学发光免疫分析法,以刺突蛋白为靶标并测量相对光单位,然后将其用于计算指标值。在预先确定的IgG血清阳性信号/截止(S / C)比为1.0的指标值阈值下,该测定法的灵敏度为100%(92.7–100%),特异性为100%(95%CI = 99.1–100.0%)。

生产用于SARS-CoV-2中和试验的假病毒

VSVΔG萤光素酶为基础的病毒,其中所述糖蛋白(G)基因已被替换为荧光素酶中,通过病毒糖蛋白表达质粒的瞬时转染(PCG SARS-CoV的-2穗,斯蒂芬Pölhmann提供礼貌产生17,以及pCAGGS VSV-G或pCAGGS EboGP作为对照18)或在TransIT-2020之前没有糖蛋白控制HEK293T细胞。简而言之,将细胞接种到15cm培养皿中并使其附着24小时,然后每板用30μg表达质粒转染。转染后〜16 h更换转染培养基。加入表达增强剂丙戊酸至终浓度为3.75 mM,并将细胞孵育3-4小时。再次更换培养基,并在再次更换培养基之前,以0.3的感染复数接种VSVΔG-luc病毒细胞4小时。感染后约24小时,收集上清液,并通过0.45-μm注射器过滤器过滤以清除碎屑。

抗体中和

通过TransIT-2020 19将 HEK293T细胞用人ACE2和TMPRSS2转染24小时后,将细胞接种到96孔组织培养处理过的黑色平板中。将收集在肝素锂试管中的血浆稀释至1:20,然后进行四次后续的1:4稀释。每孔将50 µl携带SARS-CoV-2 S,VSV-G或EboGP的假病毒(已调整为在靶细胞中导致〜10,000 RLU)与50 µl各自的血清或血浆稀释液混合,得到最终从1:40开始的一系列纵向血清或血浆稀释液,并在37°C下孵育1小时。对照包括具有VSVΔG(无包膜),不添加血清/血浆以及预定具有或不具有中和活性的血清的孔。随后,将100 µl混合物添加至靶细胞(一式两份),并将细胞在37°C下孵育24小时。然后去除上清液,裂解细胞,荧光素酶活性按照制造商的说明读取。将结果计算为无血清对照的百分比。通过无感染,无包膜对照以及阳性和阴性对照的表现来鉴定每个板。在GraphPad Prism v8中计算非线性回归曲线和80%中和效价(NT80)。

统计分析

我们以IgG为金标准,计算了中和抗体结果与IgG之间的PPA,NPA和总体百分比一致性(OPA)。然后,假设IgM为金标准,我们在中和抗体结果和IgM之间计算了PPA,NPA和OPA。我们为每个比例计算了95%的准确二项式(Clopper-Pearson)置信区间。IgG,IgM和NT80滴度呈非正态分布,并使用中位数和四分位间距进行汇总。我们使用双面Wilcoxon秩和检验在不同时间点比较了抗体效价与二分法定义的临床特征。使用Spearman非参数相关系数计算年龄与IgG,IgM和NT滴度之间的相关性。使用scipy.stats,sklearn.metrics使用Python 3.7.7执行统计计算。




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