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小动脉内皮功能障碍和ApoE基因敲除大鼠的动脉粥样硬化早期迹象

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发表时间:2020-09-18 15:08作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

小动脉内皮功能障碍和ApoE基因敲除大鼠的动脉粥样硬化早期迹象

内皮功能障碍被认为是导致动脉粥样硬化的主要因素,并且已被证明在斑块形成之前很明显。小阻力动脉中的内皮功能障碍已被提出早于导管动脉的改变。在这项研究中,我们解决了动脉粥样硬化易发大鼠血管内皮功能的早期变化。雄性ApoE基因敲除(KO)大鼠(11至13周大)接受西餐或标准饮食。饮食干预持续了20-24周。使用等轴测肌图仪在体外检查肺和肠系膜动脉的内皮功能。我们发现,西方饮食降低了环氧合酶(COX)对控制肺动脉和肠系膜动脉血管张力的作用。这些变化与早期动脉粥样硬化和ApoE KO大鼠血浆总胆固醇,LDL和甘油三酸酯水平升高有关。在用西方饮食喂养的ApoE KO大鼠的主动脉弓中,还观察到了软骨样转化的平滑肌细胞,钙化,巨噬细胞积累和泡沫细胞。ApoE KO大鼠是研究动脉粥样硬化早期阶段内皮功能障碍的新模型,可帮助我们改善临床前药物开发。

介绍

心血管疾病是全球范围内死亡的主要原因1内皮功能障碍是已知在心血管疾病进展的中心作用,并改变在内皮功能被报告给发生动脉粥样硬化斑块的发展之前234

动脉粥样硬化是慢性炎性疾病567在其早期阶段,它与血脂异常相关,增加的炎症因子表达和内皮功能障碍89在以后的阶段,动脉导管9形成动脉粥样硬化病变主动脉及其主要分支构成了动脉粥样硬化病变的经典部位。在小阻力动脉内皮功能障碍已提出在导管的动脉变化之前发起长101112因此,了解引起阻力动脉中早期内皮功能障碍的机制对于我们了解动脉粥样硬化病理的早期阶段以及因此的早期诊断和预防至关重要。然而,存在诸如肺动脉在其它动脉粥样硬化斑块的报道很少1314

实验动物被广泛用于研究心血管疾病中的内皮功能障碍,但是,当前的模型均未详细复制人类病理学,也没有最佳模型15已经表明,血脂异常本身不会引起大鼠动脉粥样硬化的改变16小鼠和大鼠通常不会发展成动脉粥样硬化,但是基因修饰已显示出可促进其发展15载脂蛋白敲除(ApoE KO)小鼠已被广泛用于研究动脉粥样硬化的病理学和治疗15ApoE通过促进清除极低密度脂蛋白(VLDL)残留物在胆固醇运输和代谢中起重要作用17VLDL,LDL和甘油三酸酯升高会导致血脂异常,这与氧化应激和动脉粥样硬化的发展有关18但是,小鼠的实验性动脉粥样硬化发展与人类不同。与ApoE KO小鼠(高脂饮食时迅速发展成动脉粥样硬化)相反,人类在几个月或1519年中缓慢发展成动脉粥样硬化随着基因组编辑技术的发展,ApoE基因敲除鼠,现已和一些研究表明,动脉粥样硬化病变发展较慢的老鼠比老鼠2021有一个关于病变发展的ApoE基因KO鼠量的持续讨论,似乎有针对性的基因组变化的位置可能会影响病变的发展2223迄今为止,还没有全面的报道描述ApoE KO大鼠的血管特性。

因此,在这项研究中,我们检查了喂养高脂西方饮食的ApoE KO大鼠中小(所谓的抵抗性)肺动脉和肠系膜动脉的血管表型。我们的目的是评估这些小动脉中内皮功能障碍的发展以及促进动脉粥样硬化发展的机制。

