有明确的证据表明电离辐射（IR）会导致白血病。对于许多类型的白血病，由于DNA损伤和染色体易位的后果，白血病前融合基因（PFG）发生在子宫的造血干细胞和祖细胞（HSPC）中，并且可以在新生儿的脐带血（UCB）中检测到。但是，有关人类HSPC中辐射诱导的细胞凋亡，DNA损伤和PFG形成的信息相对有限。在这项研究中，我们发现CD34 + HSPC与淋巴细胞相比：（i）具有极强的抗辐射性，显示出凋亡的延迟时间动力学；（ii）积累的内源性DNA损伤水平较低/早期凋亡的γH2AX泛染细胞，（iii）具有更高水平的辐射诱导的53BP1和γH2AX/ 53BP1共定位DNA双链断裂，（iv）低剂量的IR后可能形成极低水平的BCR-ABL PFG。在CD34 + HSPC中，我们将CD34 + CD38 +祖细胞鉴定为高度抗凋亡的群体，而CD34 + CD38-造血干/多能祖细胞（HSC / MPP）是对辐射诱导的凋亡非常敏感的群体。我们的研究为人类HSPC在DNA损伤，细胞凋亡和PFG的背景下对IR的反应提供了重要的见解。
在过去的几十年中，对辐射诱导的致癌作用的认识有了长足的进步。白血病，即：（i）以造血干细胞和祖细胞（HSPC）异常增殖为特征，以及（ii）儿童1中最常见的癌症，是与电离辐射（IR）2相关的首批癌症之一。许多资料都来自原子弹爆炸幸存者，医疗，职业和环境暴露人群的流行病学研究3，4，5。
白血病发生和治疗的最重要的临床因素之一是存在白血病前融合基因（PFG）。PFG最频繁的是MLL-AF4，BCR-ABL，TEL-AML1和AML1-ETO 6。虽然很少有研究通过在不同细胞系和高剂量的电离辐射后辐射诱导的DNA损伤分析PFG的感应7，8，9，IR诱导PFG在HSPC的能力还没有被测试。值得注意的是，我们从脐带血PFG的筛选（UCB）的健康供体的样品10，11，也是其他科学团体12，13，14，PFG的发生率很高，从1％到5％不等。该值大大超过了PFG +白血病的发生率，并表明只有那些在特定的HSPC人群中出现的PFG，才可能在进一步的突变积累后导致明显的白血病10。到目前为止，只有少数研究比较分析细胞凋亡和DNA损伤在HSPC和淋巴细胞15，16，17，18，19和甚至更小相比，HSPC的不同群体的凋亡和DNA损伤应答15。
在这项研究中，我们检查了DNA损伤和UCB淋巴细胞以及CD34 + HSPC的不同亚群对IR的反应。同时，我们分析了IR对急性淋巴细胞白血病（ALL）和骨髓（AML）白血病中最常见的PFG的影响，特别是TEL-AML1，MLL-AF4，BCR-ABL和AML1-ETO。在此，我们根据之前发布的数据进行显示18HSPC的高抗凋亡性和晚期凋亡。我们将CD34 + CD38 +祖细胞鉴定为极抗药性细胞群，相反，CD34 + CD38- HSC / MPP为对内源性和辐射诱导的细胞凋亡非常敏感的种群。对γH2AX荧光/早期凋亡泛染细胞的分析证实，凋亡数据还显示，与淋巴细胞相比，HSC / MPP（CD34 + CD38-）和祖细胞（CD34 + CD38 +）的内源性DNA损伤水平更低。与淋巴细胞相比，我们还在CD34 + HSPC中检测到更高水平的辐射诱导的53BP1和53BP1 /γH2AXDNA修复灶。我们揭示了低剂量的IR后BCR-ABL PFG的诱导，而高剂量最有可能是无效的，这是由于凋亡消除了受损的PFG +细胞。
用于早期和晚期细胞凋亡的标准标记分别为Annexin-V和7AAD，用于分析照射后3 h和24 h UCB CD34-淋巴细胞和CD34 + HSPC的凋亡（图 1）。将多因素方差分析应用于在两个群体中获得的所有数据，我们发现UCB细胞的凋亡取决于照射后的剂量和时间（分别为p <0.000001和<0.000001）。此外，多因素方差分析显示膜标记物具有统计学意义（p <0.000001），表明HSPC和淋巴细胞的凋亡反应不同。
CD34-淋巴细胞和CD34 + HSPC中的凋亡。图中显示了照射后0、200、500和3,000 cGy剂量在不同时间点CD34淋巴细胞和CD34 + HSPC中活细胞的百分比。每个数据点显示至少3次独立实验和95％置信区间的平均值。
