抗坏血酸治疗TET 2突变型髓系肿瘤的背景效应

功能缺失TET 2突变(TET 2山)在髓系肿瘤中很常见。TET 2是一种DNA双加氧酶，需要2-氧戊二酸和Fe(Ⅱ)氧化5-甲基胞嘧啶.TET 2山从而导致过甲基化和转录抑制。抗坏血酸(AA)通过促进Fe(III)/Fe(II)氧化还原反应提高双加氧酶活性，并可能减轻TET 2山通过恢复双加氧酶的活性。在这里，我们报告AA在预防TET 2山髓系肿瘤(MN)，阐明TET2-AA相互作用的机制，并证明AA恢复细胞TET 2活性的能力取决于N-和C-末端赖氨酸乙酰化和TET 2山。因此，乙酰化转移酶和组蛋白脱乙酰酶的药物调节可能调节依赖于Tet双加氧酶的AA效应.因此，我们的研究强调了可能增强或减弱AA对TET 2影响的因素的贡献，并为新的治疗方法提供了理论基础，包括AA与I/II类HDAC抑制剂或sirtuin激活剂的结合。TET 2山白血病。

TET 2常受亚纯错义突变和功能缺失(LOF)无意义/移码截短突变的影响。1,2。TET 2是铁2+催化2-氧戊二酸(αkg)依赖的dna-双加氧酶，它将5-甲基胞嘧啶(5 MC)逐步氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5 HmC)，5-甲酰胞嘧啶(5 FC)和5-羧基胞嘧啶(5 CaC)。3。这些tet依赖的5 mC dna氧化产物(Tdop)通过碱基切除修复被C取代，从而调节转录轮廓，决定细胞的分化命运、增殖和存活。3,4,5,6,7。此外，DNA去甲基化也是由于甲基转移酶在复制过程中无法复制羟基化甲基化(5hmC)标记而实现的。

TET 2突变(TET 2山)常见于髓系肿瘤(MN)，特别是慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合征(MDS)。1,8,9，在T/B细胞淋巴瘤中10. TET 2山在具有不确定电位(芯片)克隆造血的健康老年人中也有发现。11,12,13,14,15,16。仅TET 2缺乏就会产生一种最初良性的表型，其特征是疾病潜伏期长，外显不完全。1,9,15。然而，TET 2山芯片显示，它们通常是迈向MN的第一步。17。芯片和TET 2山肿瘤随着年龄的增长而增加：在八十年代的港口，多达60%的MDSTET 2山1,9,18. TET 2−/−和TET 2+/−小鼠最初发展为轻度骨髓增生综合征19。辐射加速这一过程表明，更多的基因点击可能导致由初级基因激活的更高的突变负担。TET 2病变20.

抗坏血酸(AA)可能通过将催化中心Fe(III)还原成Fe(II)来提高TET 2的活性21,22。同时2-氧戊二酸脱羧提供了双加氧酶活性所需的两个额外电子。AA可改善杂合子中完整TET 2的功能。TET 2山，或提高双等位基因情况下TET 1/3代偿酶活性TET 2灭活。这些作用可以恢复/改善羟甲基化，并有可能逆转由此引起的表观遗传后果。TET 2缺乏症。与这些理论预测相一致，最近的报道证实了AA的生物活性。TET 2山造血细胞TET 2山-介导白血病模型23,24,25,26，黑色素瘤27。有趣的是，白血病患者的血清AA浓度低于年龄匹配的对照组。28，他们的AA水平随着年龄的增长而继续下降。29,30。然而，这种年龄依赖性的血清AA水平并没有观察到在健康的个人。31。近年来报道了AA在预防白血病发生中的作用。23,26这些研究在很大程度上依赖于骨髓移植模型，对AA对MN进化的遗传模型的影响尚不清楚。最近的病例报告32确实表明，急性生理上剂量的AA可能有益。TET 2山作为单一代理人的AML。然而，目前尚不清楚Tet双加氧酶激活的贡献是什么，以及AA对TET 2-双加氧酶的非依赖性作用是什么。此外，其他因素可能影响TET 2的活性，从而增强或减弱AA效应。例如，翻译后依赖于tet 2赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化可能会增强或降低tet 2的稳定性和活性。33,34。TET2N末端赖氨酸残基乙酰化防止蛋白酶体降解34。与之相反，TET 2催化结构域赖氨酸残基经sirtuins脱乙酰，可提高其活性。

本研究探讨了AA治疗对小鼠模型MN演变的长期影响，以及AA对MN患者TET 2突变人髓系细胞的机制作用。此外，我们还发现，类似赖氨酸乙酰化的催化结构域赖氨酸乙酰化和错义突变对Tet双加氧酶活性有显著影响。AA处理不能恢复催化结构域赖氨酸乙酰化或错义突变引起的TET 2功能丧失。然而，在白血病细胞中加入调节赖氨酸乙酰化的化学探针可以增强AA介导的Tet-双加氧酶活性。我们的研究进一步理顺了AA单独或联合其他药物的靶向治疗应用。TET 2山髓系白血病。

长期口服AA延缓TET 2骨髓增生+/−小鼠

在移植模型中建立AA预防白细胞生成的体内效应。TET 2敲除白血病23,26，但仍未在直接遗传模型中探索TET 2-缺乏。因此，我们进行了几个关键的实验，并探讨了AA治疗的效果。TET 2山小鼠模型。我们从BMS和脾脏中分离纯化单个核细胞。TET 2+/+, TET 2+/−和TET 2−/−小鼠在有无AA的情况下测定TDOP水平。AA能提高小鼠单个核细胞的Tet活性，其三种基因型结构反映在TDOP水平的升高上(补充图5)。1A-E和补充数据1)和减少的菌落数(附图)。1F)。为了进一步探讨长期补充AA预防疾病演变的体内治疗效果，我们治疗了。TET 2+/−小鼠(3.3g/L，AA饮水)1年，分析疾病进展情况。控制TET 2+/−小鼠接受水，自发发展脾肿大，增加Gr-1的比例。+/mac-1+外周血(PB)、脾脏和骨髓中的髓系细胞。这一进展部分逆转与AA补充(图一)。1A-E和补充图。1g)在较低的脾脏重量中观察到(如图所示)。1C)，单核细胞计数。1B)和髓系谱系比例(见图。1D-e)。AA处理对PB、LSK/LK、GR-1+/Mac-1+髓系细胞比例的白细胞、红细胞、中性粒细胞总数无显著影响。1g).