结果

所有组的体重在11-13周龄开始饮食干预之前都是相似的。在研究结束时,年龄为31-37周;所有组的体重均明显增加;西方饮食中ApoE KO含量为(661.0±55.40 g),标准饮食中ApoE KO含量为(586.30±67.69 g),标准饮食中Sprague Dawley大鼠为(574.0±10.77 g)(P  <0.0001)。在西方饮食中,ApoE KO的体重增加更大,并且在标准饮食下,该组与ApoE KO和Sprague Dawley大鼠的体重之间存在显着差异(P  = 0.0005)。

西方饮食喂养的ApoE KO大鼠血浆总胆固醇,LDL和甘油三酸酯升高

在开始不同饮食之前,与Sprague Dawley大鼠相比,ApoE KO中的血浆胆固醇水平显着更高(图   1;表1P  <0.0001,n  = 15)。饮食5个月后,使用标准饮食的ApoE KO大鼠和使用标准饮食的Sprague Dawley大鼠的血浆胆固醇显着增加,而使用标准饮食的ApoE KOs则没有。西方饮食对ApoE KO大鼠的影响惊人,与标准饮食下的Sprague Dawley大鼠相比,胆固醇水平增加了十倍以上(图   1;表1P  <0.0001,n = 8)。与标准饮食的Sprague Dawley大鼠相比,标准饮食的ApoE KOs的胆固醇水平仍翻了一番(图   1;表1P  = 0.0004,n  = 7)。

图1
图1

与ApoE KO和Sprague Dawley大鼠的饮食相比,每月血浆胆固醇,LDL和HDL水平以及禁食甘油三酸酯水平与饮食的关系。与Sprague Dawleys大鼠相比,ApoE KO大鼠开始饮食前的胆固醇和LDL水平显着升高,(**)P  <0.0001;饮食5个月后,与标准饮食下的ApoE KO和Sprague Dawley大鼠相比,西方饮食下的ApoE KO大鼠的胆固醇,LDL和甘油三酯水平显着更高,(**)P  <0.0001;对照饮食前后,Sprague Dawley大鼠的HDL水平显着高于ApoE KO大鼠,(**)P  <0.0001;方差分析,n = 8,n = 7。

表1随时间推移的脂蛋白水平汇总。

在开始饮食之前,与Sprague Dawley大鼠相比,ApoE KOs的血浆LDL水平明显更高(图   1;表1P  <0.0001)。用西方食品(图1;表1P  <0.0001,n  = 8)或标准饮食(图   1;表1P  = 0.0009,n  = 7)5个月后,血浆ApoE KOs中的血浆低密度脂蛋白显着增加   在标准饮食下,Sprague Dawley大鼠的血浆LDL也显着升高(图   1;表1n = 8)。然而,与标准饮食的ApoE KO和Sprague Dawley大鼠相比,西方饮食的ApoE KO大鼠的血浆LDL水平明显更高(图   1;表1P  <0.0001)。

饮食5个月后测量甘油三酸酯水平;与标准饮食下的ApoE KO和Sprague Dawley大鼠相比,西方饮食下的ApoE KO水平显着更高(图   1;表1P  <0.0001)。

另一方面,与饮食开始前的ApoE KO相比,Sprague Dawley大鼠的血浆HDL水平明显更高(图   1;表1P  <0.0001)。血浆HDL水平在所有组中5个月饮食后显著增加,但是,它仍然显著高于Sprague Dawley大鼠(图   1 ;表1Ñ  = 8)相比,载脂蛋白E科斯西方(图   1 ;表1P  <0.0001,n  = 8)或标准饮食(图   1;表1P  = 0.01,n  = 7)。

免疫组织化学

H&E染色的结果显示,以西方饮食喂养的ApoE KO大鼠中软骨样转化的平滑肌细胞和钙化,显示出动脉粥样硬化病变的共同特征(图   2 A)。在Sprague Dawley大鼠中未观察到任何变化(图   2 B)。CD-68进一步染色显示仅在ApoE KO喂养的西方饮食中巨噬细胞和小泡沫细胞损伤的积累(图   2 C)。

图2
图2

饲喂西方饮食的ApoE KO大鼠的主动脉弓的显微图像;A)H&E染色在60倍放大下显示软骨样转化的平滑肌细胞;B)Sprague Dawley大鼠的H&E染色;C)CD-68染色显示巨噬细胞和小的泡沫细胞病变的积累。

