业已显示，来自结核分枝杆菌（M.tb）的抗原可在体外刺激人B细胞对无关的召回抗原的反应。然而，不知道是否天然结核分枝杆菌感染或是否与疫苗接种牛分枝杆菌 BCG，也有类似的效果。这项研究调查了M.tb的影响感染和BCG疫苗接种对B细胞对异源病原体召回抗原的反应。通过ELISA定量了68种未感染对照，62例潜伏性结核感染（LTBI）和107例活动性肺结核（APTB）病例以及24例最近接种过BCG疫苗的青少年和幼稚对照的针对几种细菌和病毒病原体的抗体。使用表面等离振子共振研究了抗体的亲和力，并使用B细胞ELISPOTs测量了APTB病例和健康供体对照中的浆母细胞和记忆B细胞反应（MBC）。与未感染的对照相比，APTB与呼吸道合胞病毒和麻疹病毒抗体水平更高有关。BCG疫苗接种不会改变针对异源病原体的抗体水平。结核分枝杆菌感染与人类受试者对异源病原体的抗体应答增加有关。
在结核分枝杆菌复合体（MTBC）是由几个分支杆菌菌种高达导致结核病（TB），影响全世界数百万人的疾病。2018年有1千万例结核病病例，145万人死亡，估计全球四分之一的人口被感染1。尽管由MTBC引起的疾病很严重，但其中一些病原体由于其强大的免疫刺激特性而被用作免疫疗法。MTBC最重要的成员，结核分枝杆菌（M.tb），以其佐剂特性而闻名。它是弗氏完全佐剂的组成部分，据认为可通过其对抗原呈递细胞（如树突状细胞和巨噬细胞2）的刺激作用来改善疫苗反应。牛分枝杆菌 Bacille Calmette Guerin（BCG）已用于治疗膀胱癌30多年3。确切的作用机理尚未完全阐明，但普遍的假设是BCG将先天免疫细胞吸引到膀胱中并引发它们攻击癌细胞4。
已经提出了越来越多的证据支持卡介苗在保护婴儿免受异源病原体引起的疾病的潜在作用。几内亚比绍的早期研究表明，从谁一出生就被赋予卡介苗低出生体重儿的传染病死亡人数减少5，6。这些作用被认为是由BCG 7诱导的细胞表观遗传修饰带来的先天免疫细胞功能改善的结果。对适应性免疫系统也可能有非特异性作用。Ota等。8Ritz等人的最新研究表明，与仅接种乙肝疫苗的婴儿相比，出生时接受过卡介苗除接种乙肝疫苗的婴儿的乙肝病毒特异性抗体应答更高。9报告指出，在出生时接受卡介苗的婴儿与未接受卡介苗的婴儿相比，由肺炎球菌疫苗接种在2、4和6个月大时产生的抗体水平更高。因此，卡介苗可以非特异性方式改善对与卡介苗同时接种或在卡介苗接种后接种的疫苗的免疫反应。
上面强调的研究描述了分枝杆菌对同时给予的疫苗抗原或接种分枝杆菌制剂疫苗后给予的抗原的反应的影响。然而，在过去的研究表明，从纯化的蛋白衍生物（PPD）结核分枝杆菌可以在体外刺激针对麻疹，风疹和从人外周血单核细胞的单纯疱疹病毒（PBMCs）中的抗体的分泌10。这一发现表明，M.tb可能能够增强从先前接触无关病原体衍生抗原而产生的抗体/ B细胞记忆反应。目前尚不清楚该观察结果的确切免疫机制。但是，分枝杆菌可能抗原可以非特异性激活病原体特异性记忆B细胞（MBC），从而导致抗体分泌细胞的扩增和随后抗体水平的升高。人类MBCs容易被多克隆刺激激活；Bernasconi等人的研究。11已表明，细菌CpG（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤）DNA或T细胞细胞因子对这些细胞的刺激可导致它们增殖并扩展为分泌抗体的细胞。然而，关于结核分枝杆菌暴露的这一假设尚未得到研究。此外，尚不知道自然的M.tb感染对从异源病原体召回抗原的抗体反应具有相同的非特异性刺激作用。我们还不知道最近用相关物种，牛分枝杆菌 BCG 接种疫苗对不相关抗原的血清学回忆反应是否具有类似作用。
