CD8 + T细胞介导的癌症清除率通常被PD-1和PD-L1等抑制性分子之间的相互作用所抑制，这种相互作用就像刹车一样，可防止T细胞在正常情况下过度反应，但被肿瘤细胞利用以逃避免疫监视。免疫检查点抑制剂通过消除此类制动器而彻底改变了癌症治疗方法。不幸的是，大概只有少数癌症患者对免疫疗法有反应，大概是由于免疫力不足。抗肿瘤免疫力取决于cGAS-STING途径的激活，因为STING缺陷型小鼠无法刺激肿瘤浸润的树突状细胞（DC）激活CD8 + T细胞。STING激动剂还可增强自然杀伤（NK）细胞以介导CD8 +的清除T细胞耐药性肿瘤。因此，STING激动剂已受到强烈追捧。我们先前发现，锰（Mn）通过激活cGAS-STING对于宿主抵抗细胞质dsDNA的防御是必不可少的。在这里我们报告锰在肿瘤的先天免疫感测中也是必不可少的，并增强了针对肿瘤的适应性免疫反应。锰不足的小鼠肿瘤生长和转移明显增强，肿瘤浸润的CD8 + T细胞大大减少。在机械上，Mn 2+促进DC和巨噬细胞成熟以及肿瘤特异性抗原呈递，增强CD8 + T细胞分化，激活和NK细胞激活，并增加记忆CD8 + T细胞。结合Mn 2+具有免疫检查点抑制作用的药物可协同增强抗肿瘤功效并降低小鼠所需的抗PD-1抗体剂量。重要的是，在大多数晚期转移性实体瘤患者中，使用Mn 2+和抗PD-1抗体联合治疗方案的已完成的1期临床试验显示出有希望的疗效，表现出I型IFN诱导，可控的安全性和对免疫疗法的免疫应答。我们建议这种组合策略值得进一步的临床翻译。
免疫系统识别并杀死肿瘤细胞，其中先天免疫主要负责肿瘤细胞的检测和适应性免疫的激活。然而，肿瘤细胞的清除通过抑制关卡的分子，如细胞程序性死亡之间的相互作用往往内向蛋白-1（PD-1）1，2和它的配体，例如PD-L1，3在正常情况下，这种相互作用可以防止T细胞过度反应，例如刹车。PD-1在疲惫的T细胞，尤其是在肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）上高表达，而PD-L1在许多肿瘤细胞上高表达，因此被许多肿瘤细胞用来逃避免疫监视。免疫检查点封锁（国际商品机构），诸如PD-1 / PD-L1或CTLA-4阻断抗体已经通过去除这样的抑制制动器，彻底改变了癌症治疗剂4，5，其中依赖于识别的肿瘤特异性抗原的产生和有效性激活肿瘤特异性CD8 + T细胞（也称为细胞毒性T细胞，CTL）。另外，已经发现NK细胞介导CD8 + T细胞抗性肿瘤的清除。6不幸的是，大概只有20％的癌症患者对免疫疗法有反应，大概是由于免疫激活不足所致。5，7，8
I型干扰素（IFNs）通过刺激DC和巨噬细胞的成熟和激活以呈递抗原，从而激活CTL和NK的颗粒酶和穿孔素的产生，从而激活先天免疫和适应性免疫以促进直接（肿瘤细胞抑制）和间接抗肿瘤作用。细胞，6，9和增强记忆T细胞的比例。10，11，12最近的作品表明，各种抗肿瘤疗法取决于CGAS刺途径的活化，13，14，15因为在肿瘤浸润的DC的细胞质中发现了肿瘤衍生的DNA，并且能够激活该途径，从而促进了肿瘤特异性抗原的呈递和CTL的激活。16，17重要的是，STING缺陷小鼠未能刺激CD8 +的各种抗肿瘤疗法的T细胞。13，14，18，19，20一致的是，该配体STING和cGAMP PD-L1抗体的组合显示更强的抗肿瘤作用。17，18有趣的是，已经报道了肿瘤来源的cGAMP触发STING介导干扰素应答在非肿瘤细胞激活NK细胞9该蛋白介导对STING激动剂有反应的CD8 + T细胞耐药性肿瘤的清除[ 6]，表明STING活化促进了对CD8 + T细胞敏感和CD8 + T细胞耐药性肿瘤的抗肿瘤反应。因此，近年来对STING激动剂进行了深入研究。21，22
锰（Mn）是多种生理过程（包括发育，抗氧化剂防御，繁殖和神经元功能）所需的营养无机微量元素。23，24的Mn（锰2+在一般情况下）结合成许多金属酶如Mn超氧化物歧化酶（SOD，Mn为3+或Mn 2+在这种情况下），谷氨酰胺合成酶（GS），丙酮酸羧化酶，和精氨酸酶，25在控制这些酶中起关键作用。但是，其在免疫中的功能在很大程度上是未知的。以前我们发现Mn 2+通过提高DNA传感器cGAS及其下游衔接子蛋白STING的敏感性，宿主防御DNA病毒是必需的。病毒感染后，Mn 2+从线粒体和高尔基体中释放出来，并积累在与cGAS结合的胞质溶胶中，从而增强了cGAS对双链DNA（dsDNA）的敏感性及其酶促活性。Mn 2+还增强了cGAMP-STING的结合亲和力。重要的是，Mn 2+本身是有效的cGAS激活剂，在没有任何感染的情况下，诱导细胞产生I型IFN和细胞因子。26
在这项工作中，我们发现Mn 2+在肿瘤的固有免疫感应中也必不可少，因为Mn不足的小鼠具有显着增强的肿瘤生长和转移能力，并大大减少了肿瘤浸润的CD8 + T细胞。我们证明，Mn 2+以cGAS-STING依赖性方式极大地促进了DC和巨噬细胞的成熟以及抗原呈递，增强了CD8 + T细胞和NK细胞的活化，并增加了CD44 hi CD8 + T细胞的数量。锰2+因此，在多种小鼠模型中，给药显着增强了抗肿瘤免疫疗法。更重要的是，一项针对晚期转移性实体瘤患者的完整的1期临床试验提供了令人鼓舞的证据，证明Mn 2+对患者具有可控的安全性，并有望产生抗肿瘤作用。重要的是，临床观察表明，Mn 2+给药可触发I型IFN诱导和可疑的细胞因子释放综合征，从而增强和/或恢复其对患者免疫治疗的反应。因此，该1期研究值得进一步临床应用。
由于我们先前发现Mn关键参与胞质dsDNA的先天免疫感应以激活cGAS-STING途径，这对于发挥抗肿瘤免疫反应很重要，因此我们假设Mn还将在针对肿瘤细胞的先天免疫反应中发挥作用。为了对此进行测试，首先生成了Mn不足的野生型（WT）C57BL / 6小鼠，26只，然后将小鼠黑素瘤细胞B16F10皮下接种到腹股沟中。在至少接种2.5×10 3肿瘤细胞的Mn不足的小鼠中观察到100％的肿瘤发生，而在对照组WT小鼠中诱导肿瘤发生所需的肿瘤细胞数量增加了7倍（1.8×10 4）（图7）。 1a，b）。此外，我们证实，与对照小鼠相比，Mn不足的小鼠更容易受到B16F10肿瘤侵袭，这表明肿瘤大小和重量大大增加（图 1c，d），而肿瘤浸润的CD8 +和CD4 明显减少。+ T细胞（的TIL）在肿瘤中（图 1E-H ）。锰的剥夺不影响CD4 +和CD8 + T细胞的百分比，这表明在Mn不足的小鼠中T细胞发育正常（补充信息，图 S1a）。一致地，CD8 +大大降低了产生IFNγ（图 1i）和TNFα的产生（图1j）。 在缺乏锰的小鼠的肿瘤中发现了TIL。引人注目的是，与对照组的锰充足小鼠相比，在锰不足的小鼠中静脉内接种的B16F10细胞诱导了更强的肺转移（图 1k）。这些结果表明，Mn在维持宿主抗肿瘤免疫应答中是至关重要的，并且强烈表明Mn对于在生理条件下预防肿瘤发生是重要的。