a6-8周的孩子TET 2+/−用3.3g/L AA或水处理小鼠1年，然后处死动物进行单核细胞计数分析。b)，脾脏重量(c)，和Gr1+/MAC 1+比例(d)外周血(PB，顶板)和脾脏(下盘)。e单核/粒细胞流式细胞分析的代表性结果(Gr1)+/MAC 1+)在PB和脾脏中有代表性的WT和TET 2+/−老鼠。每个象限中的数字是单元格的百分比。b, d。数据用扫描电镜分组平均值表示；统计显着性(p由两个尾t检验得出的数值。

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我们还揭露了WT和TET 2+/–小鼠亚致死性电离辐射(IR)，并在饮水中给予3.3 g/L口服AA维持。Ir暴露对WT小鼠1年生存率无明显影响。TET 2+/−老鼠只有40%的1年操作系统(见图)。2A，b)。口服AA改善IR暴露的1年OSTET 2+/−与未处理的IR相比，小鼠骨髓髓系细胞比例平均减少20%~20%。TET 2+/−老鼠(图1.2C).

aWT和TET 2+/−用4.5Gy电离辐射处理小鼠。在H上维持WT小鼠2O.TET 2+/−小鼠给予或不给予3.3g/L AA的H。2O.bWT和WT的Kaplan-Mayer生存曲线TET 2+/−老鼠。AA处理可显著延长辐照后的存活时间。TET 2+/−老鼠。c辐照的长期AA处理TET 2+/−小鼠减少肝髓样细胞浸润(TOP)和Gr1+/MAC 1+BM细胞比例(下)。图为每组8只小鼠的代表性结果。d TET 2+/−和古洛−/−小鼠被杂交以制造杂交。TET 2+/−古洛−/−老鼠。在饮水中分别给予0.033 g/L或3.3g/L抗坏血酸6周后处死。e–g3.3g/L AA可提高大鼠体内DNA氧化水平TET 2+/−古洛−/−老鼠。用2D-UPLC-MS/MS对DNA氧化产物(E.5 hmC、F.5 fC、G.5 caC)进行了表征，用扫描电镜(SEM)对氧化产物进行了分析。n=6)。h TET 2+/−古洛−/−用0.033 g/LAA、0.33g/LAA或3.3g/LAA在饮水中饲养1年。i3.3克/升AA延长TET 2+/−古洛−/−小鼠与0.033、0.33g/L AA比较。在GraphPad Prizm 8.0.1中进行了曲线比较，p给出了Gehan-Breslow-Wilcoxon检验的数值(b和i)和统计意义(p值)来自两个尾t测试表明(e–g).

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为了减轻L-古隆内酯氧化酶(Gulo)产生内源性AA的影响，我们杂交纯合子。古洛−/−小白鼠TET 2敲除小鼠产生杂交TET 2+/−古洛−/−老鼠(图1.二维空间). 古洛−/−小鼠不能合成AA，这是小鼠生存所必需的。35。因此，在我们的实验中，我们用最低限度的AA(0.033 g/L)在饮用水中给小鼠喂食。AA处理显著增加5hmC/5mC、5fC/5mC和5caC/5mC(图1)。2e-g)。我们观察到剂量依赖性的增加TET 2+/−古洛−/−AA治疗小鼠。添加0.33g/L AA和3.33g/L AA后，小鼠的中位生存期分别提高了36d和116d，与维持小鼠生存所需的最低剂量AA(0.033 g/L)相比，差异无统计学意义(图二)。2H，i).

AA处理对TET 2活化和增殖的影响

部分Tet活性丧失TET 2山促进患者骨髓增生，通过过度表达TET 2或AA治疗恢复TET 2功能，可抑制TET 2的增殖。我们接下来研究了AA在实验生成的TET 2过表达中增强TET 2活性的能力。TET 2OE)和击倒(TET 2川崎)细胞株。为此，我们将tet 2从外部表达到两者中。TET 2威汤哥(Meg-01及CMK)及TET 2山白血病细胞系(补充数据)2). TET 2OE与载体控制细胞相比，细胞具有更高的Tet活性(高达8倍)。3A和补充图。2A). TET 2OE细胞的生长速度比对照组慢2-4倍，与TDOPs增加有关(见图)。3A-d和补充图。2A)。同样的生长扰动观察到AA处理的对照细胞(图)。3B-d)。相反，TET 2ShRNA持续减少TET 2K 562和MOLM 13细胞mRNA水平下降80%~90%，5 hmC/5mC和5fC/5mC的mRNA水平下降约两倍(见图)。3E，f和补充图。2B-C)。药物剂量AA处理这些细胞可提高5 hmC/5mC和5fC/5mC比值。TET 2威汤哥(3至5倍)及TET 2川崎(3-4倍)(图1)。3E，f和附图。2B-C)。AA处理显着地抑制了细胞的生长。TET 2川崎细胞和亲本细胞一样。不过，机管局对香港经济增长的影响TET 2川崎细胞更显着(图)。3e-h和附图。2D-e)。用纯化的人CD 34进行集落形成培养。+转导细胞TET 2或者混乱控制。CD 34+细胞在添加或不添加AA的甲基纤维素培养基中生长。当TET 2ShRNA促进集落形成，AA处理降低对照和对照的生长。TET 2川崎CD 34+细胞(图1.3i，j)。我们还研究了AA介导的UP对MN患者骨髓单个核细胞TET 2活性的调节作用。TET 2威汤哥或TET 2山(补充数据)3)。与基因工程的小鼠细胞和人类白血病细胞系相比，AA只在一定程度上增加了TDOP的水平。TET 2威汤哥当TET 2山结果好坏参半。即使250μm AA处理也不显著影响TDOP水平。5 hmC/5 mC中所反映的总Tet活动TET 2山细胞数低于TET 2威汤哥控制(图1.3K)。AA治疗对5 hmC/5mC的影响无统计学意义。TET 2山患者但观察到的轻微效果TET 2威汤哥用定量质谱法评估患者的统计学意义(图一)。3K，l)。更好地了解AA介导的TET 2激活机制及其在TET 2山我们进一步分析了AA对TET 2双加氧酶活性的影响。