西方饮食喂养的ApoE KO大鼠的肺动脉中COX依赖的信号被修饰

相对于KPSS的最大收缩(收缩的100%)表示血管收缩。实验组之间对KPSS的收缩反应没有差异(补充图S3A)。在对照条件下,所有组中肺动脉对血栓烷A 2受体激动剂U46619 浓度增加的收缩反应相似。(图   3)。

图3
图3

不同实验条件下不同实验组肺动脉U46619浓度-反应曲线;对照条件,与非选择性NO合酶抑制剂L-NAME(100 µM)孵育20分钟,与L-NAME(100 µM)和消炎痛(3 µM)孵育20分钟;与鸡尾酒一起孵育20分钟:L-NAME,消炎痛,TRAM-34和阿帕明,即药理抑制了所有主要途径的内皮依赖性舒张;(**),P <0.001,L-NAME的作用;(++),P = 0.007,消炎痛的效果,F检验,n = 8、7。

在存在L-NAME的情况下,所有实验组的收缩反应均得到显着增强(图   3P  <0.0001)。收缩反应之间的差异在各组之间没有差异(补充图S4B)。

在ApoE KO-Western饮食大鼠的肺动脉中,通过与L-NAME和消炎痛一起预温育,可显着增强对U46619的收缩反应(图   3,表2P  = 0.01)。然而,在ApoE KO标准饮食和Sprague Dawley大鼠中,与L-NAME和消炎痛的预孵育降低了对U46619的收缩反应(图   3,表2P  分别为0.007和0.002)。在吲哚美辛存在的情况下,ApoE KO-Western饮食与标准饮食中的ApoE KO或Sprague Dawley大鼠之间的U46619收缩显着不同(补充图S4C,P <0.0001),表明来自ApoE KO-Western饮食大鼠的肺动脉中的净COX活性促成血管松弛因子的产生,而它具有来自ApoE KO-标准饮食或Sprague Dawley大鼠的动脉中的促收缩作用。

表2对照情况下,对U46619响应的肺动脉和对ACh的肠系膜动脉的logEC50±SE汇总;与L-NAME一起孵育20分钟;与LNAME和消炎痛一起孵育20分钟;与鸡尾酒一起孵育20分钟:L-NAME,消炎痛,TRAM-34和阿帕明;E max,最大收缩反应;R max,最大松弛响应。

在药理抑制内皮依赖性舒张的所有主要途径后,即与L-NAME,消炎痛,TRAM-34和阿帕明预孵育后,未观察到U46619诱导的收缩进一步显着变化(图   3,表2),表明在这些实验条件下,内皮依赖性超极化(EDH)成分对这些动脉壁张力的控制没有显着贡献(补充图S4D,表2P  <0.0001)。

血管松弛表示为预收缩水平(0%松弛)相对于被动壁张力(100%松弛)的百分比。在控制条件下,还比较了收缩前的肺动脉的ACh诱导的松弛反应。 与标准饮食相比,高浓度的ACh(10 -5 M)使西方饮食的ApoE KO大鼠的肺动脉舒张程度更大(图   4 A; 38.58±7.75 vs 15.34±5.20,P  = 0.03,n  = 8和7)。然而,两种饮食的Sprague Dawley大鼠和ApoE大鼠的肺动脉之间,ACh诱导的松弛没有显着差异(图   4 A)。

图4
图4

在不同的实验条件下,响应10–5 M的ACh浓度,肺动脉的松弛百分比;A)对照条件,(**),p <0.01,ApoE KO-西方饮食与ApoE KO-对照饮食;B)与ApoE KO-Western饮食与ApoE KO标准饮食相比,用非选择性NO合酶抑制剂100 µML-NAME孵育20分钟,(**),p <0.001;C)与L-NAME和3 µM消炎痛一起孵育20分钟,(**),p <0.001,ApoE KO标准饮食对Sprague Dawley;D)与鸡尾酒一起温育20分钟:L-NAME,消炎痛,TRAM-34和阿帕明,即药理抑制内皮依赖性舒张的所有主要途径。方差分析,n = 8、7。