这项研究的特点是在乌干达的未感染对照，参与结核病家庭接触研究的潜伏性结核感染（LTBI）或活动性肺结核病例（APTB）病例以及对BCG的青少年接受者中，对异源病原体召回抗原的抗体反应疫苗及其年龄相匹配的原始对照（来自英国（UK））。此外，通过研究破伤风类毒素（TT）特异性浆母细胞和MBTB在APTB病例和健康供体中的发生频率，探讨了MBC的多克隆激活是一种可能的机制。
乌干达TB家庭接触研究参与者的特征先前已有报道12，并在下表1中显示。总之，APTB病例和患有LTBI的个体比未感染的个体年龄大，与其他两组相比，APTB组的男性比例更大。在APTB组中，艾滋病毒呈阳性的人更多，社会经济地位低下的人也更多。
在英国研究的青少年年龄均在12到13岁之间，以前没有BCG疤痕，结核菌素皮肤试验阴性13。
在未感染个体，来自乌干达的LTBI和APTB病例个体之间比较了抗体应答，以确定M.tb感染状态对异源病原体抗体应答的影响。由于我们对召回反应感兴趣，因此我们研究了针对儿童疫苗（例如TT，白喉类毒素（DT）和麻疹病毒（MV））中所含抗原的抗体。我们还测量了针对这种感染的特异性抗体，在这种情况下，我们的参与者在童年时期很可能会遇到这种感染。这些包括呼吸道合胞病毒（RSV）14，腺病毒15，卡波济肉瘤疱疹病毒（KSHV）16，巨细胞病毒（CMV）17和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）18。Mtb PPD被包括作为指示分枝杆菌暴露的阳性对照。最初的粗略分析显示，各组之间对PPD，DT，RSV，MV，KSHV ORF73，KSHV 8.1和CMV抗原具有特异性的抗体水平存在差异（图 1）。总IgG抗体浓度也存在差异（补充图S1）。没有证据表明各组之间的EBV和腺病毒特异性抗体存在差异（补充图S1）。
跨M.tb感染状态的针对异源病原体的抗体反应的变化。所显示的水平条是每组中的中值IgG抗体光密度。比较未感染对照（n = 68），LTBI患者（n = 62）和APTB病例（n = 107）的抗体反应。所示的p值对应于Kruskal–Wallis检验的结果（* p <0.05； ** p <0.01）。PPD纯化蛋白衍生物，TT破伤风类毒素，DT白喉类毒素，RSV呼吸道合胞病毒，MV麻疹病毒，KSHV卡波西氏肉瘤疱疹病毒，CMV 巨细胞病毒。
在最终分析中，通过线性回归分析，使用未感染对照作为基线比较组，同时调整年龄，性别，HIV感染状况和社会经济状况的影响，确定了M.tb感染状况与抗体反应之间的关联。与未感染的个体相比，APTB与更高水平的抗PPD，抗RSV和抗MV抗体相关（表2）。我们观察到针对TT，DT和KSHV K8.1抗原（表2）和APTB中总IgG水平（补充表S1）的抗体增加的证据，但是在校正多次测试后，这在统计学上并不显着。M.tb之间没有关联感染状况和抗EBV或抗腺病毒抗体，与粗略分析的结果一致（补充表S1）。我们还观察到LTBI与抗DT，抗TT和抗PPD抗体之间存在正相关，但这些均未达到统计学意义的阈值。
接下来，我们确定最近对相关物种牛分枝杆菌 BCG的疫苗接种是否也与针对无关召回病原体抗原的抗体应答升高有关。在英国青少年队列中评估了抗体应答，该试验组包括一个接受BCG治疗的12人个体测试组和13个年龄相匹配的BCG初次对照者，并在疫苗接种之前和之后3周的两个时间点比较了两者。此队列使我们能够比较卡介苗接种个人卡介苗幼稚组，这是因为BCG是经常给婴儿的乌干达国家扩大免疫规划的一部分，我们不能在乌干达参加者19。