a，b皮下接种指定数量的B16F10细胞，皮下接种野生型（WT）锰不足（-Mn）和对照（+ Mn）小鼠（n = 8）。每隔一天监测肿瘤发生90天（a）。肿瘤体积大于50 mm 3定义为肿瘤发生，90天后肿瘤体积小于50 mm 3记录为无肿瘤（b）。c，d 皮下（sc）接种1×后，WT对照（Con）和Mn不足的小鼠（–Mn）（每组n = 6 ）中的肿瘤（c），肿瘤大小和重量（d）的代表性图像。10 5 B16F10电池。Ë如（c）中所示，小鼠的肿瘤浸润CD8 + T细胞频率的代表性FACS数据。f，g如（a）中对小鼠的肿瘤浸润CD8 + T细胞（f）或CD4 + T细胞（g）的定量。h来自（c）的B16F10肿瘤用抗CD8-FITC或抗CD4-FITC染色，并用DAPI复染。比例尺，50μm。i，j代表性FACS数据和肿瘤浸润性IFNγ + CD8 + T细胞（i）和TNFα + CD8 +的定量如（c）中的小鼠的T细胞（j）。 静脉注射（iv）1×10 5 B16F10 后第21天，对照组（Con）和锰缺乏的小鼠（–Mn）（n =每组6 只）中的k代表图像（左）和肺重量定量（右）细胞。数据代表每组指示的n只小鼠的分析，平均值±SEM。数据代表三次独立的实验。*** P <0.001；**** P <0.0001。
由于Mn 2+是cGAS-STING途径的激活剂，我们去测试Mn 2+是否会在体内促进抗肿瘤免疫反应。我们在腹股沟处皮下接种了B16F10或小鼠结肠腺癌细胞MC38的C57BL / 6小鼠，然后经鼻内或静脉内Mn 2+给药，我们发现通过这两种途径进行Mn 2+处理可显着降低肿瘤负荷（补充信息，图 S1b –e）。使用Lewis肺癌（LLC）和E.G7肿瘤模型获得了相似的结果（补充信息，图 S1f，g）。具体来说，用Mn 2+处理的LLC荷瘤小鼠存活时间明显长于对照小鼠（补充信息，图 S1h）。接下来，静脉内接种B16F10细胞以诱导肺转移。鼻内施用Mn 2+ 可使肺中的肿瘤结节减少（补充信息，图 S1i，j），表明其具有强大的全身性抗肿瘤反应。当小鼠成纤维细胞或这些肿瘤细胞在本研究中使用的浓度直接用Mn 2+直接处理时，未观察到明显的细胞死亡（补充信息，图 S1k）。重要的是，瘤内Mn 2+注射有效抑制了肿瘤的生长，因为超过50％的治疗小鼠（13/23）无肿瘤（补充信息，图 S2a）。此外，肿瘤内注射Mn 2+一侧诱导了另一侧的抑制，即未注射的肿瘤具有显着延长的生存期（补充信息，图 S2b，c），再次表明施用Mn 2+可以诱导全身性抗肿瘤反应。 。这些结果还表明，Mn 2+本身是有效的化学治疗剂。此外，对照组和Mn 2+之间的体重，存活率和大体器官解剖结构无显着差异。实验过程中接受过治疗的小鼠（补充信息，图 S2d-1）。总的来说，这些结果表明Mn有效地促进了宿主抗肿瘤免疫反应。
接下来，我们确定哪些细胞亚群具有Mn 2+引起的抗肿瘤作用。使用Rag1 -⁄-（补充信息，图 S3a）或β2m- ⁄-（补充信息，图 S3b）小鼠来验证Mn 2+触发的抗肿瘤作用取决于CD8 + T细胞27和NK细胞。由于TIL的存在和活性决定了免疫疗法的临床结果，因此在接种后在端点处解剖肿瘤，并通过流式细胞仪分析TIL。Mn 2+治疗导致B16F10肿瘤中CD8 + TILs 显着增加（图。 2a）和其他肿瘤模型中（补充信息，图 S3c）。同时，在Mn 2+处理的小鼠中，CD4 + TILs也增加了（图 2a）。一致地，在来自Mn 2+处理的小鼠的肿瘤中发现了大大增加的IFNγ-（图2b）和TNFα- 产生（图 2c）CD8 + TIL 。此外，用Mn 2+处理的带有E.G7的小鼠显示出明显减小的肿瘤大小，并显着增加了产生IFNγ的CD8 + TIL，特别是更多的SIINFEKL + CD8 + TIL（图 2d，e），表明肿瘤抗原特异性识别的增强和抗原特异性CTL的增加。此外，在施用Mn 2+后的肿瘤中观察到CD107a +和颗粒酶B + NK细胞显着增加（补充信息，图 S3d）。
皮下接种5×10 5 B16F10细胞（左）并定量肿瘤后第14天， 用盐水或5 mg / kg MnCl 2鼻内（in ）处理的WT小鼠（每组n = 8）中肿瘤的代表性图像（左）浸润CD8 + T细胞或CD4 + T细胞（右）。b，c肿瘤浸润的IFNγ + CD8 + T细胞（b， 每组n = 13）或TNFα + CD8 + T细胞（c，n）的频率（左）和定量（右）的代表性FACS数据皮下接种5×10 5 B16F10细胞后第15天， 用生理盐水或5 mg / kg MnCl 2处理的野生型小鼠的WT小鼠每组= 5 。d，e生理盐水或WT处理的WT小鼠中肿瘤浸润的IFNγ + CD8 + T或SIINFEKL + CD8 + T细胞的肿瘤图像（d），代表性FACS频率（e）和定量（e）（右）皮下接种1×10 6 E.G7细胞后，在第17天时的MnCl 2浓度为5 mg / kg （ 每组n = 4）。f CD8之间选定基因的热图来自对照小鼠和经Mn 2+处理的WT小鼠的+ TIL 。通过计算log 2（（Mn 2+ FPKM）/（Con FPKM））制作热图，将对照组中的基因值归一化为零。g，h量化肿瘤浸润颗粒酶B + CD8 +和穿孔素+ CD8 + T细胞（g， 每组n = 5）或CD62L - CD8 +和CD69 + CD8 + T细胞（h， 每组n = 5）用盐水或5 mg / kg MnCl 2处理的野生型小鼠皮下接种2×10 5个 B16F10细胞后的第16天。数据代表每组指示的n只小鼠的分析，平均值±SEM。数据代表三次独立的实验。* P <0.05；** P <0.01；*** P <0.001；**** P <0.0001。
关键的是，CD8的RNA测序（RNA-SEQ）分析+的TIL从控制分离或Mn 2+ -处理的B16-接种的小鼠显示，转录因子IRF1为IFNγ的产生和CD8 + T细胞增殖，28，29 IRF8和中T-bet（TBX21），用于IFNγ的产生和CD8 + T细胞分化，30，31，32，33和Runx2的用于记忆CD8 + T细胞发育34是在Mn中的TIL所有显著上调2+治疗的小鼠，与许多沿CD8 +的效应基因上调T细胞，包括穿孔素（Prf1）和各种颗粒酶（Gzm）（图 2f）。有趣的是，除GzmA以外的所有颗粒酶都是通过Mn 2+处理诱导的，与以前的工作（包括多中心临床研究）一致，表明GzmA在T细胞或自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性中并不重要，反而起到了促成作用。炎性细胞因子有助于癌症的发展。35，36粒酶B和穿孔的CD8的增加+ TIL的通过流式细胞术证实（图 2克）。