接下来，我们通过应用单变量方差分析分析了单独的细胞群CD34 +和CD34-中的数据。我们发现，从照射后3到24小时，活CD34-淋巴细胞的百分比显着下降（p <0.000001），而CD34 + HSPC却没有统计学上的显着下降（p = 0.09），表明这些细胞的放射敏感性较低。照射后3 h，在CD34-和CD34 +细胞中均未检测到剂量依赖性凋亡（分别为p = 0.1和0.9）。但是，在照射后24小时，我们检测到活CD34-淋巴细胞的剂量依赖性下降明显（p = 0.000001），而在CD34 + HSPC中也未见剂量依赖性（p = 0.17）。在用2 Gy，5 Gy，30 Gy照射后24小时观察到活CD34-细胞显着减少（分别为Fischer LSD，p = 0.00005，<0.000001，<0.000001），尽管只有30 Gy剂量会诱导CD34 +细胞凋亡（Fischer LSD，p = 0.015）。照射后3 h剂量为30 Gy，与CD34 +细胞相比，CD34-细胞显示出更高的凋亡（Fischer LSD，p = 0.04）。通常，在照射后24小时，无论照射剂量如何，CD34-细胞的凋亡均明显高于CD34 +细胞（0、2、5和30 Gy，Fischer LSD，p = 0.016、0.00002，<0.000001，<0.000001 ， 分别）。
因此，总的数据清楚地表明，与CD34-淋巴细胞相比，CD34 + HSPC对辐射具有极强的抵抗力，并且可能具有延迟的凋亡动力学。
在一组实验中进行了长达42h的照射后细胞凋亡时间动力学的更深入研究，其中使用适当的CD将照射的细胞进一步选入CD34 + CD38- HSC / MPP，CD34 + CD38 +祖细胞和CD34-淋巴细胞标记。除了高剂量的2 Gy外，在这些实验中，我们用10 cGy的剂量照射细胞，以评估低剂量IR诱导的细胞凋亡。HSC / MPP与祖细胞和淋巴细胞的比较表明，并非CD34 + HSPC的全部种群都能抵抗辐射诱导的凋亡（图 2，补充图1）。在包含最原始HSC的CD34 + CD38- HSC / MPP中检测到对辐射的敏感性更高（平均占整个CD34 + HSPC的9.1％）。与CD34 + CD38 +祖细胞相比，在用10 cGy和2 Gy剂量照射后18 h，HSC / MPP对凋亡过程的敏感性更高（相应地，Fischer LSD，p = 0.0003和0.000006），并且更加突出在42 h（方差分析，p <0.000001）。与祖细胞相比，HSC / MPP群体在18 h和42 h对内源性凋亡的敏感性也更高（Fisher LSD，分别为p = 0.0012和0.0000001）。同样，与淋巴细胞相比，HSC / MPP对内源性凋亡更敏感。确实，与假照射和10 cGy照射后42 h的淋巴细胞相比，HSC / MPP活细胞的百分比明显更低（Fischer LSD，p = 0.03，0.04）。10 cGy剂量在任何研究的细胞群体中均未在辐射后18 h和42 h诱导凋亡。因此，类似于假照射的细胞，在用10 cGy照射的样品中，凋亡主要是内源性的。另一方面，与2 Gy照射后18 h的淋巴细胞相比，HSC / MPP对辐射诱导的凋亡具有更高的抵抗力（Fischer LSD，p = 0.008）。由于42小时后HSC / MPP的内源性凋亡水平较高，因此2 Gy照射后42 h，HSC / MPP与淋巴细胞的辐射诱导凋亡没有差异。10 cGy剂量在任何研究的细胞群体中均未在辐射后18 h和42 h诱导凋亡。因此，类似于假照射的细胞，在用10 cGy照射的样品中，凋亡主要是内源性的。另一方面，与2 Gy照射后18 h的淋巴细胞相比，HSC / MPP对辐射诱导的凋亡具有更高的抵抗力（Fischer LSD，p = 0.008）。由于42小时后HSC / MPP的内源性凋亡水平较高，因此2 Gy照射后42 h，HSC / MPP与淋巴细胞的辐射诱导凋亡没有差异。10 cGy剂量在任何研究的细胞群体中均未在辐射后18 h和42 h诱导凋亡。因此，类似于假照射的细胞，在用10 cGy照射的样品中凋亡主要是内源性的。另一方面，与2 Gy照射后18 h的淋巴细胞相比，HSC / MPP对辐射诱导的凋亡具有更高的抵抗力（Fischer LSD，p = 0.008）。由于42小时后HSC / MPP的内源性凋亡水平较高，因此2 Gy照射后42 h，HSC / MPP与淋巴细胞的辐射诱导凋亡没有差异。与2 Gy照射后18 h的淋巴细胞相比，HSC / MPP对辐射诱导的凋亡具有更强的抵抗力（Fischer LSD，p = 0.008）。由于42 h后HSC / MPP的内源性凋亡水平相对较高，因此2 Gy照射42 h后HSC / MPP与淋巴细胞的辐射诱导凋亡无差异。与2 Gy照射后18 h的淋巴细胞相比，HSC / MPP对辐射诱导的凋亡具有更高的抵抗力（Fischer LSD，p = 0.008）。由于42 h后HSC / MPP的内源性凋亡水平相对较高，因此2 Gy照射后42 h，HSC / MPP与淋巴细胞的辐射诱导凋亡没有差异。