我们观察到在抗体应答的任何抗原，包括PPD没有差异，之间在3周的时间点（图的BCG接种的个体和天然对照 2 B）。这些结果反映之前接种卡介苗（图两组之间观察到非显著差异 2一个）。还比较了接种了卡介苗的个体和未接种过的对照组在三周时间内抗体的倍数变化，未观察到统计学上的显着差异（补充图S2）。这些发现表明，BCG疫苗接种可能无法增强针对异源病原体的抗体反应，或者至少在三周的时间内没有。
接种BCG疫苗的个体及其年龄相匹配的BCG幼稚对照对异源病原体的抗体反应。（a）卡介苗接种前的抗体反应。（b）BCG疫苗接种后3周的抗体反应。所示的水平条是每组中的中值IgG抗体光密度。显示的p值对应于Wilcoxon秩和检验（* p <0.05; ** p <0.01）的结果，该结果是比较接种过BCG（n = 12）和未接种过BCG的对照（n = 13）中的抗体反应。PPD纯化蛋白衍生物，TT破伤风类毒素，DT白喉类毒素，RSV呼吸道合胞病毒，MV麻疹病毒，CMV巨细胞病毒，EBV爱泼斯坦-巴尔病毒。
我们确定观察到的感染M.tb的个体对无关的召回抗原的抗体反应的增加是否伴随着其亲和力或整体结合强度的变化。亲和力的增加可能表明MBC是异源病原体抗原特异性抗体的来源，因为这些细胞已经进行了亲和力成熟。为此，使用表面等离子体共振（SPR）研究了抗TT和麻疹病毒血凝素（MVHA）抗原的抗体的亲和力。由于样本量的限制，在237个KTB研究参与者的样本中，仅88个样本进行了测试。
最初的粗略比较显示了三组中TT特异性抗体的解离速率（亲和力度量）差异的边际证据（补充图S3）。对于最终分析，使用线性回归来评估未感染对照作为基线比较组的M.tb感染状态与抗体亲和力之间的关联，同时调整年龄，性别，HIV感染状况和社会经济状况的影响（表3））。APTB与解离速率较慢的TT特异性抗体的存在有关，这是亲和力较高的标志。与LTBI观察到相似的正相关，但是在校正多次测试后，这在统计上并不显着。我们还观察到类似的较弱证据，表明APTB与解离速率较慢的MVHA特异性抗体相关（表3）。这些结果证实了以下假说，即在M.tb感染中观察到的针对异源病原体召回抗原的抗体反应增加是由抗原特异性MBC引起的。
为了探讨在我们的研究参与者中M.tb感染是否可能将不相关的召回抗原特异的MBC分化为成浆细胞，我们研究了48例APTB病例和115位健康供体使用B的TT特异MBC和成浆细胞的频率细胞ELISPOT分析。
我们从APTB病例获得的PBMC数量有限，因此在18例APTB病例中确定了MBC频率，而在其余病例中评估了浆母细胞频率（n = 30）。在APTB病例中，TT特异性浆母细胞与MBC的中位频率之比为7：1（8.75：1.25；图 3）。在APTB病例中，TT特异性浆母细胞相对于MBC的丰度高，提供了APTB中抗原特异性MBC的多克隆激活的证据。这个过程可能促使它们分化为成浆细胞，并可以解释在活动性结核病中观察到的针对异源病原体召回抗原的抗体水平的提高。
TT特异性浆母细胞高于APTB中TT特异性MBC。在18例APTB病例中评估了MBC反应，而在30例APTB病例中评估了PB反应。该p值来自秩秩和检验。MBC记忆B细胞，PB成浆细胞，TT破伤风类毒素。
无法确定健康供体中TT特异性浆母细胞与MBC的比例以进行比较，因为在初步分析中不容易检测到TT特异性浆母细胞。但是，在这些个体中检测到的TT特异的MBC的频率高于在APTB病例中观察到的水平（图 4）。尽管已显示TT特异的MBC在接种疫苗后可保留在循环中数年，但TT特异的浆母细胞寿命短，在抗原暴露后2周内消失20。这可能解释了健康供体中缺乏可检测的TT特异性浆母细胞。