此外，已知各种细胞因子（IL1b / 18 / 23a），趋化因子（CCL2 / 8和CXCL1 / 2/10/14）及其受体（CCR1 / 6和IL2Rb / 12Rb1 / 21R）对TIL募集和激活很重要，37，38也被高度上调在选自Mn分离的TIL 2+ -primed小鼠（补充信息，图 S3E）。相反，早期生长反应3（Egr3）和RAR相关孤儿受体C（RORC）的表达，转录因子同时抑制效应CD8 + T细胞分化和IFNγ生产，39，40，41受到严重抑制。与大多数CD8 +的效应子分化有关的转录因子7（Tcf7）T细胞42也被下调。显著增强CD44 喜 CD8 +锰检测T细胞2+处理的小鼠（补充信息，图 S3F-H ），表明更多的内存和活化的CD8 +的Mn后产生的T细胞2+给药，43这有可能提高抗肿瘤免疫反应。通过肿瘤的FACS分析进一步证实了这些结果，发现CD62L - CD8 +和CD69 + CD8 + T细胞显着增加（图 2h）），证明了增强的记忆T细胞比例和激活。一致地，CD8 + T细胞上CD44表达的增加与CD44特异性转录因子Egr1的上调密切相关。44这些RNA-seq结果强烈表明Mn 2+通过调节各种转录因子的表达促进CD8 + T细胞的分化和激活。NK细胞在抗肿瘤免疫中也起着重要作用，尤其是在肿瘤发生的早期以及CD8 + T细胞耐药肿瘤的清除中。6，9，45，46由于NK细胞不能在功能β2M−⁄−小鼠[ 47]无法确定这些小鼠中NK细胞是否参与Mn 2+促进的抗肿瘤反应。因此，我们接下来测试了Mn 2+对从小鼠脾脏分离的NK细胞的作用。与以前的报道表明一致的Mn 2+增强NK细胞活化， 48，49个 NK细胞高度的Mn活化 2+体外治疗，CD107a的的表达和粒酶B是显著增强（补充信息，图 S3I）。总的来说，我们得出结论，Mn 2+通过激活CD8 +促进了抗肿瘤免疫反应。T细胞和NK细胞可清除CD8 + T细胞敏感和CD8 + T细胞耐药肿瘤。
专业的抗原呈递DC被I型IFN激活，对于CD8 + T细胞启动至关重要。11我们发现，Mn 2+处理导致骨髓来源的DC（BMDC）产生大量的I型干扰素（图 3a），并像LPS一样大大诱导DC成熟（图 3b；补充信息，图 S4a） 。一致地，在含有DC，CD8 + T和B16-OVA细胞的共培养系统中，在体外杀伤试验中添加Mn 2+导致对肿瘤细胞的杀伤显着改善（图 3c，d）。重要的是，从Mn 2+中分离出的肺和淋巴结中的BMDC和DC用WT处理的WT小鼠在抗原呈递方面表现出大大增强的成熟度和增强的能力（图 3e，f；补充信息，图 S4b），这在肿瘤中得到进一步证实（图 3g）。与此相符，Mn 2+有效活化巨噬细胞以产生大量的DC促成的I型干扰素（补充信息，图 S4c和表 S1）。一致地，在体外和体内，Mn 2+处理促进了巨噬细胞上CD86的表达和抗原呈递（补充信息，图 S4d，e）。此外，鼻内Mn 2+给药引起肺泡巨噬细胞中TNFα的强烈产生（补充信息，图 S4f和表 S1），这也有助于DC成熟和CD8 + T细胞活化。50，51此外，锰2+肿瘤接种之前预处理显著增加IFNγ产生由CD8 +的TIL，从而升高肿瘤抗性（图 3H，我 ;补充信息，图 S4g），指示由敏化先天免疫预防性保护。更重要的是Mn 2+该治疗显着诱导了来自各种类型癌症患者的外周血单核细胞（PBMC）中DC的成熟，反应率很高（补充信息，图 S4h和表 S2）。
一个 I型IFN活性在从WT或培养基Tmem173 -/-的BMDC与SeV载体，VACV，LPS或的MnCl所示浓度（μM200和400μM）处理2 18小时。b用LPS（10 ng / mL）或指定浓度（200μM和400μM）MnCl 2处理18 h的BMDC中CD80的CD80的平均荧光强度（MFI）。FMO：流量减去CD80之一。C，D CD8 +从OT-I小鼠的脾中分离的T细胞（6-8周龄）用的BMDC在2：1比率混合，并温育与B16F10-OVA-GFP细胞用或不用的MnCl的指定浓度2为24小时 通过流式细胞术（FACS）分析肿瘤细胞的生存力。Ë 用5 mg / kg MnCl 2处理18 h的小鼠（每组n = 5 ）的肺DC（顶部，MnCl 2英寸）或腹股沟淋巴结DC（底部，MnCl 2 sc）中CD80的MFI 。˚F B16F10-OVA细胞用的BMDC共培养下指示处理18小时。通过FACS分析了OVDC肽SIINFEKL–MHC-I分子复合物和共刺激分子MHC-II在BMDC表面的表达。克 WT小鼠皮下2×10接种5 B16F10细胞，并用生理盐水或5毫克/千克的MnCl处理2的ip将小鼠（Ñ 在第16天处死（每组＝ 5只）并解剖肿瘤以进行FACS分析。定量CD86和MHC-II在肿瘤浸润DC上的表达。h在 MnCl 2中处理，然后在第5天用B16F10 sc接种并在第20天处死的WT小鼠（每组n = 4 ）的肿瘤大小和肿瘤重量的代表性图像（左）和定量（右）。在补充信息，图 S4e中描述。i CD8 + TIL，SIINFEKL + CD8 + TIL，IFNγ + CD8 + TIL和TNFα + CD8 +的摘要数据（h）中来自小鼠的肿瘤中的TIL 。数据代表每组指示的n只小鼠的分析，平均值±SEM。数据代表三次独立的实验。* P <0.05；** P <0.01；*** P <0.001；**** P <0.0001。
使用cGAS（cGas -⁄-）和STING（Tmem173 -⁄-）缺陷小鼠（补充信息，图 S5a和表 S3），我们证实了cGAS-STING途径对于Mn 2+诱导的I型IFN产生至关重要。（补充信息，图 S5b）和抗肿瘤作用（图 4a，b）。这些基因在小鼠中的缺失引起的反应完全丧失与Mn 2+治疗没有增加CD8 +或CD4 + TIL的（图 4C，d）或增强CD44 喜 CD8 +锰后T细胞比例2+管理（图 4e）。重要的是，在Mn不足（图4f）或Mn 2 +-施用（图 4g）的Tmem173 -⁄-小鼠中，肿瘤细胞的生长和抗原特异性CTL的活化都没有改变 ，证实了cGAS-的重要作用Mn 2+介导的宿主对肿瘤细胞的免疫反应呈STING状态。我们还分析了髓源抑制细胞（MDSC的）在肿瘤中作为的MDSC可能促进肿瘤生长和转移，52，53选自Mn然而，肿瘤2+-治疗的小鼠和对照小鼠在MDSC浸润中没有显示显着差异（数据未显示）。这些数据共同表明，Mn 2+促进DC成熟并以cGAS-STING依赖性方式触发CTL介导的抗肿瘤作用。