a天然TET 2-突变型HEL和TET 2野生型Meg-01和CMK细胞均稳定转染空载体POZ(载体)或POZ-TET 2过表达载体(TET 2OE)。点印迹法检测5 hmC和5mC水平。b–d细胞系(载体和TET 2OE对HEL，MEG-01和CMK分别用PBS或250 M AA处理6天。在Vi细胞XR细胞活力分析仪(贝克曼库尔特)上用台盼蓝排斥法检测存活细胞，并绘制细胞输出图。b梅格-01。cCMK。d赫尔。e–h人K 562细胞和MOLM 13细胞分别转染靶向TET 2的shRNA(SCR)或shRNA(ShRNA)。ShTET 2)，用250 MAA处理。e–f24h后用2D-UPLC-MS/MS对5hmC和5mC进行检测。g–h细胞增殖以不同时间的活细胞数为指标。i–j人脐血CD 34+14d后用集落形成法检测细胞增殖情况。a–j数据显示为平均值±扫描电镜(n=3)，是两个独立实验的代表。k TET 2威汤哥(n=8)和TET 2山 (n用2D-UPLC-MS/MS方法测定人骨髓中5 hmC/5mC的含量，扫描电镜显示数据为平均值。l TET 2威汤哥和TET 2山人骨髓细胞用250 mAA处理48h，或不处理。碱基氧化水平用2D-UPLC-MS/MS评估，同一细胞的数据与箭头连接，TET 2威汤哥, n=3；TET 2山, n=4。TET 2山MN病人信息在补充数据中提供4。成对t(测试)l), p值表示，ns：不显着。

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AA与TET 2结合光盘并且增加了它的活动

更好地了解AA介导的TET 2激活机制及其在TET 2山Mn患者分析AA与TET 2催化结构域相互作用的性质。Dna底物和辅助因子α-KG和Fe2+与TET 2的结合对TET 2的活性是必不可少的，但使AA介导的TET 2活性的扩增所需的条件尚不清楚。以前，用间接内荧光猝灭法研究了AA与TET 2催化结构域的结合，其亲和力为8.7×10。3 M−1然而，结合条件缺乏底物。22。尽管如此，dna结合是一种合作的方法，可以诱导结构适应，提高双加氧酶的活性。36。因此，探讨AA与TET 2相互作用的条件。光盘(TET 2催化结构域)在辅助性因子和含DNA底物的甲基化胞嘧啶存在下，用表面SPR进行直接结合试验。我们表达并纯化了TET 2。光盘有或没有GST标签的同质性(补充图。3A)并与AA进行SPR结合分析。为此，我们要么将gst-tet 2固定化。光盘在cm-5生物传感器芯片上使用抗gst抗体并让aa通过它，或者我们固定链霉亲和素，用它捕获生物素标记的5 mc dna，然后与tet 2结合。光盘。5 mC-DNA、100 mM Fe存在下不同浓度的AA2+用10μm的假底物NOG作分析物，不加(1)或(2)TET 2。光盘。GST作为参考通道控制。用双评估™软件进行分析表明，AA与固定化gst-tet 2结合，解离常数K为第1种情况。d=9.1±2.3M在5mC-DNA、Fe存在下2+和假底物NOG(图1.4A)。在第二个场景中，TET 2光盘在不含gst标签的情况下，用链霉亲和素传感器芯片固定化5 mC-dna-生物素，并在100 mmdr Fe存在下，在不同浓度的aa上捕获到gst2+用10 M假底物NOG作分析。4B)。在此条件下，解离常数为K。d=11.5±2.2M这个值比先前报道的K大近10倍(更强的结合)d在不含5 mC dna的情况下，通过紫外诱导的蛋白质内荧光猝灭来估算AA与tet 2的结合。22。在本研究中，SPR测量生物相关的全激活复合物中的相互作用。相反，荧光猝灭法由于其在紫外区域的强吸光度，容易受到AA与蛋白质结合的限制(附图)。3B)。此外，AA还能猝灭牛血清白蛋白(BSA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和TET 2等不同蛋白质的荧光强度。光盘猝灭常数为8.2×103 M−1，18.2×103 M−18.1×103 M−1分别(附图)3C-f)。这些结果与先前报道的tet 2的紫外诱导荧光猝灭常数的值是一致的。22。这一效应部分是由于蛋白荧光作用下AA的“作用范围”猝灭机制所致。37.

a, b表面等离子共振(SPR)检测AA[0-1000μm]与纯化的重组GST-TET 2的结合光盘在固定浓度的5mC-dna底物存在下，用抗gst抗体固定在cm5生物传感器芯片上捕获。b)或不带GST标签的TET 2光盘用5 mC-dna-生物素固定在SA芯片上(b)，在NOG(100 M)和Fe存在下3+(100海里)。以无AA条件下的响应曲线为对照，减法生成最终响应曲线。钾d = k脱/k在……上面. c。TET 2光盘采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定不同浓度AA的剂量反应，用log(激动剂)VS反应法计算EC 50=13.8±1.3M。R2=0.94)选项在GraphPad Prism 8.0.2中。d–e。游离DNA与纯化的TET 2(20 Nm)和AA(25μm)在Fe存在下作用2h。2+或铁3+(100米)。d斑点印迹右上角：以20 pmol5hmC标记DNA为阳性对照。e2D-UPLC-MS/MS统计意义(p值)来自两个尾t试验表明，NS无显着性。

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AA(9.1±2.3M)与TET 2的结合常数光盘SPR中直接结合作用的计算结果与AA的半最大有效浓度(EC 50=13.8±1.3M)对TET 2的增强作用一致。光盘酶联免疫吸附试验中5 hmC的形成所测定的活性(如图所示)。4C)。转到AA增强TET 2的催化机理，使用分离的TET 2光盘在α-kg存在下，在Fe的存在下，AA对tet 2的活性没有影响。2+(无花果)4D，e)。只有当Fe存在时，AA的作用才能被观察到。3+被利用了。因此，维持铁的氧化还原状态。2+在TET 2的催化位点上，AA介导的双加氧酶活性增加的作用机制最有可能。21。在这种情况下，可以假设还有其他几个直接或间接的生物因素可以绕过AA在补偿TET 2活性丧失方面的作用，其中可能包括催化域的翻译后修饰。

TET 2乙酰化对AA活性的影响

据报道，tet 2的几种翻译后修饰改变了其在癌细胞中的稳定性和活性，包括赖氨酸乙酰化。33,34,38。为了观察最丰富的赖氨酸乙酰化的分布，我们在HEK293T细胞中通过免疫沉淀纯化和LC-MS/MS(补充图)分析了TET 2蛋白在细胞外表达的分布。4)。与以前的报告一致33,34K53和K 1478分别是TET 2蛋白N端和C端最丰富的乙酰化赖氨酸残基(附图)。4C，d).