与健康的供体对照相比，APTB病例的TT特异性MBC频率更低。在115位健康捐献者和18位APTB病例中评估了MBC反应。该p值来自秩秩和检验。MBC记忆B细胞，TT破伤风类毒素。
这项研究首次强调了天然M.tb感染在增强针对个人以前通过感染或免疫可能已接触过的异源病原体的抗体免疫中的可能作用，并显示了用相关细菌牛分枝杆菌进行的疫苗接种卡介苗没有类似的作用。这些抗体在感染M.tb的个体中的水平和亲和力的提高可能意味着MBC是其可能的来源。此外，在活动性结核病中，TT特异性浆母细胞相对于TT特异性MBC的丰富性提供了证据支持M.tb感染会驱动针对无关召回抗原产生的MBC的多克隆激活。如果可以利用这种特性，那么它可能会导致产生免疫疗法，而不是被用来增强针对多种感染的血清学记忆，特别是在免疫力下降的人（例如老年人）中。
在APTB疾病中对异源病原体的抗体应答增加最明显的事实可能意味着这种非特异性作用在活跃复制结核杆菌的环境中最为明显。事实上，以往的研究表明，活动性肺结核病与CMV特异性抗体增加有关21，22，然而，这些研究归因兴起于抗体并发感染巨细胞病毒，而不是作为血清学记忆的标志。de Paus等人的研究。23 在结核病患者中观察到较高水平的流感特异性抗体，并认识到除了并发感染外，还有可能是由于分枝杆菌驱动的抗体非特异性增加而引起的。
BCG疫苗接种没有类似效果的观察结果可能意味着M.tb独特的蛋白质可能介导了对APTB中观察到的对这些异源病原体的抗体反应的增加。或者，这可能指向接种部位的BCG分枝杆菌载量的影响，这可能低于在活动性TB疾病期间在肺中观察到的M.tb细菌载量。在接种了BCG的卡介苗中，缺乏明显的抗分枝杆菌抗体刺激作用，而在APTB病例中，抗结核分枝杆菌抗体却上升了三倍以上（表1）。）支持这种推理。缺乏抗体应答也可能仅是由于疫苗接种后的时间造成的。稍后的某个时间点可能会产生BCG特异性抗体；我们无法在我们的研究中对此进行评估。
M.tb感染的水平和亲和力都增加了对异源病原体召回抗原的抗体反应。这进一步提供了这些抗体的来源是MBC的证据，因为这些细胞已经进行了亲和力成熟，结果产生了高亲和力的抗体。Zimmerman等人的研究。24认为，结核病中抗分枝杆菌抗体的主要来源是MBC，这是在这种疾病状态下分离出的抗体分泌细胞中高水平的体细胞超突变所证明的。结核杆菌可驱动多种病原体抗原特有的MBC活化，包括M.tb特异的那些。对于其他感染，例如疟疾25，丙型肝炎26和汉坦病毒肺部疾病27，也证明了类似的现象。Bernasconi等。（2006年）以前表明MBCs容易被多克隆刺激激活，例如接种疫苗后产生的细菌DNA和T细胞细胞因子。此外，先天性免疫细胞因子如IFN-α和IL-6促进B细胞的活化，分化为成浆细胞和分泌抗体29。它是，因此，可能的是，分枝杆菌的产品和本发明的人在细胞因子环境结核分枝杆菌感染可能会激活MBC，导致它们分化为分泌抗体的细胞。我们的B细胞ELISPOT数据说明，相对于APTB中的TT特异性MBC，大量的TT特异性浆母细胞。与健康供体相比，APTB病例中TT特异性MBC的频率较低，而后者不易检测到TT特异性浆母细胞。这些观察结果进一步支持了M.tb驱动MBC多克隆激活的假说。在未来的研究中，评估APTB病例中抗分枝杆菌药物治疗对异源病原体抗体反应的影响可能很重要。治疗后抗体应答的减少可能进一步支持我们的假设。尚不清楚M.tb可能会受益于召回抗体对其他病原体的应答增加。但是，我们推测该过程可能会通过限制因无关病原体感染而导致的宿主死亡来帮助M.tb在宿主体内存活。
