背景

附件蛋白A1在肿瘤血管表面特异表达。通过附件蛋白A1静脉注射IF7靶向肿瘤血管。我们验证了这样的假设：IF7克服了血脑屏障，静脉注射IF7C(RR)-SN 38可以消除小鼠脑瘤。

方法

(1)将表达荧光素酶的黑色素瘤B16细胞系B16-Luc接种到同基因C57BL/6小鼠的脑内和皮肤下，形成双瘤模型。IF7C(RR)-SN38以7.0μ鼹鼠/kg静脉滴注，化学发光法检测肿瘤生长情况。在免疫功能低下的SCID小鼠中，用C6-Luc细胞系建立了类似的双肿瘤模型.(2)用10%Solutol HS 15配制的IF7C(RR)-SN 38，以2.5μ鼹鼠/kg静脉滴注于两只小鼠模型：C57BL/6小鼠的B16-Luc细胞和裸鼠的C6-Luc细胞。

结果

(1)每日注射IFN_7C(RR)-SN_(38)对肿瘤生长有抑制作用，而不论细胞株或小鼠株。(2)Solutol配方IF7C(RR)-SN38每日注射可使C57BL/6小鼠B16-Luc脑瘤完全消失，而C6-Luc裸鼠则未见此现象。

结论

IF7C(RR)-SN 38跨越血脑屏障，抑制小鼠脑肿瘤的生长。Solutol HS 15-配方的IF7C(RR)-SN 38可能促进了抗肿瘤免疫应答。

中枢神经系统癌症是人类恶性肿瘤中最具破坏性的：1胶质母细胞瘤手术切除后化疗或放射治疗后，中位生存期为12个月。2除原发性中枢神经系统肿瘤外，肺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌和黑色素瘤患者均有脑转移，目前已有的化疗药物难以消除这些转移。3,4

虽然体外培养的脑肿瘤细胞对多种抗癌药物有反应，但体内的脑肿瘤并不是由于血脑屏障(BBB)在健康的条件下保护中枢神经系统免受病原体和有毒物质的影响。5,6许多研究人员试图利用大脑血管表面受体介导的蛋白质来克服这一障碍，7肿瘤穿透肽8,9,10或者纳米粒子。11另一方面，肿瘤周围的血管是混沌的，允许大分子和纳米粒子通过内皮细胞之间的间隙来克服血脑屏障。12然而，针对大脑的药物往往依赖于被动扩散，因此在最大耐受剂量下使用，会造成副作用。因此，有效治疗脑肿瘤既需要肿瘤的血管靶向性，也需要通过一种治疗手段来克服血脑屏障。13

在此之前，我们通过筛选具有抗树状水化合物抗体的肽展示噬菌体库，鉴定了几种7-聚碳水化合物模拟肽。14随后，我们鉴定了一种肽，我们将其命名为IF7，它与附件蛋白A1(Anxa 1)结合，这是一种特定的恶性肿瘤内皮细胞表面标记物。15静脉注射给荷瘤小鼠后，IF7结合抗癌药物可抑制小鼠结肠、黑色素瘤、乳腺、前列腺和肺肿瘤的生长。16,17其他人成功地测试了IF7-结合紫杉醇纳米粒子在小鼠皮下肿瘤。18我们的数据表明，在与肿瘤血管表面的Anxa 1结合后，IF7通过胞吞作用穿过内皮细胞从腔面转运到基底膜，并释放到肿瘤间质；因此，我们推测IF7结合化疗药物可以穿过血脑屏障，将药物输送到脑基质。

材料

除另有说明外，本研究中使用的肽包括IF7C(RR)或IFLLWQRCRR和C(RR)或CRR，由GenScript(Piscataway，NJ)合成。人和小鼠MC 16(ANXA 1和Anxa 1的N端15位残基加半胱氨酸残基MAMVSEFLKQAWFIEC和MAMVSEFLKQARFLEC)及其突变体经生物合成法(Lewisville，TX)合成。兔抗Annexin 1抗体来自Invitrogen，兔抗CD 34抗体来自ABCAM.FITC结合抗CD8α抗体来源于BD制药原，未结合抗CD8α来自ABCAM.IF7C(RR)-SN38和C(RR)-SN38在加州圣迭戈Calchem合成。伊立替康来自西格玛(圣路易斯，莫)。

细胞株

所有细胞系，包括大鼠胶质瘤C6、小鼠黑色素瘤B16F10和小鼠Lewis肺癌LL/2，均来自美国型细胞培养，在Dulbecco改良的Eagles+F2培养基中添加10%胎牛血清和100个单位/mL的青霉素和链霉素。用携带萤火虫荧光素酶的慢病毒感染产生C6-Luc细胞、B16F1-Luc细胞和LL/2-Luc细胞。慢病毒载体PGK-Luc是在Sanford-Burnham-Prebys医学发现研究所(SBP)的病毒核心设施中产生的。