为了研究赖氨酸乙酰化对TET 2催化活性的影响及其对细胞增殖的影响，我们用几种影响N端和C端赖氨酸乙酰化的化学探针对不同的白血病细胞株进行了处理。为此，我们使用I/II类去乙酰化酶抑制剂或乙酰转移酶P 300/CBP抑制剂或sirtuins激活剂Ⅲ类去乙酰化酶。曲古菌素A(TSA)对CMK细胞的作用，TSA是已知的I/II类脱乙酰酶抑制剂(HDAC I/II)39，导致TET 2蛋白水平和活性呈剂量依赖性增加(图一)。5A，b和附图。5A-b)。AA处理进一步提高了TET 2的活性，达三倍(图二)。5B和补充图。5B)。为了进一步扩大对乙酰化介导的tet 2活性增加的理解，我们对TET 2威汤哥(CMK)和TET 2山具有特异性P 300/CBP抑制剂C 646的(HEL和SIG-M5)白血病细胞系40或哈蒂41还有sirtuin激活剂SRT 172042在AA存在或不存在的情况下。HAT抑制剂或sirtuin激活剂均能显著增加5 hmC/5mC(图1)。5C和补充图。5C-E)。然而，无论是SRT 1720还是HAT抑制剂都没有改变TET 2蛋白水平(补充图)。5F-g)。用sirtuin激活剂SRT 1720处理CMK细胞后，5 HMC呈剂量依赖性增加，AA共处理后进一步扩增。5C和补充图。5H)。而sirtuin抑制剂sirtinol43，表明Tet活性呈剂量依赖性下降。5D和补充图。5I)。为探讨Tet活性增强对白血病细胞生长的抑制作用，用sirtuin激活剂SRT 1720处理白血病细胞株。5E-g)。SRT 1720本身具有抗增殖作用，其LD 50范围为4-8M。5E)。添加AA可使SRT 1720的LD 50降低50%。5F)。浓度在100μm以下的AA表现出中度效应，但增加SRT 1720可引起广泛的细胞死亡(图一)。5G)。TDOP水平的升高以及SRT 1720和AA在SIG-M5细胞中的抗增殖作用提示TET 2的作用可能是由于TET 1/3(补充图1/3)的激活所致。5B和j)和其他具有抗癌活性的SIRT 1靶标44。为了检验这种观察对MN患者的细胞是否正确，我们从三种不同的病例中分离出BM单个核细胞。TET 2+/−(补充数据)3)单独使用AA或与TSA或SRT 1720联合治疗。AA作为单一药物，对TET 2的活性和抗增殖作用均无影响，但与TSA或SRT 1720联合作用时，5 HMC/5mC明显升高，具有相应的生长抑制作用(图1)。5H-I，补充图。5K)，提示sirtuin激活剂或I/II类HDAC抑制剂可能增强AA对MN细胞的作用。

a用TSA 0、2.5或5M处理CMK细胞4h，提取核蛋白组分，Western blot检测TET 2蛋白水平。bCMK细胞用TSA 0、1.25、2.5或5mA处理12h，加或不加100 mAA。提取总基因组DNA，用斑点杂交法测定5hmC/5mC。曲古菌素A(开曼群岛，项目89730)。c用SRT 1720(sirtuins激活剂、开曼群岛、Catalog#10011020)处理CMK细胞12 h，用斑点杂交法测定5 hmC/5mC。dSirtinol，一种已知的sirtuin抑制剂，可以阻止AA介导的Tet活性。用浓度(0、100和200 M)的sirtinol(Selleckchem，Catalog#S 2804)处理CMK细胞12 h，用斑点杂交法检测5hmC。e人髓系白血病细胞株CMK、HEL和SIG-M5分别以TET 2野生型、杂合型和纯合子突变株为对照，用SRT 1720处理，72h后进行细胞存活监测和作图。f–gSirtuin激活增强AA诱导的Tet活性，导致细胞死亡。在100 mAA存在或不存在的情况下，SRT 1720浓度增加对CMK细胞有无影响。f)或以SRT 1720的2M增加AA的浓度(g处理后72h监测细胞存活情况。h–iTET 2+/−从MN患者BMS中分离出单个核细胞，用100 M AA处理，或与5 M TSA或SRT 1720联合治疗。h5hmC/5mC 24。i细胞存活72小时。数据显示为平均±扫描电镜一式三份，至少代表两个独立的实验；p值)来自两个尾t显示测试；*p < 0.05, **p < 0.01, ns not significant.

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AA对髓系肿瘤TET 2赖氨酸突变的影响

我们推测，在MN患者中，由于乙酰化导致TET 2功能丧失，可能出现类似乙酰化的催化结构域赖氨酸残基的TET 2错义突变。TET 2共有136/2002(6.8%)赖氨酸残基，其中55个属于催化结构域(残留物1129-2002)。1205例TET 2赖氨酸残基突变频率分析TET 2山病人(4930人中的24%)1显示其中大部分为移码(补充数据)4)。有趣的是，所有7个错义突变(分别为K1299E、K1310Q、K1491N和K1533R和3K1905E)均位于C末端催化结构域(图1)。6A，补充数据4)。为了探讨这些突变的功能后果，我们利用位点定向突变技术，在HEK293T细胞中产生了这些错义突变和异位表达。我们的数据显示TET 2威汤哥K1299E、K1310Q、K1533R和K1905E突变体蛋白表达水平相同，但K1491N突变体表达水平很低，说明K1491N突变可能影响蛋白质稳定性。6B和补充图。6A)。对5hmC和5mC的活性分析表明，K1299E、K1310Q和K1905E突变体完全失活，有趣的是，添加AA处理不能恢复TET 2功能的丧失。6C和补充图。6B)。与预测一致，赖氨酸对精氨酸(K1533R)突变对TET 2活性无影响。6C和补充图。6B)，大概是因为这两个氨基酸的相似性。TET 2的结构分析光盘在与5 mC DNA底物和辅助因子的配合物中，赖氨酸残基K 1299、K 1310和K 1905位于蛋白质-DNA结合界面(图1)。6d因此，模拟乙酰化的TET 2催化结构域赖氨酸的突变将显著影响其结合DNA底物的能力。36因此，任何突变或翻译后修饰都可能导致活性丧失，而AA扩增Fe(III)/Fe(II)氧化还原反应则无法逆转。