与L-NAME孵育20分钟后,所有组的松弛均得到显着抑制(图   4 B,P <0.001)。然而,ApoE KO-西方饮食与ApoE KO标准饮食之间仍然存在显着差异(图4B,38.58±7.75对42.39±8.46,P  = 0.0002,n  = 8、7 )。

在添加消炎痛和L-NAME后,任何一组对ACh的反应均无松弛(图   4 C)。当所有主要的内皮依赖性舒张途径被L-NAME,消炎痛,TRAM-34和Apapamin阻断时,舒张作用在所有组的肺动脉中均被消除(图   4 D)。这进一步证明在这些实验条件下,EDH信号在这些肺动脉中缺乏显着贡献。

当通过硝普钠(SNP)测试内皮独立性松弛时,ApoE KO-Western饮食与Sprague Dawley大鼠或ApoE KO标准饮食的动脉反应之间存在显着差异(图   5 A)。

图5
图5

A)肺动脉的SNP浓度-响应曲线,(**),p = 0.03,ApoE KO西餐与Sprague Dawley,(+ +),P = 0.0002,ApoE KO西餐与ApoE KO标准饮食;B)肠系膜动脉,(**),P = 0.02,ApoE KO西方饮食vs Sprague Dawley,(xx),P = 0.0003,ApoE KO标准饮食与Sprague Dawley;n = 8、7

NO是所有组中肠系膜动脉松弛的主要因素

实验组之间肠系膜动脉对KPSS的收缩反应没有差异(补充图S3B)。Sprague Dawley大鼠的肠系膜动脉对NA的收缩反应显着大于ApoE KO-Western饮食组(图   6P  = 0.01)。

图6
图6

对肠系膜动脉去甲肾上腺素的浓度-反应曲线。(***),与Sprague Dawley大鼠相比,P <0.05 ApoE KO西方饮食。n = 8,n = 7

在对照条件下,实验组之间ACh诱导的弛豫没有差异(补充图S5A)。与L-NAME一起孵育可显着抑制所有组中的松弛。与Sprague Dawley大鼠相比,两组ApoE KO大鼠的抑制作用都更大(图   7,表2P  <0.001),表明NO对ApoE KO大鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张的贡献更大。

图7
图7

不同实验组下肠系膜动脉的ACh浓度-响应曲线;控制条件;与NO合成酶非选择性抑制剂L-NAME(100 µM)孵育20分钟后;与L-NAME(100 µM)和消炎痛(3 µM)一起孵育后;与鸡尾酒一起孵育20分钟后:L-NAME,吲哚美辛,TRAM-34和阿帕明,即药理抑制了所有主要途径的内皮依赖性舒张;(**),P <0.001,L-NAME的作用;(+ +),P <0.001,消炎痛的作用,(xx),P <0.001,鸡尾酒的作用,n = 8,n = 7。

吲哚美辛(在存在L-NAME的情况下)孵育不会影响ApoE KO-Western饮食组的松弛(图   7)。然而,这在ApoE KO标准饮食组中得到了显着改善(图   7P  <0.001)。 Sprague Dawley大鼠的肠系膜小动脉中,也存在强烈的改善趋势(图   7P <0.07)。这表明在ApoE KO标准饮食和Sprague Dawley组中,在这些实验条件下,COX活性产物具有促收缩作用。在存在L-NAME和吲哚美辛的情况下,两组之间在ACh诱导的舒张中没有发现差异(补充图S5C)。

与L-NAME,吲哚美辛,阿帕明和TRAM-34预温育后,所有组中的松弛反应均得到显着抑制(图   7,表2P  <0.001),表明EDH信号的贡献。在标准饮食下,ApoE KOs和Sprague Dawley大鼠在所有抑制剂下的温育效果略有差异,但有显着差异(补充图S5,P  <0.002)。