荧光标记IF7C(RR)和C(RR)的制备

采用分子探针Alexa Fluor 488 C5-Maleimide对IFLLQARC(RR)和C(RR)肽进行荧光标记。每一肽(1mg)在5 0 0μ1 DMSO中与摩尔当量的Alexa Fluor 488 C5-马来酰亚胺反应。样品孵育4h后，用水、甲醇和二甲基甲酰胺(DMF)预洗，将样品置于BondElutSCX柱(100 mg，Agilent Technology，日本)上。用50%DMF 3ml水洗后，在含1M NaCl的水中，用3ml 50%DMF洗脱A 488标记肽。洗脱液用真空干燥，样品悬浮在2ml氯仿中。然后用2毫升水冲洗四次，然后用液泡干燥氯仿层。

多价MC 16的制备

将野生型或突变型MC16肽(0.95 mg)与3.6mg Sunbright Pte-200 mA在3.5ml DMSO中反应5h，用Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析纯化MC 16，经冻干处理，用2 mg/ml溶于TBSCC。

荧光相关光谱(FCS)

将IF7C-A 546与Anxa 1或MC 16(50μ1)的混合物加载到96孔板的每口井中，37℃下孵育1h，在MF 20分析系统(奥林巴斯)上用543 nm He-Ne激光照明。每个样本测量5次，每次测量数据采集时间为10秒。IF7C(RR)结合被定义为相对于对照组翻译扩散时间的增加。

IF7CRR与Anxa 1或MC 16四聚体结合动力学研究

用27 MHz QCM(阿菲尼克斯QNμ，Initium Inc.)进行动力学分析.19合成肽IF7C(RR)通过马来酰亚胺-硫醇偶联固定在传感器细胞金电极上形成的自组装单层膜(SAM)上。用含1mmPEG的40%乙醇的100μl孵育sam。₆氨₂十一醇和9毫米PEG₃在室温条件下，用milliq水冲洗细胞1 h后，在细胞上加入含2mm磺胺的9 mmHEPES缓冲液(pH 7.6)100μl，将马来酰亚胺(Maleimide)基团引入sam nh。₂-大部分。细胞内加入pH7.6(50 mm，450μl)的Tris-HCl，然后注射多肽溶液将IF7C(RR)固定在SAM上。用pH7.6的50 mm Tris-HCl缓冲液封闭未反应的马来酰亚胺，加入6.5mM的2-氨基乙硫醇。传感器细胞用466μl盐缓冲液(150 mmNaCl，5mmCaCl)进行平衡。₂，0.05%CHAPS，5 mM 2-氨基乙硫醇，50 mm Tris-HCl，pH7.6)。在传感器细胞内注入不同浓度的Anxa 1或MC 16四聚体，记录到25°C时QCM信号随时间的减少。∆F计算为：∆F=B_马克斯(最后决定)/(K_d+Final conc)，其中每个(Anxa 1或MC 16四聚体)的最终浓度为NM。动力学分析由Aqua ver 2.0(Initium Inc.)进行。

重组ANXA 1的表达及纯化

利用杆状病毒昆虫细胞表达系统，表达了重组、全长ANXA 1和相应的缺失突变体(Δ4、Δ6-9、Δ12、Δ13、Δ15和Δ28)。20经过以下修改。简单地说，将BacPAK 6Δchi/cath杆状病毒dna与基于pacp(−)的杆状病毒转移载体重组成重组杆状病毒，在杆状病毒的控制下编码转基因。P6.9启动子。用N端蜜蜂素信号肽和his进行重组ANXA 1的表达。₈-标记和肠激酶识别序列DDR。用HisPur Ni-NTA树脂(Pierce)从感染后42h收获的Sf9培养上清液中分离纯化蛋白质。用His标记的肠激酶(Genscript)处理ANXA 1和缺失突变体，用镍亲和层析法分离。

脊椎动物的使用

“国家卫生研究院保护和使用实验动物指南”中的“小鼠议定书”得到了SBP、先进工业科学和技术(AIST)和京都大学机构审查委员会的批准。在一个体内生物素化实验进行了在爆炸物生物(圣地亚哥，加利福尼亚州)。

小鼠脑肿瘤模型的建立

C6-Luc细胞(5×10)4将悬浮于2μl PBS中的悬浮液注射到C57BL/6小鼠脑纹状体内，采用立体定向结构。217天后，小鼠接受了荧光素酶表达肿瘤的成像。为此，腹腔注射1 0 0μl荧光素素(30 mg/ml pBS)。然后用异氟醚气体(20 ml/min)加氧(1ml/min)麻醉小鼠，并将其置于SBP和AIST动物设施配有XenogenIVIS 200成像仪的摄像机下。光子数测量1~10秒或1 min。对于双肿瘤模型，同样将C6-Luc细胞注射到NOD-SCID小鼠的脑内.用IVIS成像仪检测脑肿瘤时，C6-Luc细胞(2×10)5将悬浮于100μl PBS中的小鼠皮下注射到同一小鼠背侧。用IVIS成像仪测量脑和皮下肿瘤中的光子数。在C57BL/6小鼠体内用B16-Luc细胞建立双瘤模型。B16-Luc细胞(5×10)4)于8~10周龄C57BL/6雌性小鼠脑内注射C6-Luc细胞。当脑瘤被发现时，B16-Luc细胞(2×10)5细胞)被皮下注射到同一只小鼠的背侧。

单克隆抗MC 16抗体

用人MC 16肽与BSA结合，在弗氏不完全佐剂中乳化，ITM有限公司(日本松本)制备抗MC16单克隆抗体(克隆31-8D，小鼠IgG2b)。取脾组织淋巴细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14细胞在含50%聚乙二醇的培养基中进行融合。用有限稀释法克隆杂交瘤细胞。用ELISA法检测培养上清液中抗MC16抗体的活性.