a4930例患者血清中赖氨酸残基TET 2错义突变的棒棒糖图1有髓样肿瘤。b患者TET 2赖氨酸突变体的鉴定指示TET 2山通过定点诱变产生，并在HEK293T细胞中进行体外表达。转染72h后，取细胞进行蛋白提取，用抗Myc标记抗体(CellSignal，Cat 9402 s，1：3000)进行蛋白质印迹分析。c斑点杂交5 hmC/5mC与AA(100 MM)作用24h。dDNA结合界面上经常存在TET 2赖氨酸残基的错义突变。用红色球模型表示赖氨酸残基K 1299、K 1310和K 1905。TET 2光盘(PDB ID 4NM6)在Pymol(Deleno Science)中生成图形。e赖氨酸乙酰化抑制TET 2的活性。离体对TET 2进行了乙酰化反应。光盘有或不含P 300/CBP，且存在或不含乙酰辅酶A。用抗乙酰赖氨酸抗体(细胞信号转导，猫#9441，1：1000)进行检测。SDS-PAGE染色显示总蛋白。乙酰化和非乙酰化TET 2光盘在5 mC-dna底物、2-OG和Fe存在下进行体外活性测定。2+。用2D-UPLC-MS/MS法测定5 hmC和5mC水平。f对TET 2进行了体外乙酰化反应。光盘P 300/CBP存在(+CoA)或不存在乙酰辅酶A(-CoA)。乙酰化(+CoA)和非乙酰化(-CoA)TET 2光盘体外活性测定。100 M铁3+在反应缓冲液中添加浓度为0、100和200 mA的AA。用斑点杂交法检测5hmC和5mC水平。g对乙酰化TET 2进行了质谱分析。光盘蛋白。K 1299、K 1310和K 1905为乙酰化赖氨酸。h乙酰转移酶和脱乙酰酶调节TET 2活性的原理图。指出了用于调节乙酰转移酶和脱乙酰酶活性的化合物。数据显示为三份样品的平均值±扫描电镜，代表了两组独立的实验；p值)来自两个尾t测试表明(e–f).

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为了测试催化结构域乙酰化是否会导致tet活性丧失，而这种活性不能通过aa处理而恢复，我们使用重组tet 2进行了体外乙酰化实验。光盘P 300在辅基乙酰辅酶A存在下，用高分辨质谱法测定酶活性和赖氨酸乙酰化反应。6e-g，补充图。6C)。我们观察到K 1299、K 1310和K 1905与先前报道的赖氨酸(K 1472/1473/1478)一起被乙酰化。33。观察到了几乎完整的b-离子和y-离子序列，并将其明确地归属于特定的指示肽序列。对b或y离子(为K 1299，Y 283标记*y3/y4和b7/b8)+/Y 293+对于K 1310，Y6/Y7和b4/b5代表乙酰化，因为这些碎裂离子与天然赖氨酸有42 Da的质量转移。6g)。此外，还检测到相应的K 1310未修饰肽。然而，K 1299和K 1905的未修饰肽可能是由于未修饰赖氨酸残基的胰蛋白酶消化而未被观察到。催化结构域赖氨酸残基的乙酰化导致TET 2活性的丧失。光盘这是不能通过添加AA来逆转的(如图所示)。6f)。因此，TET 2中赖氨酸残基的乙酰化可能对其活性产生上下文依赖的相反影响(图1)。六小时例如，I类和II类HDACs的N-末端赖氨酸乙酰化可防止泛素化，减少蛋白质降解，从而提高活性(图1)。5A，b)。相反，催化结构域赖氨酸残基的乙酰化在不影响蛋白质水平的情况下降低了TET 2的活性(补充图)。5F-g)暗示这些残基直接参与其活动。

多年来，AA作为一种抗癌药物被广泛研究，因为它能够针对氧化还原不平衡、氧敏感和表观基因重编程(包括增强tet-双加氧酶活性)所呈现的癌细胞最常见的脆弱性。32,45,46,47。最近的几项研究表明，AA可能增强αkg依赖的双加氧酶的活性，从而在以下方面具有治疗作用：TET 2山锰23,26。然而，这些研究大多使用超自然细胞毒性药物AA，因此尚不清楚TET 2山这是由于AA介导的TET 2活性的部分恢复或TET 2的非依赖性对氧化还原活性和氧敏感的影响。而AA的效用问题则是TET 2山Mn仍然不清楚，在这里使用TET 2+/−以小鼠为MN病模型，结合放射治疗，首次证实了AA治疗对MN的预防作用。我们发现AA延缓了MN的发生，延长了MN的存活时间。TET 2+/−和AA缺乏株TET 2+/−古洛−/−老鼠。在这些模型中，人们可以认为类似于人类芯片，AA增加了TDOP水平，减缓了骨髓增生。

我们观察到AA处理对TET 2活性的影响变化很大，这取决于TET 2突变和TET 2蛋白翻译后修饰的背景。AA处理提高了不同细胞株Tet活性的2~10倍，反映在TDOP的全球水平上。但AA对人和小鼠原代组织中Tet活性的扩增作用不大。我们证明了自然发生的细胞系TET 2山在杂合子和双等位基因环境中，AA介导的Tet活性的增加确实是敏感的.然而，结果是大量的原代细胞TET 2山显示出一系列反应，表明存在可能影响AA对TET 2活性影响的修饰因子。AA的最佳利用TET 2山锰仍有待确定。我们观察到AA在许多细胞系中增加了tdop的水平。TET 2山病人和TET 2山这种效应确实与TET 2缺乏细胞的增殖能力降低有关。无论细胞类型如何，TDOP水平与TET 2水平相关；TET 2过度表达导致生长缓慢。同样，由TET 2缺乏症引起的增殖效应也被AA部分逆转。有趣的是，AA的作用也在TET 2−/−细胞，部分原因可能是它对Tet 1或Tet 3活性的影响，而这种活性也可以被AA扩增出来。26AA对细胞生长和存活的影响47。在任何一种情况下，AA都有可能提高所有tet酶的活性，因此无论是否有效，AA都可能有效。TET 2山是半合子或纯合或双等位结构。这些体外数据表明，AA可以作为一种低强度的预防治疗方法。TET 2山芯片或作为MN的高剂量治疗48，与AA在小鼠体内的作用相一致。TET 2山锰23,26，特别是，TET 2/FLT 3-ITD小鼠急性髓细胞白血病模型23.

