Ad5/3腺病毒能与人淋巴细胞和红细胞结合 研究了腺病毒Ad5/3在不同VP/细胞条件下与淋巴细胞和红细胞的结合情况。Ad5/3病毒以1，10,100 VP/细胞与淋巴细胞共同孵育，0.0036、0.036和0.36VP/细胞与红细胞共同孵育30 min，然后离心和细胞内病毒DNA定量(附图)。 1 )。我们发现病毒与淋巴细胞和红细胞在不同的VPs上结合：输入越高，病毒结合量越大。
为了检测Ad5/3腺病毒与淋巴细胞(10 VP/细胞)的结合情况(见图)。 1A，b )和红细胞(以0.036 VP/细胞计)(如图所示)。 1C，d )离心培养30 min后收集上清液，定量检测病毒DNA。细胞组分洗5次，每次洗后取样品。每次清洗后，Ad5/3腺病毒均能与所选择的血细胞类型保持相当一致的结合。虽然上清液在每次清洗时都被移除，但每一轮离心和洗涤后，上清液中都能检测到未结合病毒。因此，我们看到了病毒与红细胞和淋巴细胞的持续关联，证实了病毒的一部分存在于细胞中。
图1：腺病毒颗粒与淋巴细胞和红细胞的关联。 腺病毒Ad5/3-Luc1( a , c )和倾斜-123( b , d 以10 VP/细胞(3×10e7VP/ml，3×10e6细胞/ml)与人淋巴细胞共同孵育。 a , b 红细胞为0.036 VP/ml(5×10 e9 VP/ml和1.8×10 e8细胞/ml)。 c , d 37°C培养30 min后，经2000×离心分离出细胞部分和上清液。 g 10分钟。细胞组分洗涤5次，每次洗涤后，取上清液和颗粒样品，用qPCR进行分析。病毒拷贝数根据样本中基因组DNA的数量进行归一化，这取决于人β-actin的表达水平。数据以平均值+扫描电镜表示。腺病毒颗粒与细胞分数(黑条)和上清液(苏普，灰条)有关。不洗；孵化后先离心1次；用PBS洗一次，洗2次；洗两次，洗3次；洗4次；洗5次；洗3次，4次和5次。
Ad5/3与淋巴细胞和红细胞的结合是可逆的，对病毒的吞噬能力没有抑制作用。 其次，我们评估Ad5/3与人淋巴细胞和红细胞的结合是否抑制腺病毒的转导。我们使用复制缺陷的Ad5/3-Luc1来检测病毒是否能够在淋巴细胞或红细胞的作用下转移癌细胞，从而导致荧光素酶的表达。同样，用mts法检测细胞杀伤效果。 31 ].
感染Ad5/3-Luc1的细胞无论是否存在淋巴细胞或红细胞，都表现出明显的转导能力(图5/3-Luc1)。 2A，b )。当淋巴细胞稀释1：1.7+Ad5/3-Luc1混合液与A 549癌细胞共同孵育时，我们观察到荧光素酶的表达水平与10 VP/细胞相当。当淋巴细胞1：2.7和1：6.7稀释+Ad5/3-Luc1混合液与A 549细胞孵育时，荧光素酶的表达水平分别与1VP/细胞和0.1VP/细胞相当。 2A )。细胞-病毒混合物在A 549细胞上清洗3次后，荧光素酶的表达与0.1VP/细胞相似。在红细胞中，所有条件下的转基因表达水平都与0.1VP/细胞相当，包括细胞-腺病毒混合物在感染前洗过三次的组。 2B )。从阴性对照样品中未观察到发光信号。 E. 在缺乏A 549细胞的情况下，与Ad5/3-Luc1共同孵育红细胞或淋巴细胞(补充图5)。 2 )。这些结果表明腺病毒Ad5/3与淋巴细胞或红细胞的结合是可逆的，释放的病毒能够感染细胞。
图2：腺病毒转导与淋巴细胞、红细胞相互作用后的肿瘤细胞杀伤潜能。 Ad5/3-Luc1( a , b )和倾斜-123( c , d )37°C与人淋巴细胞共孵育30 min。 a , c )10 VP/细胞或与人红细胞( b , d )0.036 VP/细胞。细胞-腺病毒混合液1：1.7、1：2.7和1.6.7稀释液分别加入A 549单层。其中一组，细胞-腺病毒混合物用pbs洗涤三次，浓度为2000×。 g A 549单层加入细胞悬液10 min后1：2.7稀释。48h后测定荧光素酶的表达。 a , b )。细胞倾斜123的杀伤能力(0.1~100 VP/细胞)或与淋巴细胞( c )或红细胞( d 第3天对A 549细胞进行细胞毒性(MTS)分析。数据以平均值+扫描电镜表示。不洗；孵化后先离心，3倍洗；用PBS洗3次。