体内生物素化

Rajotte所描述的方法22被跟踪了。用阿维菌素麻醉C57/BL6小鼠。100μl的NHS-LC-生物素(皮尔斯，罗克福德，IL；1mg/ml)经尾静脉静脉注射.15分钟后，用15毫升PBS灌流心脏。分离脑肿瘤和代表器官，用含1%NP-40和蛋白酶抑制剂的PBS溶解后，用匀浆法制备组织裂解物(罗氏，印第安纳波利斯，IN)。用单克隆抗MC 16抗体、抗CD 34抗体(膜蛋白阳性对照)、抗α微管蛋白抗体(胞质蛋白阴性对照)和小鼠IgG2b(MC 16抗体的同型配对鼠IgG)和蛋白A结合琼脂糖进行免疫沉淀。用过氧化物酶、亲和素和过氧化物酶显色反应定量生物素化免疫共沉淀。用0.2M甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.4)从蛋白A珠中洗脱含抗MC 16抗体的生物素化免疫共沉淀，用2M Tris-HCL缓冲液(pH8.0)中和。样品经亲和素磁珠回收后，用过氧化物酶-亲和素印迹法或蛋白质组学方法进行分析。

蛋白质组学质谱

免疫沉淀后，用质量标准胰蛋白酶/Lys-C混合物(Promega，Madison，WI)直接在珠上直接消化蛋白质，然后用10 mm三(2-羧乙基)膦(TCEP)和30 mm碘乙酰胺(IAA)进行半胱氨酸还原。消化后的样品用C18TopTip(PolyLC，Columbia，MD)脱盐。利用Proxeon Easy NanoLC系统(Thermo Fisher Science)对多肽样品进行LC-MS/MS分析。用分析C分离多肽₁₈赞许PepMap柱0.075×500 mm，2μm粒子(热科学)，90 min梯度2~28%溶剂B，流速300 nL/min。质谱仪采用正相关数据采集方式.测量的ms1光谱分辨率为60,000，agc目标为1e6，质量范围为350至1400。M/z。每个占空比可触发多达10个MS2光谱，CID将其碎片化，并在AGC目标为1e4、隔离窗口为2.0的离子阱中获得。M/z正常碰撞能量为35。启用了动态排除，持续时间为30秒。

MS数据分析

所有质谱用MaxQuant软件1.5.5.1进行分析。对MS/MS光谱进行了研究。智人UniProt蛋白质序列数据库(2016年7月版)和GPM垃圾序列(常见的蛋白质污染物)。对于完成初始质量重新校准的第一次搜索和主搜索，前体质量公差分别设置为20 ppm和4.5 ppm。产物离子的质量耐受度为0.5Da。搜索所用的最大前体离子电荷态为7，以半胱氨酸的碳酰胺甲基化为固定修饰，以甲硫氨酸氧化和蛋白质N-末端乙酰化为可变修饰。酶被设定为胰蛋白酶的一种特定模式，最多两个缺失的切割被允许搜索。将基于目标假发现率(FDR)的光谱和蛋白质识别滤波器设置为1%.

荧光显微镜

小鼠脑组织静脉注射荧光Alexa 488标记的IF7肽或对照肽，冷冻切片，用抗CD 31抗体免疫染色，装于含Hoechst 33342的培养液中。组织切片在Keyence BZ-X 710显微镜下观察(日本大阪)。

组织学和免疫组织化学

应用抗-Anxa 1抗体(兔IgG)和小鼠抗MC16抗体，对人脑肿瘤患者的组织芯片(US Biomax GL806e、GL807a、PR807c、BC 000120、BC 081120c和BC041115d)进行了染色。免疫染色前，在含1mmEDTA的10 mm Tris-HCl缓冲液中微波提取抗原。以过氧化物酶结合抗兔IgG或抗小鼠IgG作为二抗.用二氨基联苯胺-H观察过氧化物酶的活性。₂O₂切片用苏木精染色。对于一种同型控制抗体，用小鼠IgG2b(日本名古屋医学和生物实验室)代替抗MC 16。

IF7C(RR)-SN38对荷瘤小鼠的治疗作用

当C6-Luc脑瘤的光子数达到5×10时，经尾静脉静脉注射IF7C(RR)-SN 38给荷瘤小鼠。4，通常发生在2周后。IF7C(RR)-SN 38(142μg或0.0567μ鼹鼠)溶于10μ1二甲基亚砜(DMSO)中，用50%Cremopore EL的100μl稀释，加90μl PBS，经尾静脉静脉注射。当小鼠平均体重为18g时，每针注射IF7C(RR)-SN38剂量为3.15μ鼹鼠/kg。对B16-Luc脑肿瘤，用CremporreEL配制的IF7C(RR)-SN38，剂量为7.0μ鼹鼠/kg。伊立替康(CPT-11)是一种水溶性的SN38前体药物，溶于PBS中，以50μ/kg的速度静脉注射到小鼠体内。在另一组实验中，用溶于10μl DMSO中的IF7C(RR)-SN38(100μg或0.0412μ鼹鼠)处理荷瘤小鼠，然后用100μl 10%Solutol HS 15在水中稀释。在这种情况下，药物剂量为2.5μ鼹鼠/公斤。相似配方C(RR)-SN 38作为对照。