尚不清楚为什么APTB仅与对某些病原体召回抗原而不对其他病原体的抗体反应显着相关。随着时间的流逝，这可能与暴露于不同感染的比率不同有关。最近对某些病原体的多次暴露可能会产生新的抗体反应，这可能掩盖了从分枝杆菌驱动的MBC激活中收集到的任何“好处”。某些病原体（如EBV）已显示在MBC中建立潜伏期30。该病毒还显示可增加B细胞的增殖和活化，并增加已知的TLR激动剂（如CpG 31）的作用。这将支持在M.tb感染的个体中增加EBV抗体反应的想法，但是，在我们的研究中并未观察到。
这项研究有一些局限性。我们假设在研究参与者中针对选定的异源病原体抗原检测到的抗体反应是由于过去通过感染或疫苗接种引起的。然而，尽管不太可能，最近或目前可能接触这些多种病原体。研究中包括的个体具有不同的年龄，性别，社会经济状况和艾滋病毒感染状况，反映了乌干达人口的共同人口特征。已知HIV感染会显着改变免疫反应，并与M.tb感染状况密切相关（表1）。我们能够针对HIV的影响以及回归分析中其他测得的潜在混杂因素进行调整，以减少它们对协会的影响。仅在HIV阴性个体中进行的进一步分析显示出与总研究人群中观察到的相似的关联（补充表S2和S3）。我们的发现主要基于我们研究人群中的IgG响应，但是，将来查看其他相关抗体同种型（例如IgM）可能很重要。尽管暴露于结核病但仍能够抵抗M.tb感染的个体已显示除IgG抗分枝杆菌抗体外还具有IgM 32。血清中IgM抗体的存在还与M.tb 33对上皮感染的抑制作用增强有关。
总体而言，这些数据表明迄今为止，M.tb在维持针对过去感染和疫苗的血清学记忆中所起的未知作用。假设在以后的生活中暴露于感染可以在缺乏特异性抗原的情况下帮助维持对多种病原体的抗体反应。这个过程被提出是由于抗原的MBC的多克隆刺激11，28和数据呈现在这里支持此。但是，需要进行进一步的实验以确认所涉及的机制并确定特定的M.tb介导此过程的抗原。这可能涉及使用各种分枝杆菌刺激剂和B细胞ELISPOTs进行体外细胞培养测定，以测量抗体分泌细胞。这项研究可能有助于开发治疗药物，以增强针对异源病原体的抗体免疫力。可以设想，这种治疗方法可用于已知对特定感染的抗体反应减弱的老龄化人群。
一项横断面研究设计用于确定在乌干达进行的一项TB家庭接触研究的参与者中，M.tb感染状况与对异源病原体召回抗原的抗体反应之间是否存在关联，该研究调查了人类共感染对其易感性的影响感染结核分枝杆菌34。从坎帕拉郊区招募了患有APTB及其家属的人。APTB病例均为18岁以上的成年人，或者只是最近才开始抗结核治疗，或者接受了不到4周的治疗。使用耐酸细菌痰镜检查确定APTB。使用结核菌素皮肤测试和QuantiFERON-TB插管金（QFT-GIT）测试从健康的HHC中鉴定出LTBI患者。在这两个测试中均检测为阳性的HHC被归类为LTBI，而在两个测试中均检测为阴性的HHC被归为未感染的对照。总共68名未感染对照，62名LTBI个体和107名APTB病例纳入我们的研究。将来自这些个体的QFT-GIT无上清液样品用于抗体分析。选择QFT-GIT上清液是因为并非所有研究对象都可获得血清样品。先前我们已经表明，通过测定血清和测定QFT-GIT上清液获得的抗体浓度之间没有差异35。
来自参与英国针对BCG反应的前瞻性研究的青少年的血浆样品用于确定BCG疫苗接种是否与对异源病原体召回抗原的抗体反应的非特异性增加相关。这些人是2005年英国政府在学校中进行BCG疫苗接种计划的一部分，并应邀参加了一项研究研究，目的是确定参与BCG介导的抗结核保护的免疫反应。研究的青少年包括接受BCG治疗的12名受试者，三周后进行随访，以及13名未接受BCG的年龄匹配对照组，并进行了同期随访。所有受试者均无先前的BCG疤痕（早期BCG疫苗接种的迹象），且免疫前的TST阴性13。分析了在接种卡介苗之前以及在3周的时间点从这些个体获得的样本。选择该队列的原因是，它为我们提供了比较接种卡介苗和未接种卡介苗的独特机会，考虑到卡介苗是该国免疫计划的一部分，在乌干达队列中不容易做到这一点 19。