CD34 + CD38 +祖细胞和CD34 + CD38- HSC / MPP中的凋亡。图显示了在照射后0、10和200 cGy的不同时间点，CD34-淋巴细胞，CD34 + CD38 +祖细胞和CD34 + CD38-HSC / MPP中活细胞的百分比。显示了200 cGy的6个样本和10 cGy的3个样本的平均值和95％置信区间。
接下来，我们比较了CD34-淋巴细胞和CD34 + HSPC（补充图结果2）通过组合从HSC / MPP和祖细胞中示出的数据。 2与图中呈现的数据 1。两个实验组的结果非常一致，显示与CD34-淋巴细胞相比，CD34 + HSPC的内源性和辐射诱导的细胞凋亡更低。与第一组实验相同（图 1）），在以200 cGy的剂量照射和18 h和42 h较长的孵育时间（Fischer LSD，p = 0.000001和0.000001）后，发现较低的辐射诱导的CD34 + HSPC凋亡。此外，在CD34 + HSPC中，在0小时，18小时和42小时也观察到了较低的内源性凋亡（Fischer LSD，分别为p = 0.008、0.003和0.0002）。
获得的结果表明，在CD34 + HSPC和CD34-淋巴细胞之间观察到的凋亡反应差异（图 1，补充图2）18实际上是由祖细胞（图2）的更高抗性引起的（图2）。 CD34 + HSPC的百分比。
将新鲜的UCB单核细胞（MNC）免疫磁分离为CD34-淋巴细胞和CD34 + HSPC，然后用γ射线以0、10、50、100和200 cGy的剂量照射。照射后0.5小时分析了DNA修复灶（图 3）。我们观察到γH2AX和53BP1病灶的剂量依赖性增加，以及它们在CD34-和CD34 +细胞中的共定位（ANOVA，所有终点p <0.0000001）。内源性γH2AX，53BP1病灶的水平以及CD34-和CD34 +之间的共定位没有发现差异（Fisher LSD，p分别为0.93、0.88和0.97）。但是，我们发现与CD34-淋巴细胞相比，CD34 + HSPC中IR诱导的53BP1病灶和γH2AX/ 53BP1共定位水平升高（分别为ANOVA p = 0.0002和0.0005），而IR诱导的γH2AX病灶没有升高（ANOVA， p = 0.59）。与方差分析一致，Fisher LSD测试显示，在任何剂量的50、100和200 cGy下，与CD34-细胞相比，CD34 +中的γH2AX病灶水平均未升高（分别为p = 0.73、0.52、0.36和0.35）。 。相同的测试显示，在50、100和200 cGy的剂量下（分别分别为p = 0.008、0.0003和0.004）53BP1病灶水平较高，在100和200 cGy（p的剂量下）γH2AX/ 53BP1共定位较高（p分别为0.00047和0.00044）。因为H2AX组蛋白磷酸化和53BP1重新定位到DNA损伤位置的动力学可能不同参见图 20，我们还分析了共定位病灶中存在的γH2AX和53BP1病灶的百分比。在未辐射的CD34-细胞中，共定位的γH2AX和53BP1的百分比与CD34 +中的百分比相当（Fisher LSD，分别为p = 0.3和0.9），与γH2AX为0.23％，而53BP1为0.16％，而0.16％。在所有剂量的γ射线（10、50、100、200 cGy）下，在受辐照的CD34-细胞中共定位的53BP1病灶的百分比与CD34 +细胞（Fisher LSD，p = 0.66、0.16、0.82和0.11）相当从50 cGy剂量开始，与CD34-细胞相比，CD34 +细胞中γH2AX共定位灶的百分比略有增加（Fisher LSD，分别为p = 0.05、0.004、0.004和0.011）。我们的结果表明，CD34 + HSPC和CD34-淋巴细胞之间DNA损伤应答的信号传导途径有所不同，这可能是由于γH2AX和53BP1蛋白的时间动力学不同所致。
γ射线辐照后0.5 h ，γH2AX（A），53BP1（B）及其在CD34 +和CD34-细胞中的共定位γH2AX/ 53BP1（C）的剂量反应。显示平均值和95％置信区间。