a 静脉注射2×后第14天，用生理盐水或5 mg / kg MnCl 2（每组n = 4）中的cGas −⁄−小鼠（上）或Tmem173 −⁄−小鼠（下）的肺重量定量10 5 B16F10电池。b皮下接种5×10 5 B16F10细胞后第14天， 用生理盐水或5 mg / kg MnCl 2处理的Tmem173 −⁄−小鼠（每组 n = 4）中的肿瘤图像。c，d代表性FACS数据（c）和肿瘤浸润CD8 +的定量如b所示，来自Tmem173 -⁄−小鼠的T细胞或CD4 + T细胞（d）。e补充信息中描述了实验方案，图 S3e：cGas -⁄-小鼠（每组 n = 3）在所示时间给予5 mg / kg MnCl 2 ip，并在第9天处死。频率（左）和细胞cGas −⁄−小鼠脾细胞中CD44 hi CD8 + T的数目（右）。f Tmem173 -⁄-对照（Con）和Mn不足的小鼠（–Mn）的肿瘤大小和肿瘤重量（ 皮下接种5×10 5 B16F10细胞后，每组n = 5 。g皮下接种5×10 5 B16F10细胞后第14天， 用盐水或5 mg / kg MnCl 2处理的Tmem173 −⁄−小鼠（每组 n = 9 ）的肿瘤图像（左），肿瘤重量（右）。数据代表每组指示的n只小鼠的分析，平均值±SEM。数据代表三次独立的实验。ns，不显着，P > 0.05。
考虑到Mn 2+强烈诱导I型IFN产生和DC成熟，我们认为Mn 2+可以用作抗肿瘤佐剂。通过使用B16-OVA肿瘤模型，我们在接种B16-OVA之前先用不含LPS的鸡卵清蛋白蛋白（OVA）或Mn 2+的 OVA进行肌内免疫C57BL / 6小鼠。我们发现，Mn 2 + -预免疫的小鼠对肿瘤具有更大的抵抗力，具有显着抑制的肿瘤生长（图 5a）和大大增加的存活率（图 5b）。重要的是，这种抑制作用在Tmem173- /-小鼠中消失了（图 5c，d）。一致地，用OVA和Mn 2+免疫的小鼠产生了更多的OVA特异性CTL（图 5e），促进了CD8 + T细胞增殖（图 5f）并增强了体内CTL杀伤能力（图 5g），表明Mn 2+增强了OVA特异性CD8 + T细胞。增殖。因此，我们提出了Mn 2+可以与某些STING激动剂类似地用作抗肿瘤疫苗的佐剂。54
a，b在5×10 5 B16F0-OVA皮下接种之前第 0、7 或14天（im）肌肉 ，经PBS，OVA或OVA和MnCl 2预免疫的WT小鼠的肿瘤大小（每组n = 8）在第21天（a）。监测小鼠的存活（b）。c，d在第0、7或14天 用PBS，OVA或OVA加MnCl 2 im 预先免疫的Tmem173 −⁄−小鼠（每组 n = 8）中的肿瘤大小，然后在5×10 5 B16F0-OVA皮下接种第21（c）天。监测小鼠的存活（d）。Ë代表性附图和摘要的SIINFEKL频率的数据+ CD8 +在免疫（PBS，OVA或OVA加的MnCl的脾T细胞2 IM在第0天，第7或14）的小鼠在第21天˚F CD8 +腹股沟T细胞增殖在用PBS，OVA或OVA加MnCl 2 sc 免疫后第3天从受体小鼠获得淋巴结（ 每组n = 4）。克体内CTL测定在WT（上图）或Tmem173 -/-小鼠（下图）后即时（第0天，第7，14）21 d用OVA（100微克），具有或不具有的MnCl 2（20微克）（Ñ =每个基因型5个）。数据代表所指示的分析每组n只小鼠，表示±SEM。数据代表三次独立的实验。ns，不显着，P > 0.05；*** P <0.001；**** P <0.0001。
最近的研究表明，cGAMP增强了免疫检查点封锁（ICB）（例如PD-1，PD-L1或CTLA-4封锁抗体）的抗肿瘤作用。17，18，55，我们建议，所述的抗肿瘤免疫治疗可被认为是车辆的行驶先天免疫的激活，并且在这种情况下，C气体刺途径，动作等以按加速器或甚至以起动发动机，而国际商品机构功能释放刹车。实际上，B16黑色素瘤被公认是具有微弱免疫原性的侵袭性肿瘤，因此受PD-1阻断抗体控制不佳。由于Mn 2+作为发动机启动和加速器按压等CTL激活而强烈促进DC成熟，因此我们假设PD-1阻断抗体与Mn结合使用2+可以更好地治疗B16黑色素瘤。我们发现确实如此。鼻内Mn 2+给药对CD8 + TILs（图 6c，d）和IFNγ + CD8 + TILs（图6e，f）大大增加的小鼠B16黑色素瘤生长具有明显的协同作用（图 6a，b）。 。在MC38肿瘤（补充信息，图S6a–c）和肺转移性B16F10黑色素瘤模型（图6g）中也发现了这种协同作用 ，这与通过CD8 +的重新激活实现检查点封锁引起的肿瘤消退的临床观察一致。 肿瘤内的T细胞。56惊人的是，当同时施用Mn 2+时，半剂量的PD-1阻断抗体显示出明显更好的抑制肿瘤生长的效果（图 6h）。重要的是，与使用抗PD-1或联合疗法治疗的小鼠相比，Mn 2+治疗不会减轻小鼠的体重或损害其指定的主要器官（图 6i；补充信息，图 S6d），表明安全性Mn 2+处理的机理及其转化价值。总体而言，这些数据表明，Mn 2+在小鼠模型中协同改善了免疫疗法的功效。
a用同型抗体（200μg/小鼠ip），MnCl 2（5 mg / kg in），抗PD-1抗体（200μg/小鼠ip）或MnCl 2加抗小鼠治疗的小鼠皮下B16F10植入物的肿瘤大小-PD-1抗体（ 每组n =6。组合，用MnCl 2和抗PD-1抗体联合治疗）。b代表图像（左），在小鼠中皮下植入B16F10如在肿瘤重量（右）一个。C，D代表FACS图（C ^）和定量（d肿瘤浸润的CD8）+小鼠的T细胞作为一个。e，f代表性的FACS数字（e）和定量（f）的小鼠的IFNγ + CD8 + TILs如在一个。g 静脉注射2×10 5 B16F10细胞后第15天，生理盐水或5 mg / kg MnCl 2处理的小鼠（每组n = 4 ）的肿瘤结节和肺重量的代表性图像（左）和定量（右）。h同种抗体（200μg/小鼠ip），MnCl 2（5 mg / kg ip），抗PD-1（200μg/小鼠ip），1/2抗PD 治疗的小鼠皮下B16F10植入物的肿瘤大小-1（100μg/小鼠ip），或1/2抗PD-1加MnCl 2（ 每组n = 5）。i在用MnCl 2（5 mg / kg ip ip），抗PD-1抗体（200μg/小鼠ip）或MnCl 2加anti-PD-1 处理的小鼠中皮下B16F10植入后体重追踪16天抗体（ 每组n = 5）。数据代表每组指示的n只小鼠的分析，平均值±SEM。来自细胞和小鼠的数据代表了三个独立的实验。ns，不显着，P > 0.05；* P <0.05；** P <0.01；*** P ＜0.001。