较早的报道研究了花青素合酶一种2-氧戊二酸铁(Ⅱ)依赖的加氧酶，催化花青苷类黄酮类生物合成中的倒数第二步与AA直接作用。49。用间接法研究了在不含dna的条件下，AA与人tet 2活性的功能关系。22。通过SPR结合分析，我们发现AA以剂量依赖性的方式与人TET 2的催化结构域结合，使双加氧酶活性(EC 50为13.8±1.3M)与其结合亲和力(K)相一致。d在无细胞条件下为9.1±2.3M)。早期的报告显示亲和力降低了近10倍，这可能是由于结合试验的间接性质和缺乏活化的TET 2复合物所致。22。有趣的是，健康人血浆中AA水平接近50 M。31，大大低于先前报告的亲和力。22。因此，本研究测定的AA对TET 2的EC 50与血清中的生理AA水平更为一致和有意义。31。此外，我们还发现AA可以增加Fe的含量。3+对铁2+自Fe在催化中心的氧化还原反应3+它本身无法激活TET 2。如果Fe，AA不能进一步放大TET 2的活性2+都是多余的。然而，当与AA，Fe共刺激时3+有效地恢复了TET 2双加氧酶的活性，表明AA能提高大多数Fe的活性。2+和αkg依赖的双加氧酶都是通过还原酶结合的Fe来实现的。3+对铁2+或者在非偶联脱羧循环中充当交替的氧受体。这些观察阐明了AA/TET 2相互作用的分子基础，进一步加深了我们对AA在体内活性的理解。TET 2山锰。

我们的结果表明AA对TET 2活性的影响可能被TET 2的几层调控所减弱，从而解释了AA处理在不同模型下的潜在变异性。例如，TET 2的酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化增强了其稳定性和活性。48N-和C-末端赖氨酸的乙酰化对TET 2的活性有相反的影响。33,34。N-末端赖氨酸乙酰化通过防止蛋白酶体介导的降解而提高TET 2蛋白水平30。与这些报告一致的是，TSA处理的细胞，一类和Ⅱ类HDAC抑制剂已经增加了TET 2蛋白水平和5 hmC。结果表明，AA与TSA协同作用，进一步提高了Tet活性。然而，C-末端赖氨酸乙酰化抑制TET 2，如全局5 hmC/5 mC所反映的那样。33。赖氨酸乙酰化可以阻止TET 2的催化循环，这是由于5mC-DNA底物的低效补充造成的，因此AA在这种情况下不能激活TET 2。因此，AA的作用可能取决于TET 2赖氨酸乙酰化的背景。

TET 2赖氨酸残基K 1299、K 1310和K 1905位于TET 2的DNA结合界面。光盘因此，重要的是结合到5mC-DNA底物。因此，这些残基对P 300介导的乙酰化很敏感，从而降低了催化活性。相反，它们的乙酰化可以被已知的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸sirtuins逆转。+)-依赖型去乙酰化酶(Ⅲ类HDACs)。事实上，我们已经证实小分子SRT 1720对sirtuins的激活增加了5 hmC，这一效应被AA进一步放大。相反，sirtinol对sirtuin的抑制作用呈剂量依赖性。43,505 hmC/5mC的丢失明显导致TET 2的抑制。有趣的是，对1205的配置进行了全面的分析。TET 2山MN患者大组数据组中的MN患者1所有赖氨酸残基突变(K1299E、K1310Q、K1491N、K1533R和K1905E)均位于TET 2的C端。这些错义突变的功能分析表明，由于电荷分布相似而模拟赖氨酸乙酰化反应的K1299E、K1310Q和K1905E突变完全丧失了TET 2的活性，AA处理不能逆转这种缺失。另一方面，K1533NTET2突变体表达水平较低，K1533R对其活性无影响。这一观察在下列情况下具有机械和临床意义：TET 2山包括MN在内的相关疾病。例如，sirtuin脱乙酰化酶活性的丧失可能对催化结构域赖氨酸残基的乙酰化状态产生显著影响，从而使TET 2对AA介导的Tet-激活不那么有效。此外，我们的结果为TET 2的再激活提供了新的上下文相关的组合方法，从而使HAT抑制剂或sirtuin激活剂可以与AA结合。其他协同组合，也可能包括低甲基化剂氮杂胞苷(Azacytidine)。51,52德西他滨53，可上调TET 2的表达和活性。

总之，我们提出了一个复杂的相互作用的各种翻译后修饰的TET 2，对其双加氧酶活性有深远的影响。我们的结果解释了AA对TET 2功能和其他可能的Tet酶的影响，并为AA在防止MN进化方面的长期利益提供了理论依据。

病人样本

根据克利夫兰临床IRB批准的方案，在知情同意后，从健康对照者或MN患者中获取患者BM样本。原发性患者骨髓单个核细胞用Ficoll纯化(组织不透明-1077，Sigma，10771)。人类脐带血是从俄亥俄州克利夫兰的克利夫兰脐带血中心和CD 34获得的。+细胞用人CD 34微珠试剂盒(Miltenyi Biotec)分离。

细胞株

细胞株在使用后1年内购买。在新鲜培养中，细胞在10代内被使用，以防止任何漂移。K 562和HEK293T是从ATCC(Manassas，VA)购买的，CMK、MEG-01、MOLM-13、HEL和SIG-M5是从DMSZ购买的(德国Braunschweg)。细胞按照其所提供的指导方针生长。其他详情见补充资料2.

小鼠的维持与分析

动物护理和程序是按照机构动物照料和使用委员会批准的机构指南进行的。TET 2−/−老鼠就像以前报道的那样19. 古洛−/−小鼠35研究AA对小鼠MN进展的影响。TET 2+/−老鼠。就像人类一样，古洛−/−因此，小鼠需要食物或饮用水中的AA才能正常发育，古洛−/−在饮水中用0.033 g/L AA维持小鼠。古洛−/−小鼠与TET 2-/-小鼠产生TET 2+/−古洛−/−老鼠。断奶后(3周龄)，TET 2+/−和古洛−/−；TET 2+/−将小鼠(C57BL/6背景)分为3组，分别给予0.033 g/L(维持剂量)、0.33g/L(生理剂量)或3.3g/L(处理剂量)的AA处理。用小鼠复发性眼眶出血法收集PB，涂片进行5-Grunwald-Giemsa染色，并(或)进行自动血细胞计数(HemavetSystem 950 FS)。红细胞溶解后获得白细胞总数。组织病理学分析，股骨固定在甲醛，脱钙，石蜡包埋。对脾脏和肝脏进行了类似的治疗，忽略了脱钙步骤。切片4.5m用苏木精/伊红染色。流式细胞术检测骨髓、脾脏和PB的单细胞悬液，用荧光标记抗体(GR-1-PerCP、克隆RB6-8C5、BD生物科学猫#552093，1：200；MAC-1-PE，克隆M1/70，BD生物科学Cat#553311，1：200)染色。用BD、FACSCantoII或LSRII流式细胞仪进行分析。所有数据用FlowJo7.6软件进行分析。

