左室舒张功能障碍（LVDD）和射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）是糖尿病（DM）后的微循环缺陷。与糖尿病男性相比，糖尿病女性中无法识别的HFpEF更为普遍，因此需要针对性别的诊断策略。以前，我们在患有微血管损伤的DM患者中证实了血浆miR的改变[由血浆血管生成素2（Ang-2）水平升高定义]。这项研究假设在患有LVDD或HFpEF的糖尿病（女性）患者中，血浆miR和Ang-2存在性别差异。经过初步研究后，我们评估了LVDD（n = 122），对照组（n = 244）和女性糖尿病患者（n = 10）的16种血浆miR。随后，我们在这些miR中选择并测量了血浆miR-34a，糖尿病HFpEF患者（n = 53）和对照组（n = 52）的-224和-452。在LVDD患者中，miR-34a与Ang-2水平相关（R2 0.04，R = 0.21，p = 0.001，95％CI 0.103-0.312），DM患者的血浆水平降低，而eGFR <60 ml / min和LVDD的女性的miR-34a水平较低，-与没有eGFR <60 ml / min而没有LVDD的女性相比，则为224和-452。与男性相比，在糖尿病HFpEF妇女（n = 28）中，血浆Ang-2水平和位于X染色体上的miR-224 / 452簇增加。我们得出的结论是，血浆miR-34a，-224和-452与微血管损伤标记物Ang-2相关联，并且特别针对LVDD或HFpEF的女性。
保留射血分数（HFpEF）的心力衰竭及其前体左心室舒张功能障碍（LVDD）是糖尿病患者1微血管损伤的表现。该患者人群中微血管损伤的病理生理与更多的住院和心血管死亡2相关。特别是女性与2型糖尿病（DM）具有HFPEF的发病率较高的男性相比（28％对18.4％），这往往保持未确诊的，直到疾病的晚期阶段3，4，5，6，7。因此，开发针对女性的适当诊断策略的需求至关重要，因此评估血浆microRNA（miR）水平可以改善2型DM后HFpEF及其前体LVDD的检测。
以前，我们证明了糖尿病性肾病患者（男女）血浆中循环血管生成miR的精选子集（包括miR-126，miR-130b，miR-223和miR-660）增加，并且与微血管相关血管紧张素2的血浆水平升高所定义的伤害8。另外，我们在文献综述中证明，男女之间（血浆）miRs的差异表达至少涉及两个潜在机制：（1）由于不完全的X染色体失活和（2）miR转录和加工的雌激素调节9。已经建立了内皮X-连锁的miRs的增强表达来引发微循环缺陷9虽然这些miR的较高血浆水平先前已显示出可识别患有其他心血管疾病表型（如特发性心房颤动（iAF））的女性的微血管损伤10。
本研究假设在HFpEF及其前体LVDD的（女性）患者中（尤其是在糖尿病患者中）性别特异性血浆miRs差异表达，并与微血管损伤相关（由血浆Ang-2水平升高定义）（图。 1 A）。为了测试这一点，我们评估了血浆Ang-2（一种酪氨酸蛋白激酶（TIE-2）受体配体，可促进内皮激活和不稳定）和位于（糖尿病）LVDD和（糖尿病）中的16个X染色体候选X染色体（X连锁）。糖尿病）HFpEF患者。此外，我们对血浆Ang-2和miR水平结果进行了性别特异性分层，并进行了逻辑回归分析，以评估哪些临床特征与显着差异表达的血浆miR相关。
研究的假设和工作流程。（A）这项研究假设，在LVDD和HFpEF的（女性）患者中，性别特异性血浆miR（源自X染色体）差异表达，并与微血管损伤相关（定义为血浆Ang-2水平升高）。（乙）在该研究中的工作流，我们测量血浆血管生成素-2，以前发现关联与Ang-2的（参考文献X-染色体位于的miR和miR的8，10，12）来自无症状LVDD（n = 13）的女性患者的血浆中。接下来，我们测量了LVDD（n = 122）患者与对照组（n = 244）相比的这些miR。随后，根据结果分析，我们选择了miR-34a。-224和-452并测量了HFpEF患者（n = 52）与其各自对照组（n = 53）相比的血浆水平。
补充表1显示了先兆子痫和无症状LVDD史（n = 13）与健康对照（n = 14）相比的患者的临床特征。与健康的产妇对照相比，无症状LVDD的女性二尖瓣早期充盈峰值速度（E）与舒张二尖瓣早期环速（E'）（E / E'之比）较高，左心室容积指数（LAVI）较高。