统计分析

用GraphPad棱镜程序进行统计分析。使用学生的未配对数据集进行比较t-试验(二尾)。一个p≤0.0 5值有显着性意义。

Anxa 1N末端结构域在肿瘤血管表面的存在

在体外，我们发现IF7与Anxa 1的N端结构域结合。16然而，一项研究表明肿瘤血管表面的Anxa 1蛋白可能缺乏N端结构域。23因此，我们询问肿瘤血管表面是否存在N端结构域.为此，我们提出了一种小鼠单克隆抗体，该单克隆抗体针对一种命名为MC 16的线性16-聚肽，对应于人ANXA 1的N端结构域：人MC 16肽包含15个氨基酸来自Met。1敬格鲁15加上一个C终端Cys(如图所示)。1A)。抗MC16抗体与重组人ANXA 1全长蛋白结合，但不与缺乏N端9个残基的ANXA 1缺失突变体结合。1B)(附图。1)。免疫组织化学分析显示，在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌和脑癌组织中，各种临床标本的阳性信号位于肿瘤组织衬里的内皮细胞(图1)。1C、补充图。2–4)。这些观察强烈表明ANXA1N末端存在于多种恶性肿瘤的内皮细胞上，但仅免疫染色并不能显示抗原是在细胞表面还是在细胞质中。

a全长ANXA 1，N端缺失突变体Δ9和N端结构域肽MC 16的原理图.b重组人ANXA 1蛋白的westernblot分析表明，重组人ANXA 1蛋白缺乏N端9个氨基酸残基Δ9突变体(通道1和3)或全长蛋白(通道2和4)。蛋白质与兔抗人Anxa 1抗体(左板)或单克隆抗MC 16抗体(右面板)反应。c用抗MC 16抗体免疫组织化学方法检测肿瘤组织切片。肿瘤组织如所示。标尺，100μm。d抗MC抗体免疫沉淀后血管表面蛋白生物素化过程及蛋白质组学分析中生物素化肽的再捕获。e小鼠脑肿瘤模型抗MC 16抗体或同类型匹配的小鼠IgG免疫沉淀体内生物素化血管表面蛋白的水平。将大鼠C6胶质瘤细胞接种于SCID小鼠脑内。在体生物素化小鼠脑肿瘤模型，对脑肿瘤和肝组织进行免疫沉淀。生物素化免疫沉淀的水平通过过氧化物酶结合亲和素和过氧化物酶显色反应测定，如OD 450所示。f抗MC 16抗体免疫沉淀的活体生物素化蛋白胰蛋白酶片段的定量蛋白质组学研究。

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为了确定MC 16结构域是否存在于质膜的腔侧，我们在体内采用生物素化(图1)。1D)向荷瘤小鼠注射nhs-lc-生物素，如前所述。24用PBS灌流小鼠后，用抗MC 16抗体和蛋白A结合珠分离脑肿瘤和免疫沉淀的洗涤剂溶膜蛋白。沉淀平板结合试验表明，脑肿瘤裂解液中含有较高水平的生物素化物质，而用对照抗体处理的肿瘤裂解液和肝裂解液中的生物素化物质含量明显低于对照组(图1)。1E)。我们在小鼠皮下肿瘤方面取得了类似的结果(补充图)。4)。对照组，即内皮细胞表面膜蛋白CD 34和胞质α-微管蛋白，在肿瘤和正常组织中均有类似的CD 34阳性染色和阴性α-微管蛋白染色(补充图)。5)。然而，当免疫共沉淀从这些肿瘤被分析的蛋白质凝胶后，亲和素印迹，我们没有检测到生物素化的蛋白质(数据未显示)。我们推测这些生物素化的材料是短肽片段，在印迹过滤器上保留得很差。因此，我们用蛋白质组学方法分析了生物素化免疫共沉淀，然后用酸性洗脱蛋白A微球，然后在亲和素磁珠上回收它们(见图)。1D)。该分析显示，这些片段主要是Anxa 1片段。1F，补充表1)，并鉴定出30个Anxa 1衍生片段，包括全长肽(346 Aa)(表)。2)。这些结果共同表明，Anxa 1 N端结构域与Anxa 1蛋白的其余部分被切割，并显示在小鼠脑肿瘤模型的血管表面。这一结论与ANXA 1 X射线晶体学揭示的该结构域与细胞膜相互作用的模型是一致的。25