TET 2蛋白纯化

PGEX4T1-TET 2光盘(1099-1936 Del-插入54)表达载体转化为大肠杆菌菌株BL 21(DE3)pLysS。转化剂在37℃下培养至OD 600为0.6，在16℃下诱导18 h，在50 ml裂解缓冲液(20 mm Tris-HCl pH7.6,150 mm NaCl，1x CelLytic B(Sigma C 8740)，0.2 mg/ml溶菌酶，50 U/ml苯并酶，2mm MgCl)中溶解。2、1mM DTT和1x蛋白酶抑制剂(Thermo Science A 32965)在冰上作用30分钟。溶出物用超声处理器(Fisher Science FB-505和“0.5”探头)进行超声处理，振幅70%，周期18 1 min(20 s，40 s)。然后以40,000×分离心两次。g20分钟。上清液经膜过滤，孔径为0.45mm2，用20 mm Tris-HCl pH7.6,150 mMNaCl溶液稀释4次。GST-TET 2经GEHealthcare Akta亲和纯化(GSTPrep FF 16/10)和凝胶过滤(Superdex 200增加10/300 GL)纯化。凝胶过滤采用10 mm磷酸盐缓冲液和140 mm NaCl缓冲液(pH7.4)。用TEV蛋白酶(Sigma，T 4455)去除GST。

荧光猝灭

在100μl HEPES缓冲液(50 mm HEPES，pH6.5,100 mm NaCl，0.1mm Fe)中，用0.4g蛋白孵育不同浓度的AA。2+、1mm DTT和1mmαKG)。荧光测量是在F-2500荧光分光光度计(日立)上进行的.蛋白质在280 nm波长激发，本征荧光发射光谱在290~450 nm之间。激发缝和发射缝均为5nm。响应时间为0.08s，根据修正的Stern-Volmer方程计算了结合常数(Ka)。22.

表面等离子体共振

用Biacore 3000(GE Healthcare)表面等离子体共振(SPR)技术对TET 2与AA结合的动力学特性进行了研究。响应单位(RU)作为一种约束措施，作为时间的函数被监测。为了制备表面等离子传感器芯片，纯化的gst标记tet 2。光盘(纯度>90%)用抗gst抗体(Biolegend，猫#640802，10g/ml)捕获。55,56。不同浓度AA(0-1000μm)在底物DNA、Fe存在下的变化3+以假底物NOG(25 M，取代真底物2-氧戊二酸盐，2-OG)作为分析物.另外，Biacore芯片使用固定化生物素标记的5mC DNA寡糖底物和无gst标记的tet 2。光盘被捕获，在Fe存在下，在0-1000 mA之间发生变化。3+和NOG(25 M)。在所有的SPR实验中，不同浓度的分析液以10μ1/min的速度在含固定化蛋白的传感器芯片上传递5 min，并在SPR缓冲液通过芯片上5 min时进行解离监测。数据在含有固定GST的参考通道上进行归一化。在HBS-P缓冲液中两次注入500 mm NaCl，在20μl/min下再生30 s，用BIA评价软件V3.2(Biacore Inc.)进行分析和数据拟合，并选择同时进行Ka/KD计算。在1：1 Langmuir模型的情况下，采用全局拟合的方法拟合KA和KD的Sensorgram数据。符合度标准χ2≤最大响应的1%(R)马克斯).

点印迹

在体外反应中，用0.4gTET 2孵育60 bp双链DNA底物(1M)。光盘含50 mm HEPES(pH6.5)、100 mm NaCl、0.1mm Fe(NH4)的100μ1缓冲液中的蛋白质2(SO4)2或FeCl360 bp双链DNA包括：F5‘-ATTATATAATT AACGAATTATATATATAAT-TAATATA-3’R5‘-TATAATTTmCGTAATTATATATAT-ATATTGTAAT-3‘(IDT Inc.)序列反应结束后，用相同体积的2X变性缓冲液(0.8 M NaOH/20 mm EDTA)在95°C下混合10 min，用相同体积的2M NH4OAc(pH7.0)中和。用基因组DNA纯化试剂盒(Promega)提取斑点杂交DNA。样品被变性后，使用生物点状仪器组件(Bio-Rad)在硝化棉膜上发现.然后用光谱仪™xl-1000(120 mj/cm)将它们进行空气干燥和交联。2)，用抗5 hmC(活性基序，Cat#39769，1：5,000)或抗-5 mC(Eurogentec，Cat#BI-MECY-0100，1：2,500)抗体检测。膜被亚甲基蓝染色。

5 hmC ELISA法检测TET 2活性

96孔微滴度板在0.1M NaHCO中包覆10 pmol亲和素(0.66μg，Sigma A 8706)。3。然后捕获生物素-5 mC-dna(Idt)底物，然后与tet 2孵育。光盘(0.4g)在100μl分析缓冲液[50 mm HEPES pH6.5,100 mm NaCl，0.1mm Fe(NH4)]中2(SO4)2或FeCl3在37°C下，用0.05M的NaOH(100μmol)终止反应，表明AA与1mM2-OG在37°C下作用2h。洗井后，用2%bsa堵塞水井，用抗5hmC抗体(活性基序，猫#39769，1：3000)在4℃过夜，用hrp结合的抗兔二次抗体(Santa Cruz，cat#sc-2004，1：10，1：10,000)显影，用tmb(100μl/孔，t4444)进行显色，并加入50 mhh，停止显色。2所以4在450 nm处测量光密度。

TET 2 shRNA转导

1×105细胞/条件，总体积为1mL，置于1.5mL Eppendorf管中。每管加入2 L聚布林(4mg/mL)，其次为20 L shTET 2(TrN 0000421134，Sigma)或杂乱的shRNA病毒(TRCN00421134)。样品在1000×离心下离心g在32℃下持续90 min。上清液被丢弃，样品在适当的培养基中加入FBS，然后放置在6孔板中进行进一步的实验。

稳定TET 2过表达

Hel、meg-01和cmk细胞株稳定感染。通孔带有空的POZ载体或POZ-TET 2(TET 2)的慢病毒OE)向量。RT-PCR证实TET 2的表达。

定量实时PCR

用RNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel)从细胞中提取总RNA。用大容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统)获得cDNA。采用Taqman基因表达引物TET 2(Hs 0032599_M1)和GAPDH(Hs 02786624g_M1)对CFX 96进行实时PCR检测。所有的实验都是重复的。基因表达标准化为GAPDH，并与对照组进行比较。为TET 1和TET 3用SsoAdvancedUniversalSYBR Green SuperMix(Bio-Rad，Cat)进行mRNA检测，qRT-PCR。1725270)。引物列在补充数据中4.