通过SNP测试非内皮依赖性松弛。Sprague Dawley大鼠与ApoE KO-Western饮食大鼠之间的弛豫反应存在显着差异(图   5 B; -logEC50、7.86±0.16与7.97±0.05,p  = 0.02,n  = 8)或ApoE KO-标准饮食的大鼠(图   5 B; -logEC50,8.05±0.06 p  = 0.0003,ñ  = 7)。这些结果证实了我们发现,ApoE KOs的平滑肌细胞对NO的敏感性增加。

环氧合酶蛋白表达无可检测的变化

我们的功能研究表明,西方饮食在ApoE KO大鼠的肺动脉中修饰了依赖于环氧合酶(COX)的信号。但是,我们发现两组之间的COX-1和COX-2蛋白表达没有差异(补充图S6)。

讨论区

这是第一个针对西方饮食的ApoE KO大鼠动脉血管内皮功能的研究。主要发现是,尽管未检测到COX-1和-2蛋白表达的变化,但西方饮食中男性ApoE KOs的内皮功能障碍与肺动脉COX依赖性信号传导的变化有关。此外,我们发现ApoE KOs的肠系膜动脉中的平滑肌细胞对NO更为敏感,并暗示这可能是对高胆固醇血症导致的氧化应激降低的NO生物利用度的补偿。因此,与其他实验组相比,ApoE KO大鼠的血浆胆固醇,LDL和甘油三酸酯水平明显更高。我们还观察到了早期的动脉粥样硬化病变,例如小的泡沫细胞病变和巨噬细胞的积累,

据报道,甚至在动脉粥样硬化病变出现之前,人和实验动物的动脉粥样硬化动脉中内皮依赖性舒张功能就会受到损害。绝经前男性比女性更严重24然而,这种对啮齿类动物的性别依赖性效应仍在争论中。一些研究报告说,女性更容易,而另一些则报道说,男性更容易受到2526在CRISPR / Cas9产生的ApoE KO大鼠中,雄性比雌性发展出更严重的动脉粥样硬化23在本研究中,我们并非旨在了解ApoE KO大鼠动脉粥样硬化发展中的性别差异,因此仅研究了雄性。

小阻力动脉被血脂异常的影响,并有助于在血管阻力增加1112这些动脉前动脉粥样硬化的变化发展血管内皮功能的大动脉1112在健康的内皮细胞中,血管扩张药和血管收缩药之间存在平衡,任何不平衡都会导致内皮功能障碍27内皮产生血管扩张的物质,例如NO,前列腺素(PGs)合成,前列环素和EDH,以及血管收缩的物质,例如超氧阴离子ö 2 - 内皮素-1(ET-1)和血栓烷A2 2829这些因素之间的平衡决定了内皮对血管张力的最终贡献。

减少NO的生物利用度,是公认的兔和ApoE / LDL受体基因敲除小鼠喂食高脂肪食物的内皮依赖性舒张功能障碍的关键因素2430在阻力和大动脉中,NO都是最重要的血管扩张剂10增加反应性氧物质(ROS),特别是运行2 -作为高胆固醇血症的结果,可能会影响NO的生物利用度313233为了研究NO在内皮依赖性舒张中的作用,我们将肺动脉与L-NAME(NO合酶的非选择性抑制剂)一起孵育。然而,在西方饮食中的ApoE KOs与标准饮食中的ApoE KOs或Sprague Dawley大鼠之间,L-NAME对ACh诱导的松弛或U46619诱导的收缩的作用没有差异。低胆固醇血症在过多的ROS产生和氧化应激中的作用已在33之前被证实在先前对ApoE KO大鼠的研究中,当通过血浆脂质过氧化评估时,我们没有观察到ApoE KO大鼠肺动脉中氧化应激的增加。此外,我们发现Tempol(一种超氧化物清除剂)不会影响内皮依赖性松弛34但是,在先前的研究中,大鼠较年轻(6–9周龄)并接受标准饮食,而在当前研究中,ApoE KO大鼠接受了西方饮食,并显着发展为高胆固醇血症。但是,内皮依赖性松弛的L-NAME敏感成分仍未改变。在这个术语中,令人惊讶的是,在西方饮食中,ApoE KO大鼠通过内皮依赖性SNP松弛评估的NO敏感性增加。因此,我们建议在西方饮食中,这些ApoE KO大鼠的肺动脉中NO的生物利用度可能降低,这可能是由于血脂异常引起的氧化应激所致,其可能已被平滑肌细胞对NO的敏感性增加所补偿。