IF7肽与ANXA 1和MC 16的体外结合

接下来我们用三种方法评估IF7与重组人ANXA 1蛋白和人MC 16肽的结合。2A-C)。首先，我们在涂有单体MC 16的塑料井中加入生物素化的IF7，并通过过氧化物酶结合链霉亲和素和过氧化物酶显色反应测定IF7的结合。2A)。IF7与WT MC 16结合，但当我们使用MC16突变肽F7A、K9A和E15A时，结合活性显著降低，提示F7、K9和E15残基在IF7结合中起着重要作用。第二，我们用荧光相关光谱法(FCS)评估了IF7和MC 16在溶液中的结合情况。2B)，发现IF7与ANXA 1结合，表现出一个自由的N-末端，而不是N-末端标记的ANXA 1。最后的结果与我们先前报道的板结合分析一致，表明IF7结合ANXA 1与一个自由的N端，而不是N-末端，他标记的ANXA 1。16FCS分析还表明，IF7与四聚体而不是单体MC 16结合，表明MC 16聚合是有效结合在溶液中的必要条件。最后，用石英晶体微天平(QCM)测定了ANXA 1与四聚体MC 16的结合动力学，发现ANXA 1的Kd为6.01×10。–8M，为2.47×10。–7M为四聚体MC 16(图1)。2C)。基于这些结果，加上我们先前发现IF7与ANXA 1二聚体(10)结合，我们假设ANXA1N末端二聚体通过IF7结合。因此，我们建立了ANXA 1二聚体的模型，使用Z多克模块进行蛋白质对接。26IF7对接位姿计算为−3.7kcal/mol(图1)。二维空间).

aN端生物素化IF7C(RR)与人MC 16肽及其突变体的平板结合试验。每个合成的MC 16及其突变肽(10 Nmoles)都通过其C端半胱氨酸残基与马来酰亚胺激活的塑料很好地结合在一起。每孔加入1μg/mL的生物素化IF7C(RR)肽，用过氧化物酶结合链霉亲和素和过氧化物酶显色反应检测生物素化肽的结合。bIF7与ANXA 1(左)和MC 16肽(右)在溶液中的FCS分析。提示IFN 7C(RR)与N-末端His标记ANXA 1的扩散时间无显着性差异，而无标记ANXA 1的扩散时间较对照组显著增加，提示IF7与未标记ANXA 1蛋白在溶液中结合。结果表明，与对照组相比，MC 16单体对IF7的扩散时间无明显增加，而四聚体MC 16的扩散时间明显延长，说明IF7与MC16在溶液中结合。c通过QCM与Anxa 1或MC 16结合的IF7动力学，它通过测量IF7涂层传感器的频率变化来确定单位面积的质量。dIF7与ANXA 1 N端结构域结合的计算机模拟结构模型。根据我们先前的研究推断，IF7与anxa 1二聚体结合。16结果表明，IF 7的结合需要MC 16聚合。ANXA 1二聚体结构是由蛋白质与蛋白质对接的z多克模块构建而成的。26而全长ANXA 1的1HM6 X射线结构在残馀40处加入到1MCX核心结构域。25, 57然后在MOE中使用质子化物三维模块对模型结构进行氢化。在使用AMBER 99力场分配了部分电荷之后，58氢原子被最小化了。本文提出的二聚体结构在2000强结构中排名第37位。为了在二聚体中确定一个潜在的IF7绑定口袋，使用了MOE中的Alpha Site Finder模块。利用MOE软件和GBVI/WSA软件对该模型进行了DG评分的进一步验证，并给出了计算和观测能量学比较的程序。59IF7对接位姿计算为−3.7kcal/mol。

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IF7肽在小鼠体内靶向性及对脑肿瘤的穿透作用

在评估IF7在小鼠体内靶向脑肿瘤的能力之前，证实了IF7与小鼠MC 16 N端结构域的结合(图1)。3A)。我们用IF7C(RR)-A 488结构，通过尾静脉静脉注射荷瘤小鼠。静脉注射20 min后，分离肿瘤及周围正常脑组织。洗涤剂溶解组织的荧光在肿瘤中的价值高于正常组织(图1)。3B)。20 min后制备的小鼠脑组织切片荧光显微镜显示肿瘤内有明亮的荧光。3C、上面板)。注射对照C(RR)-A 488结构的小鼠脑瘤组织切片显示脑瘤中没有荧光信号(图1)。3C，下面板)。荧光定量分析在IF7C(RR)-A 488注射脑肿瘤中显示的信号明显大于正常脑组织中的信号，当我们评估对照C(RR)-A 488-注射肿瘤时没有发现差异(图一)。三维空间)。高放大率下的脑肿瘤组织分析显示，IF7C(RR)-A 488荧光信号在癌细胞胞浆和/或细胞核内，而对照C(RR)-A 488(图1)未见脑基质中的绿色荧光。3E)。同一只小鼠代表器官的显微照片显示没有明显的荧光信号。3F，左)。注射C(RR)-A 488的动物的脑肿瘤和代表器官显示了背景荧光(如图所示)。3F，右)。这些结果强烈提示，静脉注射IFN 7的目的是脑肿瘤血管，并穿透肿瘤血管，从而克服血脑屏障，到达癌细胞。