表1显示了来自HELPFul队列的LVDD糖尿病患者（n = 12）的临床特征，其中包括LVDD患者（补充表2）。HELPFul队列是一项正在进行的病例队列研究，在荷兰心脏病门诊进行，纳入年龄在45岁以上且无心血管疾病史的患者，这些患者被全科医生转介进行心脏评估11。与没有LVDD的女性相比，具有LVDD的女性（n = 10）的收缩压和舒张压更高（表1）。
表2显示了DM患者HFpEF的临床特征（n = 53）。HFpEF妇女（n = 28）比HFpEF男性（n = 27）具有更高的E / e'比，而HFpEF男性具有较高的LAVI和较高的循环脑钠肽（BNP）血浆水平。
我们进行了一项初步研究，以选择候选血浆miRs用于LVDD和HFpEF患者的血浆分析。在这项研究中，我们评估了健康女性和男性（n = 6）中（1）118个X染色体定位的miR的血浆水平（补充表3）。在差异表达的miR中，我们选择了X连锁的miR-660在无症状LVDD和LVDD患者中进行进一步分析（图 1B）。
此外，基于我们先前发表的关于糖尿病性肾病中血浆miRs与微血管损伤的相关性8，特发性心房颤动10和肾脏移植排斥12的研究，以及与血管生成或X连锁相关的miRs文献综述。起源，我们在第二项初步研究中选择了以下miR进行分析：miR-20a，miR-21，miR-26b，miR-34a，miR-92a，miR-125a，miR-126，miR-143，miR-193a ，miR-221，miR-223，miR-224，miR-345，miR-452（参考可在补充表4中找到）。
在第二项先导研究中，与健康对照组（n = 14）相比，在先兆子痫和无症状LVDD病史（n = 13，补充表1中的临床特征）的女性血浆中测定了上述miRs，可能与舒张功能障碍有关。我们观察到， 在无症状LVDD的女性中，与正常人相比，在测量的miR中，只有血浆miR-224水平（FC 1.5，p = 0.03，95％CI 0.095–0.598）增加（补充表5和补充图1 A）。副控制。
接下来，考虑到先兆子痫病史的妇女发生微血管损伤和心力衰竭的风险增加13，我们评估了先兆子痫和无症状LVDD的妇女是否确实与微血管损伤相关。在此程度上，我们测量了先兆子痫和无症状LVDD的女性血浆中微血管损伤的标志物（n = 13，补充表1）与健康对照组（n = 14）相比，我们对Ang-2的评估，可溶性血运调节蛋白（sTM）和可溶性fms样酪氨酸激酶1（sFlt-1）显示，患有先兆子痫和无症状LVDD的女性仅血浆Ang-2水平较高（倍数变化（FC）1.4，p = 0.02，95％CI 230.5–1,084）（补充表5和补充图1B）。
最后，我们评估了微血管损伤标志物（Ang-2，sTM，sFflt-1）与血浆miR之间的关联，并观察到了Ang-2和miR-34a的中等正关联（R = 0.36，FDR调整后的p = 0.02）， -224（R = 0.32，FDR调整p = 0.03）和miR-452（R = 0.39，FDR调整p = 0.01）。对于sTM和miR-125a（R = − 0.38，FDR调整p = 0.01），-126（R = − 0.30，FDR调整p = 0.04）和miR-143（R = − 0.39，FDR调整p = 0.01）（补充图1 C）。
在确定无症状LVDD妇女血浆miR-224和Ang-2的差异表达后，我们接下来的目的是调查LVDD患者（补充表2的临床特征）是否也升高了血浆miRs和Ang-2水平。但是，我们观察到LVDD患者（n = 122）与健康对照组（n = 244）相比，血浆miRs和Ang-2差异不明显（数据未显示）。接下来，我们评估了LVDD患者血浆miRs与Ang-2之间的潜在关联。有趣的是，在整个LVDD和对照患者队列中，我们发现miR-34a与Ang-2血浆水平相关（R 2 0.04，R = 0.21，p = 0.001，95％CI 0.103-0.312，图 2一个）。