总γH2AX荧光作为DNA双链断裂和早期凋亡γH2AX泛染色的细胞的量的指标21通过流式细胞术在CD34-分析淋巴细胞CD34 + CD38- HSC / MPP和CD34 + CD38 +祖细胞30分钟，2小时，在200 cGy的γ射线照射后18 h（图 4）。
γH2AX在不同HSPC群体和淋巴细胞中的荧光。用剂量为0（左图）和200的辐射在不同时间点通过流式细胞仪分析了HSC / MPP（CD34 + 38-），祖细胞（CD34 + 38 +）和淋巴细胞（CD34-）中γH2AX的总荧光cGy（右面板）。图中显示了3个独立实验的荧光平均值，置信区间为95％。
与我们以前发表的数据线11，18，在30分钟内源性荧光γH2AX用CD34-淋巴细胞（费希尔LSD，对分别= 0.004和0.004）相比，CD34 + CD38- HSC / MPP和CD34 + CD38 +祖细胞降低。在进一步培养细胞期间，这种差异消失了（图 4）。在所有时间点，CD34 + CD38- HSC / MPP和CD34 + CD38 +祖细胞之间的内源性γH2AX荧光水平也没有任何差异（Fisher LSD，p = 0.96、0.1和0.73）。
在所有辐照样品中，在所有三个细胞群（如淋巴细胞，HSC / MPP和祖细胞）中均发现了γH2AX荧光随时间的减少（ANOVA，分别为p = 0.04、0.005和0.006）。数据分析还显示，在30分钟，2小时和18小时时，暴露于IR的CD34-淋巴细胞比暴露于HSC / MPP或祖细胞的γH2AX荧光水平更高[Fisher LSD，（30分钟）p = 0.001或0.003， （2 h）0.002或0.001，（18 h）0.002或0.001]。在所有分析的时间点，HSC和祖细胞之间均未发现差异（Fisher LSD p分别为0.71、0.78和0.84）。
总而言之，我们的结果表明与CD34-淋巴细胞相比，CD34 + CD38- HSC / MPP和CD34 + CD38 +祖细胞中内源性和IR诱导的DNA损伤/早期凋亡的积累更低。连同我们对DSB的评估数据，该数据未证实与CD34 + HSPC相比，CD34-淋巴细胞中IR诱导的γH2AX病灶水平更高，这些结果进一步表明，暴露于IR的淋巴细胞中γH2AX荧光增加的原因是早期凋亡的γH2AX泛染细胞。
将新鲜收集并经过免疫磁分离的细胞暴露于2 Gy的γ射线中，并在照射后0分钟，30分钟，1小时，2小时和18小时通过中性和碱性彗星分析进行分析（图 5A，B）。通过两种方法（Fisher LSD，中性彗星：p = 0.00005、0.000002和碱性彗星：分别为p = 0.000001、0.00001），在CD34 +和CD34-细胞中照射后立即（0 h）观察到DNA损伤增加。在随后的时间点（30分钟，1小时，2小时，18小时），DNA损伤逐渐修复，最终降至内源水平。中性彗星试验揭示了CD34 +和CD34-细胞之间内源性和IR诱导的DNA损伤均无差异。但是，使用碱彗星测定法，我们发现CD34 + HSPC中内源性DNA损伤的水平显着降低（ANOVA，p = 0.002），这在0小时和30分钟时均观察到（Fisher LSD，p = 0.000008和0.04）。这些结果支持了γH2AX荧光和凋亡分析的数据（图 2和4）。）。照射后1小时和2小时，CD34 +细胞中较低的内源性DNA损伤并不明显（Fisher LSD，分别为p = 0.46和0.91）。考虑到通过碱性彗星试验评估的内源性DNA损伤，在两种细胞类型之间均未发现对辐射的反应差异（ANOVA，p = 0.43）。
通过彗星分析评估DNA损伤。照射后0 h，30 min，1 h和2 h分析DNA损伤。显示每个时间点的平均值和95％置信区间。（一）通过中性彗星实验，我们分析了来自15个先证者的样本。（B）其中，已选择7个先证者进行碱彗星试验的测试。
最后，结果显示，与CD34 + HSPC和CD34-淋巴细胞中辐射诱导的DNA损伤反应相同，通过中性彗星试验进行了分析。然而，通过碱性彗星试验在CD34 + HSPC中检测到较低水平的内源性DNA损伤。