定点诱变

融合HD克隆试剂盒(Takara，638916)用于TET 2错义突变克隆。引物列在补充数据中4。所有序列均经Sanger测序证实。

细胞活力测定

细胞在不同浓度AA存在或不存在时，用小分子作用0~72h，用Vi细胞XR细胞活力分析仪(贝克曼库尔特)进行评价。

体外集落形成试验

来源于骨髓或纯化CD 34的单个核细胞+用shTET 2处理的细胞和空载体分别在3000个甲基纤维素平板上播种(Methocult™，H 4435；干细胞技术)。第14天获得殖民地。

TET 2的体外乙酰化光盘酶法

纯化TET 2光盘不含gst标记的蛋白(4g)与重组或不含重组p 300催化结构域(P 300)的蛋白孵育。光盘在100 M乙酰辅酶A(A 2056，Sigma-Aldrich)存在或不存在的情况下，在100 L HAT缓冲液(50 mm Tris-HCl，pH 8.0，0.1mm EDTA，1mm DTT)中，30°C，1h。光盘乙酰化蛋白与100 mM HEPES缓冲液(50 mm HEPES，pH6.5,100 mm NaCl，1 mm CaCl)混合。2，1 mmαKG，1 M5mC-dna底物)，Fe2+或铁3+，以及不同浓度的AA。乙酰辅酶A或P 300的模拟反应光盘作为对照。用Biacore™SPR仪检测不同数量的乙酰化蛋白结合。

westernblot分析

1,000万细胞经TSA处理后，再悬浮于250 L缓冲液A[10 mm HEPES(pH 7.8)，10 mm KCl，1.5 mm MgCl]中。2、0.34M蔗糖、10%甘油，在冰上孵育15 min。最终浓度为0.2%的NP 40添加到细胞中，并在最高温度下旋转10s(Vortex genie-2，Science Inst)。离心收集核(5 min，1300×)g4°C再悬浮于250℃缓冲液B(3 mm EDTA，0.2mm EGTA)中，5 min在冰上溶解。离心后(5分钟，1700×g取4°C)上清作为核分数，进行Western blot分析。所有溶液均加入1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒(A 32965，Thermo)。采用抗TET 2抗体(B乙基实验室，Cat#304-247 A，1：1000)进行Westernblot分析。

用于修饰DNA碱基的2D-UPLC-MS/MS

所有2D-UPLC-MS/MS分析均按先前报道的方法进行。57。简单地说，DNA水解物以体积比为4：1的内部标准混合，形成浓度为50 fmol/L的[D]。3]-5-hmdc，[13C10, 15N2]-5-甲酰基-2‘-脱氧胞苷(5-FDC)，[13C10, 15N2]-5-羧基-2‘-脱氧胞苷(5-CADC)，[13C10, 15N2]-5-羟甲基-2‘-脱氧尿苷(5-羟甲基-2’-脱氧尿苷)和[15N5]-8-牛。用带光电二极管阵列检测器的Waters Acquity 2D-UPLC系统进行色谱分离.第一维色谱定量分析未修饰脱氧核苷(DN)和5-甲基-2‘-脱氧胞苷(5-MDC).第二维使用Xevo TQ-S串联四极质谱对所有其他分析物进行量化。

TET 2乙酰化反应的MS分析

如前所述，对TET 2的翻译后修饰进行了LCMS/MS分析。58。在50 mm碳酸氢铵中加入5μL 10 ng/μ胰蛋白酶，室温下提取蛋白质带，在50 mm碳酸氢铵中加入5 min L 10 ng/μ胰蛋白酶，在50 mm碳酸氢铵中提取肽(2x)，再用乙腈脱水，再在凝胶内消化前与碘代乙酰胺进行烷基化反应。这两种提取液经真空干燥后再悬浮于30℃1%甲酸中进行LC-MS分析。在溶液消化中，用乙酰化和模拟对照样品进行胰蛋白酶消化，并在固相萃取过程中进行脱盐。色谱柱为Dionex柱(15 cm×75m)，色谱柱为Dionex柱(15 cm×75 m，2μm，100μm反相毛细管色谱柱)。将胰蛋白酶提取液(5L)注入乙腈和0.1%甲酸梯度洗脱，流速为0.3μL/min。微电喷雾离子源工作在1.9kV。

质谱数据分析

蛋白质组发现器对MS原始文件进行分析。根据TET 2(NCBI参考序列：NP_001120680.1)或内部构建的人TET 2蛋白序列，对MS/MS谱进行检索。考虑的修饰包括赖氨酸(K)的乙酰化。前体耐受性为10 ppm，片段耐受性为0.02Da。对分配给乙酰化反应的MS-MS光谱进行了手动检查，以确保正确性：y-和b-对系列碎裂离子进行标记检测。肽的无标记定量(总离子强度)是在热释电分析软件中用Qual浏览器进行的。简单地说，肽保留时间和肽质量是从相关的MS-MS光谱中得到的.从LC-MS中提取等分辨前体离子m/z比，用柱保留时间选择感兴趣的离子。峰下面积被用来量化特定系列的离子丰度。

统计与重现性

所有统计分析均以GraphPad Prism 8.0(Https://www.graphpad.com/)除非另有说明。统计显着性是用两个尾随学生进行的。t除非另有说明，否则测试。每个实验一式三份，在可能的情况下至少进行两次。

报告摘要

有关研究设计的更多信息可在与本文链接的“自然研究报告摘要”中获得。

本手稿中所报告的所有来源数据都是补充数据的一部分，作为补充数据。1。任何具体的材料要求都可以向相应的作者提出。本手稿中使用的所有工程细胞系可根据要求提供。TET 2翻译后修饰赖氨酸乙酰化的质谱蛋白质组学数据已通过Pride存入ProteomeXchange财团。59具有DataSet标识符PXD 020550的合作伙伴存储库。