与对照相比，（女性）DM患者的LVDD血浆Ang-2水平和循环miR-34a，-224和-452。（A）特别是miR-34a在LVDD患者的总患者群中与Ang-2呈显着相关性（N = 366，R 2 0.04，R = 0.21，p = 0.001，95％CI 0.103-0.312）。（B）与没有LVDD的糖尿病患者相比，患有LVDD的糖尿病患者的miR-34a水平较低（倍数变化1.2，p = 0.02，95％CI-0.428至0.117）。（C）eGFR <60 ml / min和LVDD的女性与没有LVDD的女性相比，miR-34a水平较低（倍数变化1.9，p = 0.03，CI-0.737至-0.030）。（D）与没有LVDD的女性相比，eGFR <60 ml / min和LVDD的女性血浆miR-224降低（倍数变化1.8，p = 0.04，CI − 1.998至− 0.059），（E）患有mGFR的女性血浆miR -452降低与没有LVDD的女性相比，eGFR <60 ml / min和LVDD（倍数变化1.5，p = 0.04，CI-1.213至-0.039）。相对的miR-表达值标准化为等离子体的miR-16的水平，表示为平均值（SEM）的平均值±标准误差和组间差异被描绘为* p ≤0.05。使用Spearman等级相关性计算变量之间的相关性。
（女性）DM HFpEF患者的血浆Ang-2水平和血浆miR-34a，-224和-452。（A） 与没有HFpEF的糖尿病女性相比，有HFpEF的糖尿病女性血浆Ang-2 水平升高（倍数变化1.3，p = 0.02，95％CI 110.5–980.9）（与没有HFpEF的糖尿病男性相比，糖尿病HFpEF男性则没有） ，（B）miR-34a与没有HFpEF的糖尿病妇女相比，有HFpEF的糖尿病妇女有增加的趋势（倍数变化1.5，p = 0.08，95％CI − 0.009至0.173）。（C）miR-224（血浆变化0.57，p = 0.04，95％CI − 0.452至− 0.010）和（D）miR-452（血浆变化0.58，p）增加 = HFpEF的糖尿病女性与HFpEF的糖尿病男性相比= 0.05，− 0.539至− 0.002）。相对miR表达值被归一化到等离子体的miR-16的水平，表示为平均值（SEM）的平均值±标准误差和组间差异被描绘为* p 根据学生T-检验≤0.05。
随后，我们进行了线性回归分析，以评估哪些临床特征决定了LVDD患者的血浆miR-34a。该分析（表3）确定，特别是性别（β= − 0.160，p值= 0.002）和DM的存在（β= 0.121，p值= 0.02）是这种关系的统计学显着决定因素，而eGFR <60 ml /尽管不显着（min =β=-0.101，p值= 0.09），min仍显示出趋向于关联的趋势。鉴于DM的存在是血浆miR-34a的重要决定因素，我们评估了有或没有LVDD的糖尿病患者血浆miR-34a的水平（表1），发现患有LVDD的糖尿病患者的miR-34a血浆水平显着低于没有LVDD的糖尿病患者（FC 1.23，p = 0.02，95％CI-0.428至0.117，图 2 B）。
在我们对无症状LVDD妇女的初步研究中，我们观察到血浆Ang-2与miR-224和-452之间存在显着相关性。因此，我们使用线性回归分析（表3）来研究性别是否可以确定LVDD患者的血浆miR-34a，-224和-452水平。我们发现性别对于miR-34a（β= − 0.160，p = 0.002），miR-224（β= 0.145，p = 0.002）和miR-452（β= 0.165，p = 0.007）。有趣的是，线性回归分析还表明，eGFR <60 ml / min表现出（非显着）趋势，可作为血浆miR-34a的决定因素（β= − 0.101，p = 0.09），而eGFR <60 ml / min无法确定血浆miR-224（p = 0.58）或miR-452（p = 0.11）。
随后，我们评估了eGFR <60 ml / min伴或不伴LVDD的患者中这些miR的差异表达（补充表6的临床特征）。分析结果表明，特别是eVDD≤60 ml / min的LVDD 女性患者min显示较低水平的miR-34a（FC 1.9，p = 0.03，CI-0.737至-0.030，图 2 C），miR-224（FC 1.8，p = 0.04，CI-1.998至-0.059，图 2 D）和miR-452（FC 1.5，p = 0.04，CI − 1.213至− 0.039，图 2 E）与eGFR <60 ml / min而无LVDD的女性患者相比。