根据上述数据，我们进行了一项首次公开募集，剂量递增的人为第1期临床试验，以评估Mn 2+引发抗PD-1抗体加化疗的安全性和初步疗效（ClinicalTrials.gov， NCT03991559）。从2018年11月25日至2019年5月15日，招募了22例晚期转移性实体瘤患者，并接受了至少两次剂量的联合治疗（图7a -c;补充信息，表 S2，S4，S5）。氯化锰2该溶液通过鼻内或吸入给药（如材料和方法中所述）。在2020年4月15日的数据截止时，所有患者均经历了至少一项可评估的治疗后肿瘤扫描，并显示出初步的良好临床疗效，最佳客观缓解率为45.5％（95％CI，26.9-65.3），而90.9％（95％CI） （72.2-97.5）最佳疾病控制率（图 7b；补充信息，图 S7a）。一致地，临床反应与从这些癌症患者分离的PBMC的体外Mn 2+反应具有良好的相关性（补充信息，表 S2）。至关重要的是，先前通过抗PD-1抗体和化学疗法或放射疗法的联合治疗失败的所有五名患者均显示出疾病控制，其中三名具有部分缓解（PR）和两名患有稳定疾病（SD），表明Mn 2+恢复了抗肿瘤作用。这些免疫无反应的患者进行免疫治疗。显着地，观察到一名乳腺癌患者的胸壁坏死性肿瘤块的脱落和六名卵巢癌患者的冰冻骨盆的大部分缓解（图 7c）。通过微分脉冲极谱法测定的无血Mn浓度在0.029μM和1.2μM的正常范围内，这与ATSDR建议的电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）不同（补充信息，数据S1）。重要的是，给药后血液中的锰水平升高，但仍保持在正常范围内，似乎可以预测其抗肿瘤作用（图 7d）。通过临床反应分层显示，在PR和SD病变减少的患者中观察到Mn浓度显着增加（队列2），但在PD和SD病变增大的患者中未观察到锰浓度（队列1），并且至少持续升高12周（图 7e）。血液中Mn的升高促进了I型IFN的诱导和某些促炎性细胞因子的诱导，因为在队列2中观察到了IFNα，IL-6，IL-8和TNFα的统计学显着增加（图 7e；补充信息，图 S7b）。（第2组），与Mn 2+在小鼠模型和人PBMC中的免疫刺激作用一致。
a临床试验设计的图形摘要。b在目标病变的最长直径中，与基线相比的最佳百分比变化。虚线表示根据实体瘤反应评估标准（RECIST）v1.1有关进行性疾病和部分反应的阈值。c显示了代表性案例。患有难治性转移性乳腺癌的UPN4患者在进行了四个疗程的联合治疗后达到PR，并经历了坏死性病变从胸壁剥离的现象。服用Mn 2+后，两名铂耐药的转移性卵巢癌患者获得PR，冷冻骨盆部分缓解。d n之后的血液Mn浓度水平 =按临床反应分组的患者的C1-C6疗程。e根据血中锰浓度分组的患者血清细胞因子和效应蛋白的基线和治疗后最高表达水平。队列1包括SD-E和PD患者；队列2包括达到PR和SD-S的患者。f难治性大肠癌患者UPN1因胸腔积液和肺水肿而导致伴随低氧血症的急性CRS，可通过抗TNFα/TNFαR抗体疗法解决。DLT，剂量限制性毒性；PR，部分反应；SD-S，病情稳定，病灶减轻；SD-E，病情稳定，病变扩大；PD，进行性疾病。使用配对t计算P值测试（SPSS 26）。数据表示平均值±SEM；* P <0.05；** P ＜0.01。
这项1期试验记录了可控的安全性，在19例（86％）患者中发生了任何级别的与治疗相关的不良事件（AE），在9例（41％）患者中发生了与治疗相关的严重不良事件（3-4级），没有任何不良事件与治疗有关的死亡（补充信息，表 S6）。1-2级AE耐受性良好，而3-4级AE在支持治疗下得以解决。五名患者由于免疫相关性肺炎（n = 2）和化疗相关的血液学和胃肠道毒性（n = 3）而中止治疗。中位随访11.8个月，未观察到Mn过量相关的毒性和Mn在基底神经节中的蓄积。57重要的是，五名腹腔广泛转移的患者出现了急性怀疑的局部或全身性细胞因子释放综合征（CRS），并明显诱导出血清I型IFN和一些促炎性细胞因子，包括IL-6和TNFα（补充信息，图。 S7c，d），由于胸腔积液和肺水肿引起的腹水，腹泻，肠梗阻和低氧血症累积（图 7f），但是所有这些都通过单独使用抗TNFα/TNFαR或抗IL6R抗体来解决。全部22例患者治疗前后的影像学资料均显示出来（补充信息，图 S8）。因此，该1期研究提供了令人鼓舞的初步证据，支持Mn 2+的安全性和抗肿瘤作用 在患有晚期转移性实体瘤的患者中，目前正在进行2期研究。
Mn是具有多种生物活性的营养性无机微量元素。尚未发现其免疫调节作用。在这项研究中，我们研究了Mn在桥接先天免疫和适应性免疫以监测肿瘤方面的作用（补充信息，图 S7e）。我们发现锰在肿瘤的先天免疫感测中起着关键作用，因为锰不足的小鼠不能很好地控制肿瘤的生长和转移。相反，在Mn不足和施用Mn 2+的cGas -⁄-或Tmem173 -⁄-之间，肿瘤生长，转移和抗原特异性CTL激活均未改变。老鼠。这些结果强烈表明，Mn对于在生理条件下预防肿瘤发生是重要的，并且Mn 2+介导的抗肿瘤免疫应答取决于cGAS-STING途径。这与以前的发现非常吻合，Mn对于cGAS-STING介导的胞质DNA感测很重要，而肿瘤浸润DC的cGAS-STING介导的肿瘤DNA感测对于抗肿瘤免疫反应至关重要。13，14，16，17，18，19，20鉴于事实的Mn 2+激活CGAS用10 4倍以下的dsDNA除Mg 2+确实，锰2+ -cGAMP取得3.5×10 2更高结合亲和力倍蜇除Mg 2+ -cGAMP，而小鼠的Mn-不足是高度敏感的DNA病毒，26它极有可能是细胞溶质的Mn 2+也极为参与使cGAS-STING在生理条件下对肿瘤监测敏感。
我们还证明了Mn 2+可以用作有效的抗肿瘤试剂或佐剂。在所有测试的小鼠模型中，经鼻内，静脉内或瘤内Mn 2+给药均能引起强烈的全身性抗肿瘤反应，并具有增强的NK细胞功能，DC和巨噬细胞成熟/激活，CD8 + T细胞分化/激活和记忆性T细胞存活，以及大大抑制了肿瘤的生长和转移。此外，Mn 2+协同增强了各种抗肿瘤治疗的效果，从而显着降低了抗PD-1抗体的剂量。一致地，Mn 2+实质上诱导了来自各种癌症患者的PBMC中DC的成熟。更重要的是，第一阶段临床试验从2018年11月开始，针对晚期转移性实体瘤患者，这些患者未能采用标准的抗癌治疗或化学疗法或放射疗法与抗PD-1疗法相结合，表现出良好的临床疗效，客观反应率为45.5％，再次施用Mn 2+后，疾病控制率为90.9％。在提交这项工作期间，已发表的论文还报道了Mn 2+对小鼠的抗肿瘤作用，58与我们的观察一致。因此，对于Mn 2+以提高临床上的抗肿瘤治疗效果，尤其是免疫原性低（冷肿瘤）或抗PD-1反应低的癌症患者。实际上，调节STING的化合物的开发一直是癌症治疗研究的重点。DMXAA，一种小鼠STING激动剂，据报道在小鼠中具有很强的抗肿瘤活性，但由于不能激活人STING而在临床试验中失败。59，60，61，62 cGAMP最近已证明，以限制肿瘤进展。17然而，由于cGAMP的跨膜能力差，静脉注射高剂量的cGAMP每天只能产生适度的疗效，21它通常需要细胞通透性才能进行细胞内递送。然而，锰2+容易激活细胞，因为锰2+是积极和有效地转运到细胞中，与细胞内的Mn 2+浓度为约10倍，比细胞外一个更高，通过各种转运包括二价金属转运体（DMT1），锌2 +和Ca 2+转运蛋白。23，26此外，最近的研究表明，锰2+直接激活DNA的CGAS独立并触发2'3'--cGAMP，一个独特的催化合成63，64加强Mn 2+作为新型STING激动剂的潜在应用，以增强抗肿瘤和抗病毒免疫反应。