在与动脉粥样硬化相关的心血管疾病中,不同的内皮衍生因子的平衡发生了变化。重要的是,增加了内皮源性收缩因子的产生。这种情况发生时独立地降低NO产生或可用性,并且还与增加的氧化应激相关联3536氧化应激已经被COX-1和/或COX-2的诱导的上调表明触发内皮衍生的收缩1037在这项研究中,我们发现肺动脉与L-NAME和吲哚美辛(一种COX酶的非选择性抑制剂)共同孵育后,ApoE KO-Western饮食大鼠没有放松。这与先前在雄性Wistar-Kyoto大鼠的肾动脉中的发现一致,表明NO和COX相关的内皮依赖性舒张途径的关键重要性38但是,无论是西方饮食还是标准饮食,我们都没有观察到ApoE KOs中COX-1和COX-2蛋白质表达的任何变化,因此,COX依赖性收缩显然与COXs酶的表达变化无关,但可能与由于下游酶的活性或受体分布的变化。

COX1和COX2在调节血管张力中很重要。这些酶参与前列腺素类如前列环素(PGI的形成2),一个血管舒张因子,和血栓烷A2,异前列烷和PGH 2,其是血管收缩剂383940在正常情况下,这些COX产品之间存在平衡,但随着年龄的增长或疾病的发展而变化10临收缩性前列腺素和血栓素A2在动脉粥样硬化增加,并占据了大部分的内皮细胞介导的收缩3941COX-1是血栓烷A2的主要来源,COX-1缺失可防止ApoE无效小鼠中的动脉粥样硬化病变形成39在另一方面,老化和高血压禁止显示前列环素诱导的动脉松弛 273541对自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠的研究表明,ACh引起前列环素的大量释放。然而,在老年和高血压大鼠中,前列环素诱导松弛的能力降低。相反,它引起收缩 35这可以解释本研究的结果,尽管COX表达不变,但我们观察到消炎痛的功能变化在两组之间是不同的。我们的发现表明,来自ApoE KO大鼠的小动脉在形成动脉粥样硬化病变之前先发展了内皮功能障碍 3941有趣的是,我们的研究表明,在大鼠肺动脉中,COX活性在以标准饮食喂养的Sprague Dawley大鼠和ApoE KO大鼠中产生了促收缩的净效应,而仅在以西方饮食喂养的ApoE KO大鼠中才观察到血管舒张作用。这是否是一种适应性变化,例如用于如上所述的NO生物利用度或产量的可能降低,还是由于高胆固醇血症引起的病理发展的结果,仍有待观察。重要的是,U46619是血栓烷A 2激动剂,这会使结果更加复杂。

ApoE KO和Sprague Dawley大鼠的肠系膜动脉反应与肺动脉反应不同。鉴于L-NAME强烈抑制了ACh诱导的舒张,因此可以得出结论,无论饮食如何,NO在ApoE KO肠系膜动脉的内皮依赖性舒张中均具有重要作用。有人曾表明,NO介导的内皮依赖性舒张在ApoE基因敲除小鼠受损饲喂西方饮食由于增加ö 2 -生产33类似的结果在主动脉的32-35个月大的Sprague Dawley大鼠中观察到尽管增加NO合酶的表达并增加了L-精氨酸/ NO途径的活性42动脉粥样硬化的动脉俯卧,增加的Ô 2 -在停用NO和过氧亚硝酸盐形成一个显著角色3342在我们的研究中似乎就是这种情况。在L-NAME的存在下从ApoE基因KO鼠肠系膜动脉的内皮依赖性舒张的更强的抑制表明较大的NO信号,可能是一种机制,以补偿增加的生产的O- 2 -作为高胆固醇血症的结果。由于我们没有直接测量NO的产生及其生物利用度,因此我们无法指定NO信号的变化。但是,在SNP实验中看到的NO敏感性增加表明,NO信号的这种增强可能在平滑肌细胞水平上。