接下来，我们假设在糖尿病的情况下，从LVDD到HFpEF的表型进展可能与明显的微血管损伤和Ang-2水平升高有关。为此，我们测量了患有HFpEF的DM患者的血浆Ang-2水平（表2，n = 53）。在这里，我们观察到与没有 HFpEF的糖尿病妇女相比，患有HFpEF的糖尿病妇女的血浆Ang-2水平（FC 1.3，p= 0.02，95％CI 110.5–980.9，图 2 A）增加（n = 28）。 = 27）。
接下来，我们根据初步研究结果选择了miR-34a，-224和-452，并比较了HFpEF的DM患者和非HFpEF的DM患者的血浆水平。与没有HFpEF的糖尿病患者（n = 52）相比，有HFpEF的糖尿病患者（男女）（n = 53），我们观察到miR-224和-452水平无显着差异（数据未显示）。但是，与没有HFpEF的糖尿病女性（n = 27，FC 1.5，p = 0.08、95％CI − 0.009至0.173，相比，没有HFpEF的糖尿病女性），miR-34a的血浆水平显示有增加的趋势图 2B）。此外，当将HFpEF的女性（n = 28）与HFpEF的男性（n = 27）进行比较时，miR-224的血浆水平（FC 0.57，p = 0.04，95％CI-0.452至-0.010，图）。 2C）和miR-452（FC 0.58，p = 0.05，− 0.539至− 0.002，图 2 D）在患有HFpEF的女性中明显高于男性。
在这项研究中，我们的主要发现是（1）LVDD糖尿病患者和eGFR <60 ml / min的女性糖尿病患者miR-34a，-224和-452的水平降低，但是血浆miR-224和miR-患有HFpEF的糖尿病女性与患有HFpEF的糖尿病男性相比为452；（2）回归分析表明，LVDD患者的性别，DM和肾功能不全与血浆miR-34a水平有关；（3）患有HFpEF的糖尿病女性血浆Ang-2水平升高，而患有HFpEF的糖尿病男性血浆Ang-2水平却没有升高。
MiRs广泛参与2型DM 14术后微血管损伤的表现。在HFpEF的情况下，X连锁的miR-545-5p将HFpEF患者与健康对照者15区别开来，而X连锁的miR-221将HFpEF患者与射血分数降低（HFrEF）的心力衰竭患者区别开来16。尽管如此，对这些miR表达结果的统计分析并未针对男女进行分层，并且所确定的miR与微血管损伤所涉及的分子途径无关17。在这项研究中，患有LVDD的糖尿病患者血浆miR-34a水平降低，而患有LVDD和eGFR <60 ml / min的糖尿病女性血浆miR-34a，-224和-452降低。相反，患有糖尿病的HFpEF妇女与男性相比，miR-34a升高（尽管不显着），而患有糖尿病的HFpEF妇女miR-224和-452升高。血浆miR-34a水平的这种二分式结果可能表明在不同的舒张功能障碍表型中血浆miR释放的不同病理生理机制。先前在患有主动脉瓣狭窄患者的心肌细胞重塑不同阶段后的血浆miRs中证实了这一点18。这也可能表明，舒张功能障碍的不同阶段改变了血浆载体（例如高密度脂蛋白（HDL），细胞外囊泡和血浆Argonaute-2蛋白质）之间循环miR的分布，就像我们先前从DM向糖尿病性肾病的表型发展之后所证明的那样19。因此，代替总血浆miRs的绝对绝对数量，这些载体之间miRs分布的特定差异可能为这种二分趋势及其与舒张功能障碍中微血管损伤的关系提供更好的解释。尽管如此，本研究的回归分析仍发现，在LVDD患者中，性别是血浆miR-34a的统计学显着决定因素。这可能可以解释观察到的女性与男性HFpEF相比增加的情况，并暗示与先前针对miR-34a显示的相似的性别特异性血浆表达模式20。尽管如此，也很可能是LVDD（n = 10）的糖尿病女性的小样本量导致了他血浆miRs的差异表达。因此，还需要其他功能强大的研究来研究舒张功能障碍不同阶段血浆miR趋势的性别差异。