a平板法检测IF7和对照肽与小鼠和人MC 16肽的结合。评估生物素化IF7C(RR)和对照C(RR)与MC16的结合方式，与图1相似。2A. b荧光标记IF7肽对小鼠脑肿瘤血管的靶向作用。对荷瘤小鼠静脉注射Alexa 488标记的IF7C(RR)。30分钟后，对同一小鼠的脑肿瘤组织和正常组织进行增溶处理，并测定洗涤剂溶解组织的荧光信号。c将Alexa 488标记的IF7C(RR)或对照C(RR)肽经荷瘤小鼠尾静脉注入C6-Luc胶质瘤瘤模型。蓝色荧光(左面板)代表核Hoechst 33342，绿色荧光(右)代表Alexa 488。标尺：5μm。d绿色荧光在(肿瘤)和外(正常)脑肿瘤中的定量图像分析。误差条表示均值±扫描电镜。学生的统计分析t-测试。e肿瘤组织切片的高倍率图像来自IF7C(RR)-A 488-或C(RR)-A 488-注射小鼠。用Alexa 594(红色)结合抗大鼠IgG抗体对内皮细胞表面标记CD 31进行免疫染色。标尺：40μm。f荷瘤小鼠代表器官注射IF7C(RR)-A 488(左)和C(RR)-A 488(右)的荧光显微照片。

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IFN_7C(RR)-SN_(38)对小鼠脑肿瘤的治疗作用

为了评价IF7结合药物治疗脑肿瘤的潜在疗效，我们选择了临床上用于治疗脑癌的伊立替康(CPT-11)的活性成分SN 38。27,28,29IF7C(RR)-SN38或对照C(RR)-SN38对C6细胞和小鼠黑色素瘤B16细胞的体外杀伤作用表明，IF7C(RR)-SN38的细胞毒活性与游离SN38相当。5).

接下来，为了比较体内抑制脑和皮下肿瘤生长所需的药物剂量，我们进行了双肿瘤模型的实验，其中一只SCID小鼠在大脑和皮肤下接受C6-Luc细胞(见图)。4A，补充图。8A)。然后静脉注射IF7C(RR)-SN38，用光子数评估肿瘤在体内的生长情况。用IF7C(RR)-SN 38治疗对脑和皮肤下的肿瘤生长有明显的抑制作用，剂量为3.15μ鼹鼠/kg。

a用Nod-SCID小鼠C6-Luc细胞建立双瘤模型。C6-Luc细胞在小鼠大脑和皮肤下生长。脑及皮下肿瘤在光子数大于2×10^4的情况下，每日经尾静脉静脉注射IF7C(RR)-SN38(3.15μ鼹鼠/kg)，连续9d。bIF7C(RR)-SN38对C57BL/6小鼠B16-Luc黑色素瘤双瘤模型的影响。对b16-luc细胞的生长进行了监测，其方式类似于a静脉滴注IF7C(RR)-SN38(7.0μ鼹鼠/kg)、伊立替康(CPT-11)(50μ鼹鼠/kg)或缓冲液对照6天。这种药用火烈鸟稀释。在每一个a和b，误差条表示均值±SEM。学生的统计分析t-测试。请注意，IF7C(RR)-SN38对脑肿瘤的影响与皮下肿瘤的作用相当，而不管肿瘤细胞株和小鼠株如何。

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为了证实这些观察，我们采用了一种类似的双肿瘤模型，将黑色素瘤B16-Luc细胞植入C57BL/6小鼠体内。4B，补充图。8B)。静脉注射IF7C(RR)-SN 38与缓冲液对照组相比，明显拮抗脑肿瘤和皮下肿瘤的生长，剂量为7.0μ鼹鼠/kg。当我们使用SN 38前药物伊立替康时，在没有肿瘤血管靶向肽的情况下，剂量高达50μ摩尔/kg时，伊立替康抑制皮下肿瘤的生长，但对脑肿瘤的生长有极小的抑制作用。总之，这些结果表明，至少在这些小鼠的双肿瘤模型中，IF7C(RR)-SN38抑制脑肿瘤的生长和皮下肿瘤的生长一样有效。

在图中所示的实验中。4在注射前，我们将IF7C(RR)-SN38溶解在Cremopore EL中。这种非离子洗涤剂被用于临床使用紫杉醇，尽管一些人已经表达了对潜在的炎症效应的关注。30,31因此，我们用低毒性的非离子表面活性剂Solutol HS 15溶解了IF7C(RR)-SN38。10%Solutol HS 15对等基因C57BL/6小鼠B16-Luc脑瘤的治疗作用明显改善(图二)。5A，补充图。9A)相对于Cremopore El的管理而言(见图。4B)：肿瘤在每日注射的第一周开始缩小，剂量低至2.5μ鼹鼠/kg，第二周持续缩小而不注射药物，然后完全消失。在停止药物治疗后，小鼠存活了3个月，没有出现脑或身体其他部位B16-Luc细胞生长的迹象，表明完全缓解(图一)。5A，右)。类似的治疗裸鼠携带C6-Luc肿瘤抑制肿瘤的生长，但是，没有促进脑瘤的完全消失(图一)。5B，补充图。9B)。这些结果提示在C57BL/6小鼠脑肿瘤完全消失时存在免疫反应。

aIF7C(RR)-SN38对C57BL/6小鼠B16-Luc脑肿瘤的影响。bIF7C(RR)-SN38对裸鼠C6-Luc脑肿瘤的影响。在本实验中，IF7C(RR)-SN38或C(RR)-SN 38(对照组)的药物剂量分别为2.5μ/kg，用10%Solutol HS 15稀释，每日给药7天。注意，在C57BL/6小鼠停止使用IF7C(RR)-SN38后，B16脑肿瘤继续缩小。在每一个a和b，误差条表示均值±SEM。学生的统计分析t-测试。