在西方饮食中,ApoE KO大鼠的肠系膜动脉中的COX和EDH信号均被抑制后,观察到很小的影响。这表明与Sprague Dawley大鼠相比,该实验组的EDH信号传导受到抑制。这与先前在糖尿病大鼠肠系膜动脉中的观察结果一致43相比之下,在标准饮食下,COX的抑制作用稍微改善了ApoE KO大鼠的动脉舒张,表明COX产品在这些动脉中具有一定的促收缩作用。EDH抑制抑制了这种松弛,表明在标准饮食下,来自ApoE KO大鼠的肠系膜动脉中存在一些血管松弛EDH效应,但在暴露于西方饮食后被抑制。但是,与Sprague Dawley大鼠相比,在任何饮食下ApoE KO大鼠中EDH信号的贡献均明显降低,尽管Sprague Dawley大鼠没有显示任何显着的COX依赖性反应。这与以前的报告一致,表明正常情况下大鼠肠系膜动脉的COX信号传导不明显44因此,与Sprague Dawley大鼠相比,来自ApoE KO大鼠的肠系膜动脉显示NO的增加,而这可以通过ApoE KO大鼠的COX产品对标准饮食的促收缩作用增加和EDH信号减弱而得到平衡在西方饮食上。

尽管提供了高度标准化的实验条件,但使用等距肌电描记器进行的内皮功能的药理研究仍存在重大局限性。我们使用ACh诱导内皮依赖性反应,而在体内条件下,内皮依赖性因素在血流量变化和许多体液因素的影响下调节血管紧张度。我们不知道大鼠之间的体内血液动力学参数是否不同。血脂异常和相关的炎症也可能在体内ApoE KO大鼠中促成内皮状态,而这些体液因子并未出现在肌电描记器中。这些不确定性应在以后的研究中加以考虑。在本研究中,仅ApoE KO大鼠被喂以西方饮食。然而,4546,虽然这不是与其他研究一致 16因此,如果用相同的饮食喂养,在我们的ApoE KO大鼠中观察到的某些西方饮食相关变化也有可能在Sprague Dawley大鼠中看到。但是,这不在我们的研究范围之内,尤其是西方饮食是否可以加速ApoE KO大鼠的内皮功能障碍和早期动脉粥样硬化。

结论

据我们所知,这是第一个检查西方饮食喂养的ApoE KO大鼠血管表型的报告。结果是根据关于动脉粥样硬化的先前数据在动脉粥样硬化的其他模型中获得,其中,在改变到血管紧张COX贡献与内皮功能障碍在动脉粥样硬化的早期阶段和氧化应激的显著角色相关联324142动脉粥样硬化动物模型,更好地模仿人类疾病的时程将提高我们的COX抑制剂的治疗效用的理解4047ApoE KO大鼠是研究动脉粥样硬化早期阶段内皮功能障碍的新模型,可帮助我们改善临床前药物开发。

方法

补充图显示了研究设计的摘要图。S1

动物

使用了11至13周大的15只雄性ApoE KO和8只雄性Sprague Dawley大鼠(美国圣路易斯的Horizon Discovery)。Horizon Discovery使用锌指(ZF)技术生产ApoE KO大鼠。每个笼子中饲养2只动物(温度21±1°C,明暗循环12–12 h)。ApoE KO大鼠随机接受西方饮食(体重360.10±8.39 g,n  = 8)或标准饮食(体重352.10±7.94 g,n  = 7),其中41%和10%的能量来自脂肪,分别为(目录号D12079B和目录号D 98,121,701,Brogaarden Korn&Foder ApS,Lynge,丹麦)。将Sprague Dawley大鼠作为遗传背景对照22并喂食标准饮食(体重373.9±7.69,n = 8)。所有动物均可随意获得食物和水。该项目持续了20-24周。在接受西方或标准饮食20–24周后,在31–37周龄时,将大鼠用Sevofloran(Sevorane,AbbVie,哥本哈根,丹麦)麻醉并处以安乐死。