在这项研究中，我们观察到无症状LVDD的妇女以及患有HFpEF的糖尿病妇女的血浆Ang-2水平较高，这一发现在患有LVDD的糖尿病妇女中不存在。同样，这可能与LVDD（n = 10）的糖尿病女性队列规模相对较小有关。尽管如此，在LVDD患者和对照组的总队列中，血浆Ang-2水平较高（n = 366）与miR-34a适度相关，这可能表明该标志物与这些LVDD患者的微血管损伤可能相关。较高的血浆Ang-2的水平，表明在HFPEF女性微血管损伤的关联，与研究相一致，即表明冠状动脉微血管功能障碍是在HFPEF女性特定病理生理学21，22。此外，与HFpEF男性相比，HFpEF女性的血浆中miR-224和-452明显更高。两个miR的X染色体起源很可能仅与女性的差异表达有关。先前我们曾回顾过，特别是X染色体上的miRs会引发微血管损伤表型，这可以解释为什么HFpEF妇女的两个miRs都更高，同时微血管损伤标记物Ang-2 9的水平也更高。但是，必须进行其他验证研究才能评估这种潜力。
在这项研究中确定的血浆miRs中，miR-34a主要由脂肪细胞分泌，并促进全身性炎症状态23。有趣的是，该miR在女性中具有完善的心肌功能，因为先前发现在心肌肥大的鼠模型中用miR-34a进行定向心肌治疗可减少雌性小鼠的心脏纤维化并改善心脏收缩性24。该特定miR对性别特异性下游影响的更多证据来自以下事实，即它调节长非编码RNA X非活性特异性转录本（XIST）的表达，该转录本调节女性细胞中X染色体的失活25。在下调XIST（通常介导X染色体失活）的表达时，miR-34a可以增加位于X染色体上染色体簇上的miR-224和-452的表达（来源miRBase 22版）。 。在X连锁的miR-224 / 452簇中（也主要在脂肪组织中表达26），在我们的无症状LVDD妇女（补充图1 A）和患有HFpEF与HFpEF的糖尿病妇女的初步研究中，miR-224增加糖尿病男性，而eGFR <60 ml / min且存在LVDD的女性，两种miR均降低（图 2 D，E）。关于miR-224，已知该miR可调节脂肪细胞分化27，炎症28和（微）血管静止或激活29。miR-452在新陈代谢和炎症中也有作用，因为高血糖调节miR-452的表达30，而其脂肪细胞特异性的降低则激活TNF-α诱导的炎症反应31。但是，还需要更多的研究来研究这些miR是否能精确指出患有LVDD或HFpEF的糖尿病女性的脂肪细胞功能障碍是微血管损伤的共同原因。
在这项研究中，我们测量了Ang-2作为HFpEF和LVDD患者微血管损伤的标志物。但是，Ang-2是单一蛋白质生物标记，可能无法捕获患者人群中的（微血管）疾病变异性。因此，需要更多的研究来评估内皮和微血管功能的其他参数，以确认从LVDD到HFpEF的表型发展过程中是否存在微血管损伤。或者，对循环性非编码RNA和其他蛋白质生物标记物的比较分析可能会在全身性炎症引起的微血管损伤表型后，在内皮细胞和心肌细胞水平上更好地捕获不同的分子特征。这种比较分析的一种有趣方法是测量miR-224 / 452簇和Pentraxin-3，32，在冠状动脉微循环中产生，HFpEF患者 33左心室（LV）舒张功能障碍发生改变。通过增加可调节心脏收缩功能的miR-34a的测量值 34及其促纤维化并已知与HFpEF的心肌结构异常有关的基因靶标Bcl-2，可进一步加强这种方法 35。这可以阐明在这项研究中确定的血浆miRs是否确实将脂肪细胞功能障碍确定为HFpEF和LVDD患者（女性）的内皮功能障碍和微血管损伤的病理生理底物。
这项研究符合《赫尔辛基宣言》的道德原则，并经过马斯特里赫特大学医学中心（MUMC），乌得勒支大学医学中心（UMCU）和莱顿大学医学中心（LUMC）的机构审查委员会的批准。所有患者均提供书面知情同意书。
对具有先兆子痫（PE）病史的妇女在产后大约一年进行常规心血管功能评估。对于本研究，通过邮寄邀请那些至少产后4年的女性参加第二次随访心血管评估。根据国际妊娠高血压学会确定的标准诊断PE：在妊娠20周后，收缩压（SBP）≥140 mmHg和/或舒张压（DBP）≥90 mmHg。蛋白尿超过0.3克/天36。
“有心血管疾病风险的患者发现左心室舒张功能障碍和心力衰竭伴有射血分数的存在和发展的生物标志物”（HELPFul）的研究设计和程序已更详细地发表11。简而言之，HELPFul是一个荷兰病例队列，来自UMCU的患者参加了他们的全科医生转诊以进行诊断性心脏评估。曾接受过心脏干预或已知患有先天性心脏病的患者被排除在外。组织多普勒超声心动图显示早期舒张期充盈速度峰值（E）和舒张早期二尖瓣环速度峰值（e'）（间隔和外侧平均）（E / e'）≥8的患者LVDD的可能性。从所有年龄在45岁或以上的患者中随机抽取“队列”患者，力争纳入25％的合格参与者。收集有关合并症，病史和用药的信息。