为了研究MBC多克隆激活可能是导致结核病患者对异源病原体抗体反应升高的可能原因，对来自TB家庭接触研究的48个APTB病例的冷冻保存的PBMC和来自115个健康供体对照的新鲜PBMC进行了分析，以确定其效果。活动性结核感染对TT特异性浆母细胞和MBC频率的影响。健康的捐助者是从乌干达病毒研究所的自愿艾滋病咨询和检测诊所招募的。他们都是艾滋病毒阴性，年龄在18-55岁之间，并被临床医生发现是健康的。
这些研究都是探索性的，样本量由足够的样本和用于实验室分析的试剂的可用性确定。
Immulon 4 HBX微量滴定板（美国Thermo Scientific）涂有50 µl /孔的5 µg / ml DT，5 µg / ml TT（均来自美国国家生物标准和控制研究所），5 µg / mlM.tb。PPD（丹麦血清州立研究所），5 µg / ml RSV抗原，5 µg / ml麻疹2级抗原，5 µg / ml 2级腺病毒抗原，1.25 µg / ml Epstein–Barr病毒衣壳（均来自Microbix，Biosystems，加拿大）或0.1％（w / v）脱脂牛奶（非特异性结合的对照）在4°C的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 9.6）中过夜。过夜孵育后，将板用含有0.05％Tween 20（PBS-T）的1 x PBS（pH 7.4）洗涤四次。然后在室温下用150 µl /孔的PBS-T中的1％（w / v）脱脂牛奶封闭板2 h。在0.1％脱脂牛奶PBS-T（测定缓冲液）中稀释每100份样品中的1份稀释液，然后将50 µl加入到抗原包被的孔和对照孔中。在室温下孵育2小时后，如前所述洗涤各孔，并与50μl/孔与辣根过氧化物酶（Dako，Denmark）缀合的多克隆兔抗人IgG以0.5μg/ ml孵育，在室温下再孵育1小时。然后将板洗涤四次，并通过与100μl/孔的含有过氧化氢的邻苯二胺（Sigma）在室温下黑暗中孵育15分钟来检测酶活性。通过添加25μl/孔的2 M硫酸来终止反应，然后在ELISA板读数器（Biotek）中在490 nm的测试波长和630 nm的参考波长下测量光密度（OD）。从测试抗原孔中减去来自对照孔的OD，以消除背景抗体水平。然后将板洗涤四次，并通过与100μl/孔的含有过氧化氢的邻苯二胺（Sigma）在室温下黑暗中孵育15分钟来检测酶活性。通过添加25μl/孔的2 M硫酸终止反应，然后在ELISA平板读数器（Biotek）中在490 nm的测试波长和630 nm的参考波长下测量光密度（OD）。从测试抗原孔中减去来自对照孔的OD，以消除背景抗体水平。然后将板洗涤四次，并通过与含有过氧化氢的100μl/孔的邻苯二胺（Sigma）在室温下黑暗中孵育15分钟来检测酶活性。通过添加25μl/孔的2 M硫酸终止反应，然后在ELISA板读数器（Biotek）中在490 nm的测试波长和630 nm的参考波长下测量光密度（OD）。从测试抗原孔中减去来自对照孔的OD，以消除背景抗体水平。通过添加25μl/孔的2 M硫酸来终止反应，然后在ELISA板读数器（Biotek）中在490 nm的测试波长和630 nm的参考波长下测量光密度（OD）。从测试抗原孔中减去来自对照孔的OD，以消除背景抗体水平。通过添加25μl/孔的2 M硫酸来终止反应，然后在ELISA板读数器（Biotek）中在490 nm的测试波长和630 nm的参考波长下测量光密度（OD）。从测试抗原孔中减去来自对照孔的OD，以消除背景抗体水平。