使用RT-qPCR，我们分析了五组UCB样品对BCR-ABL，TEL-AML1，MLL-AF4和AML1-ETO PFG的诱导作用。由于冷冻保存的细胞数量不足，无法在单个实验中分析所有四个选定的PFG，因此形成了单独的组。如表1所示，仅测试了一些组的一个易位，其他组进行了2或3个易位。根据组的不同，将细胞暴露于10、50、200、500、1,000或3,000 cGy的γ射线。在照射后3小时和24小时分离RNA。每个细胞的RNA产量在0.17和5.34 pg之间变化（图 6）。我们没有看到剂量和时间对每个细胞的RNA产量有任何显着影响（ANOVA，分别为p = 0.11、0.23）。虽然RNA产量每细胞随照射时间的延长而略有下降，在总转录和凋亡之间未发现统计学上的显着相关性（R = 0.24，p = 0.06，Spearman）。RT-qPCR分析显示180份样本中有32份阳性样本（17.7％）。其中18份BCR-ABL阳性，2份TEL-AML1阳性和12份MLL-AF4 PFG阳性。我们没有观察到AML1-ETO融合基因的任何阳性信号。通过测序分析，我们排除了通过RT-qPCR获得的7个假阳性样品（5个BCR-ABL和2个MLL-AF4）（表1）。最终我们获得了BCR-ABL（43％）的13/30阳性样品，TEL-AML1（3.3％）的2/60，MLL-AF4（16％）的10/60和AML1-ETO的0/30（0 ％）。
辐照和未辐照的UCB样品的RNA产量。将样品暴露于0、10、50、200、500和3,000 cGyγ射线后3小时和24小时，用Nanodrop 1,000分光光度计测量RNA产量。在3和24小时时，分别从3个样本的0、10和50 cGy，6个样本的200和500 cGy以及从4个样本的3,000 cGy中显示平均值和95％置信区间。
虽然将所有5组合在一起观察到辐照样品中PFG发生率较高的一些趋势（表1），在5个被分析组中的任何一个或所有组中，辐照后的剂量和时间都不是诱导PFG的重要因素（ANOVA，p> 0.05）。在IR诱导的样品中，BCR-ABL的阳性率比假照射的对照组高2.25倍（9对4），但未发现剂量反应。MLL-AF4的阳性率从对照组的4轻微增加到受辐照样品的6，同时也没有观察到剂量反应。TEL-AML1的阳性率从未辐照对照的0增加到30 Gy辐照样品的2。至于低剂量和高剂量可能引起不同的反应，我们还分别分析了低剂量（≤50 cGy）和高剂量（≥200 cGy）。BCR-ABL阳性样品的数量从对照中的2个增加到低剂量照射样品中的6个（ANOVA，p = 0.021）。其他PFG在低剂量和高剂量下均未显示出统计学上的显着诱导作用。我们也没有看到阳性对照和阳性辐照样品之间的PFG拷贝数有任何差异，而与PFG的剂量和类型无关（T检验，p> 0.05）。总之，尽管获得的结果并未显示任何剂量依赖性的PFG诱导作用，但是它们提示BCR和ABL基因是响应IR形成PFG的最合适的伴侣，特别是在低剂量（10和50）下cGy。
在这项研究中，我们分析了暴露于电离辐射后UCB CD34 + HSPC和淋巴细胞的凋亡，DNA损伤和PFG诱导。
我们的结果表明，HSPC的凋亡延迟，主要是由于CD34 + CD38 +祖细胞（约CD34 + HSPC的90％）对内源性和辐射诱导的凋亡具有更高的抵抗力。这些结果与我们先前公布的研究部分一致的11，18，但本研究报告分别分析祖细胞和HSC / MPP进入更深的细节。此外，我们研究了在低剂量10和50 cGy以及延长孵育时间至42 h后的细胞凋亡。
Milyavsky等人的研究。第一个研究了CD34 + HSPC 15不同亚群中的凋亡过程。在这项研究中，IR辐射的HSC（Lin-CD34 + CD38-CD45RA-CD90 +）和MPP（Lin-CD34 + CD38-CD45RA-CD90-）群体的凋亡细胞比例显着高于辐照的祖细胞（Lin-CD34 + CD38 + ）。这些结果与我们的结果一致，表明对CD34 + CD38- HSC / MPP子集中的细胞凋亡具有高度敏感性。此外，我们的研究首次将HSC / MPP和祖细胞的凋亡与分化的淋巴细胞进行了比较。有趣的是，尽管HSC / MPP细胞对内源性凋亡的敏感性比淋巴细胞高，但它们并未显示出更高的放射敏感性。祖细胞对辐射诱导的和内源性细胞凋亡的这种抗性可能是由于抗凋亡蛋白的较高的表达22，23，24，25。即使仅在CD34 + HSPC上进行了上述基因表达研究，该结果对于祖细胞也可能是有效的，因为它们占CD34 +群体的大部分（约90％）。除了Milyavsky的研究和我们的研究之外，Kraft等 还分析了细胞凋亡，但是，他们比较了细胞周期激活的外周血（PB）HSPC和淋巴细胞 16。他们的结果显示，HSPC和淋巴细胞之间没有任何差异。此最终的不一致性可以通过细胞培养的不同条件所引起（即：（ⅰ）生长因子刺激与未刺激的细胞;（ⅱ）HSPC和淋巴细胞培养一起 VS分开）。