诊断检查还包括身体检查，标准心血管生物标志物，心电图（ECG），自行车运动心电图和经胸超声心动图的血液测试。结构化的病例记录表用于评估提示心脏病理的症状。高血压是由（1）自我报告，（2）使用降压药物或（3）门诊中心收缩压> 140 mmHg（至少两次测量）的平均值确定的。2型糖尿病是通过自我报告或使用降糖药确定的。高胆固醇血症是通过自我报告或使用降脂药物确定的。心房颤动是通过门诊患者心电图的自我报告或房颤确定的。体重指数（BMI）由体重（kg）除以以米（m 心电图（ECG），自行车运动心电图和经胸超声心动图。结构化的病例记录表用于评估提示心脏病理的症状。高血压是由（1）自我报告，（2）使用降压药或（3）门诊中心收缩压> 140 mmHg（至少两次测量）的平均值确定的。2型糖尿病是通过自我报告或使用降糖药确定的。高胆固醇血症是通过自我报告或使用降脂药确定的。心房颤动是通过门诊患者心电图的自我报告或房颤确定的。体重指数（BMI）由体重（kg）除以以米（m 心电图（ECG），自行车运动心电图和经胸超声心动图。结构化的病例记录表用于评估提示心脏病理的症状。高血压是由（1）自我报告，（2）使用降压药或（3）门诊中心收缩压> 140 mmHg（至少两次测量）的平均值确定的。2型糖尿病是通过自我报告或使用降糖药确定的。高胆固醇血症是通过自我报告或使用降脂药物确定的。心房颤动是通过门诊患者心电图的自我报告或房颤确定的。体重指数（BMI）由体重（kg）除以以米（m 结构化的病例记录表用于评估提示心脏病理的症状。高血压是由（1）自我报告，（2）使用降压药物或（3）门诊中心收缩压> 140 mmHg（至少两次测量）的平均值确定的。2型糖尿病是通过自我报告或使用降糖药确定的。高胆固醇血症是通过自我报告或使用降脂药物确定的。心房颤动是通过门诊患者心电图的自我报告或房颤确定的。体重指数（BMI）由体重（kg）除以以米（m 结构化的病例记录表用于评估提示心脏病理的症状。高血压是由（1）自我报告，（2）使用降压药物或（3）门诊中心收缩压> 140 mmHg（至少两次测量）的平均值确定的。2型糖尿病是通过自我报告或使用降糖药确定的。高胆固醇血症是通过自我报告或使用降脂药物确定的。心房颤动是通过门诊患者心电图的自我报告或房颤确定的。体重指数（BMI）由体重（kg）除以以米（m 或（3）门诊中心的平均收缩压>至少140 mmHg（至少两次测量）。2型糖尿病是通过自我报告或使用降糖药确定的。高胆固醇血症是通过自我报告或使用降脂药确定的。心房颤动是通过门诊患者心电图的自我报告或房颤确定的。体重指数（BMI）由体重（kg）除以以米（m 或（3）门诊中心的平均收缩压>至少140 mmHg（至少两次测量）。2型糖尿病是通过自我报告或使用降糖药确定的。高胆固醇血症是通过自我报告或使用降脂药物确定的。心房颤动是通过门诊患者心电图的自我报告或房颤确定的。体重指数（BMI）由体重（kg）除以以米为单位的身高平方 心房颤动是通过门诊患者心电图的自我报告或房颤确定的。体重指数（BMI）由体重（kg）除以以米（m 心房颤动是通过门诊患者心电图的自我报告或房颤确定的。体重指数（BMI）由体重（kg）除以以米为单位的身高平方2）。腰围与臀围的比值是用腰围（cm）除以臀围（cm）来计算的。估计的肾小球滤过率（eGFR）由肌酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂-c用经过验证的CKD-EPI公式37计算得出。
UHFO-DM是来自UMCU的前瞻性诊断效率研究38。入选Etten-Leur初级保健诊断支持中心（SHL）糖尿病服务的60岁及2岁以上糖尿病患者。这是向全科医生注册的所有2型糖尿病患者的代表性样本。糖尿病服务的标准护理包括定期进行血清葡萄糖和HbA1c评估以及其他实验室参数和眼底镜检查的年度监测，以帮助全科医生管理糖尿病患者。此外，SHL为根据当前糖尿病指南工作的糖尿病护士的全科医生提供支持服务。该地区共有561位全科医生使用SHL的糖尿病服务，其中48位 175名2型糖尿病患者参加了SHL服务。SHL总共有100位护士从业人员为200多位糖尿病患者提供服务。在SHL糖尿病服务数据库中随机抽取了约1200名患者的样本，当居住在Goes的Oosterschelde医院的心脏病门诊部60公里以内时，他们被要求参加研究。