“正常”范围的哺乳动物组织的Mn浓度为5μm和53μM之间65，66与0.029μM和1.2μM内血液的Mn浓度和脑含有20μM的最高锰含量至53μM。67以前，我们观察到当培养基Mn 2+水平达到2 µM。重要的是，五名转移患者中较高的血液锰水平（在0.821μM和0.96μM之间）诱发急性CRS，导致PR（2例）或SD（3例）。我们的结果表明，促进抗肿瘤治疗所需的血液中Mn水平在生理范围内，可以认为是相对安全的。此外，众所周知，血浆中的锰转换相当快，因为锰离开血浆的估计半衰期为1分钟68，因为锰迅速重新分布到肝脏并与胆汁结合并传递到肠道进行粪便排泄。69，70
最近已明确证明癌症免疫疗法对将来的肿瘤治疗有效且重要。然而，大概只有百分之一的癌症患者对免疫疗法有反应，大概是因为免疫激活不足以识别肿瘤特异性抗原并产生肿瘤特异性CD8 + T细胞。结果，不同类型的联合治疗方案成为主流实践，以扩展ICB的临床益处。71与化学疗法的结合在各种类型的晚期转移性实体瘤中很常见，尽管其增强的活性相对有限。72，73从该先入人体试验初步建议Mn的增强效果突出的临床响应率2+化学-免疫治疗方案的特点是：在20例患者（90.9％）中持久控制了疾病，其中10例患者（45.5％）被评估为PR反应，其中5例以前未使用过抗PD-1加上化学疗法。引人注目的是，在八名患有铂和/或抗PD-1抗体耐药的转移性卵巢癌患者中，六名患者实现了PR，两例SD缩小，同时使六名患者的骨盆冰冻得到缓解。血液中Mn 2+的升高证明了Mn 2+对ICB效率的显着促进作用。浓度与患者I型IFN的诱导以及随后释放的某些促炎细胞因子密切相关。在那些细胞因子（IFNα，IL-6和TNFα）显着增加的患者中，有5名患者在其血液中Mn 2+浓度显着升高2-3周后出现了急性或局部急性CRS 。实际上，仅通过化疗加抗PD-1抗体治疗的患者很少报道CRS。74，75，76个，所有这些临床发现共同支持的概念，即锰2+此外，通过激活先天免疫，可有效增强患者的适应性免疫反应。根据这些结果，我们提出抗肿瘤免疫疗法的作用就像驾驶车辆，而ICB的作用是释放制动器，Mn 2+的施用会压迫加速器，甚至会启动发动机。两者对于有效的抗肿瘤治疗都是必不可少的。
鉴于Mn 2+是一种经过充分研究的毒理学所必需的营养素，并且FDA批准通过口服，肌内和静脉内给药来使用，因此我们认为Mn 2+具有开发通用抗肿瘤疗法的临床潜力。此外，该组件简单和Mn的稳定性2+，成本低和Mn的广泛可用性2+使这样疗法更有希望和有吸引力的。
按指示购买抗GAPDH（Santa Cruz，sc-25778），抗cGAS（Santa Cruz，sc-245858； Sigma，HPA031700）抗体。其他抗体是自制的，如前所述使用。77，78，79
Alexa Fluor 488抗小鼠IA / IE（M5 / 114.15.2），PE抗小鼠CD11c（N418），APC抗小鼠CD11c（N418），PE抗小鼠CD45.1（FC）， Alexa Fluor 700抗人CD45（2D1），PE抗人CD11c（3.9），APC / Cy7抗人HLA-DR（L243），APC抗人CD86（IT2.2），PE-抗小鼠CD62L（MEL-14），PE抗人类/小鼠Granzyme B（QA18A28），PE / Dazzle594抗小鼠CD69（H1.2F3），APC抗小鼠穿孔素（S16009B），Alexa Fluor 488抗小鼠NK-1.1（PK136），PE抗小鼠CD83（Michel-19），APC抗小鼠CD107a（1D4B），PE / Cy7抗小鼠CD86（P03），BV421抗小鼠鼠标F4 / 80（BM8）。在LSR Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences）上获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（Tree Star）进行分析。PE抗人CD11c（3.9），APC / Cy7抗人HLA-DR（L243），APC抗人CD86（IT2.2），PE抗小鼠CD62L（MEL-14），PE -抗人/小鼠颗粒酶B（QA18A28），PE / Dazzle594-抗小鼠CD69（H1.2F3），APC-抗小鼠穿孔素（S16009B），Alexa Fluor 488-抗小鼠NK-1.1（PK136）， PE抗小鼠CD83（Michel-19），APC抗小鼠CD107a（1D4B），PE / Cy7抗小鼠CD86（P03），BV421抗小鼠F4 / 80（BM8）。在LSR Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences）上获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（Tree Star）进行分析。PE抗人CD11c（3.9），APC / Cy7抗人HLA-DR（L243），APC抗人CD86（IT2.2），PE抗小鼠CD62L（MEL-14），PE -抗人/小鼠颗粒酶B（QA18A28），PE / Dazzle594-抗小鼠CD69（H1.2F3），APC-抗小鼠穿孔素（S16009B），Alexa Fluor 488-抗小鼠NK-1.1（PK136）， PE抗小鼠CD83（Michel-19），APC抗小鼠CD107a（1D4B），PE / Cy7抗小鼠CD86（P03），BV421抗小鼠F4 / 80（BM8）。在LSR Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences）上获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（Tree Star）进行分析。APC抗小鼠CD107a（1D4B），PE / Cy7抗小鼠CD86（P03），BV421抗小鼠F4 / 80（BM8）。在LSR Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences）上获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（Tree Star）进行分析。APC抗小鼠CD107a（1D4B），PE / Cy7抗小鼠CD86（P03），BV421抗小鼠F4 / 80（BM8）。在LSR Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences）上获取流式细胞仪数据，并使用FlowJo软件（Tree Star）进行分析。