等距力测量

解剖肺动脉(右叶中的第一支支气管动脉)和三层肠系膜,并将其安装在等轴测肌成像仪(丹麦奥胡斯,丹麦奥胡斯)中,如先前所述34用钾溶液(KPSS)评估了最大的收缩反应:用PSCl中的NaCl等摩尔替代KCl。通过血栓烷A 2受体激动剂U46619(10 -8 –3×10 -6   M)和去甲肾上腺素(NA,10 -8 –3×10 -5   M)的累积应用测试了肺动脉和肠系膜动脉的收缩力10:内皮功能通过放松预收缩动脉与乙酰胆碱(ACh评估-7,10 -6 10和–5   M)。分别通过U46619或NA介导的肺动脉和肠系膜动脉刺激获得了大约70%的KPSS诱导的最大收缩前收缩。在单独的时间控制实验中未观察到时间效应(补充图S2)。

血液采样和组织采集

从大鼠开始在七氟醚麻醉下开始饮食,每月从尾巴中采集500 ul EDTA管(Microvette 500 K3E,Hounisen,Skanderborg,丹麦)中的血样。在大鼠禁食过夜后,在麻醉后立即在4 mL EDTA真空管中从左心室收集最后一个样品。在采集后的30分钟内将所有血液样品在4.000 g下于4°C离心10分钟。吸出的血浆保存在-80°C直至进行分析。解剖未进行功能研究的其余肺动脉,并在液体N 2中速冻,并在-80°C下储存直至分析。

免疫组织化学

分离主动脉弓和胸主动脉,并在4℃下于4%PFA(多聚甲醛,Alfa Aesar,美国)中固定过夜,然后包埋在石蜡中。组织教派。(3–4 µm)安装在载玻片上,并保持在室温下直至染色。将切片去石蜡并用苏木精和曙红(H&E,Sigma-Aldrich,奥斯陆,挪威)和兔多克隆CD68(CD-68,Abcam,剑桥,英国)染色。如先前所描述染色,在显微镜下成像的2348

血液化学

使用酶比色法(Roche,巴塞尔,瑞士)在Cobas C111系统(Roche Diagnostics,Basal,瑞士)上分析血浆样品中的总胆固醇,HDL和甘油三酯含量。

免疫印迹

从22只大鼠收集的肺动脉用于Western印迹分析,由于技术问题,缺少了一个样品。肺动脉中的总蛋白质含量使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质检测试剂盒(Thermo Scientific,美国马萨诸塞州,美国)进行定量。在37°C孵育30分钟后,在562 nm(PHERAstar,BMG Labtech,奥尔滕贝格,德国)上测量样品。在含有2%SDS的Laemmli样品缓冲液中,将上清液用于制备凝胶。使用12%Criterion预制凝胶(丹麦哥本哈根的Bio-Rad实验室)分离蛋白质,然后将其电转移到硝酸纤维素膜上。如先前所述,用PBS-T中的5%脱脂奶粉封闭印迹,49用PBS-T洗涤后,将印迹与一抗(COX-1,COX-2和β-肌动蛋白)在4°C孵育过夜,并在室温下用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗观察1小时使用增强的化学发光系统(ECL Plus,GE Healthcare,Amersham,英国)。使用无污点技术将值标准化为总蛋白。

资料分析

(适用于Windows,LaJolla,加利福尼亚州,美国5.02)的GraphPad Prism软件进行数据分析,类似以前的研究34抑制剂的作用被计算为药物给药前后浓度-反应曲线差异的比较。从这些曲线得出–logEC 50,其中EC 50是产生半最大响应所需的浓度,并使用额外的平方和F检验得出最大响应并进行比较结果表示为平均值±SEM。平均值之间的差异通过单因素方差分析,Bonferroni事后检验或t检验统计量进行检验,结果表示为平均值±SD(平均值的标准偏差)。P <0.05被认为具有统计学意义。





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