为了防止重复调查，只要求已知心脏病专家确诊为心力衰竭的患者填写调查表。他们还被要求允许他们仔细检查他们的病历，以了解合并症和心力衰竭的诊断日期。SHL的100名护士从业人员为200多位糖尿病患者的全科医生（GP）提供支持。在SHL糖尿病服务数据库中随机抽取了约1200名患者的样本，当居住在Goes的Oosterschelde医院的心脏病门诊部60公里以内时，他们被要求参加研究。为防止重复调查，只要求已知心脏病专家确诊为心力衰竭的患者填写调查表。他们还被要求允许他们仔细检查他们的病历，以了解合并症和心力衰竭的诊断日期。SHL的100名护士从业人员为200多位糖尿病患者的全科医生（GP）提供支持。在SHL糖尿病服务数据库中随机抽取了约1200名患者的样本，当居住在Goes的Oosterschelde医院的心脏病门诊部60公里以内时，他们被要求参加研究。为防止重复调查，只要求已知心脏病专家确诊为心力衰竭的患者填写调查表。他们还被要求允许仔细检查他们的医疗档案是否存在合并症和心力衰竭的诊断日期。SHL糖尿病服务数据库中招募了200名患者，并且居住在Goes的Oosterschelde医院的心脏病门诊部内60公里以内时，要求他们参加研究。为防止重复调查，只要求已知心脏病专家确诊为心力衰竭的患者填写调查表。他们还被要求允许仔细检查他们的医疗档案是否存在合并症和心力衰竭的诊断日期。SHL糖尿病服务数据库中招募了200名患者，并且居住在Goes的Oosterschelde医院的心脏病门诊部内60公里以内时，要求他们参加研究。为防止重复调查，只要求已知心脏病专家确诊为心力衰竭的患者填写调查表。他们还被要求允许他们仔细检查他们的病历，以了解合并症和心力衰竭的诊断日期。
超声心动图测量如先前所述进行13，并根据美国超声心动图学会（ASE）39的建议进行。使用相控阵超声心动图多普勒系统（Vivid 7，GE Vingmed Ultrasound，挪威霍滕）进行超声心动图测量。左室舒张末期（LVEDd），收缩末期（LVESd）直径（mm），舒张末期室间隔厚度（IVST; mm）和后壁（下外侧）壁厚（PWT; mm）胸骨旁长轴视图 使用公式0.8×（1.04（（（LVEDd + PWT + IVST）3-（LVEDd）3））+ 0.6来确定左心室质量（LVM; g），以体表面积40为索引。相对壁厚（RWT）使用公式（2×PWT）/ LVEDd）40计算。使用Teichholz公式41确定左室舒张末期（LVEDV，mL）和收缩末期（LVESV，mL）的体积。心率（HR，bpm）通过心电图上五个连续RR间隔平均值的倒数乘以60来计算，而（（LVEDV – LVESV）/（LVEDV））×100用于计算左心室射血分数（LVEF ，％）。通过胸骨旁长轴视图中左心室流出道水平的VTI和收缩期中段横截面积（cm2）的乘积计算卒中量（SV，mL）。平均主动脉速度时间积分（VTI，cm）是通过平均左心室流出道速度的五个连续连续多普勒配准的外缘描迹来计算的。通过将SV乘以HR计算出心输出量（CO，L / min）。E / A比是早期（E）与晚期（A）心室充盈速度的比率，而E / E'是早期充盈（E）的二尖瓣峰值速度与早期舒张二尖瓣环速度（E'）的比率。 。早期使用组织多普勒（TD）e '）在二尖瓣环间隔和侧向插入时评估舒张速度。评估是使用EchoPAC PC SW（GE Vingmed Ultrasound）6.1.2版离线执行的。
根据美国心脏协会的指南42诊断为无症状LVDD（心力衰竭B期）。无症状的LVDD定义为存在先前的心肌梗塞，左心室肥大（左心室质量指数（LVMi）> 95 g / m 2），同心重塑（RWT> 0.42和LVMi≤95 g / m 2），轻度LVEF受损（ > 40％和<55％）或无症状的瓣膜病40。我们将无症状的瓣膜疾病定义为轻度主动脉瓣关闭不全或中央主动脉瓣关闭不全。在此亚临床阶段，射血分数（HFpEF）保持不变的HF被定义为LVEF≥55％，但出现了无症状LVDD 40的其他标准之一。
我们应用了由心脏病专家（RM，MJC，AT）和专门从事心力衰竭（FR）的全科医生组成的专家小组对LVDD进行共识诊断。这种方法相当于以前的研究43，44。专家组使用了所有可用的诊断信息，包括患者报告的症状，危险因素，心电图，超声心动图，运动测试结果，（心血管）药物使用情况和血浆B型钠尿（BNP）水平。该小组根据LVDD的可用舒张功能的诊断标准，并建议近期国际准则切点45，46，47。专家组将患者分为四组。无LVDD，可能的LVDD，可能的LVDD和确定的LVDD。出于本研究的目的，我们将可能的LVDD与确定的LVDD合并为“ LVDD”，将没有LVDD，可能的LVDD合并为“没有LVDD”。