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IFN_7C(RR)-SN 38小鼠对脑肿瘤的免疫应答

肿瘤浸润淋巴细胞，尤指CD8+细胞毒性T细胞与各种癌症的预后密切相关。32,33为探讨细胞毒性T细胞在宿主小鼠抗肿瘤反应中的可能作用，我们将B16-Luc和LL/2-Luc两种等基因细胞系分别注射到单纯的C57BL/6小鼠和经IF7C(RR)-SN38治疗后从脑B16-Luc瘤中恢复的C57BL/6小鼠体内。当这些细胞被皮下注射到一只天真的老鼠体内时，这两种细胞都会形成肿瘤(图一)。6A，左)。相反，当从脑B16-Luc肿瘤中恢复的小鼠体内注射细胞时，LL/2-Luc肿瘤生长，而B16-Luc肿瘤则未出现。6A，右)。

a皮下注射LL/2-Luc或B16-Luc细胞4天后，两株同基因癌细胞系在天真和脑肿瘤恢复小鼠体内生长。b免疫组织化学检测B16-Luc细胞注射后20h，B16-Luc细胞的抗CD8抗体。标尺：100μm。cCD8定量分析+皮下注射部位的细胞。

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用抗CD8抗体免疫组织化学方法检测B16-Luc细胞注射Neive C57BL/6小鼠20 h后，发现CD8最低。+T细胞在刺激位点(0.2细胞/高功率场(HPF))(如图所示)。6B、左和图。6C)。相比之下，显著的CD8+经IF7C(RR)-SN38治疗后，C57BL/6小鼠B16-Luc细胞注射部位出现细胞浸润(92.2个/HPF)。6B对，如图所示。6C)。这些结果强烈提示IF7C(RR)-SN 38治疗不仅能使脑肿瘤完全缓解，而且还能促进宿主对肿瘤细胞的免疫排斥反应，防止肿瘤在体内其他部位复发。

在这里，我们证明高效的肿瘤血管-靶向化疗药物IF7C(RR)-SN 38可能促进免疫反应，导致细胞毒性T细胞对脑肿瘤的激活。我们认为我们的研究加强了IF7C(RR)-SN38作为脑恶性肿瘤临床试验的候选病例。

我们确认了之前报道的结果，16,17小鼠肿瘤血管表面Anxa 1N末端结构域的存在。然而，正如其他人所报告的，23该结构域不是以全长Anxa 1的形式表达，而是以肽片段的形式存在(如图所示)。1A，补充表1和表2)。我们还发现，该蛋白的前15个氨基酸残基足以与IF7结合。2)。IF7同时结合人和小鼠MC 16肽(图7)。3A)，表明IF7在小鼠肿瘤模型中获得的结果与人类相关。基于这些发现，我们建议将一种静脉注射的IF7结合物输送到肿瘤血管，并浓缩在肿瘤中。在此报告的数据(图1)。3)和以前16,17研究表明，IF7和IF7结合物通过从腔面到基底间质的胞吞作用穿过内皮细胞。吴等人也报道了Anxa 1介导的内吞/胞吞。在肺癌模型中。23他们报告说，当Anxa 1在内皮细胞的腔静脉上表达时，被抗Anxa 1抗体结合，就会内化并被运输到基底表面。我们的结论是，IF7与某些(如果不是全部)含有MC 16结构域的Anxa 1片段结合，以类似于Anxa 1与抗Anxa 1抗体结合的方式介导转运。我们推测IF7的转运可能使静脉注射IF7结合化疗克服BBB并到达脑肿瘤。当我们开发IF7时，我们在C末端加入半胱氨酸进行药物结合，我们用两种精氨酸来增加亲水性(IF7C(RR))。结果IFLLWQRCRR序列类似于R/KXXR/K，这是C端规则(Cendr)通过中性粒细胞因子-1进行内化和组织渗透的共识。34,35然而，我们结合IF7C(RR)与A 488或SN 38通过C在该基元内，这很可能使该活性失活。相反，我们假设IF7-结构的转运发生在内皮细胞表面的腔静脉，如抗ANXA 1抗体的转运所示。23,36由于已知有多种BBB转运途径，37,38IF7/ANXA 1可能通过多种策略克服BBB。