除非另有说明，否则所有化学药品均购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。CFSE细胞分裂示踪试剂盒（Biolegend，423801），烫发/洗涤缓冲液（BD Biosciences，51-2091KZ），红细胞裂解缓冲液（Solarbio，R1010），4％固定液（Solarbio，P1110），LPS（Sigma，L4130） ），卵清蛋白（InvivoGen，＃vac-pova），MHC-1特异性OVA肽H-2K b：SIINFEKL（OVA 257–264）（SciLight肽），胶原酶D（罗氏，11088866001），DNase I（罗氏，10104159001） ，一水合环磷酰胺（TargetMol，T0707），重组小鼠IL-2（Biolegen，575404），重组小鼠IL-15（Biolegend，566302），小鼠NK细胞分离试剂盒（Miltenyi-Biotec，130-115-818）。
在DMEM中培养B16F10，B16F10-OVA，B16F0-OVA，MC38，LLC，L929细胞（小鼠成纤维细胞），L929-ISRE细胞（表达干扰素刺激响应元件的L929细胞）。在补充有10％（v / v）胎牛血清（FBS），5μg/ mL青霉素和10μg/ mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养E.G7细胞。为了生成BMDC，用PBS冲洗胫骨和股骨的骨髓细胞，并在培养皿中接种，接受20 ng / mL的GM-CSF，20 ng / mL的IL-4，并在37°C的潮湿环境中孵育5 ％CO 2（第0天）。在第3天，将平板用含有20 ng / mL GM-CSF和20 ng / mL IL-4的一半培养基替换，在第6天，收获BMDC用于实验。如所述产生骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）。80简而言之，将胫骨和股骨的骨髓细胞通过在10 mL培养基（加有20％热灭活的FBS，谷氨酰胺和30％含有巨噬细胞刺激因子的L929上清液）中培养的PBS在37°C的潮湿环境中冲洗5。 ％CO 2持续5天。从小鼠支气管肺泡灌洗液中收集肺泡巨噬细胞。按照制造商的说明，使用小鼠NK细胞分离试剂盒从C57BL / 6小鼠脾脏中富集NK细胞。在存在20 ng / mL小鼠重组IL-2和50 ng / mL IL-15的情况下，将NK细胞在补充有10％FBS的RPMI-1640培养基中培养3天。
该研究得到北京大学人类研究伦理委员会和中国人民解放军总医院机构审查委员会的批准，并且符合赫尔辛基宣言。如补充信息表S2所示，在献血时有51位癌症患者自愿者献血以表征人PBMC对Mn 2+的反应，年龄在27至75岁之间 。志愿者中有20名是男性，而31名是女性。通过连续离心使用Histopaque-1077（Sigma，10771）从志愿者的外周血中分离PBMC，并在补充了5％FBS的RPMI-1640培养基中进行培养。PBMC以1×10 6细胞/ ml 的最终浓度接种在24孔板中。
WT C57BL / 6小鼠购自北京生命河实验动物技术有限公司。cGas −⁄−和Tmem173 −⁄−小鼠是通过将创始小鼠进行杂交育种而获得的，这些小鼠是通过将C57BL / 6受精卵与Cas9进行细胞质注射而产生的mRNA（100 ng /μL）和gRNA（50 ng /μL）。通过mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra（Ambion，am1345）和HiScribeTM T7高产RNA合成试剂盒（NEB，E2040S）分别体外转录Cas9 mRNA和单向导RNA（gRNA）。Rag1 -⁄-小鼠来自Hai Qi（清华大学医学院），β2m- ⁄-小鼠来自清华大学医学院董忠军。OT-1小鼠来自Yan Shi（清华大学医学院）。所有小鼠均在北京大学实验动物中心繁殖并保持在无特定病原体的条件下。根据北京大学实验动物中心的批准，根据美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行实验。在6周至8周龄之间使用小鼠。
除非另有说明，否则将WT C57BL / 6小鼠皮下注射入100μLPBS中的5×10 5 B16F10、1×10 6 MC38或LLC或E.G7细胞的右腹股沟。对于黑色素瘤转移模型，将300μLPBS中的2×10 5 B16F10细胞静脉注射到C57BL / 6中。每天监测肿瘤的生长并每1-2天测量一次。肿瘤体积确定为长（mm）×宽（mm 2）×0.5。对于Mn 2+治疗，用盐水或5 mg / kg MnCl 2鼻内治疗携带WT肿瘤的小鼠每2天一次。对于免疫检查点封锁疗法，在肿瘤接种后第3、7、11天，用200μgα-PD-1单克隆抗体（Clone 29 F.1A12，BioXCell）在200μL盐水中腹膜内治疗WT荷瘤小鼠。对照小鼠接受大鼠IgG2a同种型（克隆2A3，BioXCell）。
切碎肿瘤并在37°C下用添加有10 U / ml DNase I（Roche）的1 mg / mL胶原酶D（Roche）消化45分钟，然后通过70μm细胞过滤器过滤以获得单细胞悬液。
取自肿瘤或脾细胞的TIL在4°C下用SIINFEKL四聚体（MBL）染色1 h，避光。将细胞用染色缓冲液洗涤两次，然后在4°C下用抗小鼠CD8α和其他表面标记（Biolegend）染色30分钟。将细胞洗涤两次并重悬于染色缓冲液中以进行FACS分析。
将石蜡载玻片脱蜡，再水化，进行热诱导的表位修复（HIER），然后与抗小鼠CD8（GB11068，Servicebio）或小鼠CD4（GB13064-2，Servicebio）的一抗孵育。使用山羊抗兔Alexa Fluor 488抗体（GB25303，Servicebio）作为二抗。DAPI（G1012，Servicebio）被用作核复染色。
小鼠腹膜内注射D-荧光素（150 mg / kg），在荧光素摄取达到峰值之前5分钟麻醉，然后使用IVIS Lumina III（PerkinElmer）对小鼠进行生物发光成像（BLI）。萤光素酶表达通过Living Image软件进行成像和计算。
仙台病毒（SeV，来自武汉大学的丛从正），牛痘病毒（VACV，Western Reserve株，来自中国科学院微生物研究所闵方；或Western Reserve-Vvt7株，来自华中农业大学的金梅林）。使用BHK21细胞通过噬斑测定来测量病毒效价。对于细胞刺激，将细胞用SeV（MOI为0.01），VACV（Western Reserve-Vvt7株，MOI为0.01）感染1 h，冲洗并在新鲜培养基中培养。
如前所述测量I型IFN浓度。81简而言之，通过将IFN刺激的反应元件（ISRE）克隆到pGL3-Basic Vector（Promega）中，构建IFN敏感的荧光素酶载体，并将其稳定转染到L929细胞中。将L929-ISRE细胞接种到96孔板中，并与小鼠细胞培养上清液一起孵育。重组小鼠IFNβ（R＆D Systems）用作标准品。4小时后，将细胞裂解并通过荧光素酶报告基因测定系统（Promega）进行测量。