由两名心脏病专家和一名GP 38组成的结果评估小组确定是否存在HF 。小组使用了诊断检查中的所有可用信息，包括超声心动图，但NT-proBNP结果除外（以防止与该特定测试有关的掺入偏差）。在没有达成共识的情况下，将采用多数决定。对于HFpEF患者，必须具有超声心动图舒张异常和心力衰竭的指示性症状和体征（即外周或肺部液体retention留或颈静脉压力升高）或超声心动图左心室肥厚，心房纤颤或心绞痛主诉。
血浆RNA从使用RNeasy微型试剂盒（Qiagen，Venlo的1082，荷兰）如先前所描述的200μL人血浆800μL用Trizol试剂（Invitrogen，布雷达，荷兰）中分离19。简要地，将氯仿添加至血浆/ Trizol混合物中，并以15,000g离心15分钟。将水相用1.5×100％乙醇的体积相结合，输送到MinElute离心柱（Qiagen），并在离心18.000 15秒克。随后，用700μLRWT缓冲液洗涤RNA，用500μLRPE缓冲液洗涤两次，并在前两个洗涤步骤后以18000 g离心15 s，在最后洗涤步骤后以18,000 g 离心2 min。最后，用15μL无RNase的水洗脱RNA。
对于miR cDNA合成，使用miR反转录试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA）进行总RNA的反转录。根据制造商的协议，使用Megaplex PreAmp引物库对cDNA进行预扩增。为先导研究中产生的定制设计的Megaplex卡来确定的118的X染色体位于的miR，2 Y染色体位于的miR的表达，选择的一组的48 microvacular损伤相关的miRNA 8，12和U6和miR-16作为对照。Megaplex阵列在7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）上运行和分析。在主要的患者研究中，如前所述，通过专用的TaqMan qRT-PCR分析检测了单个miRNA的表达8。在比较无症状LVDD患者，LVDD患者和HFpEF患者中miR-16 en U6 Ct值及其各自的标准差（SD）之后，我们选择使用miR-16 13的表达水平对miR表达结果进行标准化。
在马斯特里赫特队列中，血浆可溶性Flt-1（sFlt-1），血栓调节蛋白（sTM）和血管生成素（Ang-2）的浓度通过ELISA（R＆D System s，明尼阿波利斯，明尼苏达州和Diaclone Research，Besancon，法国）根据厂商提供的协议。在HELPFul和UHFO-DM队列中，血浆Ang-2浓度通过ELISA（明尼阿波利斯明尼阿波利斯的R＆D System公司和法国Besancon的Diaclone Research）根据制造商提供的协议确定。
基线特征以均值±标准差（SD）表示，而非正态分布数据以四分位数间距（IQR）表示为中位数，类别数据以百分比表示。使用Pearson卡方检验或学生T检验比较两组之间的差异，具体取决于变量的分布和类型。MiRNA表达值表示为平均值±平均值的标准误（SEM），并使用学生的T检验评估组差异。为了说明年龄的影响，我们还通过单因素协方差分析（ANCOVA）评估了年龄之间各组之间miRNA表达值的差异。变量之间的相关性使用Spearman等级相关性计算，而p通过本杰米尼·霍奇伯格（Benjamini Hochberg）校正，通过FDR进行多次测试来调整数值。在线性回归模型中，使用了一种同时输入法，其中血浆miRs被选为因变量，而年龄，性别，eGFR，高血压，糖尿病和肥胖症为自变量。甲p值<0.05被认为是统计学显著。数据分析使用SPSS 20.0版（SPSS，Inc.，Chicago，IL）和GraphPad Prism，5.0版（GraphPad Prism Software，Inc.，San Diego，CA）进行。
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