仅有少数报告提供了通过测量HSPC或其种群中DNA修复灶来处理DNA损伤反应的实验结果。我们的数据与其中一些研究的结果相关。Vandevoorde等。在UCB CD34 + HSPC和人类淋巴细胞的大部分，T淋巴细胞中定量共定位的γH2AX/ 53BP1病灶17。与我们的研究相似，他们发现与淋巴细胞相比，HSPC中共定位的γH2AX/ 53BP1病灶水平更高。卡夫（Kraft）等人。16观察到富含CD34 +的细胞中53BP1病灶水平升高，并且细胞周期激活的外周血（PB）HSPC和PB淋巴细胞之间的辐射诱导的γH2AX病灶水平没有差异。瓦西里耶夫（Vasilyev）等人辐照了含有HSPC大部分的CD133 + UCB细胞，观察到CD133 +细胞中53BP1病灶的水平更高，而正如我们的研究一样，γH2AX病灶的水平没有差异19。Milyavsky等。通过分析标记为HSC（Lin-CD34 + CD38-CD45RA-CD90 +），多能祖细胞（MPP）（Lin-CD34 + CD38-CD45RA-）的CD34 + HSPC的分选和亚序列照射人群的DNA损伤反应，进行了更详细的研究CD90-）和祖细胞（Lin-CD34 + CD38 +）15。与祖细胞相比，该组在HSC / MPP组合种群中观察到了更高水平的辐射诱导的γH2AX病灶，表明在更多原始细胞种群中DNA修复过程被延迟。还有一种出版物不支持Milyavsky等人的上述数据。但部分支持我们关于CD34 + HSPC和CD34-淋巴细胞之间差异的数据26。重要的是，这项研究表明，暴露于辐射后，CD34 + CD38-，CD34 + CD38 +和CD34-细胞中γH2AX病灶水平几乎相同的下降。
从上述所有论文中，彗星测定仅用于Milyavsky等人的研究。15。这些作者在15 Gy剂量后通过中性彗星测定法测量了DNA损伤。与祖细胞相比，HSC / MPP组合的DNA修复明显延迟。尽管我们使用了2 Gy的治疗剂量，但该结果与我们从中性彗星试验得到的结果不符。除此之外，Milyavsky等没有比较HSPC和淋巴细胞。15。
与当前的研究相似，卡夫等人。也通过流式细胞仪分析了γH2AX荧光。与我们通过相同方法获得的结果相反，他们发现与淋巴细胞相比，在细胞周期激活的HSPC中内源性和IR诱导的DNA损伤均未降低。我们假设在HSPC内源性损伤积累较低相比，在我们的实验淋巴细胞中CD34 +观察HSPC可占ROS水平较低27，28，29，30。在另一方面，我们不能排除在CD34 + HSPC降低内源性和IR诱导γH2AX荧光通过早期凋亡γH2AX泛染色的淋巴细胞比例高而引起的可能21，31。
在本研究的下一部分中，我们分析了单核UCB细胞中PFG的诱导。尽管在不同细胞系中高剂量的电离辐射（100戈瑞）的后几组显示PFG的感应7，8，9，PFG感应在低和治疗剂量后UCB细胞没有影响。Quina等人。据报道，在淋巴IM9细胞系9中，10 Gy的γ射线未诱导PML-RARα 。相对于PML-RARα，BCR-ABL，用更高的频率中检测到的RNA从HL60细胞中提取48小时后照射100 Gy的X射线的7，8。在KG1中以更高的频率观察到γ射线对AML1-ETO的诱导（25×10 –7）比HL60（5×10 –7）癌细胞系7。尽管对低剂量和高剂量的反应可能有所不同，但在上述研究中通常仅使用一剂辐射。我们首次研究了在宽剂量范围内照射后PFG的诱导。我们的研究集中在G0非增殖细胞上。因此，在不改变细胞特性（例如生长因子导致HSPC增殖）的情况下测试了IR的作用。即使我们观察到辐照样品中的PFG诱导，我们也检测到了对照样品中的PFG。最后，我们观察到与对照相比，低剂量照射的细胞中BCR-ABL PFG的增加非常低，但具有统计学意义。在高剂量时没有这种作用的可能原因是细胞凋亡的开始，通常在> 50 cGy的剂量下可见32。如上述对细胞系的研究所示，与对照相比，我们也没有揭示受辐照细胞中拷贝数的任何增加。可能的解释可能是我们的细胞处于G0期，并且此类细胞与PFG不会发生繁殖。因此，很容易推测在造血细胞中辐射诱导的PFG的进一步研究中应验证细胞周期刺激。
这项研究已获得布拉迪斯拉发儿童医院伦理委员会的批准，所有实验和方法均按照相关指南进行。所有UCB样本均已获得父母或法定监护人的知情同意，以参与研究。