用复制敏感的倾斜-123病毒(图1)研究了细胞结合腺病毒的抗肿瘤作用。 2C，d )。我们观察到阳性对照细胞的最大杀伤量( E. 100 VP/cell)。当使用10 VP/细胞的倾斜-123，我们发现类似的细胞杀伤1：1.7和1：2.7混合淋巴细胞与倾斜-123的稀释，直到第3天(图1)。 2C )。当我们使用1：6.7稀释的淋巴细胞加倾斜-123混合液或1：2.7稀释的细胞-病毒混合物洗涤三次时，细胞杀伤率相当于1VP/细胞(图1)。 2C )。因此，表明腺病毒与这些细胞类型结合并不抑制病毒的肿瘤力。与红细胞相比，1：1.7和1：2.7混合细胞的稀释度分别为10 VP/细胞和1 VP/细胞。当1：6.7的红细胞稀释+倾斜-123混合液或细胞-病毒混合物洗涤3次时，用1：2.7稀释度，细胞杀伤率可与0.1VP/细胞相当(见图)。 二维空间 )。因此，我们发现，即使与淋巴细胞或红细胞结合，病毒仍能完全发挥作用。
通过迁移实验进一步研究了细胞结合腺病毒的杀伤能力。我们观察到，细胞结合的腺病毒倾斜-123的效力与未结合的腺病毒在1VP/细胞时相当。结果表明，部分病毒从红细胞和淋巴细胞中释放出来，通过透孔迁移，杀死A 549细胞。因此，它进一步证实，腺病毒，在这种情况下，倾斜-123，即使在与淋巴细胞或红细胞结合(并随后释放)后，仍然保持肿瘤的能力(补充图)。 3 ).
腺病毒Ad5/3与淋巴细胞和红细胞表面结合 为了观察Ad5/3病毒与血细胞的结合情况，我们与淋巴细胞和红细胞共同孵育了倾斜-123，并通过电子显微镜(SEM和TEM)对样品进行了观察。腺病毒是一种无包膜病毒，有二十面体衣壳(~90 nm)[ 38 ]。SEM图像显示Ad5/3嵌合腺病毒能在淋巴细胞表面结合。 3A，b )和红细胞。 3C )。因此，我们不仅能够通过扫描电镜对病毒进行检测和鉴定，而且还能证实其与人淋巴细胞和红细胞的表面联系。
图3：含淋巴细胞和红细胞的Ad5/3腺病毒的电镜观察。 37°C与人淋巴细胞共孵育30 min的倾斜-123扫描电镜(SEM)图像 a , b )和人类红细胞( c ). (d) Ad5/3腺病毒伴淋巴细胞的透射电镜观察箭头表示病毒在细胞表面的结合。
根据以前的知识，红细胞不能内化腺病毒 39 ]，但对于淋巴细胞来说，这一点还没有得到很好的研究。为证实腺病毒Ad5/3与淋巴细胞的结合，采用透射电镜对淋巴细胞-腺病毒混合物进行了分析。有趣的是，我们没有发现任何内化的腺病毒，但我们发现倾斜-123结合在一个淋巴细胞的表面(图一)。 三维空间 )。因此，结果进一步证实了我们的发现，Ad5/3腺病毒与选定的细胞类型有表面联系。
腺病毒Ad5/3与红细胞和淋巴细胞的结合是可逆的，对肿瘤的体内转导没有抑制作用。 系统性地输送肿瘤病腺病毒是一种很有吸引力的方法，因为它同时提供了治疗原发肿瘤和转移瘤的可能性。 40 ]。因此，我们决定在体内研究红细胞和淋巴细胞是否能有效地将Ad5/3导入肿瘤，以及与这些细胞结合是否能保护病毒不被中和。接种人前列腺皮下肿瘤(PC-3MM2)的免疫缺陷小鼠(PC-3MM2)静脉滴注，以病毒(1.5×10e10VP/100 l)为阳性对照，1.5×109VP/100μl为实验对照，或与红细胞或淋巴细胞500 VP/细胞结合。