预先用K8.1或ORF73包被的Immulon 4 HBX微量滴定板由艾滋病和癌症病毒计划病毒肿瘤科，上汽弗雷德里克公司，NCI-弗雷德里克，弗雷德里克，医学博士21702提供。在包被过程中，将分别在0.05 M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH 10）或1×PBS中稀释的100 µl /孔2 µg / ml K8.1或ORF73在4°C的平板孔中孵育过夜。将板用PBS-T洗涤3次，然后用280 µl /孔的测定缓冲液[2.5％（w / v）BSA（Sigma），2.5％（v / v）正常供体山羊血清（Equitech-Bio）封闭在1×PBS中加入0.005％（v / v）Tween 20、0.005％（v / v）Triton X-100]在37°C下放置3 h，然后在80°C下保存直至使用。
将板在37℃解冻以准备测定，并用PBST洗涤3次。制备样品或对照样品的100份稀释液，然后每孔一式两份加入100 µl。每个板具有3个阳性和2个阴性对照样品用于质量控制。在37°C下温育90分钟后，将孔洗涤五次，然后与100 µl /孔的山羊抗人IgG偶联，碱性抗磷酸酶（Roche Diagnostics）用5,000倍稀释的碱性磷酸酶（Roche Diagnostics）在37°C下温育30分钟。将板洗涤五次，并通过与100 µl /孔温育1步p检测酶活性-硝基苯基磷酸酯底物溶液（Thermo Scientific Pierce，美国）在黑暗中于室温下放置30分钟。通过每孔加入50 µl 3 N NaOH终止反应，然后以405 nm的波长读取平板。
按照制造商的说明36，使用Platelia CMV IgG ELISA来测量CMV特异性抗体。简而言之，将稀释的样品，已知抗CMV抗体浓度的标准品和对照添加到预先涂有CMV抗原的微量滴定板中。将板与样品在37℃下孵育45分钟，然后用缓冲液洗涤。然后将由辣根过氧化物酶结合到抗人IgG单克隆抗体上的共轭物添加到每个孔中，并在37°C下孵育45分钟。洗涤板并将酶底物添加到每个孔中，然后在室温下孵育15分钟。此后，加入终止溶液，并在450nm波长下读取OD。
按照制造商的说明，使用人IgG总Ready-SET-Go（Affymetrix ebioscience）测量总IgG 37。在此过程中，将Immulon 4 HBX微量滴定板在100°C / 4℃下用100 µl /孔纯化的抗人IgG单克隆抗体包被过夜。然后将板用洗涤缓冲液洗涤两次，并与250μl/孔封闭缓冲液在室温下孵育2小时。将板洗涤两次并八次，制备重组人IgG对照，并将样品以100,000稀释1。将体积为100 µl /孔的制备标准品和样品加入板中，然后在室温下孵育2小时。在下一步中，将板洗涤四次，并在室温下与100 µl /孔的HRP偶联抗人IgG单克隆检测抗体孵育1小时。将板洗涤四次并与100μl/孔的四甲基联苯胺（TMB）底物溶液在黑暗中于室温下孵育15分钟。
评价了针对TT和MVHA抗原的抗体的亲和力。通过胺偶联至2000 RU的水平，将这些抗原固定在CM5传感器芯片（Biacore，GE Healthcare，Amersham）上。