如先前所述19从UCB中提取单核细胞，并在液氮中冷冻或新鲜使用。为了通过RT-qPCR分析PFG，γH2AX荧光和通过流式细胞仪检测凋亡，我们使用了冷冻细胞。基于我们先前研究的结果，选择了冷冻的MNC样品进行实验，这些样品通过RT-qPCR检测为阴性11。在37°C的水浴中将MNC快速融化后，在标准孵育条件下，在添加了10％FBS，100 IU / ml青霉素和100 µg / ml链霉素的RPMI培养基中孵育2小时，除去粘附的单核细胞。否则，为了通过荧光显微镜法定量DNA修复灶和通过彗星分析法进行DNA损伤反应，省略了冻融步骤，并使用CD34 MicroBead试剂盒（Miltenyi Biotec，Bergisch）将新鲜提取的UCB MNC免疫磁分离为CD34 + HSPC和CD34-淋巴细胞德国格拉德巴赫），然后进行辐照。
使用THERATRON Elite 80（MDS Nordion，加拿大渥太华），以0.35 Gy / min的剂量率将细胞以γ射线辐照在冰上。在辐照期间，将细胞置于浓度为2×10 6个细胞/ ml和2.5–3×10的显微镜载玻片（TPP，瑞士）或显微镜载玻片上以进行彗星测定（ThermoShandon，Pittsburg，PA，美国）。每张幻灯片4格。在水浴中将照射的细胞短暂加热至37°C，然后在CO 2培养箱中于37°C 孵育直至分析。假照射的对照细胞同时进行与照射的相同的操作。
辐照后（3、24或48 h）在不同时间点收获MNC，离心分离100 g / 10 min，在PBS中洗涤并重悬于100 µl Annexin试剂盒缓冲液（Roche，巴塞尔，瑞士）中，并分析流式细胞仪检测细胞凋亡 抗人CD45-V450抗体1:50（100 µg / ml，BD biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）用于区分核细胞和红细胞，而抗人CD34-APC抗体1:20（Miltenyi Biotec）用于门控HSPC。在细胞凋亡实验的第二部分中，抗人CD19-AmCyan抗体1:15（25 µg / ml，BD biosciences）用于指定B细胞前体，抗人CD38-PE-Cy7抗体1:20（25 µg） / ml，BD biosciences）以鉴定CD34 + CD38 +祖细胞和CD34 + CD38- HSC / MPP。Annexin-V（BD biosciences）和7AAD（BD biosciences）分别用于分析凋亡和晚期凋亡/坏死细胞（LAN）。Annexin-V染色呈阳性，而7-AAD呈阴性的细胞群被门控为凋亡。LAN细胞的膜联蛋白和7-AAD均为阳性（补充图）3）。将细胞与特异性抗体孵育30分钟。所有数据均使用FACSCanto II细胞计数器（BD biosciences）进行采集，并使用FACSDiva 6.0软件（BD biosciences）进行分析。测量了大约5×10 5个 CD45 + MNC细胞，其中部分0.5–2％（≈500个细胞）占CD34 + HSPC。CD34 + CD38 +祖细胞约占CD34 + HSPC细胞的90％，而10％则是富含造血干细胞（HSC）的CD34 + CD38-群体。
基本上按照先前的描述处理用于DNA修复灶计数的样品21。将每个样品铺展并在两个微观细胞载玻片上进行分析。每个场上约有20万个细胞被细胞纺丝。一抗混合物由1：800稀释的53BP1多克隆/兔抗体和1：400稀释的γH2AX单克隆/小鼠抗体（均来自Novus bios）组成。二抗混合物由1：200的Alexa Fluor 488 IgG（H1L）抗兔抗体和1：200的Alexa Fluor 555 IgG（H1L）抗小鼠抗体组成（生命技术，分子探针，Eugene或OR）。免疫染色后，将Vectashield固定介质（Vector Laboratories，英国Peterborough）滴在显微镜下的细胞玻片上，并用半透明指甲油密封盖玻片（Menzel-Gläser，德国）。使用Metafer幻灯片扫描系统3.6（MetaSystems GmbH，4）。采集的主要参数是物镜放大倍率63x，聚焦平面数11和聚焦平面距离28/40 µm。对于每个曝光条件下250个细胞的图像分析，我们使用了JCountPro软件，如先前所述33。