静脉注射后，各组( i . e 。用qPCR方法检测肿瘤中存在腺病毒DNA。红细胞或淋巴细胞的病毒传递不能改善肿瘤的转导。然而，与淋巴细胞相比，与红细胞相比，肿瘤组织中的倾斜-123 DNA的存在略有增加(图1)。 4A ，p-h； p =0.00575)。因此，我们已经证明，病毒与红细胞或淋巴细胞的结合并不妨碍肿瘤的转导。此外，静脉注射倾斜-123治疗组，无论是否与红细胞和淋巴细胞结合，病毒DNA有效地存在于肝脏、脾脏和肺部(图一)。 4B-d )。当病毒携带淋巴细胞时，我们发现肝脏中的病毒DNA比用红细胞传送时要少(p-h)； p =0.0477)。与对照组(10倍)相比，与淋巴细胞结合时，肺部病毒DNA明显降低(图10)。 4D ，p-h； p =0.0374)。我们在阳性对照组中检测到病毒持续时间延长(比其他组多10倍)(图1)。 4E )。从而证实人红细胞和淋巴细胞并不能阻止腺病毒在肿瘤和器官中的转导。
图4：腺病毒在是否存在淋巴细胞和红细胞的情况下对前列腺肿瘤的系统转导。 免疫缺陷NMRI小鼠皮下接种PC3MM2前列腺肿瘤，静脉注射倾斜-123以前与人淋巴细胞或红细胞孵育(500 VP/细胞)。阳性对照组和阴性模拟对照组分别接受10倍以上的病毒(1.5×10e10VP)或PBS。治疗后第3天，对小鼠进行安乐死和肿瘤治疗。 a )、肝脏( b )、脾脏( c )、肺( d )和血清( e )采集腺病毒Ad5/3基因组，用qPCR方法检测腺病毒Ad5/3基因组。病毒拷贝数根据样本中基因组DNA的数量进行归一化，由人β-actin(用于肿瘤)和小鼠β-actin(用于小鼠标本)的表达水平确定。计算肿瘤与肝脏的拷贝数比率以评估病毒的分布( f )。数据以平均数表示。红细胞：红细胞；淋巴细胞：淋巴细胞。** P < 0.01, *P < 0.05 by two tailed post hoc Dunn’s test adjusted by Holm multiple testing correction method.
重要的是，肿瘤与肝脏的比率分析表明，腺病毒在与淋巴细胞结合时能更好地在肝脏上传递肿瘤(平均2.44)，与红细胞结合时更好(p-h)； p =0.00798；平均68.93)，仅注射病毒(平均0.4)。特别是与红细胞结合时，对肿瘤转导的偏好甚至明显高于阳性对照组(10×10×以上静脉滴注病毒，平均18例)(图18)。 4F )。肝脏是大多数病毒摄取的器官，因此这是一个相关的比较 41 ].
-123与红细胞结合(p-h)； p =0.0352)和淋巴细胞，尽管中和抗血清，并显示病毒DNA在肿瘤中的存在比单独病毒与抗血清混合时增强(见图)。 5A )。有趣的是，当病毒与抗血清混合时，我们发现肝脏中有少量的病毒DNA存在(图一)。 5B ).
图5：腺病毒系统在有无淋巴细胞和红细胞的情况下与Ad5/3特异性抗血清一起转导前列腺肿瘤。 免疫缺陷NMRI小鼠皮下接种PC3MM2前列腺肿瘤，在Ad5/3特异性抗血清存在下，静脉注射倾斜-123，先与人淋巴细胞或红细胞(500 VP/细胞)孵育。阴性模拟对照接受PBS。经过3天的治疗后，小鼠被安乐死和肿瘤。 a )、肝脏( b )、脾脏( c )、肺( d )和血清( e )采集腺病毒Ad5/3基因组，用qPCR方法检测腺病毒Ad5/3基因组。病毒拷贝数根据样本中基因组DNA的数量进行归一化，由人β-actin(用于肿瘤)和小鼠β-actin(用于小鼠标本)的表达水平确定。计算肿瘤与肝脏的拷贝数比率以评估病毒的分布( f )。数据以平均数表示。红细胞：红细胞；淋巴细胞：淋巴细胞。* P < 0.05 by two tailed post hoc Dunn’s test adjusted by Holm multiple testing correction method.