我们以前报道过，在皮下结肠肿瘤模型小鼠静脉注射荧光标记的IF7 15 min后，荧光信号主要出现在血管基底侧的小泡中，40 min后在间质和肿瘤细胞中可见荧光信号。16在我们的脑肿瘤模型小鼠中，荧光标记的IF7静脉注射会集中在肿瘤中，浓度是周围正常脑组织的900倍(图1)。3C，d)。IF7荧光在脑肿瘤间质中的出现是IF7跨越血脑屏障的证据(图1)。3E)。肿瘤细胞中荧光信号的存在也提示肿瘤细胞积极接受IF7，进一步提示IFN 7受体在脑肿瘤细胞表面表达。我们尚未发表的数据表明，MC 16结构域不仅在肿瘤血管表面表达，而且也在肿瘤细胞表面表达。我们推测肿瘤基质中的IF7主要针对肿瘤细胞表面的Anxa 1肽，表现为MC 16结构域。然而，我们的LC-MS/MS分析没有检测到静脉注射IF7C(RR)-SN38的小鼠脑肿瘤中的SN38，这可能是因为我们注射了低水平的IF7-SN38。尽管如此，我们得出结论，到达肿瘤细胞的SN 38水平很高，足以产生细胞毒性。基因表达数据表明ANXA 1脑恶性肿瘤中的过度表达39,40我们对Anxa 1N末端结构域的免疫组织化学显示脑肿瘤中有强烈的信号(如图所示)。1C，补充图。3)，IF7C(RR)-SN38结合物可能与人类脑肿瘤的治疗有关。

我们在这项研究中发现，IF7C(RR)-SN38不仅抑制肿瘤生长，而且还能触发宿主免疫系统对肿瘤的识别(图一)。5还有无花果。6)。我们推测IF7C(RR)-SN38对脑肿瘤的高效率可以使未受损的宿主免疫细胞浸润肿瘤，识别部分受损的癌细胞所显示的抗原。体内抗肿瘤细胞毒性CD8+T细胞的出现可导致肿瘤的根除，本文报道的结果提示IF7C(RR)-SN 38可能引起宿主的免疫治疗反应。在PD-1/PD-L1阻断治疗中，细胞毒性T细胞浸润肿瘤是临床成功的关键。41在抗Pd-1抗体治疗黑色素瘤患者中，CD8+T细胞浸润黑色素瘤肿瘤.42在小鼠卵巢肿瘤模型中，PD-L1阻断治疗可诱导肿瘤T细胞浸润。43高选择性细胞毒性IF7C(RR)-SN 38对癌细胞可能允许完整的炎症T细胞对脑肿瘤的反应。虽然脑组织被认为是免疫特权，但最近的研究表明，脑中的抗原会引起免疫反应。44因此，IF7C(RR)-SN 38的发展可以扩大检查点免疫治疗在脑恶性肿瘤患者中的应用。

本研究通过以下原因提示IF7C(RR)-SN38的临床相关性。首先，IF7与人和小鼠MC 16结合。3A)，表明在小鼠脑瘤模型中获得的结果将适用于人脑肿瘤。第二，我们的单克隆抗MC 16抗体与包括脑肿瘤在内的人肿瘤血管反应呈阳性反应。1C和补充的无花果。2, 3)。最后，对人类肿瘤标本中基因表达的分析表明，ANXA 1在中枢神经系统肿瘤中过度表达，尤其是在胶质母细胞瘤中。39,40,45

当Anxa 1N末端发挥各种抗炎作用时，46,47,48我们假设IF7(RR)-SN38对抗这些效应，从而增加炎症，如图所述。6。然而，我们对注射IF7的小鼠肿瘤的组织学分析并没有显示炎症的迹象(数据未显示)。由于Anxa 1在巨噬细胞活化后在细胞表面表达。49或者在许多细胞凋亡之后，50,51IF7-SN38治疗可能通过靶向活化的巨噬细胞或凋亡细胞来促进未知的作用。需要进一步研究IF7C(RR)-结合药物来评估这些可能性。此外，尽管我们认识到分析许多这些表型是非常理想的Anxa 1缺乏突变的小鼠，我们无法追求这一策略，因为肿瘤在这些小鼠中不能很好地生长，这是由于肿瘤血管生成受损，正如我们以前报道的那样。17

目前的研究显示，每天在2.5μ鼹鼠(5.35mg)/kg下注射IF7C(RR)-SN38可导致脑肿瘤完全消失(如图所示)。5A)。这一剂量在小鼠中转化为人体等效剂量(Hed)为0.43mg/kg。52因此，当剂量上升到0.43mg/kg时，我们可能会看到治疗效果的迹象。推荐给人类癌症患者的cpt-11剂量为120-200 mg/m。2.53,54假设正常成年人的体表面积为1.7米2体重70 kg，计算值为2.91-4.85mg/kg。在CPT-11分子量为586 Da，SN 38分子量为392 Da的情况下，在SN381.95~3.24mg/kg范围内，CPT-11的推荐剂量是等效的。IF7C(RR)-SN 38(2141Da)0.43mg含有0.079 mg SN 38。IF7C(RR)-SN38的这些值预测，在药物活性剂量下，SN38对人体的毒性很小。

由于越来越复杂的诊断和治疗方法的发展，癌症治疗变得越来越昂贵。我们的药物由一种短肽和一种抗癌试剂组成，可以有效地进行化学合成。鉴于预测的极其有效的肿瘤靶向活性，IF7C(RR)-SN38在低剂量下应该是有效的，最大限度地减少副作用和进一步降低成本。随着肿瘤血管归巢肽的临床试验开始，55,56我们很快就能评估这些策略对癌症患者，包括脑恶性肿瘤的疗效。