将样品在HBSPE（含0.15 M NaCl，3 mM EDTA和0.005％（w / v）表面活性剂P20; GE Healthcare的10 mM HEPES pH 7.4）中以1比3的比例稀释并通过Bio-Gel P-30（Bio-Rad， UK）聚丙烯酰胺凝胶旋转柱，以最大程度地减少非特异性结合。将它们在含1％（w / v）羧甲基-右旋糖酐钠盐（Sigma）的HBSPE运行缓冲液中每8份稀释一次，并在Biacore 3000仪器中于25°C的温度下进行分析。将90 µl体积的样品以15 µl / min的速度注入芯片表面，然后解离8分钟。在分析下一个样品之前，将芯片用含有3 M MgCl2和25％（v / v）乙二醇的50 mM HEPES再生，然后用pH 1.5的20 mM甘氨酸再生，并在HBSPE中重新平衡。
使用BIA评估软件4.1.1版进行数据分析，并从测试流通池数据中减去具有固定化α-1抗胰蛋白酶背景的流通池痕迹。使用Langmuir 1：1解离模型确定样品注入后10到300 s之间的解离速率。
我们使用室内和体外B细胞ELISPOTS按照Sebina等人的方法分别确定APTB病例和健康供体中TT特异性浆母细胞和MBC的频率。38，39。将冷冻保存的PBMC解冻，重悬于RPMI（Life Technologies的Gibco）中，其中包含10％（v / v）的胎牛血清，2 mM的1-谷氨酰胺（均来自英国Sigma-Aldrich）和1×青霉素-链霉素（Invitrogen）。然后将细胞在37°C和5％CO 2下静置4–6 h 。
在体外ELISPOT中， 用25 ng / ml人IL-10（英国R＆D Systems），0.5 µg / ml商陆有丝分裂原（PWM）的混合物刺激细胞密度为1×10 6细胞/ ml的PBMC。，6 µg / ml的CpG寡脱氧核苷酸，1.2 mg / ml的金黄色葡萄球菌 Cowan，50 µMß-巯基乙醇在37°C和5％CO 2下反应六天。然后将大约4×10 5的培养细胞转移到预先用1 µs PBS或仅使用1 x PBS包被2 µg / ml TT包被的96孔滤膜（Merck Milipore）的每个孔中。将板密封并在37°C和5％CO 2下孵育6小时之后，将生物素-SP偶联的亲和片段驴抗人IgG（Jackson ImmunoResearch）加入平板孔中，以帮助检测抗TT特异性抗体分泌细胞。在4°C孵育过夜后，添加抗生蛋白链菌素-AKP（BD biosciences），并将平板在室温孵育1小时，然后孵育AP-共轭底物（Bio-Rad，USA）以形成斑点。10分钟后，将板孔用水冲洗并晾干，然后使用AID ELISPOT阅读器（德国AID Diagnostika）对其进行读取。然后将MBC的数量表示为每百万个细胞的斑点总数。
离体ELISPOT涉及将静息的PBMC以4×10 5个 细胞/ 孔的细胞密度直接转移到96孔滤板。随后的所有步骤均与体外ELISPOT所述步骤相似。
使用Stata Release统计软件包和GraphPad Prism软件分析研究数据。使用Kruskal-Wallis检验进行了初步分析，以比较未感染对照，LTBI和APTB病例个体之间的抗体反应。与自举置信区间线性回归分析，然后被用于确定之间的关联结核分枝杆菌感染的状态和对数转换的抗体应答12，17。针对潜在混杂因素的影响进行了调整，例如艾滋病毒感染，年龄，社会经济地位和性别。为了考虑多次测试，对M.tb之间的每个比较计算Q值感染者和未感染者，使用Bonferroni方法。Wilcoxon秩和检验用于比较接种过BCG的个体和未接种过BCG的对照之间的抗体反应，以及APTB病例中MBC和PB的频率。
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