因此，我们已经证明，即使存在中和抗体，细胞能够传递Ad5/3病毒。值得注意的是，当腺病毒Ad5/3与细胞结合时，即使存在中和抗体(平均值；倾斜-123+抗血清0.26；倾斜-123+红细胞+抗血清14.85；倾斜-123+淋巴细胞+抗血清156.68)；倾斜-123+抗血清和倾斜-123+淋巴细胞加抗血清之间的专案试验( p )(图1。 5F ).
每个肿瘤在肿瘤血管和肿瘤微环境方面都不同，这使得它们对肿瘤病毒治疗有不同的反应。 42 ]。当使用小鼠(或任何动物模型)时，每只小鼠在肿瘤摄取的速度、肿瘤的大小和血管的形成等方面都不同。这些因素在肿瘤信号转导变异中起着重要作用。同样的现象也出现在人类身上。因此，我们重复了上述所有类似的实验，但使用了不同的肿瘤模型：人肺腺癌A 549肿瘤。在本实验中，我们在肿瘤、肝脏和脾脏中发现了更多的Ad5/3病毒DNA，而阳性对照组的病毒静脉注射量是其他组的10倍。单独与淋巴细胞结合的实验剂量的倾斜-123和与淋巴细胞结合的倾斜-123对肿瘤有相似的病毒传递效果(图一)。6A )，而对肝脏的影响则较小(图中所示)。 6B )和脾脏(附图。 4A )。在本实验中，除了阳性对照组的一只小鼠外，我们没有发现血清中存在病毒(补充图)。 4B ).
图6：淋巴细胞和红细胞存在与否时肺肿瘤腺病毒系统传导。 免疫缺陷NMRI小鼠皮下接种A 549人肺腺癌肿瘤，静脉注射2×10e9VP/100 l的倾斜-123，或预先与人淋巴细胞或红细胞(667 VP/细胞)孵育或不加抗血清。阳性对照组和阴性模拟对照组分别接受倾斜-123和PBS的2×10e10 VP/100μl。3d后处死小鼠。肿瘤( a ) (d 细胞病毒和抗血清混合在一起)和肝脏 b ) (e 将细胞病毒与抗血清混合后，用快速冷冻法检测腺病毒Ad5/3基因组。计算肿瘤与肝脏的拷贝数比率以评估病毒的分布( c , f )。病毒拷贝数根据样本中基因组DNA的数量进行归一化，由人β-actin(用于肿瘤)和小鼠β-actin(用于小鼠标本)的表达水平确定。数据以平均数表示。红细胞：红细胞；淋巴细胞：淋巴细胞。
阳性对照组(10倍)肿瘤肝比平均为1.017，实验病毒剂量组为12.78，红细胞病毒结合组为0.034，淋巴细胞结合病毒组为13.75。 6C )。但两组间无显着性差异。对于红细胞组，只有一只小鼠的一个肿瘤的E4拷贝数/ng基因组DNA值略呈阳性，为0.1(如图所示)。 6A 5A，b ).
当我们加入中和抗血清时，我们发现与其他组相比，接受与红细胞结合的病毒加上抗血清的组中大多数病毒DNA(图1)。 6d )。此外，在这组患者的肝脏和脾脏中发现的病毒DNA较少(如图所示)。 6E 和补充图。 4C )。我们没有在任何一组的血清中检测到病毒(补充图)。 4D )。在本实验中，抗血清对病毒本身有更大的中和作用，导致肝脏中的病毒比肿瘤多，因为肝脏摄取(例如库普弗细胞)不依赖于与病毒初级受体的相互作用。 43 , 44 ]。在病毒加淋巴细胞和抗血清的情况下，我们看到了明显的中和作用(图)。 6d-f 和补充图。 4C ).
病毒+抗血清组肿瘤与肝脏的比值平均为0.0024，病毒+红细胞+抗血清组为18.49，病毒+淋巴细胞+抗血清组为0.4。我们观察了IL-2和TNF-a在肿瘤标本中的表达，显示了病毒复制(附图)。 5C，d ).