在DNA断裂，包括表达整个核γH2AX染色细胞的地方γH2AX荧光（所谓的γH2AX泛染色）21，34使用流式细胞仪测量。照射后0.5、2和18小时收获约300万个细胞。将细胞以150 g离心10分钟。然后将细胞沉淀重悬于1 ml PBS中的4％多聚甲醛中，并在室温下孵育10分钟。孵育后，将3 ml PBS添加到样品中，并以15分钟/ 150 g的速度再次离心。然后将500 µl 70％乙醇缓慢加入细胞沉淀，并孵育30分钟。首先使用含1％BSA和0.1％Triton X-100的PBS缓冲溶液在冰上将细胞复水，然后在100 µl PBS中用特异性抗体染色。为了分析γH2AX的荧光发射，使用浓度为1:15的抗γH2AX-AlexaFluor 488共轭物（BD生物科学公司）。为了区分不同的细胞群，抗人CD45-V450 1：50，CD34-APC 1:15和CD38-Pe-Cy7 1：使用了20（BD生物科学）。最后，将细胞重悬于200 µl PBS中，并使用FACS Canto II（BD biosciences）流式细胞仪分析γH2AX荧光。
DNA损伤反应是通过碱性35和中性单细胞凝胶电泳（SCGE）36并行检测的，也称为彗星试验。简而言之，将先证者细胞在溶于PBS的0.75％LMP琼脂糖中的悬浮液铺展到预先涂有1％NMP琼脂糖的显微镜载玻片上。将约25,000个细胞放在载玻片上。辐照后，将细胞在4°C的缓冲液中溶解1小时，该缓冲液由2.5 M NaCl，0.1 M Na 2 EDTA，10 mM Tris-HCl和1％Triton X-100组成，pH = 10。将载玻片放在电泳盒中，以在电泳溶液（0.3 M NaOH和1 mM Na 2EDTA，pH≥13）。电泳在4°C的温度下以0.73 V / cm的电压进行30分钟，伴随的电流为〜300 mA。然后将玻片在0.4 M Tris-HCl中中和，沥干，用5 µg / ml溴化乙锭（EtBr）染色，并盖上盖玻片。在中性彗星试验中，在补充了2％肌氨酸的碱性裂解液中进行裂解。在由0.1 M Tris–HCl和0.3 M钠组成的电泳缓冲液中进行展开（在4°C下20分钟）和电泳（在0.41 V / cm电压下60分钟，伴随的安培数为〜50 mA）的电泳步骤。在pH值为9的条件下，每个前证人至少用一百个EtBr染色的类核苷酸在Carl Zeiss AxioImager.Z2荧光显微镜下使用计算机图像分析Metafer 5（MetaSystems GmbH，5）。尾巴和尾矩中的DNA百分比分别用作测量碱性和中性SCGE中DNA损伤的参数。
总RNA利用在3小时和24小时后从照射10万个细胞的制造商推荐的标准协议与RNAzol（研究分子中心，俄亥俄，美国）分离10。RNA产量通过Nanodrop（Thermo Scientific，St.Leon-Rot，德国）测量。按照制造商的操作规程（Thermo Scientific），通过在标准反应中含有1–3μg总RNA的标准RNA的逆转录合成cDNA，然后将其用作RT-qPCR的模板。
如先前所述进行RT-qPCR 10。简而言之，RT-qPCR包含2 µl cDNA（相当于150 ng RNA），每个引物300 nM（VBC-Biotech，维也纳，奥地利），200 nM探针（5'-荧光团是FAM，3'-猝灭剂是BHQ1；（ Merck，Darmstadt，德国）和Solis BioDyne（爱沙尼亚塔尔图）的HOT FIREPol Probe qPCR混合物。具有单个融合基因的质粒标准品由Ipsogen（Qiagen，Marseille，France）合成。RT-qPCR的方案，引物和探针是根据Gabert等设计的。37。RT-qPCR在BioRad CFX96仪器上进行。如果三个测试管中至少有一个为阳性，则所有样品均重复三次，并视为阳性。
RT-qPCR产物的测序如我们先前所述11进行。简而言之，将RT-qPCR产物用Exo / Sap（Affymetrix，加利福尼亚，美国）消化，以除去所有污染性引物，TaqMan探针和dNTP。首先使用包含限制性酶切位点的引物在标准PCR中将RT-qPCR产物重新扩增，从而将PCR产物定向亚克隆到测序载体pUC18中。在亚克隆步骤和感受态细胞DH5α（RbCl +）的转化之后，分离重组质粒DNA，并使用载体的测序引物在测序反应中用作模板。
统计分析通过Statistica 8.0软件（Dell软件，Round Rock，德克萨斯州，美国）进行。通过Fisher LSD的ANOVA或t检验对数据进行分析，认为结果在p <0.05时有显着差异。通过Spearman相关检验分析PFG阳性，凋亡或RNA产量之间的相关性。如果p值小于1×10 –6，我们将p值显示为p <0.000001，在其他情况下，我们提供了准确的数字。
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