通过MojoSort ™小鼠CD8 T细胞分离试剂盒（Biolegend，480008）纯化从6-8周龄的OT-1小鼠脾脏分离的CD8 + T细胞。将CD8 + T细胞与BMDC混合，并与含或不含MnCl 2指示浓度的预镀B16F10-OVA-GFP细胞（CD8 + T：BMDC：Tumor = 2：1：2）孵育24小时。通过流式细胞术分析B6F10-OVA-GFP细胞。
WT C57BL / 6小鼠是肌肉内注射的对照，OVA（100μg）单独或以20μgMnCl 2悬浮在PBS中，最终注射量为100μL，分别在第0、7和14天进行。免疫后第21天，纯C57BL / 6在37°C下，用不同浓度的CFSE（5μM或0.5μM）标记脾细胞10分钟。将高浓度的染色细胞在37°C下用OVA 257-264（10μg/ mL）脉冲90分钟。用培养基洗涤两次后，将标记的细胞混合并通过静脉内施用转移至免疫的小鼠。转移后24小时，收集脾细胞并通过流式细胞术测量CFSE标记的细胞的百分比。具体的杀灭百分比计算为：（CFSE 低％-CFSE 高％）/ CFSE低％×100。
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）分离总RNA。用随机引物和Superscript III逆转录酶（Invitrogen）将一微克总RNA转化为cDNA。用基因特异性引物组进行PCR。定量实时PCR用对的LightCycler SYBR绿掺入执行® 96系统（Roche）中，并且将数据表示为累积索引（2 △ △ CT）。
使用MojoSort ™小鼠CD8 T细胞分离试剂盒从OT-1转基因小鼠脾脏中纯化CD45.1 + CD8 + T细胞。然后用CFSE标记CD8 + T细胞，然后用PBS洗涤两次。在第0天，将2×10 6 CFSE标记的CD8 + T细胞静脉内转移至CD45.2背景受体小鼠。在第3天，通过流式细胞术分析来自受体小鼠脾脏的CD45.1 + CD8 + T细胞，以量化CFSE 低细胞的比例。
给小鼠接种初免-加强免疫方案：在第0天肌肉内（im）用单独的抗原OVA（100μg）或用20μg/ 50μgMnCl 2悬浮在PBS中的肌肉注射动物，最终注射量为100μL。在第7天和第14天提高了免疫力。
断奶的C57BL / 6小鼠随机分为两个饮食组，分别饲喂对照饮食AIN-76A（D10001，锰59.34 ppm）或不添加Mn的AIN-76A（D18901，Mn低于1 ppm）。 Research Diets Inc.（美国新不伦瑞克省）为6-8周。每周测量小鼠的饲料消耗和体重。通过二氧化碳窒息处死小鼠并使其颈脱位。饲喂对照饮食的小鼠被标为+ Mn，Mn充足或对照小鼠，而饲喂Mn缺乏饮食的小鼠被标为–Mn或Mn不足小鼠。
开放标签，剂量递增和剂量扩展1期临床试验已获得中国人民解放军总医院机构审查委员会（S2018-182-01）的批准，并根据《赫尔辛基宣言》的道德准则进行以及国际统一临床实践指南指南。所有作者都保证严格遵守研究方案，并保证数据的准确性和完整性。从每位登记患者获得书面知情同意书。
符合条件的患者是成年人（年龄在18岁或以上），具有组织学证实的晚期转移性实体瘤。至少有一个根据反应标准定义的≥1 cm的可测量病变；东部合作肿瘤小组（ECOG）的绩效状态为0–2；适当的器官功能；以前没有器官移植；并且没有不受控制的主动感染。有抗PD-1或CAR-T治疗后复发史的患者符合条件。补充信息表S5中提供了包含和排除标准的完整列表 。
所有患者均鼻内给予0.05或0.1 mg / kg / d氯化锰，或每天一次吸入0.1、0.2或0.4 mg / kg / d吸入，然后静脉注射化疗（第2天）加2-4 mg / kg抗PD-1抗体（第3天）以3周为周期。在基线和每6周通过计算机断层扫描（CT）和/或磁共振成像（MRI）进行肿瘤评估。根据实体瘤反应评估标准（RECIST）v1.1以盲法评估肿瘤反应。进行了脑部MRI和神经系统检查，以评估Mn 2+治疗的安全性。根据《不良事件通用术语标准》 5.0版对所有不良事件进行监视和记录。
在每个周期之前，在肝素化管中收集血样。静置15分钟以激活微量元素后，将20μL样品在4000 rpm下离心1分钟。用高精度微量元素分析仪（AASA医疗技术有限公司，中国武汉）检测游离血Mn 2+的浓度，该分析仪已获得中国国家药品监督管理局（2013-2401836）的批准。游离血Mn 2+的正常范围是0.029–1.2μM。
血液中Mn 2+浓度的测定基于电化学技术差分脉冲极谱法。这是一种微量元素检测技术，其工作原理与ATSDR推荐的电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）不同。血样用磺基水杨酸预处理以破坏和沉淀蛋白质和其他大分子，这将有助于Mn从键态释放到游离态。根据NMPA的数据，极谱法测定的血液中Mn 2+的正常范围分别为0.029–1.2μM和ICP-AES 的正常范围为0.06-0.38μM。
将所有血液样品收集在未肝素化的试管中，使其在室温下凝结2小时，然后以1500x g离心10分钟。从凝固的血液中吸收血清样品，并保存在-80°C下。根据制造商的说明，通过基于LEGENDplex珠的免疫分析法（BioLegend，圣地亚哥，美国）分析血清细胞因子和趋化因子。使用人类CD8 / NK面板（740267，Biolegend）同时定量13种血清细胞因子/趋化因子，包括IL-2、4、6、10、17A，IFNγ，TNFα，可溶性Fas（sFas），可溶性FasL（sFasL） ，颗粒酶A，颗粒酶B，穿孔素和颗粒溶素。人类抗病毒反应小组（740349，Biolegend）用于分析11种人类血清炎性细胞因子/趋化因子，包括IFN-α，β，γ，IL-1β，6、8、10、12，TNFα，IP-10和GM -CSF。™数据分析软件（BioLegend）。
学生的t检验用于分析数据。比较的两组用方括号标记。使用Mantel-Cox检验比较生存曲线。对于条形图，显示了至少三个独立实验的一个代表性实验，每个实验一式三份进行。采用描述性统计和Wilson方法总结有反应的患者比例，并分别计算95％CI。通过配对t检验检测治疗周期之间的差异。除非另有说明，否则所有统计分析均在SPSS 25中进行。对于点图，每个点代表一个独立的生物学重复。数据显示为平均值±SEM（Ñ ≥3）。ns，不重要，P > 0.05；* P <0.05；** P <0.01；*** P <0.001；**** P <0.0001。
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